CN108935316A - 一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法，所述方法选取BALB/C小鼠为动物模型，实验步骤为：1.隔日给予口服低内毒素牛血清白蛋白酸化水溶液灌胃，持续五周；2.第六周时定时尾静脉注射2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天；3.第9周至第11周观察小鼠一般状态；4.第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周；第15周为试验终点。其优点表现在：(1)本发明有效降低了IgA肾病小鼠的死亡率；(2)本模型可以更好的模拟人类IgA肾病的发病机制，进一步筛选治疗IgA肾病的药物。(3)技术操作简便，动物模型成功率高，有很好的应用前景。

Description

一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法

技术领域

本发明涉及动物模型及构建方法技术领域，具体地说，是一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法。

背景技术

慢性肾脏病是一个全球性的公共健康问题，据报道我国18岁以上的成年人群中CKD的患病率为10.8％，IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是以IgA或IgA为主的免疫球蛋白弥漫沉积在肾小球系膜区及毛细血管袢，临床表现和病理改变各异的临床－病理综合征，IgA 肾病是最常见的原发性肾小球疾病，大约有30％左右的肾脏病患者经穿刺后诊断为IgA肾病，目前只能通过肾活检来确诊。自从1968年Berger首次报道IgAN以来，各国学者在IgAN 的研究中做了大量的工作，但是至今本病的发病机理仍不清楚。人们先后设计制作了多种 IgA肾病模型，这些动物模型从不同的侧面展示了IgAN复杂的发病机理，为人们深入研究 IgAN的发病机理提供了重要的实验依据和手段。目前IgAN的主要动物模型分为免疫诱导型、继发病变型、自发病变型。Rifai等于1979年首次成功建立第一例IgAN动物模型，通过 BSA作为载体，采用二硝基苯酚作为抗原，IgA来自对二硝基苯酚半抗原具有特异反应性的 MOPC-315骨髓瘤小鼠。结果发现小鼠出现血尿，肾小球系膜区出现免疫复合物沉积。1982 年，Isaac等通过研究抗原和循环免疫复合物的大小及电荷性质对肾小球沉积的影响发现：带负电荷的右旋糖酐抗原通过腹腔注射和静脉注射方式，引起较明显的IgA、IgM和补体沉积，伴中度系膜细胞增生。以上两种方式均通过免疫复合物介导，最终引起肾脏系膜区IgA 免疫复合物的沉积建立了IgAN动物模型。Emallcipator于1987年采用口服马脾铁蛋白、牛γ球蛋白和卵白蛋白等不同分子蛋白的方法，隔日喂食小鼠14周后，引起IgA肾病的比例分别为50％、91％、50％。提示异种蛋白可以诱导动物体内免疫反应，增加IgA合成与分泌。 1989年刘志红等使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)静脉注射SD大鼠中诱发IgAN成功。SEB是一种可溶性的细菌外毒素蛋白质，静脉注射入动物体内可损伤肠道毛细血管，提高肠道黏膜通透性，肠道内食物抗原增加，引起局部及全身性炎症反应，局部IgA分泌增加。由此产生的过量IgA超过肝脏的转运及清除能力时，最终沉积在肾脏系膜区，揭示了肠道黏膜免疫异常导致IgAN的可能证据。有研究发现部分IgA肾病患者在患有上呼吸道或消化道感染后会加重肉眼血尿的临床症状，从而表明IgA肾病与粘膜免疫之间存在相关关系，这种相关性表明增强的或异常性的IgA黏膜免疫应答可能在IgAN起作用。Barratt提出一个IgAN 可能的发病机制是黏膜型IgA在骨髓异常生成，然后到达循环系统，促使IgA在肾小球系膜区沉积。针对这个假说的基础是O-糖基化模式的特点IgAN患者的循环系统中可以发现黏膜IgA1，同时，IgAN患者中T细胞过量表达归巢受体引导细胞到达骨髓。还有研究表明复发或慢性细菌感染可能刺激黏膜IgA系统，是IgAN进展性原因。

