CN104049070A - 一种IgAN动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种IgAN动物模型的构建方法。具体步骤为：(a)体外制备IgA免疫复合物；(b)将制备得到的IgA免疫复合物注射到小鼠体内。本发明的建模方法操作简单易行、成功率高、重复性好、机体损害小，并且能够用于探究早期IgAN患者体内IgA免疫复合物的清除机制，筛选能够清除系膜区IgA免疫复合物沉积的药物、以及评价使用生物学方法清除异常沉积的IgA来治疗IgAN的效果。

Description

一种IgAN动物模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种动物模型的构建方法及其应用，具体为一种IgAN动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

IgA肾病(IgAN)是全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病，大约25％～50％的患者在疾病诊断后25年内发展到终末期肾衰竭(ESRD)；患者即使接受肾移植，仍有超过50％的患者在肾移植术后两年内IgAN复发。因此，对IgAN的发病机制及其防治研究具有重要的临床价值和社会意义。

现有研究表明，IgAN作为一种自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA为主的免疫球蛋白在肾小球系膜区及毛细血管袢呈弥漫颗粒状或团块状沉积所引起一系列临床及病理改变。半乳糖缺失的IgA暴露其铰链区抗原决定簇，使得针对异常IgA的自身IgG和IgA抗体产生，形成的免疫复合物沉积于系膜区，激活系膜细胞及补体系统导致肾脏损伤。

目前，在原治疗基础上从自身免疫发病机制角度出发，探索新的IgAN治疗思路成为了研究热点。但是，各种新的治疗方法和药物能否有效减少或者去除肾小球的IgA免疫复合物沉积，都需要先通过动物实验来进行验证。为了解决上述问题，本发明提供了一种构建IgA免疫复合物沉积动物模型的方法，构建得到的动物模型能够成功模拟临床患者体内IgA免疫复合物在肾小球系膜区沉积的现象，进而为研究IgAN发病机制和药物对免疫复合物的降解作用提供研究基础。

已经报道的可以用于构建IgAN动物模型的方法包括：尾静脉注射葡聚糖G200的方法，口服或静脉注射葡萄球菌、大肠杆菌、副流感嗜血杆菌、仙台病毒等病原微生物成分或免疫复合物的方法，用穿通支原体(Mpe)经尿道上行感染小鼠的方法，以及口服牛血清白蛋白(BSA)加尾静脉注射葡萄球菌肠毒素(SEB)复合法等。但是上述方法在操作上繁琐复杂，造模时间长，而且在造模过程中还存在着对其他器官造成严重损伤引起动物死亡，免疫复合物沉积不明显，重复性不好等问题。因此，寻找一种操作简单易行、成功率高、重复性好、机体损害小的IgAN动物模型构建方法，并把构建得到的模型用于IgAN的病理和药理研究，能够为IgAN患者的临床治疗提供参考。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种IgAN动物模型的构建方法，模拟临床IgAN患者体内IgA免疫复合物在肾小球系膜区沉积的现象，仅使用简单的步骤就能够构建出可以用于研究IgA发病机制和药物对免疫复合物的降解作用的IgAN动物模型。

本发明构建IgAN动物模型的方法包括以下步骤：

(a)体外制备IgA免疫复合物；

(b)将步骤(a)制备得到的IgA免疫复合物注射到小鼠体内，注射量为750μl/次，注射一次。

所述“免疫复合物”是指抗原和抗体特异性结合形成的复合物。

其中，步骤(a)中IgA免疫复合物为IgA1-IgG免疫复合物。用于制备步骤(a)中IgA免疫复合物的IgA1可以是正常糖基化的IgA1，或异常糖基化的IgA1。

其中，步骤(a)中制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例为(1:1)-(2:1)。优选地，使用商品化IgA1制备IgA免疫复合物时，抗原：抗体的比例为1:1；使用IgAN患者血清来源的IgA1制备IgA免疫复合物时，抗原：抗体的比例为2:1。

