CN105209489B

CN105209489B - 针对间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的特异性检测工具

Info

Publication number: CN105209489B
Application number: CN201480023572.XA
Authority: CN
Inventors: A·萨特里; 李书林
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2013-03-05
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2034-03-05
Also published as: EP2964672A1; US10329353B2; CN105209489A; EP2964672A4; JP2016512197A; JP6672383B2; US20160009812A1; JP2018138058A; WO2014138183A1; EP2964672B1

Abstract

本发明包括发现细胞表面波形蛋白作为从癌症患者的血液检测和分离间质和上皮‑间质转化的循环肿瘤细胞的新颖生物标志物。此外，提供一种对循环肿瘤细胞上的细胞表面波形蛋白的检测具有特异性的抗体以及所述抗体检测、计数和分离CTC的用途。

Description

针对间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的特异性检测工具

本申请要求2013年3月5日提交的美国临时申请号61/772,973的优先权权益，所述美国临时申请的整个内容以引用的方式并入本文。

文件名称“UTFCP1208WO_ST25.txt”中包含的3KB(如Microsoft Windows中所测量)且于2014年2月18日创建的序列表通过电子提交与此一起提交，并且以引用的方式并入本文。

发明背景

本发明根据由国立卫生研究院授予的资助号CA120295在政府资助下进行。政府享有本发明的某些权利。

1.发明领域

本发明大体上涉及癌症生物学的领域。更具体来说，它涉及计数和分离循环肿瘤细胞以有助于早期检测肿瘤、转移和复发。

2.相关技术的描述

转移是癌症相关死亡的主要原因。循环肿瘤细胞(CTC)被视为转移的种子，并且被定义为使它们自身从原发性肿瘤脱离进入血流中，并且朝向远端器官行进以定殖成转移瘤的罕见细胞(Pantel和Brakenh off,2004)。尽管在癌症疗法领域的近期进步能够牵制原发性癌症散布，但需要用于早期检测、诊断和治疗性监测转移性癌症的可靠生物标志物。癌症患者的外周血液中存在的CTC正作为用于早期检测和监测抗癌药物的治疗功效的有前途靶标而出现(Parkinson等,2012)。目前，用于检测CTC的可接受标志物包括EpCAM和细胞角蛋白(Parkinson等,2012)。然而，这些标志物可检测仅上皮CTC，从而排除已丧失EpCAM的表达的上皮-间质转化的(EMT)CTC(Sieuwerts等,2009)和源于间质肿瘤的任何其它非上皮CTC，所述间质肿瘤构成成人癌症类型的约10％以及儿科癌症类型的约20％(Mackall等,2002)。当前检测工具的这个局限性表明急切需要可满足这些要求的新颖工具。

发明概述

在一些实施方案中，本发明提供一种用于检测循环肿瘤细胞上的细胞表面波形蛋白的新颖抗体。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合波形蛋白多肽，并且其中所述抗体与84-1单克隆抗体竞争结合所述多肽。在某些方面，本发明的单克隆抗体可与84-1单克隆抗体结合相同表位。

在一个方面，本发明的单克隆抗体可包含与84-1的V_H CDR1(SEQ ID NO:3)至少80％同一的第一V_H CDR；与84-1的V_H CDR2(SEQ ID NO:4)至少80％同一的第二V_H CDR；与84-1的V_H CDR3(SEQ ID NO:5)至少80％同一的第三V_H CDR；与84-1的V_L CDR1(SEQ ID NO:6)至少80％同一的第一V_L CDR；与84-1的V_L CDR2(SEQ ID NO:7)至少80％同一的第二V_LCDR；和与84-1的V_L CDR3(SEQ ID NO:8)至少80％同一的第三V_L CDR。

在另一方面，本发明的单克隆抗体可包括与SEQ ID NO:3同一的第一V_H CDR；与SEQ ID NO:4同一的第二V_H CDR；与SEQ ID NO:5同一的第三V_H CDR；与SEQ ID NO:6同一的第一V_L CDR；与SEQ ID NO:7同一的第二V_L CDR；和与SEQ ID NO:8同一的第三V_L CDR。

