CN102944684B

CN102944684B - 抗a、抗b血型定型试剂

Info

Publication number: CN102944684B
Application number: CN201210440828.XA
Authority: CN
Inventors: 黄韫韬; 严兵; 尹娟; 刘非
Original assignee: Wuhan Kanglaibo Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Kanglaibo Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: CN102944684A

Abstract

本发明提供了抗A、抗B血型的单克隆抗体及生成所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号分别为：CCTCC C201215和CCTCC C201216；所述杂交瘤细胞分别由人A血型红细胞、人B血型红细胞免疫小鼠后筛选获得。本发明还进一步提供了含所述单克隆抗体的试剂及相关试剂盒。

Description

抗A、抗B血型定型试剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用杂交瘤技术生产杂交瘤细胞及由其制备的单克隆抗体和血型定型试剂。

背景技术

自Landsteinor(1900)发现ABO血型以来，血型鉴定试剂主要用人血清，存在着个体间差异较大、质量不稳定、成本高、需耗用大量人血等问题。多年来各国学者一直致力寻找一种理想的试剂代替人血清，先后用鱼类、蜗牛、扁豆等动植物组织浆液进行研究，但由于种种问题未能普及推广应用。Voak(1980)和Sacks(1981)用淋巴细胞杂交技术先后建立了分泌抗A型、抗B型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其用于ABO系统血型鉴定。迄今已有几株具有良好特性的抗A、抗B是可用的，其中1983年英国剑桥医学研究所分子生物学实验室研制的ABO血型系统McAb已达到美国食品和药品管理局(FDA)的技术标准，获准由英国特别生物技术公司(Celltech)大批生产并销往西欧、美洲和日本市场；1987年法国(CNTS)和日本出售同类产品。据美国波士顿生物医学咨询公司调查，血液制品的McAb以92％的年增长率递增，1990年达到1亿3千万美元。如今，在世界各国，ABO血型单克隆抗体试剂已成为常规试剂，在我国抗A、抗B单克隆抗体血型试剂占所有临床应用的ABO血型试剂总量90％以上。我国是一个13亿人口的大国，对血型定型试剂需求量非常大，而目前市场上供应的血型定型试剂在质量和数量上不能满足市场的需求。

目前市场上抗A抗B试剂生产用细胞株由于细胞培养分泌上清抗体盐水凝集效价不够国家标准，为达到国家标准，在试剂中添加少量腹水，这样会大大增加成本，而且由于腹水中杂抗体会对试剂结果产生干扰。由此，开发安全可靠、性价比高的抗A、抗B单克隆抗体血型试剂具有较大的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种杂交瘤细胞，其保藏编号分别为：CCTCCC201215和CCTCC C201216；分别由人A血型红细胞、人B血型红细胞免疫小鼠后制备获得。

本发明的另一个目的是提供上述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体，所述单克隆抗体分别为A血型的单克隆抗体和B血型的单克隆抗体。

本发明的又一个目的是提供了包含所述A血型的单克隆抗体和B血型的单克隆抗体的血型定型试剂；进一步提供了包含所述试剂的试剂盒及其使用方法。

本发明的抗A和抗B单抗细胞株由于分泌上清的抗体盐水凝集效价很高，达到甚至超过国家标准，且经实验证明所述抗A抗B单克隆抗体可完全满足临床血型筛查的需求，具有特异性强、稳定性好、生产成本低等优点，各项指标达到国内外同类产品的水平。

生物材料的保藏信息：

分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别命名为9H5和8G9，于2012年9月18日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCC C201215和CCTCC C201216。

具体实施方式

以下实施例有助于进一步了解本发明的优点和特点，不应视为对本发明的限制。所使用的实验材料如无特别说明均为普通市售。

【实施例1】抗A抗B血型单克隆抗体的制备

1.免疫方法和程序：

免疫原：分别采用人A血型红细胞、人B血型红细胞。

免疫动物(湖北省实验动物中心提供)：BALB/C小鼠，雌性，6-8周龄。

方法：A型或B型红细胞分别用生理盐水洗涤两次并调制成1亿/每毫升浓度；对免疫动物进行多点注射，每隔一周注射一次，第四针加强后三天取脾脏细胞用于细胞融合。

2.单抗制备

2.1细胞融合

融合用骨髓瘤细胞：用小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0(P2—X—Ag8·6·5·3)(购自中国科学院武汉病毒研究所病毒保藏中心)，为Ig非分泌型。

