CN106282237A - 一种biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞制备方法及可视化方案 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞制备方法,以解决传统CAR-T的靶向性单一、制备繁琐、耗时费力、经济性差的缺点。该方法通过构建avidin-CAR慢病毒包装载体;病毒包装;T细胞分离、激活、共刺激结构域基因转导、扩增来制备CAR-T细胞。并在通用型CAR-T治疗系统基础上,引入分子影像学检测手段,提出了一种基于该细胞的可视化治疗方案,可以实时、动态、在体监控CAR-T细胞治疗过程,从而解决目前CAR-T细胞在治疗过程中缺乏有效监控的现状。本发明具有制备简易、选择多样、靶标广泛、治疗过程可视化的优点,适用于肿瘤患者的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗领域,主要涉及嵌合抗原受体T细胞的制备以及治疗过程中的可视化等技术内容。尤其是一种biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞制备方法及可视化方案。
背景技术
生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin-System,BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世,BAS很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实,生物素-亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应,使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
目前,嵌合抗原受体T细胞(chemric antigen receptor T cells,CAR-T)过继性免疫治疗策略给癌症治愈带来了希望。CAR-T治疗的原理如下:通过基因工程修饰,使体外分离收集的癌症患者的T细胞表达识别单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR),并在体外大量扩增CAR-T细胞后将其输回癌症患者体内进行细胞免疫治疗。CAR作为一种基因表达的嵌合蛋白包含与T细胞信号传导结构域连接的、抗体的抗原结合结构域(如:单链抗体scFv)。CAR-T细胞过继性免疫的显著优势在于:细胞免疫治疗更具精确性。CAR-T细胞过继免疫治疗系统应用基因修饰病人自体的T细胞,利用抗原抗体结合原理规避了依赖MHC限制的抗原呈递,从而具有精确的靶向性。同时克服了肿瘤细胞可能通过下调MHC分子表达以降低抗原呈递的免疫逃逸。
同时,细胞过继免疫治疗系统的研发主要集中在CAR的构建,通过多方面的修饰以增强CAR-T细胞的靶向性,免疫杀伤性、效用持久性及安全性。尽管CAR的构建已取得了诸多显著进展,然而,基于传统的CAR-T细胞过继性免疫治疗系统始终存在以下明显缺陷:(1)靶向性单一:传统的CAR-T治疗系统仅能够靶向表达某一种肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。然而,肿瘤通常具有异质性,一个肿瘤群体中并非所有的肿瘤细胞仅表达单一的肿瘤相关抗原。并且,肿瘤细胞能够通过转录或表达调控降低或丢失某种肿瘤相关抗原的表达。因此,对于肿瘤群体中不表达该CAR-T系统靶向的肿瘤相关抗原的肿瘤细胞,或对于基因调控导致该肿瘤相关抗原表达丢失或降低的肿瘤细胞,该CAR-T治疗系统的治疗效果将有限。(2)制备繁琐:每一套靶向某单一肿瘤相关抗原的CAR-T系统均需要单独构建,并通过实验检测其安全性、靶向性和有效性,应用于临床的评价周期较长,耗时费力,经济性较差。(3)在CAR-T细胞过继免疫治疗过程中,对CAR-T细胞在体内的靶向能力、生物代谢情况缺乏有效的评价和监控手段,因而常导致治疗过度或治疗无效。
发明内容
