CN105693863B - 抗融合蛋白cea576-669hsp70l1单克隆抗体3c1及其用途 - Google Patents

抗融合蛋白cea576-669hsp70l1单克隆抗体3c1及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体是一种抗融合蛋白CH的单克隆抗体3C1，产生该种抗体的杂交瘤细胞株，以及这种抗体的免疫检测用途。本发明还涉及单克隆抗体4E8和3C1在制备用于检测融合蛋白CH的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体4E8和3C1的试剂盒，以及应用此试剂盒在用于判断融合蛋白CH治疗CEA阳性肿瘤时的血清或体液浓度，应用单克隆抗体3C1检测CH融合基因修饰的免疫细胞、肿瘤细胞等哺乳动物细胞中的表达以及CEA阳性肿瘤的临床诊断。本发明所述单克隆抗体可与CH蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，具有CH蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

Description

抗融合蛋白CEA576-669HSP70L1单克隆抗体3C1及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，是一种抗融合蛋白 CEA576-669HSP70L1(CH)的单克隆抗体3C1，产生该种抗体的杂交瘤细胞株，以及这种抗体的免疫检测用途。
背景技术
热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)家族按照分子量可以分为四类：Hsp90 家族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子Hsp家族。HSP在细胞内发挥分子伴侣作用，在新生肽的正确折叠、转运以及对异常构象蛋白的降解中发挥重要作用(Kültz D.2005.Molecularand evolutionary basis of the cellular stress response. Annu.Rev.Physiol.67:225-257.)。此外，HSP蛋白及其相连的蛋白多肽在细胞处于应激的条件时，会以复合物的形式释放到细胞外。一些HSP，如GRP96, HSP70,HSP90，在细胞外具有免疫佐剂效应，能够刺激机体免疫细胞产生针对其结合的蛋白肽段的特异性免疫应答(Baker-LePain J.C.,M.Sarzotti,and C.V. Nicchitta.2004.Glucose-regulated protein 94/glycoprotein96elicits bystander activation of CD4+T cell Th1cytokine production invivo.J.Immunol.172: 4195-4203.Gong J.,Y.Zhang,J.Durfee,D.Weng,C.Liu,S.Koido,B.Song,V. Apostolopoulos,and S.K.Calderwood.2010.A heat shock protein 70-based vaccine with enhanced immunogenicity for clinical use.J.Immunol.184:488-496. Tanaka T.,K.Okuya,G.Kutomi,A.Takaya,T.Kajiwara,T.Kanaseki,T.Tsukahara, Y.Hirohashi,T.Torigoe,K.Hirata,Y.Okamoto,N.Sato,andY.Tamura.2015. Heat shock protein 90 targets a chaperoned peptide to thestatic early endosome for efficient cross-presentation by human dendriticcells.Cancer Sci.106:18-24.)。