融合方法：

(1)制备饲养细胞：采用BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，作为融合时的饲养细胞；取BALB/C小鼠一只，拉颈处死，75％乙醇浸泡5分钟，在无菌操作下，用不含小牛血清RPMI1640培养基注入腹腔冲洗，并吸出冲洗液，如此反复4次，洗液用不含小牛血清的RPMI1640培养基洗涤2次，计数，用含20％小牛血清的RPMI1640培养基配制成1.0×106个/ml的细胞悬液；于96孔板中按50微升/孔滴加。

(2)细胞融合：取加强免疫后第三天的小鼠，摘眼球放血，拉颈处死，置75％酒精浸泡5分钟，无菌操作取出脾脏，并用眼科剪刀将其剪成数段，放入盛有不含小牛血清RPMI1640培养基的10ml圆底塑料管中，用外包塑料王的研磨棒挤压出脾细胞，静置数分钟，取出细胞悬液，并用不含小牛血清RPMI1640培养基混合，离心洗涤两次，弃上清，计数，配制成细胞悬液；将SP2/0细胞与免疫脾细胞按1：5比例混合，于4℃、1400rpm离心10分钟，吸净上清，加入50％PEG(Sigma P7181)处理，在5分钟内慢慢加入10ml不含小牛血清的RPMI1640培养基，在1000rpm条件下离心10分钟，弃上清，加入含20％小牛血清的RPMI1640培养基配制的HAT(Sigma H0262)中，然后接种到96孔细胞培养板上，于融合后第10-14天挑选有杂交瘤细胞生长的孔，吸取培养上清液进行筛选，并换以HT培养基。

2.2筛选和克隆化

筛选：采用血凝试管滴定法。方法如下：准备一排试管，第一管加入300μl生理盐水和100μl上述融合细胞培养上清，其它各管分别加入200μl生理盐水，做倍比稀释。然后每管中加入200μl2％的红血球，混匀，室温18℃-25℃放置15分钟，1000rpm离心1分钟，观察结果。沉淀血块摇动，有不散的血凝块判为阳性。如全部散开无血凝块为阴性。

克隆和再克隆：采用有限稀释法，在96孔细胞培养板中进行。取阳性孔细胞计数，用含20％小牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞至含量为5个细胞/ml，接种于一块96孔板中，每孔0.2ml，第10-14天采用间接检测，挑选强阳性孔细胞扩大培养后冻存和再克隆，以连续两次克隆阳性率100％为止；其中，A型或B型免疫小鼠与SP2/0骨髓瘤融合经初步筛选，满足以下条件克隆挑出进行再克隆：上清只与免疫血型反应而与其它血型没有交叉反应，上清凝集效价大于1:64,结果分别从A和B融合细胞中筛选出3个和4个符合上述条件的克隆，并制备对应腹水测滴度，结果见下表1和表2所示：

表1.A型杂交瘤细胞组织培养上清液和对应腹水的凝血滴度：

杂交瘤编号	培养上清滴度	腹水滴度
			3A5	64	2048
9H5	512	16392
			6G3	128	8196

表2.B型杂交瘤细胞组织培养上清液和对应腹水的凝血滴度：

杂交瘤编号	培养上清滴度	腹水滴度
			3G4	64	2048
6F1	64	4096
			8G9	256	16392
9A3	128	8196

从实际成本和结果考虑，最终选取效价最高的抗A株；编号9H5、抗B株：编号8G9作为工业生产用细胞株，对该两株培养上清亚类进行鉴定皆为IgM亚类。上述两株细胞株已于2012年9月18日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为分别为：CCTCC C201215和CCTCC C201216。

【实施例2】工业化生产抗A抗B血型定型试剂(单克隆抗体)及其检定

1.杂交瘤细胞培养上清液的制备

将实施例1筛选获得的抗A血型或抗B血型杂交瘤细胞在无色RPMI1640加5％小牛血清经培养传代，待杂交瘤细胞生长后取上清液小样，检测血凝效价大于或等于国家标准后收集上清液加入万分之三的叠氮钠即得。