中国专利申请：CN 102499177 A公开了一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的用途。该IgAN 肾小球硬化大鼠模型的建立方法包含：步骤1，选取大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂；步骤2，将步骤1的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。该大鼠模型的用途包含其在IgAN肾小球硬化过程病理研究中的应用。

但是关于本发明一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法，该方法选取BALB/C小鼠为动物模型，所述方法包含以下步骤：

(1)选取BALB/C小鼠适应性喂养一周后，隔日给予口服低内毒素牛血清白蛋白酸化水溶液灌胃，持续五周；

(2)将步骤1所得到的小鼠在第六周时定时尾静脉注射2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天；

(3)第9周至第11周观察小鼠一般状态；

(4)第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周；

(5)第15周为试验终点。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤2尾静脉注射BSA后，立即给予保温措施。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤2与步骤4小鼠尾静脉注射剂量不超过0.1ml/10g体重。

作为本发明的一个优选实施方案，所述小鼠尾静脉注射所用针头为0.3mm(国际标准为 30g)规格针头使用。

作为本发明的一个优选实施方案，所述酸化水溶液配制方法为：先取新鲜蒸馏水高压灭菌，然后取37％浓盐酸0.5mL加双蒸水定容成6mM盐酸1000mL，密闭后4℃保存，即可制得酸化水溶液。

作为本发明的一个优选实施方案，所述配制口服0.1％BSA酸化水的方法为：用精密天平准确称取BSA(Low Endotoxin)1g，溶于权利要求5所配制好的酸化水中，放置于磁力搅拌器上混匀，密闭于高压蒸汽灭菌后的玻璃容器内冷藏保存，即可制得口服0.1％BSA酸化水。

作为本发明的一个优选实施方案，所述配制2％BSA尾静脉注射溶液的方法为：用精密天平准确称取BSA(Low Endotoxin)1g，加入100mL无菌生理盐水中，充分混匀，放置于高压蒸汽灭菌后的玻璃容器内放于4℃冰箱冷藏保存，即可制得2％BSA尾静脉注射溶液。

作为本发明的一个优选实施方案，所述配制Staphylococcal enterotoxin B(SEB)尾静脉注射溶液的浓度为0.1mg/mL的方法为：取SEB按0.1mgSEB溶于1mL的无菌生理盐水中，用孔径为0.02μm的一次性针头滤器过滤(备注：SEB本身不是无菌)，每只小鼠尾静脉注射量为0.8mg/kg·W。

作为本发明的一个优选实施方案，所述建立方法还包含对IgA肾病小鼠肾功能不全模型的检验方法，包含：

(1)测量小鼠24h尿蛋白定量、小鼠摘眼球处死取血，做肾功能，肝功能，蛋白功能，血脂功能的检测；

(2)取小鼠肾脏免疫荧光冰冻切片及石蜡切片和病理HE、PAS、PASM、MASSON染色检测；

(3)取小鼠肾脏做透射电镜的观察。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型建立方法的应用，所建立的IgA肾病小鼠动物模型中的IgA肾病免疫荧光与临床上IgA肾病病人的病理特征相似，利用IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法制得的IgA肾病小鼠动物模型可用于筛选治疗人IgA肾病的药物。

本发明优点在于：

1、口服低内毒素BSA(<1.0EU/mg)、尾静脉注射SEB这种造模方法可以成功复制小鼠实验性模型，此模型的特点是体重较正常组减轻，肌酐比正常组有差异，蛋白尿于第七周开始升高，此模型符合脾肾阳虚的中医证型。此外在小鼠造模技术后给予保温，可以有效改善小鼠体温过低情况，从而有效降低了IgA肾病小鼠的死亡率。