在另一方面，本发明的单克隆抗体可包含与84-1的V_H结构域(SEQ ID NO:1)至少约80％同一的V_H结构域和与84-1的V_L结构域(SEQ ID NO:2)至少约80％同一的V_L结构域。在某一方面，本发明的单克隆抗体可包含与84-1的V_H结构域(SEQ ID NO:1)同一的V_H结构域和与84-1的V_L结构域(SEQ ID NO:2)同一的V_L结构域。在另外某一方面，本发明的单克隆抗体可为84-1抗体。

在一些方面，本文公开的单克隆抗体可为重组的。在一些方面，实施方案的单克隆抗体可为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在一些方面，本发明的单克隆抗体可为Fab'、F((ab')2、F((ab')3、单价scFv、二价scFV或单结构域抗体。在一些方面，本文单克隆抗体可为人抗体、人源化抗体或去免疫抗体。在某些方面，所述人源化或去免疫抗体可在人IgG(例如IgG1或IgG2)骨架上包含前述CDR。

在某些方面，实施方案的单克隆抗体可缀合于显像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。在某些方面，本文公开的单克隆抗体可包含在药学上可接受的载体中。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸分子，其包含编码本发明的单克隆抗体的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种重组多肽，其包含含有84-1的V_H结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:3、4和5)的抗体V_H结构域。在另一实施方案中，本发明提供一种重组多肽，其包含含有84-1的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:6、7和8)的抗体V_L结构域。在另一实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸分子，其包含编码包含含有84-1的V_H结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:3、4和5)的抗体V_H结构域和/或含有84-1的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:6、7和8)的抗体V_L结构域的多肽的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含一种或多种编码实施方案的单克隆抗体或重组蛋白的多核苷酸分子。在某些方面，宿主细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

在一个实施方案中，本发明提供一种制备抗体的方法，其包括在细胞中表达一种或多种编码本发明的抗体的V_L和V_H多肽链的多核苷酸分子，以及从所述细胞纯化所述抗体。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其中所述抗体包含与84-1的V_HCDR1(SEQ ID NO:3)至少80％同一的第一V_H CDR；与84-1的V_H CDR2(SEQ ID NO:4)至少80％同一的第二V_H CDR；与84-1的V_H CDR3(SEQ ID NO:5)至少80％同一的第三V_H CDR；与84-1的V_L CDR1(SEQ ID NO:6)至少80％同一的第一V_L CDR；与84-1的V_L CDR2(SEQ ID NO:7)至少80％同一的第二V_L CDR；和与84-1的V_L CDR3(SEQ ID NO:8)至少80％同一的第三V_L CDR。

在一个实施方案中，本发明提供一种特异性检测循环肿瘤细胞的方法，其包括(a)从患者获得血液样品，(b)使所述样品与结合细胞表面波形蛋白的抗体一起孵育，以及(c)检测所述抗体结合的细胞。在某些方面，结合细胞表面波形蛋白的抗体可为本文公开的抗体。在一些方面，抗体可为结合细胞表面波形蛋白的抗体样分子，如适体。在一些方面，检测抗体结合的细胞可包括使用流式细胞计量术、免疫组织化学、荧光显微术、放射免疫测定或ELISA。

在某些方面，方法可进一步包括在使样品与结合细胞表面波形蛋白的抗体一起孵育之前清除样品的CD45阳性细胞。在某些方面，方法可进一步包括通过使样品与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂一起孵育来增加细胞表面波形蛋白表达水平。在一些方面，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是原钒酸钠。在其它方面，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂可为迪憐他汀(dephostatin)、mpV(pic)、苯胂氧化物、葡萄糖酸锑钠、BAY U6751、酪氨酸磷酸酶抑制剂混合物(包括钒酸钠、钼酸钠、酒石酸钠和咪唑)或RK-682。

在某些方面，方法可进一步限定为一种分离活循环肿瘤细胞的方法，并且进一步包括从样品分离(c)的抗体结合的循环肿瘤细胞。在一些方面，分离可包括免疫磁性捕集、基于粘附的细胞分选、磁性激活细胞分选或荧光激活细胞分选(FACS)。在某些方面，方法可进一步包括为所分离的活循环肿瘤细胞基因分型。