HSP70L1是HSP70家族的一员，分子量约55kd。同HSP70类似，HSP70L1 在细胞外也具有免疫佐剂效应，尤其是能够刺激一类抗原提呈细胞-树突状细胞(dendritic cell,DC)产生炎性反应以及获得抗原提呈功能的成熟(Wan T.,X. Zhou,G.Chen,H.An,T.Chen,W.Zhang,S.Liu,Y.Jiang,F.Yang,Y.Wu,and X.Cao.2004.Novel heat shock proteinHsp70L1activates dendritic cells and acts as a Th1 polarizingadjuvant.Blood.103:1747-1754.)。本室制备的融合蛋白，癌胚抗原(CEA)的576-669段(CEA576-669)融合至HSP70L1的N端的融合蛋白能够诱导机体产生针对CEA的特异性免疫应答反应。因此融合蛋白CH可用于针对CEA阳性的肿瘤治疗(Wu Y.,T.Wan,X.Zhou,B.Wang,F.Yang,N.Li,G. Chen,S.Dai,S.Liu,M.Zhang,and X.Cao.2005.Hsp70-like protein1fusion protein enhances induction of carcinoembryonic antigen-specific CD8+CTL response by dendritic cell vaccine.Cancer Res.65:4947-4954.)。
我们新发现，编码融合蛋白(CH)的融合基因修饰的DC细胞也具有成熟 DC的特征，可以作为DC疫苗，诱导机体产生针对CEA的特异性免疫应答反应，因此也可以作为CEA阳性肿瘤的治疗性疫苗(中国专利申请 201010108973.9携带融合蛋白基因的重组腺病毒及其制备方法和应用)。令人感兴趣的是，CH融合基因修饰的一些肿瘤细胞，能够上调表达MHC-I分子，这暗示利用携带融合基因的表达载体，如重组腺病毒载体，进行基因治疗，一方面通过转染CH基因进入体内的抗原提呈细胞，如DC，诱导机体产生针对 CEA的特异性免疫应答；另一方面，通过转染CH基因进入肿瘤细胞，可以提升肿瘤细胞表达MHC-I分子的水平增加被CTL识别的可能性，也可以在不表达CEA的肿瘤细胞中引入CEA分子，从而使肿瘤细胞产生MHC-CEA来源表位肽，使其能够被CEA特异性的CTL识别，从而被杀伤清除，实现肿瘤免疫治疗的目的。
因此，无论将来使用融合蛋白CH进行免疫治疗、还是融合基因修饰的免疫细胞进行细胞治疗、以及携带融合基因的重组载体的基因治疗、都需要对血清、体液或者细胞中的融合蛋白CH进行免疫检测，因此，研制出一种结合特异性高的抗CH的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够具有高亲和力、特异性结合融合蛋白CEA576-669HSP70L1(CH)的单克隆抗体，及其在制备用于检测融合蛋白 CH的免疫检测工具中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种特异性结合融合蛋白CH的单克隆抗体4E8，是由保藏编号为CCTCC NO:C201612的杂交瘤细胞株分泌产生。
还提供了一种特异性结合融合蛋白CH的单克隆抗体3C1，是由保藏编号为CCTCCNO:C201626的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明的第二方面，提供了2株杂交瘤细胞株CH-4E8和CH-3C1，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC)，保藏日期为2016年1月28日，保藏编号分别为CCTCC NO:C201612和CCTCC NO:C201626。
本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
单抗的筛选与制备：采用融合蛋白CH(SEQ ID NO:1)免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CH特异性抗体的杂交瘤细胞，30株。其中2株(其一为4E8克隆株)的上清灵敏度达到0.1ng/孔(1ng/ml)，其余 28株的上清灵敏度达到1ng/孔(10ng/ml)(结果见表1)。
杂交瘤细胞分泌上清识别CH来源不同抗原特异性的鉴定：将上述杂交瘤细胞株的上清，分别与CEA576-669蛋白和HSP70L1蛋白作为抗原进行ELISA 检测，其中有6株上清不识别，其余24株识别CEA576-669蛋白。因此，初步判断有6株单抗识别的位点位于CH蛋白的HSP70L1段，24株单抗的识别位点位于CEA576-669段(结果见表2)。
本发明的第三方面，提供上述单克隆抗体4E8在制备检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒中的应用。
所述的试剂或试剂盒是Western Blot、免疫组化或ELISA检测试剂或试剂盒。所述的试剂或试剂盒是用于检测融合蛋白CH融合基因修饰的免疫细胞、肿瘤细胞或者其他哺乳动物细胞中融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒。