2、有研究发现部分IgA肾病患者在患有上呼吸道或消化道感染后会加重肉眼血尿的临床症状，从而表明IgA肾病与粘膜免疫之间存在相关关系，这种相关性表明增强的或异常性的IgA黏膜免疫应答可能在IgAN起作用。Barratt提出一个IgAN可能的发病机制是黏膜型IgA在骨髓异常生成，然后到达循环系统，促使IgA在肾小球系膜区沉积。针对这个假说的基础是O-糖基化模式的特点IgAN患者的循环系统中可以发现黏膜IgA1，同时，IgAN 患者中T细胞过量表达归巢受体引导细胞到达骨髓。还有研究表明复发或慢性细菌感染可能刺激黏膜IgA系统，是IgAN进展性原因。而采用本发明的造模方法形成的IgA肾病小鼠动物模型与人类IgA肾病粘膜免疫发病机制类似，可以很好地模拟人类IgA肾病的发病机制，进一步筛选治疗IgA肾病的药物。

3、根据本发明的建立方法所制得的IgA肾病小鼠肾功能不全模型具有以下特征：

(1)一般情况下模型组小鼠在注射BSA后出现不同程度精神萎靡、怕冷、食欲减退、毛色杂乱、体重下降症状。

(2)生化指标：

模型组24小时尿蛋白定量较正常组显著升高(p<0.01)；模型组血清Scr及UA均较正常对照组升高(分别p<0.05和p<0.01)；模型组血清白蛋白水平较正常组升高(p<0.01)。

4、技术操作简便，动物模型成功率高，有很好的应用前景。

附图说明

附图1是小鼠在注射BSA前后的一般情况图。

附图2是正常组与模型组小鼠肾组织免疫荧光的检测图(400x)。

附图3是正常组与模型组小鼠肾组织的病理变化图。

附图4是正常组与模型组小鼠肾脏超微结构电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型的建立方法。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 IgA肾病小鼠肾功能不全动动物模型的建立(一)

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物

40只BALB/c小鼠购于上海必凯公司，在上海中医药大学实验动物中心适应性喂养观察一周后开始进行实验。

1.2方法

1.2.1分组与给药

在观察期间将小鼠称重并且编号，使用IBM SPSS Statistics 23软件按体重排序后随机分为两组，每组20只小鼠，两组分别为正常对照组(Control)和模型组(Model)。

正常对照组小鼠每日给予生理盐水0.5mL灌胃，模型组每只隔日给予0.1％BSA的酸化水0.5mL口服灌胃，第六周时定时尾静脉注射2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天；第9周至第11周观察小鼠一般状态；第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周；正常对照组以等剂量生理盐水尾静脉注射；第15 周为试验终点。

2结果

2.1观察小鼠一般情况

实验结果如图1所示，模型组小鼠在注射BSA后明显出现不同程度精神萎靡、畏寒肢冷、食欲减退、毛色杂乱、体重下降症状。

2.2观察小鼠体重的变化

小鼠第0周、第5周、第9周、第12周、第15周体重的变化：模型组小鼠在第12周与第15周与正常组相比体重明显下降(p<0.05)，第15周(p<0.01)。

表1小鼠体重变化情况(单位：g)

注：与正常对照组比较，▲表示p<0.05，△表示p<0.01

2.3观察小鼠24h尿蛋白定量的变化

模型组小鼠在第七周开始出现蛋白尿，此后蛋白尿水平稳步上升，结果如表2所示(p<0.01)。

表2各组小鼠24小时尿蛋白定量(mg)比较

注：与正常对照组比较，▲表示p<0.05，△表示p<0.01

2.4观察小鼠肾功能的变化

模型组小鼠血肌酐与尿酸水平明显升高，结果分别如表3所示(p<0.01)，说明模型组小鼠肾功能受到损伤。

表3各组小鼠肾功能BUN、Scr、UA比较

注：与正常对照组比较，▲表示p<0.05，△表示p<0.01

2.5观察小鼠蛋白指标的变化

模型组小鼠ALB水平明显降低(p<0.01)