2.抗A抗B血型定型试剂的配制

合并1中的上清液，加入次甲基兰于抗A上清中，使抗A血型血清染色呈蓝色。加吖啶黄于抗B上清中，抗B血型血清染色呈黄色，除菌过滤，获得抗A抗B血型定型试剂。

3.抗A抗B血型定型试剂的特异性检定

按《中国药典》2010版标准规定通则《生物制品无菌试验规程》A3.2.3项进行。

(1)取A₁、A₂B、B、O血型红细胞各3例，分别混合，用适量生理氯化钠溶液洗涤3次，最后1次2000r/min离心5分钟，分别用生理氯化钠溶液配制成2％红细胞悬液。

(2)按每列5支试管排列，各加待检试剂(抗A抗B血型定型试剂半成品)0.1ml，然后在各试管中分别加入2％A₁、A₂B、B、O血型红细胞悬液0.1ml，置18-22℃15分钟，1000r/min离心1分钟，肉眼观察有无凝集，同时做红细胞悬液对照(待检试剂改为生理氯化钠溶液)。

待检试剂与相应红细胞的凝集应符合表3要求，不得发生溶血和其他不易分辨现象。

表3

4.抗A抗B血型定型试剂的效价测定

(1)取A₁、A₂、A₂B、B血型红细胞各3例，分别混合，用适量生理氯化钠溶液洗涤3次，最后1次2000r/min离心5分钟，用生理氯化钠溶液制成2％红细胞悬液。新鲜红细胞悬液采血后在1周内使用。冰冻保存红细胞在试验当日融化，并应作对照证明其反应性是适宜的方可使用。

(2)将试管排成2列，每列六支，自第2支加0.2ml生理氯化钠溶液，将待检试剂2倍系列稀释，加入相应2％红细胞悬液0.2ml。同时做红细胞悬液对照。置18～22℃15分钟，1000r/min离心1分钟，肉眼观察结果。

效价滴度以产生“+”凝集的待检试剂最高稀释度计算，不计红细胞悬液体积，2列试管终点相同作为待检试剂凝集效价，并应符合表4要求。如2列终点相差1管，且效价均符合要求，则以凝集效价低的判为终点；如2列终点相差1管，有1列效价不符合要求，则需取双倍量待检试剂复试，复试结果不得有1列试管终点不符合要求。

表4

5.抗A抗B血型定型试剂的冷凝集素和不规则抗体测定

(1)O血型谱细胞(或随机取10例非血缘性O血型红细胞)，3例B血型红细胞(测抗A用)，3例A血型红细胞(测抗B用)。红细胞处理方法同2.4.3.1⑵项。用生理氯化钠溶液配成2％红细胞悬液，用200g/L BAS生理氯化钠溶液配成5％红细胞悬液。

(2)以用10例O血型红细胞为例。每一待检试剂，排3列试管，每列13支，各加待检试剂0.2ml，每列前3管分别加入3个相应2％红细胞悬液0.2ml，每列后10管分别加入10个O血型红细胞悬液0.2ml。第1列置37℃，第2列置18～22℃，2小时后肉眼观察结果。第3列置4℃，2小时后在4℃环境中肉眼观察结果。

5％红细胞BSA生理氯化钠悬液按上法进行，但仅作2列，分别置18～22℃及37℃，2小时后肉眼观察结果。

全部试管都不得产生凝集反应，也不得发生溶血。抗A抗B血型定型试剂检定合格后即可分装，每支(瓶)装量为1.0ml、5.0ml及10.0ml。

【实施例3】抗A抗B血型定型试剂盒

[药品名称]

通用名：抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)

英文名：Anti-A and Anti-B Blood Grouping Reagents(MonoclonalAntibody)

汉语拼音：KangA、KangB xuexing dingxing shiji(dankelong kangti)

[用途]

专供鉴定人ABO血型用。

[试验原理]