本发明提供了利用单克隆抗体4E8在制备用于检测细胞内CH蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为4E8单克隆抗体，或者荧光素以及其他偶联物偶联的4E8单克隆抗体。使用本发明单克隆抗体可以检测 CH融合基因修饰的细胞中，CH蛋白的表达、亚细胞定位等，可用于进一步研究CH在细胞内的功能(结果见图2、3)。
本发明的第四方面，提供上述单克隆抗体4E8在制备用于检测CEA阳性肿瘤的ELISA试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第五方面，提供上述单克隆抗体3C1在制备检测细胞内融合蛋白 CH表达的试剂或试剂盒中的应用。
优选的，在上述应用中所述的单克隆抗体3C1与单克隆抗体4E8合用。
本发明提供了利用两株单抗制备的ELISA试剂盒，用该试剂盒可以特异性的检测到CH，而与HSP70L1和CEA576-669无交叉反应，因此可用于将来血清、体液以及细胞中CH含量的检测。方法如下：在识别CH蛋白的杂交瘤中，选择识别不同抗原表位的单克隆株上清，即分别选择识别CEA576-669的上清和可能识别HSP70L1段的上清，进行配对。ELISA结果显示，特异性结合 CEA576-669蛋白克隆号为4E8的杂交瘤分泌的上清，与特异性结合HSP70L1蛋白的克隆号为3C1的杂交瘤上清，检测CH的灵敏度和特异性最好。分别制备这两株杂交瘤小鼠腹水，通过亲和层析柱分别纯化单抗4E8和3C1。将4E8 作为捕获抗体包被于酶标板，3C2作为检测抗体。通过验证，该对单抗制备成的ELISA试剂盒，特异性、灵敏度以及线性度都适合于将来的检测目的(结果见图1)。
本发明的第六方面，还提供了单克隆抗体3C1在制备检测细胞内HSP70L1 表达的试剂或试剂盒中的应用。可用于WB检测目的，与市售兔源多抗的效果一致。鉴于市售抗HSP70L1的检测抗体多为兔源多抗，3C1单抗无疑具有更好的特异性(结果见图4)。
所述的单克隆抗体3C1可以独立的用于检测细胞内HSP70L1的表达目的，采用免疫荧光、WB、或者免疫组化的方法。
所述的单克隆抗体3C1还可以联合其他抗肿瘤抗原的抗体用于检测融合了相应肿瘤抗原和HSP70L1的融合蛋白，方法采用疫荧光、WB、或者免疫组化。
本发明的第七方面，提供了上述杂交瘤细胞株CH-4E8或CH-3C1在制备检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒中的应用。所述的试剂或试剂盒是Western Blot、免疫组化或ELISA检测试剂或试剂盒。所述的试剂或试剂盒是用于检测融合蛋白CH融合基因修饰的免疫细胞、肿瘤细胞或者其他哺乳动物细胞中融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒。
本发明的第八方面，提供了上述杂交瘤细胞株CH-3C1在制备用于检测 CEA阳性肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第九方面，提供一种用于检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒中包括单克隆抗体3C1。
优选的，所述的试剂或试剂盒中还包括用于Western Blot、免疫组化或 ELISA检测的其他通用试剂。
优选的，所述的试剂或试剂盒中还包括单克隆抗体4E8。
本发明优点在于：
本发明所述针对CH蛋白的特异性单抗4E8和3C1，识别融合蛋白CH 中的不同表位，分别位于CH中CEA段和HSP70L1段，并且具有高亲和力和特异性，奠定了基于CH的免疫治疗、细胞治疗和基因治疗中用于CH检测的实验技术。此外，还建立了基于单抗4E8的免疫荧光技术，可用于基于CH 基因修饰哺乳动物细胞的鉴定和功能研究。此外，4E8是明确识别CEA576-669段，在目前市售的CEA鼠源单抗中，免疫原多CEA全长蛋白或者笼统的标明为内部片段，并没有确定位于本发明所述的CEA576-669段，因此4E8为CEA阳性肿瘤的诊断添加了一个新的检测工具。
本发明所述单克隆抗体可与CH蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，具有CH蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
生物材料样品的保藏信息：
1、抗人CH单克隆抗体杂交瘤细胞株4E8
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
地址：中国湖北省武汉市武汉大学
保藏日期：2016年1月28日
保藏编号：CCTCC NO:C201612
分类命名：杂交瘤细胞株CH-4E8
2、抗人CH单克隆抗体杂交瘤细胞株3C1
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