本发明的目的在于针对现有传统的CAR-T治疗系统的不足,通过制备一套全新的、通用型的CAR-T治疗系统,解决传统CAR-T的靶向性单一、制备繁琐、耗时费力、经济性差的缺点;并在制备的通用型CAR-T治疗系统基础上,引入分子影像学检测手段,实时、动态、在体监控CAR-T治疗过程,可视化通用型CAR-T治疗系统,从而解决目前CAR-T系统在治疗过程中缺乏有效监控的现状。
为了达到上述发明目的,本发明的技术方案如下,
本发明的biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞制备方法主要包括三步:
第一步,构建avidin-CAR慢病毒包装载体;
第二步,病毒包装;
第三步,T细胞分离、慢病毒感染(共刺激结构域基因转导)、激活扩增;
其中,制备avidin-CAR慢病毒表达载体是通过基因工程手段,将其表达于癌症患者外周血中分离收集的T细胞以获得avidin-CAR-T细胞;该基因工程改造的T细胞相对于传统的CAR-T细胞的不同之处在于:以avidin蛋白的表达替代传统CAR上与抗原结合的蛋白功能区(如:scFv),
本发明的采用biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞进行治疗的可视化方案,根据具体要求,以不同类型的示踪剂分子标记已经过生物素化的靶向分子,并将其输入癌症患者体内,通过分子影像监测其在患者体内的靶向性及生物代谢情况,以判断靶向分子对肿瘤靶向的时效性;示踪剂分子的种类包括:(1)用于SPECT显像的各类单光子放射性同位素;(2)用于PET显像的各类正电子放射性同位素;(3)可用于光学显像的各类荧光染料分子、量子点等。
根据具体要求,以不同类型的示踪剂分子标记avidin-CAR-T细胞,在输入示踪剂标记的生物素化靶向分子之后,将示踪剂标记的avidin-CAR-T细胞输入癌症患者体内,通过分子影像监测其在患者体内的靶向性及生物代谢情况,以判avidin-CAR-T细胞对肿瘤靶向的时效性。示踪剂分子的种类包括:(1)用于SPECT显像的各类单光子放射性同位素;(2)用于PET显像的各类正电子放射性同位素;(3)可用于光学显像的各类荧光染料分子、量子点等。
本发明的有益效果是:
1.制备简易:仅需要一次构建avidin-CAR的表达载体而不需要针对不同的肿瘤相关抗原制备相应不同的CAR表达载体。节约时间,人力和成本。
2.选择多样:可以根据不同的肿瘤相关抗原选取相对应的靶向分子(如,抗体、多肽、配体等)。由于靶向分子具有大量的选择性,可以是商品化的治疗抗体,单链抗体,治疗多肽,亦可以是处于研发阶段具有高亲和性的靶向分子。因此,本系统最大的优势即体现在选择的多样性。
3.靶标广泛:通过生物素化不同靶向分子,根据具体的治疗方案可以同时或依次靶向多种肿瘤相关抗原,避免因为肿瘤异质性或基因调控导致肿瘤相关抗原表达下调造成的脱靶现象。
4.治疗过程可视化:通过引入分子影像手段,对靶向分子的预靶向、效应T细胞的靶向过程进行实时动态监控,掌握预靶向分子、avidin-CAR T细胞在体内的靶向的时效性。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述,并且,部分地从说明书中变得显而易见,或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细的说明。为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案,下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图(现有技术图除外)仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,通过下面的详细说明,本发明的上述目的、特征和优点将显而易见;并且在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是采用本发明的avidin-CAR-T细胞进行过继性免疫治疗的示意图
图2是本发明中以biotin或示踪剂标记靶向分子以获得生物素化靶向分子的示意图
具体实施方式