所述商品化IgA1是指Human IgA1protein，产品编号ab91020，abcom公司，或Human IgA1protein，产品编号30C-CP7034，fitzgerald公司，或Human IgA1,Myelom，产品编号400109，Merck Chemicals公司。

其中，步骤(b)所述的注射可选择肌肉注射，尾静脉注射，但优选为尾静脉注射；所述的小鼠优选为Babl/c小鼠。

判断所构建动物模型体内的IgA免疫复合物沉积程度的方法为：分别在1h、4h、8h、16h、24h时间点处死小鼠，取肾组织做冰冻切片，免疫荧光检测IgA免疫复合物沉积情况。

本发明还提供利用本发明方法制备的动物模型在筛选IgA1酶类药物中的用途，包含以下步骤：

(1)将IgA1酶类药物注射到动物模型体内；

(2)免疫荧光判断动物模型体内IgA免疫复合物的分解程度；

(3)根据分解程度对IgA1酶类药物的效果进行评价。

其中，步骤(1)所述的IgA1酶类药物是商品化的IgA1酶，或细菌中提取的IgA1酶。

在一个具体的实施例中，采用商品化的人多发性骨髓瘤血浆IgA1或者IgAN患者血清中提取的低糖基化IgA1作为抗原，采用商品化的IgG作为抗体在体外形成免疫复合物。

在一个具体的实施例中，采用商品化的IgA1酶和从流感嗜血杆菌ATCC49247中提取的IgA1酶注射到动物模型中，评价不同的IgA1酶对体内IgA1的消化能力。

已有研究提示，即使行肾移植治疗，约50％的病人术后3-5年IgAN将再次复发，其原因仍是IgA免疫复合物沉积于移植肾。说明清除异常沉积的IgA免疫复合物是治疗的根本。现有的制作IgAN动物模型的方法存在繁琐复杂的问题，本发明方法从模拟IgAN的发病机制出发，将体外形成的IgA免疫复合物直接注射到小鼠体内，通过免疫荧光观察IgA及其IgA免疫复合物在肾小球系膜区的沉积现象，为筛选能够分解系膜区免疫复合物沉积的药物、探究早期IgA清除机制，以及采用生物学方法清除异常沉积的IgA从而达到治疗IgA肾病的研究提供一种简单易行的动物模型。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1IgA患者血清中Jacalin结合蛋白的SDS-PAGE电泳：

1.IgA1标准品；2.稀释血清；3.50％饱和(NH4)₂SO₄沉淀；4.Jacalin穿透液；5.PBS流出液；6.蜜二糖洗脱液1；7.蜜二糖洗脱液2；8.蜜二糖洗脱液3；9.蜜二糖洗脱浓缩液

图2Western blot鉴定提取的IgA1蛋白：

1.IgA患者血清；2.过Jacalin纯化柱穿透液；3.PBS流出液；4.过Jacalin柱蜜二糖洗脱液；5.PBS流出液；6-9.过Sephadex G-200分子筛层析流出液

图3Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析：

第1峰为pIgA，第2峰为mIgA，第3峰为非IgA峰

图4IgA1蛋白过Sephadex G-200分子筛层析：

第1峰为pIgA1，第2峰为mIgA1

图5-1商品化的IgA1形成的免疫复合物1的免疫荧光观察图(4h)

图5-2IgAN患者血清中提取的低糖基化IgA1形成的免疫复合物2的免疫荧光观察图(4h)