在某些方面，方法可进一步包括使样品与EpCAM或细胞角蛋白抗体一起孵育。在某些方面，方法可进一步包括定量患者中循环肿瘤细胞的数目。在某些方面，血液样品来自先前尚未被诊断有癌症的患者，并且方法是早期癌症检测的方法。在另一方面，血液样品来自处于缓解中的患者，并且方法是检测复发的方法。在一些方面，每毫升血液检测到至少约3个循环肿瘤细胞指示患者具有肿瘤。在其它方面，每毫升血液检测到至少约1个或至少约2个循环肿瘤细胞指示患者具有肿瘤。

在某些方面，方法可为监测癌症患者中对疗法的响应的方法，其中如果循环肿瘤细胞的数目随时间降低，那么所述患者被称为已对疗法具有积极响应。在某些方面，方法可为预测方法，其中每毫升血液检测到至少约5个循环肿瘤细胞指示患者具有不良预后。在其它方面，方法可为预测方法，其中每毫升血液检测到至少约1个、至少约2个、至少约3个或至少约4个循环肿瘤细胞指示患者具有不良预后。

在某些方面，患者可具有上皮肿瘤。在其它方面，患者可具有间质肿瘤。在某些方面，肿瘤可包括乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，肿瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和白血病。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗根据本发明方法确定具有循环肿瘤细胞的患者的方法，所述方法包括施用有效量的本文公开的缀合抗体。在一些方面，缀合抗体可包含在药学上可接受的组合物中。

在一个方面，抗体可被全身性施用。在其它方面，抗体可被静脉内、皮内、肿瘤内、肌肉内、腹膜內、皮下或局部施用。方法可进一步包括向受试者施用至少第二抗癌疗法。第二抗癌疗法的实例包括但不限于手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

在其它方面，方法可进一步包括向受试者施用本发明组合物超过一次，例如像1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或大于20次。

在一个实施方案中，提供一种用于治疗受试者的癌症的包含本发明实施方案的抗体的组合物。受试者可已根据本发明实施方案的方法确定具有循环肿瘤细胞。在一些方面，受试者可为人。在一些方面，受试者可为非人哺乳动物。在一些方面，组合物可为药学上可接受的组合物。

在某些方面，受试者可具有上皮肿瘤。在其它方面，受试者可具有间质肿瘤。在其它方面，受试者可具有转移性肿瘤。在某些方面，肿瘤可包括乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，肿瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和白血病。

在一些方面，组合物可进一步包含至少一种其它抗癌剂，如化学治疗剂、放射冶疗剂、基因疗法或第二免疫治疗剂。在一些方面，组合物可被配制以供全身性、静脉内、皮内、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下或局部施用。

在一个实施方案中，本文提供本发明实施方案的抗体生产用于治疗受试者的癌症的药剂的用途，其中所述受试者已被确定包含循环肿瘤细胞。

某些实施方案涉及一种抗体或重组多肽组合物，其包含特异性结合细胞表面波形蛋白的分离的和/或重组抗体或多肽。在某些方面，抗体或多肽具有与任何本文提供的单克隆抗体的全部或一部分至少或至多80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一(或其中可导出的任何范围)的序列。在其它方面，分离的和/或重组抗体或多肽具有、具有至少、或具有至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或大于100个来自任何本文提供的序列或所述序列的组合的连续氨基酸。

在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含一个或多个具有任何本文公开的氨基酸序列的氨基酸区段。举例来说，抗体或多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个氨基酸区段，所述区段在长度方面包含约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25to 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个氨基酸，包括介于之间的所有值和范围，所述氨基酸与任何本文公开的氨基酸序列至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一。在某些方面，氨基区段选自如表7中提供的细胞表面波形蛋白结合抗体的氨基酸序列中的一个。

在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含具有任何本文公开的氨基酸序列的氨基酸区段，其中所述区段在本文提供的任何序列中的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200处开始，并且在同一提供的序列中的氨基酸位置4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25至25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200处结束。在某些方面，氨基区段或其部分选自如表7中提供的细胞表面波形蛋白结合抗体的氨基酸序列中的一个。

在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含与细胞表面波形蛋白结合抗体(如表7中所提供)的V、VJ、VDJ、D、DJ、J或CDR结构域至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一(或其中可导出的任何范围)的氨基酸区段。举例来说，多肽可包含1、2或3个与如表7中提供的细胞表面波形蛋白结合抗体的CDR 1、2和/或3至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一(或其中可导出的任何范围)的氨基酸区段。