各组小鼠TP、ALB比较

注：与正常对照组比较，▲表示p<0.05，△表示p<0.01

2.6观察小鼠肾组织免疫荧光的检测

通过免疫荧光直接法检测小鼠肾组织冰冻切片免疫球蛋白IgA肾小球内沉积采用Image-Pro Plus6.0软件进行半定量分析，结果如图2所示，正常对照组未见IgA免疫复合物沉积；模型组和各治疗组小鼠肾小球系膜区IgA呈颗粒状或团块状沉积，较正常组荧光强度明显升高(p<0.01)。

小鼠IgA免疫荧光强度比较

注：与正常对照组比较，▲表示p<0.05，△表示p<0.01

2.7小鼠肾脏HE、PAS、PASM、Masson染色，观察肾组织的病理变化

检测结果如图3所示，IgAN造模小鼠肾小球内可见明显系膜细胞增生和系膜基质增多，部分表现为局灶增生或局灶节段硬化改变，部分肾小球囊腔内可见球囊粘连，严重者可见肾小球内纤维化；肾小球病变与肾小管间质病变基本相吻合，轻中度系膜增生改变时，小管间质未见明显病变，系膜弥漫增生改变时可见肾小管上皮细胞空泡变性，肾间质单核细胞表现为浸润性改变；正常对照组小鼠肾小球内未见明显异常。

2.8小鼠肾脏超微结构

检测电镜图如图4所示，正常组电镜下观察肾小球结构正常，模型组可见肾小球系膜区电子致密物沉积，系膜细胞及系膜基质增生，足细胞足突节段性融合和改变，以及凋亡足细胞及泡沫细胞的存在。

3结论

通过本发明提供的方法建得的IgA肾病小鼠肾功能不全模型，可以更好的模拟人类IgA 肾病的发病机制并用于筛选治疗人IgA肾病的药物。

实施例2 IgA肾病小鼠肾功能不全动动物模型的建立(二)

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物

20只规格相差不大的BALB/c小鼠购于上海必凯公司，20只规格相差不大的昆明小鼠，在上海中医药大学实验动物中心适应性喂养观察一周后开始进行实验。

1.2方法

1.2.1分组与给药

在观察期间将小鼠称重并且编号，每组20只小鼠，两组分别为BALB/c小鼠组和昆明小鼠组。

两组小鼠每只隔日给予0.1％BSA的酸化水0.5mL口服灌胃，第六周时定时尾静脉注射 2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天。第9周至第11周观察小鼠一般状态。第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周。第15 周为试验终点。

2结果

昆明小鼠死亡率显著高于BALB/c小鼠，BALB/c小鼠的死亡率为40％左右，因此，使用BALB/c小鼠造模更为适宜。

3结论

动物的种属不同，小鼠的死亡率不同。

实施例3 IgA肾病小鼠肾功能不全动动物模型的建立(三)

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物

40只规格相差不大的BALB/c小鼠购于上海必凯公司，在上海中医药大学实验动物中心适应性喂养观察一周后开始进行实验。

1.2方法

1.2.1分组与给药

在观察期间将小鼠称重并且编号，使用IBM SPSS Statistics 23软件按体重排序后随机分为两组，每组20只小鼠，两组分别为正常对照组(Control)和模型组(Model)。

模型组每只隔日给予0.1％BSA的酸化水0.5mL口服灌胃，第六周时定时尾静脉注射 2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天，尾静脉注射BSA后，立即给予保温措施。第9 周至第11周观察小鼠一般状态。第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周。正常对照组以等剂量生理盐水尾静脉注射。第15周为试验终点；正常对照组小鼠每只隔日给予0.1％BSA的酸化水0.5mL口服灌胃，第六周时定时尾静脉注射2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天，尾静脉注射BSA后，不给予保温措施。第9周至第11周观察小鼠一般状态。第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周。正常对照组以等剂量生理盐水尾静脉注射。第15周为试验终点，