图5-3阴性对照组的免疫荧光观察图

图5-4同源对照组的免疫荧光观察图

图5-5免疫复合物沉积8h的免疫荧光观察图

图5-6免疫复合物沉积24h的免疫荧光观察图

图5-7免疫复合物沉积1周后重复注射1次的免疫荧光观察图

图6-1低糖基化IgA1形成的免疫复合物与NaCl(对照)作用后的免疫荧光观察图

图6-2低糖基化IgA1形成的免疫复合物与提取自流感嗜血杆菌ATCC49247的IgA1酶作用后的免疫荧光观察图

图6-3低糖基化IgA1形成的免疫复合物与商品化的IgA1酶作用后的免疫荧光观察图

图6-4商品化IgA1形成的免疫复合物与NaCl(对照)作用后的免疫荧光观察图

图6-5商品化IgA1形成的免疫复合物与提取自流感嗜血杆菌ATCC49247的IgA1酶作用后的免疫荧光观察图

图6-6商品化IgA1形成的免疫复合物与商品化的IgA1酶作用后的免疫荧光观察图

图5-1至图6-6中，a为荧光抗体2：检测IgA1的Fc段；b为荧光抗体1：检测IgA1的F(ab)段；c为荧光抗体3：检测羊抗人抗体的F(ab)段，即免疫复合物中的IgA1的Fab段。

具体实施方式

用于形成免疫复合物的抗原：

抗原1：购买商品化的人多发性骨髓瘤血浆IgA1，Myeloma(Fitzgrald公司)

抗原2：从IgAN患者血清中提取的低糖基化IgA1

用于形成免疫复合物的抗体：

抗体1：AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG,F(ab’)2Fragment Specific(Jackson公司)，为特异抗IgA1的IgG

抗体2：ChromPure Goat IgG.F(ab’)2Fragment(Jackson公司)，为非特异抗IgA1的普通的IgG

荧光抗体：

荧光抗体1：检测IgA1的F(ab)段

(FITC)-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgG,F(ab’)2Fragment Specific(Jackson公司)

荧光抗体2：检测IgA1的Fc段

Mouse monoclonal B35064B4Anti-Human IgA1Fc(FITC)ab99793(abcam公司)

荧光抗体3：检测羊抗人抗体的F(ab)段

Rhodamine(TRITC)-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Goat IgG,F(ab’)2Fragment Specific(Jackson公司)

8-10W的Babl/c雌性小鼠购自成都达硕生物科技有限公司

实施例1本发明IgA免疫复合物的制备

将抗原1(商品化的IgA1)与抗体1按照1:1浓度比例形成免疫复合物1：

将商品化IgA1稀释至1mg/ml与1mg/ml Goat anti-human F(ab)2抗体，即抗体1混合，室温放置5min后，取5μl滴在洁净载玻片上，显微镜下观察可见有明显复合物形成，将形成的复合物置4℃保存备用。

实施例2本发明IgA免疫复合物的制备

1、从IgAN患者血清中提取低糖基化IgA1

将IgAN患者血清样品通过硫酸铵沉淀、阴离子交换进行初步分离纯化后，利用凝集素Jacalin对IgA1的糖链末端特异结合的特性，通过Jacalin亲和层析柱制备IgA1亚型纯品，利用葡聚糖凝胶Sephadex G-200可分离5-600KD分子量范围内的蛋白质原理，将IgA1通过Sephadex G-200分子筛层析柱进一步分离获得不同形式的IgA1，混合不同形式的IgA1即可得到总IgA1。

1.1硫酸铵沉淀

步骤：取血清5.0ml于小试管中，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵5.0ml，防止形成团块降低沉淀物的特异性，混匀后室温静置30min或置4℃冰箱过夜，高速低温离心10000rpm，10分钟，将上清液(含白蛋白)弃去，取沉淀物(含球蛋白)溶于0.02mol/L Tris缓冲液(pH8.0)中，重复洗涤一次，加入2ml0.02mol/L Tris缓冲液(pH8.0)溶解，此液即为粗提的γ－球蛋白溶液，将溶解的粗提液转移到10KD的透析卡中，置于盛适量Tris缓冲液的大烧杯中，4℃搅拌情况下透析过夜，用纳氏试剂检测水中的NH4+，直到阴性为止。

1.2DEAE52-纤维素离子交换层析

材料：样品(经pH8.0，0.02mol/LTris缓冲液透析过的IgAN患者血清)，DEAE―纤维素(阴离子交换剂)，2.5×25cm层析柱及不同离子强度的Tris洗脱剂。

