CN115290895B - 人pd-l1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰在预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人PD‑L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰在预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的应用，其可以用于制备预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品，例如能特异性识别人PD‑L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体，或是含有上述多抗或单抗的试剂盒，或是用于扩增制备上述多抗和单抗的试剂盒。通过上述多抗或单抗检测第162位赖氨酸的甲基化修饰的人PD‑L1蛋白的表达量，进而判断待测样本使用抗PD‑1或抗PD‑L1免疫治疗的敏感性，为指导临床使用抗PD‑L1及PD‑1单抗提新的依据可能。

Description

人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰在预测恶性肿瘤免 疫治疗敏感性的应用

技术领域

本发明属于生物医药及肿瘤治疗技术领域，特别是人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰在预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的应用。

背景技术

随着程序性死亡受体配体(PD-L1)及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)免疫检查点的不断发现，针对肿瘤病人的免疫治疗技术越来越受到关注。PD-L1是一种免疫球蛋白样的免疫抑制因子，存在于各种细胞中，包括肿瘤细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DCs)和癌相关成纤维细胞(CAFs)。PD-L1的配体程序性死亡受体(PD-1)主要表达于T细胞上。肿瘤细胞表面的PD-L1能够与肿瘤浸润T淋巴细胞(CTLs)上的PD-1相互作用，从而抑制T细胞的增殖，减弱T细胞的细胞因子分泌，负调节T细胞介导的细胞毒性，最终导致肿瘤细胞逃逸机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。

多项临床实验表明使用抗PD-L1单克隆抗体(单抗)或者抗PD-1单克隆抗体，可以阻断PD-1/PD-L1的相互作用，使得CTLs再次活化，进而使得机体免疫系统杀伤异常的肿瘤细胞，使得肿瘤患者预后明显改善。根据美国国立综合癌症网络(NCCN)指南显示，肿瘤中PD-L1表达≥50％且无肿瘤驱动基因突变的患者可以接受抗PD-L1单抗单药治疗。然而，多项临床研究表明抗PD-L1治疗在各种肿瘤中的应答率仅为15-45％；此外，还有多项临床试验表明，PD-L1低表达的患者也可受益于抗PD-L1治疗。这些临床证据表明单纯性将PD-L1表达量作为是否使用PD-L1单抗的判断依据仍然存在争议。

既往研究表明，PD-L1的磷酸化、棕榈酰化和糖基化修饰能够增强PD-L1的稳定性，使得肿瘤细胞表面的PD-L1表达量升高，进而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。然而，PD-L1的甲基化修饰及其生物学功能尚未有人报道。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了了一种涉及人PD-L1蛋白第162位赖氨酸发生的甲基化修饰现象，在预测/评价恶性肿瘤抗-PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感性中的应用，同时还相应地提供了一种可以真实反应PD-L1蛋白162位赖氨酸甲基化水平的抗体。采用本发明提供的抗体，能够特异性识别PD-L1蛋白162位赖氨酸甲基化，可以用于指导筛选出恶性肿瘤抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感的患者，具体通过以下技术实现。

人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰在制备预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品中的应用。

优选地，上述应用方法中，预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品是特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体。在利用上述人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰的功能作用时，可以直接使用能特异性识别该甲基化修饰的多抗或单抗，判断出该甲基化修饰表达的人PD-L1蛋白所占比例，由此判断恶性肿瘤使用抗-PD-1或抗PD-L1免疫治疗的敏感性。

优选地，上述应用方法中，预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品是含有特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体的检测试剂盒。该试剂盒可以用于直接预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性。将其中包含的多抗或单抗直接使用即可。同时，试剂盒中还可以包括检测所必需的常规缓冲液、洗涤液、包被液等试剂。

优选地，上述应用方法中，预预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品是用于PCR扩增特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的单克隆抗体的试剂盒，或是用于动物免疫获得特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体的试剂盒。本试剂盒不同于上段提到的试剂盒，本试剂盒主要用于实验室中通过PCR扩增，或动物免疫等方法，制备合成相应的多抗或单抗，进而间接地支持预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性。