2结果

正常对照组小鼠死亡率明显高于模型组，正常对照组死亡率为28％左右，模型组死亡率为25％左右。

3结论

增加保温措施，可以有效改善小鼠体温过低情况，减少死亡率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型，是由下列方法制备得到，该方法选取BALB/C小鼠为动物模型，所述方法包含以下步骤：

(1)选取BALB/C小鼠适应性喂养一周后，隔日给予口服低内毒素牛血清白蛋白酸化水溶液灌胃，持续五周；

(2)将步骤1所得到的小鼠在第六周时定时尾静脉注射2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天；

(3)第9周至第11周观察小鼠一般状态；

(4)第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周；

(5)第15周为试验终点。

2.根据权利要求1所述的IgA肾病小鼠肾功能不全模型，其特征在于，所述步骤2尾静脉注射BSA后，给予保温措施；步骤2小鼠尾静脉注射剂量不超过0.1ml/10g体重；步骤2中小鼠尾静脉注射所用针头为0.3mm(国际标准为30g)规格针头使用。

3.根据权利要求1所述的IgA肾病小鼠肾功能不全模型，其特征在于，所述步骤4中小鼠尾静脉注射剂量不超过0.1ml/10g体重；步骤4中小鼠尾静脉注射所用针头为0.3mm(国际标准为30g)规格针头使用。

4.一种IgA肾病小鼠肾功能不全模型建立方法，该方法选取BALB/C小鼠为动物模型，所述方法包含以下步骤：

(1)选取BALB/C小鼠适应性喂养一周后，隔日给予口服低内毒素牛血清白蛋白酸化水溶液灌胃，持续五周；

(2)将步骤1所得到的小鼠在第六周时定时尾静脉注射2％BSA缓冲液0.2mL，每日1次，连续3天；

(3)第9周至第11周观察小鼠一般状态；

(4)第12周起尾静脉注射SEB缓冲液0.2mL，剂量为每只小鼠0.8mg/kg，每周1次，连续3周；

(5)第15周为试验终点。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸化水溶液配制方法为：先取新鲜蒸馏水高压灭菌，然后取37％浓盐酸0.5mL加双蒸水定容成6mM盐酸1000mL，密闭后4℃保存，即可制得酸化水溶液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述配制口服0.1％BSA酸化水的方法为：用精密天平准确称取BSA(Low Endotoxin)1g，溶于权利要求5所配制好的酸化水中，放置于磁力搅拌器上混匀，密闭于高压蒸汽灭菌后的玻璃容器内冷藏保存，即可制得口服0.1％BSA酸化水。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述配制2％BSA尾静脉注射溶液的方法为：用精密天平准确称取BSA(Low Endotoxin)1g，加入100mL无菌生理盐水中，充分混匀，放置于高压蒸汽灭菌后的玻璃容器内放于4℃冰箱冷藏保存，即可制得2％BSA尾静脉注射溶液。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述配制Staphylococcal enterotoxin B(SEB)尾静脉注射溶液的浓度为0.1mg/mL的方法为：取SEB按0.1mgSEB溶于1mL的无菌生理盐水中，用孔径为0.02μm的一次性针头滤器过滤(备注：SEB本身不是无菌)，每只小鼠尾静脉注射量为0.8mg/kg·W。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述建立方法还包含对IgA肾病小鼠肾功能不全模型的检验方法，包含：

(1)测量小鼠24h尿蛋白定量、小鼠摘眼球处死取血，做肾功能，肝功能，蛋白功能，血脂功能的检测；

(2)取小鼠肾脏免疫荧光冰冻切片及石蜡切片和病理HE、PAS、PASM、MASSON染色检测；

(3)取小鼠肾脏做透射电镜的观察。

10.权利要求1-3任一所述IgA肾病小鼠肾功能不全模型在筛选治疗人IgA肾病的药物中的应用。