以下,参照附图详细说明本发明的优选实施例。在此之前需要说明的是,本说明书及权利要求书中所使用的术语或词语不能限定解释为通常的含义或辞典中的含义,而应当立足于为了以最佳方式说明其发明发明人可以对术语的概念进行适当定义的原则解释为符合本发明技术思想的含义和概念。随之,本说明书所记载的实施例和附图中表示的结构只是本发明最佳实施例之一,并不能完全代表本发明的技术思想,因此应该理解到对于本发明而言可能会存在能够进行替换的各种等同物和变形例。
例如,在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解,硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式,而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语,故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内,本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题,基本达到所述技术效果。此外,“耦接”一词在此包含任何直接及间接的电性连接手段。因此,若文中描述一第一装置耦接于一第二装置,则代表所述第一装置可直接电性连接于所述第二装置,或通过其他装置或连接手段间接地电性连接至所述第二装置。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式,然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的,并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如图1所示,首先,将靶向肿瘤相关抗原的靶向分子(如,抗体)标记上生物素(biotin)获得生物素化靶向分子。之后,将生物素化靶向分子输入癌症患者体内,靶向分子能够与肿瘤相关抗原结合。然后,再输入已制备好的avidin-CAR-T细胞进行过继性免疫治疗。由于biotin能够与avidin高亲合力地结合,因此,avidin-CAR-T细胞能够结合到已与细胞膜上肿瘤相关抗原结合的生物素化靶向分子并发挥细胞免疫作用。
如图2所示,以biotin或示踪剂(如,放射性同位素、荧光染料等)标记靶向分子获得能够示踪的生物素化靶向分子。靶向分子的选择多样,可以是抗体、多肽、配体、酶底物等。
下面举例说明如何制备Avidin-CAR-T细胞:
1.构建avidin-CAR慢病毒包装载体
将avidin序列整合入CAR慢病毒表达载体的CD8Hinge&TM序列的5′上游。感染avidin-CAR慢病毒的细胞将表达avidin-CAR,CD8Hinge&TM序列的5’上游的部分将暴露在细胞膜外,连接CD8Hinge&TM部分,使该细胞具备连接生物素及其标记的分子的能力。
用avidin序列替换CAR逆转录病毒载体:pMSGV1-huAb139scFv-hCD8.28BBZ的huAb39scFv部分,进一步将整个avidin-CD8 Hinge&TM-CD28-4-1BB-CD3zeta部分的序列插入到慢病毒载体pITA的NotI和BamHI位点之间。所用的包装系统是pSPAX2和pMD2.G
以pRSET-mSA-EGFP为模版,以
5’-ccgCTCGAGATGGCTGAAGCTGGTATCACCG
5’-ataagaatGCGGCCGCTAATGGTGGTGATGGTGATGGG
为引物进行扩增,得到扩增产物avidin-6xhis;
将avidin-6xhis电泳后,切取回收400bp附近条带,胶回收,XhoI和NotI酶切后回收得到411bp的片段;XhoI和NotI酶切pMSGV1-huAb139scFv-hCD8.28BBZ,回收7405bp条带,将回收部分与avidin-6xhis连接,获得p-avidin-6xHis-CAR质粒;
以p-avidin-6xHis-CAR质粒为模版,以
5’-ATGGCTGAAGCTGGTATCACCG
5’-TTAGCGAGGGGGCAGGG
为引物进行扩增,得到扩增产物avidin-6xHis-CAR;
将avidin电泳后,回收1265bp附近条带,将回收部分与T载体连接,
获得T-avidin-6xHis-CAR质粒;
以T-avidin-6xHis-CAR为模版,以
5’-TAAACCGTCCGCTGCTTCCaCGGCCGCATT