更优选地，上述应用方法中，使用特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体，检测待测样本的人PD-L1蛋白中，第162位赖氨酸的甲基化修饰的人PD-L1蛋白表达所占的比例；通过设定比例的阈值，或肿瘤TPS或CPS评分方法，预测恶性肿瘤抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感性。

进一步优选地，采用设定比例的阈值预测时，如果超过阈值则预测对抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗不敏感，如果低于阈值则预测对抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感。既往研究表明PD-L1的磷酸化、棕榈酰化和糖基化修饰会影响肿瘤细胞的免疫逃逸，在我们的研究中，我们发现，PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的高表达反而会抑制PD-L1与其配体PD-1的结合，进而重新激活和促进T细胞发挥原有功能，对肿瘤细胞进行杀伤，最终有效抑制肿瘤细胞的增殖。因此，如果PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰出现高表达，说明肿瘤细胞的增殖已经适应了对PD-L1与其配体PD-1的抑制作用，如果再使用抗PD-1或抗PD-L1的单抗免疫治疗就不能产生实际意义。

更进一步优选地，上述应用方法中，第162位赖氨酸的甲基化修饰的人PD-L1蛋白表达所占比例的阈值为65％。

更优选地，上述应用方法中，所述多克隆抗体的制备方法是：先合成用于模拟第162位赖氨酸甲基化的PD-L1蛋白的多肽，然后将多肽注射免疫动物进行免疫致敏，提取免疫动物的血清，收集、纯化血清中的多克隆抗体；所述单克隆抗体采用基因编辑技术制备获得。在PD-L1蛋白的氨基酸序列、编码表达PD-L1蛋白的核苷酸序列公知的前提下，针对PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰，可以采用本领域的常规公知技术，先合成能够模拟第162位赖氨酸甲基化的PD-L1蛋白的多肽，然后将这种多肽作为抗原通过动物免疫法进行免疫，提取动物血清纯化获得多抗；也可以采用本领域的常规公知技术，利用基因编辑的方法，直接制备能特异性识别赖氨酸甲基化的单克隆抗体。

申请人通过深入研究人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰，与使用抗PD-L1及PD-1单抗进行恶性肿瘤免疫治疗的敏感性的关系，发现通过使用能特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰的多克隆抗体，可以更加精准地预测恶性肿瘤抗-PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感性。现阶段，可以主要使用肿瘤组织中TPS或CPS评分来指导临床PD-L1或者PD-1单抗治疗；为指导临床使用抗PD-L1及PD-1单抗提新的依据可能。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：发现了一种能够更准确，更真实地反应和预测恶性肿瘤抗-PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感性的方法，利用PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化的特殊功能，为指导临床使用抗PD-L1及PD-1单抗提新的依据可能。

附图说明

图1为通过蛋白质质谱分析发现PD-L1蛋白上潜在的甲基化位点示意图；

图2为表达人的野生型PD-L1及PD-L1第162位赖氨酸突变的RKO细胞系的流式细胞学结果示意图；

图3为表达人的野生型PD-L1及PD-L1第162位赖氨酸突变的Lewis细胞系的流式细胞学结果示意图；

图4为定量检测结合得到的RKO WT及RKO K162R突变型的细胞上的PD-1蛋白含量的示意图；

图5为使用Caspase 3/7试剂盒检测RKO WT及RKO K162R细胞凋亡细胞比例的示意图；

图6为小鼠背部肿瘤体积变化和肿瘤组织重量的检测结果；

图7为定制特异性识别PD-L1第162位赖氨酸甲基化的多克隆抗体(兔血清抗体)的特异性及敏感性试验结果；

图8为每例肺癌标本中PD-L1蛋白及PD-L1第162位赖氨酸单甲基化的表达水平的ROC曲线。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：PD-L1蛋白潜在的甲基化位点测定