在本发明的方法和/或组合物的情形下讨论的实施方案可关于本文所述的任何其它方法或组合物加以采用。因此，涉及一种方法或组合物的一实施方案可也应用于本发明的其它方法和组合物。

如本文在说明书中所用，“一”可意指一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求中所用，当连同措辞“包含”一起使用时，措辞“一”可意指一个(种)或超过一个(种)。

除非明确指示仅指代供选择物或供选择物是互相排斥的，否则在权利要求中使用术语“或”用于意指“和/或”，但本公开支持仅指代供选择物以及“和/或”的定义。如本文所用，“另外”可意指至少第二或第二以上。

在整篇本申请中，术语“约”用于指示值包括用于测定所述值的装置、方法的固有误差偏差或存在于研究受试者之间的偏差。

本发明的其它目标、特征和优势将根据以下详细描述而变得显而易知。然而，应了解尽管指示本发明的优选实施方案，但详细描述和特定实施例通过仅说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将根据这个详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。

附图简述

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参照这些附图中的一个或多个，结合本文呈现的特定实施方案的详细描述来更充分了解。

图1：分离和表征细胞表面波形蛋白(CSV)特异性抗体84-1。图1A：筛选抗体中的CSV特异性抗体的图示。使用流式细胞计量术以及针对癌特异性结合进行选择来分析来自不同杂交瘤上清液的各池单克隆抗体的CSV结合性。使用ELISA和蛋白质印迹表征所选抗体的波形蛋白结合性。图1B：使用流式细胞计量术对不同非上皮正常细胞系和癌细胞系中的CSV表达的免疫评估：CSV仅可在癌细胞系SKNBE-2(成神经细胞瘤)、从患者血液分离的AML细胞和LM7(骨肉瘤)细胞中检测，而非上皮正常细胞HUVEC、HFOB和PBMC是CSV表达阴性的。同种型对照用于阴性对照。图1C：使用流式细胞计量术对不同上皮正常细胞系和癌细胞系中的CSV的免疫评估：CSV仅可在癌细胞系MDA-MB-453(乳腺癌)、DLD-1(结肠癌)和HLM-6(肝癌)中检测，而正常上皮细胞系HEK-293、NCM-356和MCF-10A是CSV表达阴性的。图1D：使用共焦显微术对正常细胞系和癌细胞系中的CSV的细胞表面染色分析：将HLM-3(肝癌)和NCM-356(正常结肠)细胞进行CSV、WGA(细胞表面标志物)和核染剂DRAQ5染色。84-1结合指示与WGA共同定位的细胞表面波形蛋白，如由图的用白色箭头指示的放大部分所证实。比例尺指示10μm。图1E：使用流式细胞计量术对人原发性和转移性癌细胞中的CSV的免疫评估：对人原发性结肠癌(HPC1)和人肝转移性癌(HLM3)的分析指示相较于原发性HPC1细胞，CSV在HLM3上充分表达。图1F：使用共焦显微术于薄Geltrex涂布的孔上进行HPC1源性球体中的CSV检测：CSV可在球体周边的少数细胞中检测。核染剂DRAQ5用于界定细胞。比例尺指示20μm。

图2：使用84-1mAb分离和计数CTC的方法。图2A：84-1介导的CTC检测、分离、计数和分析的图示。图2B：使用荧光显微术检测外加至血液中的单细胞。使用连续稀释和斑点分析来分离单一LM8细胞，并且外加至1ml血液中。在RBC溶解之后，将单核细胞群体进行84-1mAb和AlexaFluor-488二级抗体染色以检测CSV阳性细胞。高倍放大显示检测到全血群体中的CSV阳性单细胞。图2C：从全血分离单细胞。使用基于EasySep的84-1阳性和CD45阴性选择来分离外加至全血中的单细胞。在37℃下孵育之后2小时，可在培养皿上观察到这个单细胞。图2D：使用针对CSV、CD45的抗体和核染剂DRAQ5来将从血液分离的细胞的显微照片共染色。比例尺指示10μm。图2E：从健康、原发性和转移性患者血液试样计数CSV阳性CTC。来自原发性癌症患者的血液用于选择检测阈值(虚线)。转移性癌症患者样品显示相比较来说较高CTC计数。