5’-tGGAAGCAGCGGACGGTTTAACTTTGGTGAAGG
引物进行定点突变,移除6xHis和NotI酶切位点
获得T-avidin-mNotI-CAR质粒;
以T-avidin-mNotI-CAR为模版,以
5’-CTGGTACAACCAGCTGGGtTCCACCTTCATCG
5’-aCCCAGCTGGTTGTACCAGGTGCCGGTGAT
引物进行定点突变,移除BamHI酶切位点
获得T-avidin-mNotI-mBamHI-CAR质粒;
以T-avidin-mNotI-mBamHI-CAR为模版,以
5’-ataagaatGCGGCCGCATGGCTGAAGCTGGTATCACCG
5’-cgcGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGG
为引物进行扩增,的得到扩增产物avidin-CAR;
将avidin-CAR电泳后,切取回收1200bp附近条带,胶回收,NotI和BamHI酶切后回收得到1245bp的片段;NotI和BamHI酶切pITA,回收7500bp附近条带,将回收部分与abidin连接,获得avidin-CAR慢病毒表达载体。
2.病毒包装:
以pSPAX2,pMD2.G和avidin-CAR慢病毒表达载体按照3∶2∶4的比例(质量比)瞬时转染293T细胞,36h收取上清,超速离心纯化获得avidin-CAR慢病毒颗粒
3.T细胞分离、慢病毒感染、激活、扩增:
用单个核细胞分离试剂盒(购自AllCells公司)从癌症患者(或健康志愿者)的外周血中分离单个核细胞(PBMC)并于终浓度为50IU IL-2,及含有抗CD-3,CD-28抗体的X-VIVO15培养液中培养1-2天,之后进行avidin-CAR慢病毒感染:将T细胞转至6孔板培养(密度为5×106个/孔),将avidin-CAR慢病毒颗粒及终浓度为8μg/ml polybrene加入细胞培养液中并培养12-16h。感染16小时后,离心,转袋扩增培养12天(培养液中含有终浓度为50IU IL-2),可获得约1×109细胞数。
基于biotin-avidin系统的avidin-CAR-T细胞过继性免疫治疗方案如下:
1.生物素化靶向肿瘤相关抗原的靶向分子(如,抗体、多肽、配体、酶底物等)获得生物素化靶向分子。以下以生物素标记抗体为例进行说明:
(1)选取或制备靶向某种肿瘤表面相关抗原的单克隆抗体;
(2)用蛋白生物素化试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific公司)对此单抗标记,标记反应结束后对产物进行纯化,测定标记率。具体实验方法及操作步骤可参考试剂盒说明书;
2.将生物素化的靶向分子静脉注射入肿瘤患者体内,选取合适时间点将avidin-CAR-T细胞(采用如上所述通过1.构建avidin-CAR慢病毒包装载体;2.病毒包装;3.T细胞分离、激活扩增三步制备的avidin-CAR-T细胞)输入患者体内,评价和观察疗效。由于biotin能够与avidin高亲合力地结合,因此,avidin-CAR-T细胞能够靶向到已与肿瘤相关抗原结合的生物素化靶向分子并发挥细胞免疫作用。
基于分子影像技术的可视化方案如下:
1.以示踪剂(如,放射性同位素、近红外荧光染料等)标记生物素化靶向分子获得用于分子成像的分子探针,将其输入癌症患者体内,并通过分子影像监测其在患者体内的靶向性及生物代谢情况,以判断其靶向的时效性。
以近红外荧光染料分子Dylight 680-NHS标记已生物素化抗体并进行活体显像为例进行说明:
(1)制备靶向某种肿瘤表面相关抗原A的生物素化抗体;
(2)用近红外荧光染料分子Dylight 680-NHS标记试剂盒(购自ThermoFisher Scientific公司)对生物素化单克隆抗体进行标记。标记反应结束后对产物进行纯化,测定标记率。具体实验方法及操作步骤可参考试剂盒说明书;
(3)将制备的可视化分子探针尾静脉注射入一组表达A相关抗原的荷瘤鼠体内,以小动物活体成像系统对荷瘤鼠进行连续时间点成像(Ex/Em:675/720nm),通过显像结果评价(半定量分析)分子探针在肿瘤及正常组织中的摄取情况。计算分子探针的T/NT(肿瘤组织摄取值/非肿瘤组织摄取值)值最大的时间点,此时间点即为输入avidin-CAR-T细胞进行过继性细胞免疫治疗的最佳时间点。