地址：中国湖北省武汉市武汉大学
保藏日期：2016年1月28日
保藏编号：CCTCC NO:C201626
分类命名：杂交瘤细胞株CH-3C1
附图说明
图1.单抗4E8和3C1配对制备的ELISA试剂盒检测CH、CEA576-669和 HSP70L1蛋白含量。
图2.单抗4E8检测在CH基因修饰人单核来源DC细胞中CH的表达。以不同来源杂交瘤克隆株上清作为一抗，对CH基因修饰人单核来源DC细胞进行胞内染色标记，FACS检测CH的表达。
图3.单抗4E8检测在CH基因修饰DC细胞中CH在细胞内的定位。利用4E8单抗、免疫荧光标记AdLacZ和AdCH转染的人单核来源DC，观察CH 在细胞内的表达、分布和亚细胞定位。
图4.单抗3C1检测细胞内天然存在的HSP70L1。采用4种不同细胞，分别为293T，MCF7，AdLacZ和AdCH转染的人单核来源DC，进行WB检测内源性HSP70L1的表达。上排，采用市售HSP70L1抗体(Abcam,兔源)，中排为3C1，下排为内参actin。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1抗CH单克隆抗体的制备
1、动物免疫：将纯化的CH重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，皮下免疫6-8 周龄BALB/c小鼠，剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，并选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取免疫的小鼠脾细胞悬液；以脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞1:5-1:10比例混合，滴加50％PEG(PH8.0)1ml，加入不完全培养基及终止液，离心弃上清后加入HAT培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述纯化的CH重组蛋白作为包被抗原进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性；挑取阳性值高的单克隆株，进行下一步鉴定。
实施例2杂交瘤上清的鉴定
将CH蛋白用pH8.3的包被液进行十倍倍比稀释，最高为100ng/ml，0.1ml/ 孔，包被于酶标板，4℃过夜。第二天，弃掉孔中上清，用含有0.1％吐温20 的磷酸盐洗液洗涤三遍；按照0.1ml/孔，加入5％脱脂牛奶37℃封闭2小时；弃掉封闭液；分别加入杂交瘤上清，阴性对照(含10％FCS的RPMI1640)，以及阳性对照(CH免疫的兔血清)，4℃过夜；洗液洗涤三遍；加入HRP偶联的二抗，37℃孵育1小时；洗液洗涤6遍；加入底物，显色，酶标仪检测。
结果显示(表1)，2株上清的灵敏度达到1ng/ml，其中一株为4E8；其余上清灵敏度达到1ng/孔(10ng/ml)。
表1：杂交瘤上清的结合CH的鉴定
实施例3杂交瘤上清识别抗原特异性的鉴定
将CEA576-669和CH蛋白分别用PH8.3的包被液进行稀释，100ng/ml，0.1ml/ 孔，包被于酶标板，4℃过夜。第二天，弃掉孔中上清，洗液洗涤三遍；按照0.1ml/孔，加入5％脱脂牛奶37℃封闭2小时；弃掉封闭液；分别加入杂交瘤上清，阴性对照(含10％FCS的RPMI1640)，以及阳性对照(CH免疫的兔血清)，4℃过夜；洗液洗涤三遍；加入HRP偶联的二抗，37℃孵育1小时；洗液洗涤6遍；加入底物，显色，酶标仪检测。
结果显示(表2)，6株上清不识别CEA576-669，其中一株为3C1；其余24 株上清识别CEA576-669，其中包含4E8。
表2：杂交瘤上清识别抗原特异性的鉴定
实施例4不同杂交瘤细胞株来源单抗配对ELISA试剂盒的制备
选取确定识别CH蛋白不同表位的2株细胞上清，即在6株不识别和24 株识别CEA576-669蛋白的各株中各选择一株的上清。其中一株作为捕获抗体，按照上述方法包被于酶标板，另一株上清作为检测抗体。如上述方法，以CH 为抗原，进行ELISA检测和筛选。结果显示，4E8作为捕获抗体，3C1作为检测抗体，检测到CH蛋白的灵敏度和特异性优于其他组合。
将这两株杂交瘤接种于预先一周前腹腔注射0.5ml降植烷、10-12周龄 Balb/c鼠的腹腔，细胞用量为5×106/只。待小鼠腹水积聚后、收集腹水，离心取上清，亲和层析法分别纯化单抗4E8和3C1。将4E8作为捕获抗体包被于酶标板，3C1作为检测抗体。分别以CH、HSP70L1和CEA576-669为抗原，倍比稀释，然后进行夹心ELISA检测。如图1结果显示，用4E8作为捕获抗体， 3C1作为检测抗体，在检测CH蛋白的灵敏度、特异性以及线性度都符合预期。