图3：分离的CTC的分子表征。图3A：对CTC和匹配白细胞中的KRAS的突变分析。CTC具有同质(中间图版)和异质密码子13突变(右侧图版)，而白细胞具有野生型序列(左侧图版)。图3B：对来自尤因肉瘤(EWS)和平滑肌肉瘤(LMS)样品的CTC的分析。使用CD99标志物验证EWS CTC，并且使用α-SMA染色验证LMS CTC。比例尺指示10μm。图3C：针对分子特异性标志物来对CTC的分析。针对上皮标志物EpCAM、EMT特异性调控子SLUG、和E-钙粘着蛋白将使用84-1mAb分离的CTC染色。比例尺指示10μm。图3D：对CTC的波形蛋白、β-连环蛋白和c-myc表达的分析。分离来自人结肠癌样品的CTC，并且进行总波形蛋白、β-连环蛋白、c-myc和核染剂DRAQ5染色，此指示患者样品中的β-连环蛋白和c-myc的完全核定位。比例尺指示10μm。图3E：原钒酸钠(SOV)对LM8和WBC的作用。LM8和WBC用SOV处理，并且使用共焦显微术分析CSV的表达。使细胞进行CSV、细胞表面标志物WGA和核染剂DRAQ5染色。明显的是当相较于未处理细胞的CSV表达时，用SOV处理癌细胞15分钟会增强CSV表达。未观察到SOV对WBC具有作用。图3F：对SOV对患者源性CTC的作用的分析。患者血液在溶解之后经受SOV处理，并且使用84-1和核染剂DRAQ5针对波形蛋白进行染色。SOV处理特定增强肿瘤细胞中CSV的表达。比例尺指示10μm。

图4：图4A：使用可商购获得的抗体对骨肉瘤细胞系LM7中的CSV的免疫评估。AMF-17B、EC-40、CS和V-9抗体用于使用流式细胞计量术来检测LM7细胞上的CSV，然而，使用这些抗体未观察到结合。图4B：使用流式细胞计量术对针对LM7骨肉瘤细胞系的CHP-TAMRA肽的免疫评估。CHP-TAMRA肽结合LM7细胞，从而指示在这些细胞上存在CSV。图4C：使用蛋白质印迹评估84-1和12-1与rhVim蛋白的结合。将10、100和1000ng rhVim装载于4-20％梯度凝胶上，并且进行蛋白质印迹。用84-1和12-1抗体探测印迹。观察到抗体对总波形蛋白具有极高亲和力。图4D：制备来自LM7细胞的细胞溶解产物，并且使用84-1和12-1抗体进行免疫沉淀并进行蛋白质印迹。用cell signaling抗体(兔源，以排除IgG条带)探测印迹。图4E：使用共焦显微术在癌细胞系中进行的细胞内和细胞外波形蛋白染色分析：使HLM-3(肝癌)细胞进行CSV、WGA和核染剂DRAQ5染色。非渗透化细胞中的84-1结合仅为膜所特有，而渗透化细胞显示总波形蛋白水平。比例尺指示20μm。

图5：图5A：使用免疫荧光成像评估来自人血液的PBMC群体的CSV染色。从人血液分离PBMC群体，并且连同84-1一起评估不同标志物(CD3e、CD11b和CD45)染色。在84-1抗体下，这些细胞不显示任何强烈免疫染色。比例尺指示10μm。图5B：使用共焦显微术对正常细胞系和癌细胞系的细胞内波形蛋白染色分析：将HLM-3(肝癌)和NCM-356(正常结肠)细胞进行CSV、WGA(细胞表面标志物)和核染剂DRAQ5染色。84-1结合指示相较于NCM-356细胞，波形蛋白仅存在于HLM3细胞中。比例尺指示10μm。图5C：使用流式细胞计量术对从骨肉瘤患者样品分离的细胞中的CSV的免疫评估：对OST-DL-391(无转移)和OST-DL-396A(向脑转移)的分析指示相较于OST-DL-391细胞的分数，OST-DL-396A的关于CSV的细胞分数增加。图5D：使用流式细胞计量术对人原发性和转移性癌细胞中的CSV的免疫评估：对人原发性结肠癌(HPC)和人肝转移性癌(HLM)的分析指示相较于原发性HPC1细胞，CSV在HLM3上充分表达。CPM-1代表从转移自结肠的肺癌分离的细胞，并且相较于原发性癌细胞的CSV显示CSV增加。图5E：使用共焦显微术于薄Geltrex涂布的孔上的HPC1源性球体中的波形蛋白和β-连环蛋白表达：在球体的周边的少数细胞中可检测到总波形蛋白，此与β-连环蛋白的核积累增加相关联。核染剂DRAQ5用于界定细胞。比例尺指示20μm。