步骤：用0.02M Tris缓冲液(pH8.0)平衡柱子，将透析袋内的蛋白质溶液用0.22μm的过滤器过滤后缓慢加入层析柱上，开下端出口，使样品进入柱床，吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱，用线性梯度缓冲液(20-200mmol/L NaCl)洗脱，流速1ml/min，分部收集洗脱液1.5ml/管。

1.3Jacalin亲和层析

试剂

(1)0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline，PBS)(2)0.1M蜜二糖/PBS Elution Buffer

(3)0.02％NaN3

实验步骤：

(1)用5倍柱体积的PBS液平衡层析柱；

(2)将样品手动加入Immobilized Jacalin亲和层析柱，4℃孵育30min；

(3)用10倍柱体积的PBS洗柱(或直至洗脱液在280nm的光吸收度低于0.01)，血清中的IgA1将吸附于层析柱上，不与柱子结合的蛋白质随缓冲液流出柱外，弃去洗脱液；

(4)用5倍柱体积的0.1M蜜二糖/0.1M PBS(PH7.4)0.5ml/min洗脱层析柱至紫外分光光度仪280nm波长下光吸收度低于0.01，吸附于柱上的血清IgA1将随溶液流出，2ml/管子收集洗脱液；

(5)再用10倍柱体积PBS平衡层析柱，柱子保存于含0.02％NaN3的超纯水中：

(6)将洗脱液转移入分子限量10KD的透析袋中，结扎，用相对分子质量为20000的聚乙二醇(PEG)4℃浓缩。

1.4Superdex200凝胶柱层析

试剂

0.05M PB/0.15M NaCl缓冲液(PH7.2)

实验步骤：

(1)将浓缩洗脱液上样于Sephacryl S200分子筛层析柱；

(2)用3倍柱体积的0.05M PB/0.15M NaCl缓冲液(PH7.2)0.5ml/min洗柱，每种IgA1中含有不同分子量成分将按照分子量由大到小的顺序随缓冲液流出柱外，共有3个洗脱峰，分别为多聚IgA1(polymeric IgA1，pIgA1)、单体IgA1(monomeric IgA1，mIgA1)和其他非IgA1蛋白；

(3)收集峰1和峰2洗脱液，PEG20000浓缩后，重复上样，再次洗脱，此次有2个洗脱峰，收集各峰洗脱液，混合后得到纯品IgA1，PEG20000浓缩后保存于EP管中，BCA法测蛋白浓度。

(4)胶体的再生与保存：用0.5mol/L NaCl溶液浸泡胶体30min，倾去NaCl溶液，蒸馏永冲洗数次，再用缓冲液充分平衡即可。

1.5western blot法验证提取的IgA1

SDS-PAGE电泳后，转膜，5％脱脂牛奶封闭1h，加入TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgA1抗体(a链，SouthernBiotech公司)，37℃杂交袋中孵育2h，TBST洗3次，进行化学发光反应。

纯化提取结果：分离纯化血清IgA的SDS-PAGE电泳结果如图1所示。Western Blot法鉴定提取的血清IgA1如图2所示。Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析分离结果如图3所示。不同形式IgA1过Sephadex G-200分子筛层析分离结果如图4所示。

2、制备免疫复合物

将抗原2(按照上述方法从患者血清提取的低糖基化IgA1)与抗体1按照2:1的浓度比例体外形成免疫复合物2：

将制备的IgA1稀释至2mg/ml与1mg/ml Goat anti-human F(ab)2抗体，即抗体1混合，室温放置5min后，取5μl滴在洁净载玻片上，显微镜下观察可见有明显复合物形成，将形成的复合物置4℃保存备用。