1、PCDNA3.1-HA-PD-L1质粒的制备

由奥科生物技术公司将合成的HA-PD-L1目的基因克隆到PCDNA3.1表达载体中，获得PCDNA3.1-HA-PD-L1质粒；

2、PD-L1蛋白甲基化位点的识别

(1)按照turbofect转染试剂(由Thermo公司提供)的说明书，在HEK293T细胞中转染PCDNA3.1-HA-PD-L1质粒并表达HA-PD-L1蛋白，即带有HA标记蛋白的PD-L1蛋白；

(2)转染3天后，按照说明书使用Anti-HA磁珠(由MCE公司提供)分离HEK293细胞中的PD-L1蛋白；

(3)然后通过蛋白质质谱分析(机器型号：Exactive Plus LC-MS/MS massspectrometer(Thermo)，2kV，RF＝40，320℃)得到了PD-L1赖氨酸甲基化位点，如图1所示，PD-L1蛋白第75、89、105和162位赖氨酸发生了甲基化。

实施例2：PD-L1蛋白甲基化位点的功能研究

以PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化作研究对象为例，其具体功能研究为：

1、分别构建PLKO-AS3W-PD-L1载体、PLKO-AS3W-PD-L1K162R载体

由奥科生物技术公司将合成的HA-PD-L1及PD-L1K162R的目的基因克隆到PLKO-AS3W载体中，得到PLKO-AS3W-PD-L1载体、PLKO-AS3W-PD-L1K162R载体。

PLKO-AS3W-PD-L1K162R载体即PD-L1蛋白第162位赖氨酸突变为精氨酸，以此模拟PD-L1第162位赖氨酸甲基化缺失；

2、分别构建表达人野生型PD-L1载体的结肠癌RKO细胞系、小鼠Lewis肺癌细胞系，以及表达人突变型PD-L1K162载体的结肠癌RKO细胞系、小鼠Lewis肺癌细胞系

(1)采用Crisp/Cas9技术，使用pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒(Addgene公司)将结肠癌RKO细胞中原有的PD-L1基因特异性敲除，命名为RKOPD-L1KO；具体sgRNA为：

5'-GTCCAGATGACTTCGGCCTT-3'；

5'-GGATGACCAATTCAGCTGTA-3'；

5'-GACACATTCAGAATATTACC-3'；

(2)采用同样的Crisp/Cas9技术，将小鼠Lewis肺癌细胞中的鼠PD-L1敲除。具体sgRNA为：

5'-GCCAGTGGCAGGTGAGTCTC-3'；

5'-GCCTGCTGTCACTTGCTACG-3'；

5'-GAGGTTGGACAAGGCTTCCG-3'；

(3)将PLKO-AS3W-PD-L1载体/PLKO-AS3W-PD-L1K162R载体，慢病毒包装质粒PPAX，以及PMG2D共转染HEK293T细胞，96小时后，取细胞培养液上清，获得含有表达人PD-L1野生型(PD-L1WT)及人PD-L1K162R突变型(PD-L1K162R)基因序列的慢病毒；

(4)使用含有PD-L1野生型、PD-L1K162R突变型基因序列的慢病毒分别感染上述结肠癌细胞RKOPD-L1KO和小鼠Lewis肺癌细胞，获得表达hPD-L1WT及hPD-L1K162R的RKO细胞系(分别命名为RKO^hPDL-1WT、RKO^hPDL-1K162R)，以及Lewis细胞系(分别命名为Lewis^hPDL-1WT、Lewis^hPDL-1K162R)，检测RKO及Lewis细胞中人PD-L1及鼠PD-L1的表达情况，如图2、3所示，可见细胞系已经成功构建。

3、PD-L1第162位赖氨酸甲基化修饰的功能研究

(1)PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化缺失，对PD-L1与PD-1的结合能力的影响

研究方法具体如下：

①首先通过受体-配体结合实验将人PD-1纯蛋白(由SinoBiological公司提供)分别加入到表达PD-L1WT及PD-L1K162R的RKO细胞系中，共孵育1小时后；