图6：图6A：肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。评估从血液分离的单核群体的84-1、CD45和DRAQ5染色。CD45阳性免疫细胞与84-1阳性肿瘤细胞相互作用，如通过核的尺寸所确定。图6B和6C：对小鼠中的CTC的连续分析：用LM8(图6B)或CT-26(图6C)细胞植入小鼠。通过下颌下面颊放血方法来获得约200μl血液。在约每周间隔下获得样品直至小鼠由于肿瘤负担而被安乐死。左侧图版指示每周计数的CTC，以正常小鼠作为对照。显示图6B和6C的右侧图版上的代表性数据，其来自各自分别具有LM8或CT-26肿瘤的一只小鼠。此处表示的数据是在每周间隔下获得的CTC相对于肿瘤体积的图。图6D：使用针对CSV、CD45的抗体和核染剂DRAQ5来将从血液分离的细胞的显微照片共染色。比例尺指示10μm。图6E：分离和培养从LM8(上部图版)和CT-26(下部图版)分离的CTC，持续八天监测所述CTC的细胞集落形成。比例尺指示10μm。图6F：检测犬模型中的84-1阳性CTC。分离来自血液样品的CTC，并且通过亮视野和荧光显微术来分析。分离CTC，并且在96孔板上培养并获取亮视野图像。对于荧光成像，使CTC进行CSV、CD45和核染剂DRAQ5染色，并且通过共焦显微术来分析。使用钙黄绿素-AM染色来测试细胞活力。比例尺代表10μm。

图7：图7A：使从患者的血液分离的单核细胞进行84-1染色。可观察到这些细胞不同于血液中的PBMC群体。图7B：从CRC患者分离的CTC的细胞培养。在96孔板中在体外培养从结肠癌患者的血液分离的84-1+CTC，并且用于单细胞分析。图7C：通过流动式细胞测量分析进行的MDA-MB-46884-1分析。使MDA-MB-468细胞进行84-1染色，并且分析CSV结合阳性细胞分数。图7D：原钒酸钠(SOV)处理诱导CSV在LM7细胞上表达，如通过流式细胞计量术所目视观察。

图8：使用12-1抗体和DRAQ5(核染剂)针对细胞表面波形蛋白将使用12-1单克隆抗体提取的LM7细胞染色。比例尺指示10μm。

图9：比较使用84-1、CellSearch和84-1+CellSearch进行的乳腺癌CTC检测方法。来自各转移性乳腺癌患者的一管血液用于通过84-1方法(图9A)和CellSearch方法(图9B)来计数CTC。由84-1方法与CellSearch方法两者计算CTC的平均数(图9C)。将这些患者分类为稳定(对疗法响应)和进行性(不对疗法响应，显示肿瘤进展)群体。

图10：比较使用84-1和CellSearch进行的前列腺癌CTC检测方法。来自各前列腺癌患者的一管血液用于通过84-1方法和CellSearch方法来计数CTC。将这些患者分类为稳定(对疗法响应)和进行性(不对疗法响应，显示肿瘤进展)群体。

图11：抗体12-1强度图。数据定量继之以产生肽和强度图以及预染色(底部图)和主要测定(1:5000–中间图；1:1000–顶部图)的强度图，其中10aa肽在左侧，12aa肽在中间，并且15aa肽在右侧。

图12：抗体84-1强度图。数据定量继之以产生肽和强度图以及预染色(底部图)和主要测定(1:5000–中间图；1:1000–顶部图)的强度图，其中10aa肽在左侧，12aa肽在中间，并且15aa肽在右侧。

图13：组合抗体12-1和84-1强度图。比较小鼠单克隆抗体12-1(中间图)和84-1(顶部图)的强度图揭示两种样品具有显著类似性，其中10aa肽在左侧，12aa肽在中间，并且15aa肽在右侧。