实施例3本发明动物模型的制备

将实施例1和实施例2得到的免疫复合物尾静脉注射到小鼠体内，构建类似于IgAN患者的免疫复合物沉积的动物模型。

3.1实验分组：

随机选取8-10W的Babl/c雌性小鼠30只，进行分组，每组5只。

3.2尾静脉注射：

实验组1注射750μl的免疫复合物1(商品化IgA1+抗体1)；实验组2注射750μl的免疫复合物2(血清提取的低糖基化IgA1+抗体1)；阴性对照组分别为注射商品化IgA1或血清提取的低糖基化IgA1+NaCl；同源对照组分别为注射商品化IgA1或血清提取的低糖基化IgA1与抗体2形成的免疫复合物3；

3.3检测免疫荧光，判断免疫复合物的沉积程度

(1)分别在1h、4h、8h、16h、24h，颈处死小鼠，取小鼠肾组织，做冰冻切片；

(2)免疫荧光检测各时间点肾脏IgA1及含IgA1的免疫复合物沉积情况。通过荧光抗体1和荧光抗体2来检测IgA1沉积情况，另用荧光抗体3来检测免疫复合物中抗体的沉积情况。

(3)动物实验荧光染色方法

1)取各组织切片，每只小鼠选取3个标本，双蒸水脱胶后用圈存笔圈存组织，冷丙酮4℃固定5‐10min，PBST洗5min×3次。

2)封闭：各标本加入即用型兔血清30‐40μl，37度温箱湿盒内孵育1h，PBST洗5min×3次。

3)避光下，将按1:50稀释的兔抗人IgG‐Fab和兔抗羊IgG‐Fab30μl共同加入一标本上，1:50稀释的鼠抗人IgA‐Fc30μl加入另一标本，第三个标本则加入PBS做阴性对照，37℃温箱湿盒内孵育45min，PBST洗5min×7次。

4)各标本上加入1:5000稀释的DAPI30‐40μl，室温湿盒内孵育3min，PBST洗3min。

5)封片：各标本上加入15μl抗荧光淬灭剂，倾斜盖上盖玻片，正置荧光显微镜下观察。

实验结果：在荧光显微镜下，与阴性对照组(如图5-3)和同源对照组(如图5-4)相比，无论是免疫复合物1(如图5-1)还是免疫复合物2(如图5-2)均能明显观察到免疫复合物在肾小球系膜区的沉积现象。在注入小鼠体内1h到8h内，荧光强度无明显差别，16h时荧光强度有逐渐增强趋势，24h时的荧光强度明显强于8h，差异有统计学意义(P＜0.05)(如图5-5和5-6所示)。

(表1为4h时的荧光面积和强度)

表1免疫荧光分析结果

为了验证本发明动物模型的稳定性，注入免疫复合物1周后再以相同的剂量重复注射1次，24h后处死的小鼠其肾小球系膜区沉积的免疫复合物与仅注射1次的小鼠相比，差异有统计学意义(P＜0.05)(图5-7)。表明第一次注射入的免疫复合物能较稳定地存在于小鼠肾组织系膜区，而不会被小鼠自身免疫系统消化排除。

结果说明，本发明方法用正常糖基化的IgA1或低糖基化的IgA1均能成功构建出类似于IgAN患者体内免疫复合物沉积的动物模型。

实验例本发明动物模型用于评价IgA1酶的体内作用

实验材料：

流感嗜血杆菌ATCC49247购自上海川翔生物科技有限公司；

商品用IgA1酶(IgA Protease(Igase Pro-Pro-Y-Pro)，商品号：EP0205，MObitec公司)

1、细菌IgA1酶的制备

取出甘油保存的流感嗜血杆菌ATCC49247菌种管，室温下解冻，然后接种于哥伦比亚巧克力琼脂平板上，37℃孵箱培养18‐24h；取菌苔进行革兰染色检查，如为无污染的纯培养物，则挑取平板中数个单菌落，接种于3ml加入含有Hemin(终浓度为10μg/ml)和β‐NAD(终浓度为10μg/ml)的心脑浸液液体培养基中，置37℃全温震荡培养箱200r/min培养18h，镜检无污染后用比浊管调整菌液的浊度，使光吸收值A600为1.0；取2ml菌悬液接种于200ml的心脑浸液液体培养基中，37℃全温震荡培养箱200r/min培养15‐24h。将培养一定时间的细菌悬液在冷冻离心机上以3000r/min的转速离心10min，收集上清备用。