再以放射性同位素Na125I标记已生物素化抗体并进行SPECT活体显像为例进行说明:
(1)制备靶向某种肿瘤表面相关抗原A的生物素化抗体;
(2)取合适比例的生物素抗体和Na125I加入装有Idogen安瓿瓶中反应适当时间(Idogen法标记),标记反应结束后对产物进行纯化(过G25柱),ITLC测定标记率及放化纯。
(3)将制备的可视化分子探针尾静脉注射入一组表达A相关抗原的荷瘤鼠体内,以小动物SPECT/CT活体成像系统对荷瘤鼠进行连续时间点成像,通过显像结果评价分子探针在肿瘤及正常组织中的摄取情况。对应于显像时间点,进行分子探针在动物体内的生物分布分析实验,精确计算分子探针的T/NT(肿瘤组织摄取值/非肿瘤组织摄取值)值最大的时间点,此时间点即为输入avidin-CAR-T细胞进行过继性细胞免疫治疗的最佳时间点。
2.以示踪剂(如,放射性同位素、近红外荧光染料等)标记avidin-CAR-T细胞,在上述确定的输入体内的时间点将其输入癌症患者体内,并通过分子影像监测其在患者体内的靶向性及生物代谢情况,以判断其靶向的时效性。
以放射性同位素99mTc-HMPAO标记avidin-CAR-T并进行SPECT活体显像为例进行说明:
(1)取合适比例的99mTc-HMPAO和avidin-CAR-T反应适当时间(由于HMPAO具有亲脂性,可以穿过细胞膜进入细胞内)。
(2)将制备的可视化的avidin-CAR-T尾静脉注射入一组之前已输入生物素化靶向分子的荷瘤鼠体内,以小动物SPECT/CT活体成像系统对荷瘤鼠进行连续时间点成像,通过显像结果评价avidin-CAR-T在肿瘤中的浓聚及正常组织中代谢情况。对应于显像时间点,进行分子探针在动物体内的生物分布分析实验,精确计算avidin-CAR-T在肿瘤中的浓聚及正常组织中代谢情况。
需要注意的是,尽管上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例,但如前所述,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (3)
1.一种biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞制备方法,其特征在于:该方法主要包括三步,
第一步,构建avidin-CAR慢病毒包装载体;
第二步,病毒包装;
第三步,T细胞分离、慢病毒感染(共刺激结构域基因转导)、激活及扩增;
其中,制备avidin-CAR慢病毒表达载体是通过基因工程手段,将其表达于癌症患者外周血中分离收集的T细胞以获得avidin-CAR-T细胞;该基因工程改造的T细胞相对于传统的CAR-T细胞的不同之处在于:以avidin蛋白的表达替代传统CAR上与抗原结合的蛋白功能区(如:scFv)。
2.生物素化靶向分子。其特征在于:选取各种能够与肿瘤表面相关抗原结合的靶向分子,最典型的如:抗体、多肽、适配体、酶底物等。并通过化学反应将其生物素化。
3.一种采用biotin-avidin-慢病毒表达载体和CAR-T细胞进行治疗的可视化方案,其特征在于:根据具体要求,以不同类型的示踪剂分子标记已经过生物索化的靶向分子,并将其输入癌症患者体内,通过分子影像监测其在患者体内的靶向性及生物代谢情况,以判断靶向分子对肿瘤靶向的时效性;示踪剂分子的种类包括:(1)用于SPECT显像的各类单光子放射性同位素;(2)用于PET显像的各类正电子放射性同位素;(3)可用于光学显像的各类荧光染料分子、量子点等;
根据具体要求,以不同类型的示踪剂分子标记avidin-CAR-T细胞,在输入示踪剂标记的生物素化靶向分子之后,将示踪剂标记的avidin-CAR-T细胞输入癌症患者体内,通过分子影像监测其在患者体内的靶向性及生物代谢情况,以判avidin-CAR-T细胞对肿瘤靶向的时效性。示踪剂分子的种类包括:(1)用于SPECT显像的各类单光子放射性同位素;(2)用于PET显像的各类正电子放射性同位素;(3)可用于光学显像的各类荧光染料分子、量子点等。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170104 |