②使用PE-PD-1抗体(由Biolegend公司提供)标记结合到RKO WT及RKO K162R突变型的细胞上的PD-1蛋白；

③使用流式细胞技术(具体设备型号：Becton-Dickinson FACScan System；Franklin Lakes,NJ,USA)，定量检测结合到RKO WT及RKO K162R突变型的细胞上的PD-1蛋白含量；

具体检测结果如附图4所示，结果表明PD-L1的第162位赖氨酸甲基化的缺失，增强了PD-L1与PD-1的结合能力。

(2)T细胞介导的肿瘤杀伤实验

研究方法具体如下：

①使用人淋巴细胞分离液(由MERCK公司提供)分离人外周血单个核细胞(PBMC)；

②使用anti-CD3(0.1ug/ml)、anti-CD28抗体(0.1ug/ml)及白介素2细胞因子(100IU/ml)刺激PBMC分化为CD8阳性T细胞，

③将RKO WT细胞、RKO K162R突变型细胞分别与预先处理的上述PBMC细胞(CD8阳性T细胞)共培养，96小时后，使用Caspase 3/7试剂盒(由Sangon Biotech公司提供)分别检测RKO WT及RKO K162R细胞凋亡细胞比例。

上述详细实验步骤可参考2018年发表的外文文献《Eradication of triplenegative breast cancer cells by targeting glycosylated PD-L1》(Chia-Wei Li,etal.Cancer cell,33(2):187–201)的第13页的“T cell-mediated tumor cell killingassay”部分。

检测结果见附图5，由此可以发现PD-L1蛋白的第162位赖氨酸的甲基化修饰可以促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。图5的左图为三次重复T-细胞介导的肿瘤杀伤实验的代表图，右图为三次重复实验中凋亡细胞比例的统计结果。

(3)小鼠皮下瘤实验

实验动物来源于江苏集萃药康生物有限公司的人源化PD-1的C57BL/6小鼠(B6/JGpt-Pdcd1em1Cin(hPDCD1)/Gpt)，具体实验步骤如下：

①将100ul PBS含有1×10⁶个Lewis^hPDL-1WT细胞，或含有Lewis^hPDL-1K162R细胞皮下注射到8周龄人源化PD-1的C57BL/6小鼠背部，每隔四天量取小鼠背部肿瘤体积，具体计算方法为：体积＝0.5×最长径×最短径×最短径；

②20天后断颈处死小鼠，分离肿瘤组织，并给予称重。

具体的小鼠背部肿瘤体积变化和肿瘤组织重量的检测结果见附图6所示，由此验证了PD-L1蛋白的第162位赖氨酸的甲基化可以影响其皮下肿瘤细胞的增殖能力。

申请人同样针对PD-L1蛋白的第75、89、105和162位赖氨酸甲基化，按照上述研究方法分别进行了深入的功能研究。最终发现，只有PD-L1蛋白第162位甲基化的修饰可以影响PD-L1与其配体PD-1的结合。PD-L1蛋白第75、89、105位的赖氨酸甲基化对PD-L1/PD-1的结合没有影响，因此相应的具体检测结果因与本发明要突出的技术过程和技术效果关系不大，故省略。

实施例3：制备特异性识别第162位赖氨酸甲基化的人PD-L1蛋白的多克隆抗体

1、人第162位赖氨酸甲基化的PD-L1蛋白的分析与设计

合成多肽EGYP(K-Me1)AEV(多肽链结构为EGYPKAEV，其中赖氨酸K被单甲基化修饰)作为免疫原，命名为WG-00793P，偶联KLH用于免疫，由abclonal公司合成；同时合成非甲基化的对照肽(多肽链结构为EGYPKAEV)，命名为WG-00793C，由abclonal公司合成；用于分别模拟K162位甲基化的PD-L1蛋白和非甲基化的PD-L1蛋白。

2、制备人工免疫原免疫动物

具体制备过程如下：

(1)购入2.0kg重的SPF级的三只实验级日本大耳白兔；

(2)佐剂包裹抗原：在每次免疫之前，将KLH-多肽PBS复合物(多肽EGYP(K-Me1)AEV或对照肽EGYPKAEV，粉末状)0.35mg吸入一支1ml无菌注射器中，以另一只1ml注射器吸入等量的完全弗氏佐剂，两支注射器以无菌塑料软管连接并反复相互抽拉，直到完两支注射器内的液体全乳化，即可用于免疫；