本品系用产生抗A或抗B血型抗体的杂交瘤细胞培养上清液配制而成，采用凝集试验原理，专供鉴定人ABO血型用。

[主要组成成分]

1.抗A血型定型试剂(蓝色)10ml 1瓶

2.抗B血型定型试剂(黄色)10ml 1瓶

3.说明书 1张

[样本要求]

本试剂适用于全血或10％、5％红细胞悬液。

[试验方法]

1.平板法(玻片法)：本品与受检者全血或10％红细胞生理氯化钠悬液按1：1搅匀，不必再稀释，按照有无凝集判定结果。

2.试管法：本品与受检者5％红细胞生理氯化钠悬液按1：1使用，不必再稀释，摇匀，1000r/min离心1分钟或室温静置1小时，按照有无凝集判定结果。

血型	抗A试剂	抗B试剂
			A	+	-
B	-	+
			O	-	-
AB	+	+

注：“+”有凝集反应，“-”无凝集反应

[对试验结果的解释]

将已知的抗A、抗B血型定型试剂与受检者的红细胞混合时，与抗A血型定型试剂发生凝集者即为A型血型，与抗B血型定型试剂发生凝集者即为B型血型，与抗A、抗B血型定型试剂均发生凝集者即为AB型血型，与抗A、抗B血型定型试剂均不发生凝集者即为O型血型。

[该试验方法的局限性]

本试验仅作为正定型检测ABO血型用。

[产品性能指标]

[亲和力]＜15秒，[效价]≥国标

[注意事项]

1.对含有较多自身冷凝集的受检者，在鉴定血型时往往被误认为AB血型，遇到此种情况，需用37℃生理氯化钠溶液洗涤受检者细胞2-3次，以去除吸附在红细胞上的凝集素，然后再鉴定血型。

2.在做配型试验时，如发现有不配合现象，则取受检者血清，用已知A血型或B血型细胞进行反定型试验，以核实原鉴定的血型是否正确。

3.用立即试管法不能测出亚型(如Ax)，需延长作用时间。

4.本品如出现浑浊或变色则不能使用，若开瓶使用时间较长后，最好用已知ABO血型红细胞检查结果是否与已知血型相符，以防制品污染，变质失效，而造成鉴定错误。

5.血型红细胞检查结果是否与已知血型相符，以防制品污染，变质失效，而造成鉴定错误。

[包装、规格]2支/盒，10ml/支

[贮藏]2-8℃避光保存

【实施例4】抗A抗B血型定型试剂盒临床验证

1、血型试剂：用实施例3中配好试剂，按其说明书要求操作。

2、血型定型：用上述试剂对献血员、新生儿、血液病和肿瘤等各类人群进行血型定型，用正反定型及标准血清验证，方法按《中国生物制品规程》二部方法，常见ABO血型的检测结果，对其中23379例的血型分类统计见表5，对特殊人群的检测结果见表6。

表5.常见ABO血型的检测

血型	检测例数	血型符合率(％)
			A	6995	100％
B	6131	100％
			O	7888	100％
AB	2365	100％
			合计	23379	100％

表6.特殊人群的血型检测

人群	检测例数	血型符合率(％)
			新生儿(含脐血)	5130	100％
肿瘤患者	3570	100％
			血液病患者	4095	100％

合计

12795

100％

以上共507114例样本无一例错判，血型定型符合率100％。这其中对A2、A2B和B3血型均能检出。

Claims

1.一种血型定型试剂，包括：

抗A型血型定型试剂，所述试剂含有抗A型血红细胞的单克隆抗体；和

抗B型血型定型试剂，所述试剂含有抗B型血红细胞的单克隆抗体；

其特征在于，所述抗A型血红细胞的单克隆抗体由保藏编号为CCTCCC201215的杂交瘤细胞株制备；

所述抗B型血红细胞的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC C201216的杂交瘤细胞株制备。

2.包括权利要求1所述的血型定型试剂的检测试剂盒。

3.抗A型血型单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC C201215的杂交瘤细胞制备。

4.抗B型血型单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC C201216的杂交瘤细胞制备。

5.一种血型定型方法，包括将待测样品与权利要求1所述的血型定型试剂接触，确定所述待测样品的血型。