(2)硫酸铵盐析

取细菌培养上清液100ml，在4℃搅拌条件下缓慢加入饱和硫酸铵(NH₄)₂S0₄至终浓度为50％，注意搅拌过程中不要搅出气泡，之后静置2h于4℃6000r/min离心15min，收集沉淀，用少量Tris‐HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.2)溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品。

(3)IgA蛋白酶粗制品的透析与浓缩

将IgA蛋白酶粗制品加入10KD的透析卡中，在Tris‐HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.2)中4℃透析24h，其间更换透析液1‐2次并搅动，将透析后的样品于4℃8000g离心20min，弃去沉淀，收集上清转移入预冷的Amicon‐Ultra‐15超滤管中(50KD)，5000g离心15min，收集浓缩液，BCA法测蛋白浓度，‐20℃冻存。

2、动物模型准备：按照实施例3的方法构建实验组1、阴性对照组、同源对照组、实验组2、阴性对照组、同源对照组的小鼠各4只。

3、IgA1酶对物模型肾组织中IgA1的体内降解作用

(1)给上述的动物模型(4h)通过尾静脉注入商品化的IgA1蛋白酶和步骤1制备的来自细菌的IgA1蛋白酶，作用2h后，处死小鼠，取肾组织制作冰冻切片。

(2)免疫荧光观察沉积于小鼠肾脏的IgA1及含IgA1的免疫复合物的降解情况。

实验结果：加酶组免疫复合物(如图6-2、6-3和图6-5、6-6)荧光强度明显弱于复合物加NaCl对照组(如图6-1和图6-4)，商品化IgA1酶对沉积于肾脏的IgA1及含IgA1免疫复合物的分解作用(如图6-3和6-6)明显弱于流感嗜血杆菌ATCC49247分泌的IgA1酶作用(如图6-2和6-5)。由此可知，通过尾静脉注入IgA1蛋白酶能够消化沉积于小鼠肾脏的正常糖基化的或低糖基化的IgA1及其免疫复合物。因此，本发明方法构建的动物模型可以用于检测或评价IgA1酶的体内作用，从而用于这类药物的筛选。

综上所述，本发明提供了一种IgAN动物模型的构建方法，模拟临床IgAN患者体内IgA免疫复合物在肾小球系膜区沉积的现象，仅使用简单的步骤就能够构建出一种用于评价IgA1酶在体内对免疫复合物的分解作用的IgAN动物模型，为IgAN的临床治疗和药物筛选提供重要参考。

Claims (11)

1.一种IgAN动物模型的构建方法，包括以下步骤：

(a)体外制备IgA免疫复合物；

(b)将步骤(a)制备得到的IgA免疫复合物注射到小鼠体内，注射量为750μl/次，注射一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述IgA免疫复合物为IgA1-IgG免疫复合物。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(a)IgA免疫复合物中，IgA1是正常糖基化的IgA1，或者是异常糖基化的IgA1。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例为(1:1)-(2:1)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例为1:1。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例为2:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)所述的注射为尾静脉注射。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)所述的小鼠为Babl/c小鼠。

9.一种权利要求1～8所述的方法制备的动物模型。

10.权利要求9所述的动物模型在筛选IgA1酶类药物中的用途，包含以下步骤：

(1)将IgA1酶类药物注射到动物模型体内；

(2)免疫荧光判断动物模型体内IgA免疫复合物的分解程度；

(3)根据分解程度对IgA1酶类药物的效果进行评价。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：步骤(1)所述的IgA1酶类药物是商品化的IgA1酶，或细菌中提取的IgA1酶。