(3)第一次动物致敏：为了增加致敏效果，将步骤(2)所得液体采用多点法(每点150μl)注射于日本大耳白兔皮下(记为免疫第0天)；

(4)第二次动物致敏：免疫第7、19、40、68天后，分别将KLH-多肽PBS复合物0.35mg采用步骤(2)相同的方法进行制备，采用多点法(每点150ul)注射于日本大耳白兔皮下，进行第二、三、四、五次实验动物致敏。免疫后第80天实验检测抗体效价和特异性；

(5)收集、保存抗体血清：

①将免疫后的兔子用绳子固定四肢形成仰卧姿势，双上肢交叉置于头部后面固定，用细绳拴住兔上颌门牙后向后拉，顺势将兔头固定于双上肢上；

②暴露颈部，消毒并剪去颈部毛发，沿颈部正中自胸骨上窝至下颌剪开颈部皮肤约15cm，找到气管后沿气管仔细分离皮下组织，远心端至喉部，近心端至胸锁乳突肌；

③在气管下方即可见搏动的劲动脉，仔细分离两侧颈动脉，并充分游离；

④将两根黑丝线套入一侧动脉并分开(一根在远心端，一根在近心端)，用丝线将动脉远心端结扎，然后将动脉近心端用动脉夹夹住，用眼科剪在丝线与动脉夹中间的动脉壁上剪开一个小口，迅速插入预先制作好的细塑料软管，并迅速用近心端丝线固定软管与动脉，以防软管脱出和漏血；

⑤轻轻松开动脉夹，用50ml离心管倾斜放置接住从放血管里射出来的动脉血，直至无血液滴出，可同法处理另一侧颈动脉增加放血量，并可于放血流量缓慢时挤压心脏以增加血液排出量；

⑥将兔血清于4℃冰箱放置过夜；第一次吸取血清，4℃下12000rpm离心15min，取上清即抗体血清，置入20℃冰箱内保存。

(6)兔血清抗体纯化：

①制备亲和层析柱

纯化原理：活化的琼脂糖凝胶通过偶联抗原蛋白的巯基，从而使抗原结合在固相载体上。

试剂：偶联Buffer(50mM tris、5Mm EDTA-NA)，pH＝8.5；Wash buffer(1×PBS320mM氯化钠)；

A.称取10mg的EGYPKAEV多肽(对照肽)，用2ml偶联Buffer溶解，蛋白则根据蛋白浓度取合适体积，总含量在10mg左右，即层析柱Ⅰ的材料。

称取10mg的EGYP(K-Me1)AEV多肽，用2ml偶联Buffer溶解，蛋白则根据蛋白浓度取合适体积，总含量在10mg左右，即层析柱Ⅱ的材料。

取2ml Sulfolink couping gel于上述层析柱Ⅰ、Ⅱ的材料中，将抗原加入层析柱于旋转培养器上旋转2-3小时，分别制成层析柱1及层析柱2；

②抗血清纯化

A.将层析柱静置在层析架上30分钟，连接恒流泵；平衡40ml 1*PBS流速2.0、30ml1×Gly、30ml 1×PBS将层析柱Ⅰ、Ⅱ内环境平衡到中性；

B.上样：血清样品中加入1/20 4M氯化钠，流速1.3-1.6，过层析柱1两遍；

C.洗涤：加入40ml Wash buffer；

D.收样：加入1×Gly，流速0.5-0.7，收集8管，每管2ml，共16ml；

E.层析柱Ⅰ收集完后，按照B-D的相同步骤过层析柱Ⅱ；

F.层析柱Ⅱ收集完后，加入过量酸将抗体洗脱干净，再用1×PBS平衡到中性；

G.将收集的抗体放入透析袋中，混匀后取30μl用于抗体浓度测定，其余放入1×PBS 50％甘油中透析浓缩过夜；然后放入灭菌的5ml冻存管中，-20℃保存。

实施例4：兔血清抗体的敏感性及特异性检测

1、包被

将100μl非甲基化EGYPKAEV的PBS复合物(对照肽)、100ul甲基化EGYP(K-Me1)AEV多肽链的PBS复合物分别稀释为浓度1μg/ml，分别滴加到1cm×1cm的PVDF膜(聚偏氟乙烯)上，于4℃过夜；