实施例5 4E8单抗检测CH基因修饰细胞中CH的表达
免疫磁珠法分离健康人来源的外周血单核细胞，在人重组GM-CSF (50ng/ml)+IL-4(10ng/ml)的诱导条件下培养5天，即为未成熟单核细胞来源DC。用携带融合基因CH的重组腺病毒(AdCH)转染的人未成熟单核细胞来源DC。转染浓度为MOI＝100，转染48小时后，即为CH基因修饰的DC (AdCH-DC)。
将上述细胞，用4％多聚甲醛固定15min，用0.1％saponin缓冲液分别配制 4E8和另3株来源的抗体，打孔并于4℃标记2小时。用不含抗体的0.1％saponin 缓冲液洗涤后，用0.1％saponin缓冲液配制抗小鼠FITC偶联的二抗，4℃标记 30min；然后上流式细胞仪检测。
如图2显示，与阴性对照比较，4E8标记的AdCH-DC可以检测到阳性信号；另3株来源单抗标记的AdCH-DC，不能检测到阳性信号，表明4E8可用于免疫荧光技术，检测CH基因修饰的细胞中CH的表达。
实施例6单抗4E8检测CH基因修饰DC细胞中CH的亚定位
如上述方法制备的(AdCH)转染的人未成熟单核细胞来源DC (AdCH-DC)，以携带LacZ基因的重组腺病毒(AdLacZ)转染的人未成熟单核细胞来源DC(AdLacZ-DC)为对照。转染浓度为MOI＝100，转染48小时。
将上述细胞用4％多聚甲醛固定15min，用0.1％saponin缓冲液配制4E8 抗体，打孔并于4℃标记2小时。用不含抗体的0.1％saponin缓冲液洗涤后，用0.1％saponin缓冲液配制抗小鼠FITC偶联的二抗，4℃标记30min；用 0.1％saponin缓冲液配制抗核糖体亚基RPL17的抗体，打孔并于4℃标记2小时。用不含抗体的0.1％saponin缓冲液洗涤后，用0.1％saponin缓冲液配制抗兔Tsred偶联的二抗，4℃标记30min；于终止标记前15分钟，加入DAPI。用不含抗体的0.1％saponin缓冲液洗涤后，细胞离心涂片，于共聚焦显微镜下观察。
结果如图3显示，4E8检测的CH特异性的表达在CH基因修饰的AdCH-DC 中，而在对照AdLacZ-DC中不表达；并且细胞内CH分布在胞浆，不分布在核内；在胞浆中，CH可以与核糖体共定位。
实施例7单抗3C1检测DC细胞中HSP70L1
如实施例5、6所述方法制备AdLacZ-DC和AdCH-DC。用市售的细胞裂解液分别裂解AdLacZ-DC和AdCH-DC，293T和MCF7细胞。按照标准WB 方法，分别用Abcam来源的兔源HSP70L1抗体、本发明3C1单抗进行内源性 HSP70L1表达的检测。如图4显示，3C1能够特异性的检测到HSP70L1的表达。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种特异性结合融合蛋白CH的单克隆抗体3C1，是由保藏编号为CCTCC NO:C201626的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.一种如权利要求1所述的单克隆抗体3C1在制备检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体3C1在制备检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的单克隆抗体3C1与单克隆抗体4E8合用，所述的单克隆抗体4E8，是由保藏编号为CCTCC NO:C201612的杂交瘤细胞株分泌产生。
4.一种如权利要求1所述的单克隆抗体3C1在制备检测细胞内HSP70L1表达的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO:C201626。
6.一种如权利要求5所述的杂交瘤细胞株在制备检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒中的应用。
7.一种用于检测细胞内融合蛋白CH表达的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中包括如权利要求1所述的单克隆抗体3C1。
8.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中还包括用于Western Blot、免疫组化或ELISA检测的其他通用试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中还包括单克隆抗体4E8，所述的单克隆抗体4E8，是由保藏编号为CCTCC NO:C201612的杂交瘤细胞株分泌产生。
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