2、封闭

丢弃残留液体，加入5％脱脂奶粉(封闭液)200μl/孔，37℃下孵育60min；

3、洗涤

加洗涤液(TBST)250ul/孔，洗涤三次，每次放置5min；

4、加入一抗(即待测血清抗体，兔血清抗体)

丢弃残留液体，并依次加入不同稀释度的待测血清抗体150μl/孔，37℃放置120min；

(5)洗涤

加洗涤液(TBST)250μl/孔，洗涤三次,每次放置5min；

(6)加入酶标抗体(二抗)

将HRP标羊抗兔二抗1:10000稀释，加入150μl/孔，并于37℃下放置120min；

(7)洗涤

加洗涤液(TBST)250μl/孔，洗涤三次，每次放置5min；

(8)显色

加入ECL显色液(由Thermo公司提供)50μL/孔，按说明书进行显影；具体结果如图7所示。结果表明E17404兔血清抗体的特异性及敏感性较好。实施例5：使用anti-PD-L1K162me检测临床肺癌标本中的PD-L1第162位甲基化的水平

1、收集使用PD-L1单抗的病人的肺癌标本69例(其中对PD-L1单抗治疗敏感的病人有46例，不敏感的病人有23例)，上述肺癌标本是在上海市肺科医院医学伦理委员会批准的临床方案，并在书面知情同意的情况下收集的，经过PD-L1单抗治疗过的肺癌肿瘤病人的临床组织样品。

2、使用实施例3制备的特异性识别PD-L1的162位赖氨酸甲基化的抗体，以及PD-L1抗体(货号：13684；Cell Signaling Technology)，并委托百奥斯生物科技有限公司进行免疫荧光染色。

3、免疫荧光染色后，使用Image J软件分析每例肺癌标本中PD-L1蛋白及PD-L1第162位赖氨酸单甲基化的表达水平，并绘制ROC曲线。

如图8所示，ROC曲线结果表明：相比于单独使用PD-L1蛋白的表达水平，或相比于单独使用PD-L1蛋白甲基化的绝对表达水平，第162位赖氨酸甲基化的PD-L1蛋白的比例能够更好地预测PD-L1单抗治疗敏感性。

Claims (8)

1.检测人PD-L1蛋白第162位赖氨酸的甲基化修饰的试剂在制备用于预测接受抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体治疗的恶性肿瘤免疫治疗的敏感性的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品是特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品是含有特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体的检测试剂盒。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，预测恶性肿瘤免疫治疗敏感性的产品是用于PCR扩增特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的单克隆抗体的试剂盒，或是用于动物免疫获得特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，使用特异性识别人PD-L1蛋白第162位赖氨酸甲基化修饰的多克隆抗体或单克隆抗体，检测待测样本的人PD-L1蛋白中，第162位赖氨酸的甲基化修饰的人PD-L1蛋白表达所占的比例；通过设定比例的阈值，或肿瘤TPS或CPS评分方法，预测恶性肿瘤抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感性。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用设定比例的阈值预测时，如果超过阈值则预测对抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗不敏感，如果低于阈值则预测对抗PD-1或抗PD-L1免疫治疗敏感。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，第162位赖氨酸的甲基化修饰的人PD-L1蛋白表达所占比例的阈值为65%。

8.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法是：先合成用于模拟第162位赖氨酸甲基化的PD-L1蛋白的多肽，然后将多肽注射免疫动物进行免疫致敏，提取免疫动物的血清，收集、纯化血清中的多克隆抗体；所述单克隆抗体采用基因编辑技术制备获得。