图14：抗体12-1的MEME基序。

图15：抗体84-1的MEME基序。

说明性实施方案的描述

检测癌症患者的外周血液中的循环肿瘤细胞(CTC)正作为新颖工具而出现在对若干类型的转移性癌症的早期诊断和预测中。目前，CTC标志物限于上皮癌，并且不能检测非上皮(即间质)和上皮-间质转化的(EMT)癌细胞类型。在本文中，本发明者报道一种新颖癌细胞表面波形蛋白(CSV)特异性单克隆抗体84-1，其显示对非上皮和EMTCTC的高特异性和灵敏性(可从100万个血细胞检测1个CTC)。这使得84-1成为一种用于CTC检测和分离的理想工具。此外，本发明者也发现一种使用磷酸酶抑制剂刺激CTC上波形蛋白的细胞表面表达，从而增加检测和分离的效率的方法。CTC的检测和分子表征是转化癌症研究的一个最快速增长领域。利用本发明者的细胞表面标志物，本发明者可计数、分离和分析CTC以有助于早期检测肿瘤、转移和复发。同样，84-1是一种用于监测和评估个人化疗法在癌症患者中的效率的潜在工具。另外，使用84-1抗体分离的CTC可被详细研究，包括通过基因组测序来分子表征以检测任何突变，此将有助于开发特异性靶向疗法，这是个体化用药的最终目标。

本发明包括：A)发现细胞表面波形蛋白作为一种从癌症患者的血液检测和分离间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的新颖生物标志物；B)一种对循环肿瘤细胞上的细胞表面波形蛋白的检测具有特异性的抗体；以及C)特异性磷酸酶抑制剂增强/刺激CTC上的细胞表面波形蛋白的表达，从而增强部分B)中的抗体的检测能力的用途。

I.本发明抗体

在某些实施方案中，涵盖结合细胞表面波形蛋白的至少一部分以及特异性检测循环肿瘤细胞的表面上的波形蛋白的抗体或其片段，以及它在诊断和治疗疾病方面的相关用途。如本文所用，术语“抗体”意图广泛指代任何免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE以及保留抗原结合活性的包含抗体CDR结构域的多肽。抗体可选自由以下组成的组：嵌合抗体、亲和力成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或天然或合成配体。优选地，抗波形蛋白抗体是单克隆抗体或人源化抗体。通过已知手段以及如本文所述，可产生对细胞表面波形蛋白、它的一个或多个相应表位、或任何前述各物的缀合物具有特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段以及结合结构域和CDR(包括任何前述各物的工程化形式)，无论所述抗原或表位从天然来源分离或是天然化合物的合成衍生物或变体。

适于本发明的抗体片段的实例包括不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)由VH结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，即包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域由使两个结构域缔合以形成结合结构域的肽连接体连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；和(ix)双链抗体，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利申请公布20050214860)。可通过并入连接VH结构域和VL结构域的二硫桥来使Fv、scFv或双链抗体分子稳定。也可制备包含接合于CH3结构域的scFv的微抗体(Hu等,1996)。

抗体样结合肽模拟物也涵盖在实施方案中。Liu等(2003)描述“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是充当削减抗体，并且具有某些优势(血清半衰期较长以及合成方法的繁重性较小)的肽。也涵盖可用于检测CTC上的细胞表面波形蛋白的附加工具，包括适体(例如从DNA或RNA分子产生)、小肽和纳米粒子。

动物可用抗原，如6-His标志物的可溶性波形蛋白(NCBI登记号P08670，以引用的方式并入本文)接种以产生对波形蛋白具有特异性的抗体。常常，使抗原结合或缀合于另一分子以增强免疫应答。如本文所用，缀合物是结合于用于在动物中引发免疫应答的抗原的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质。在动物中应答于抗原接种产生的抗体包括由多种个别抗体产生性B淋巴细胞制得的多种非相同分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是其各自可识别相同抗原上的不同表位的抗体种类的混合群体。鉴于动物中多克隆抗体产生的恰当条件，所述动物的血清中的大多数抗体将识别所述动物已针对其加以免疫的抗原性化合物上的集合表位。通过亲和纯化来进一步增强这个特异性以仅选择识别目标抗原或表位的那些抗体。在针对波形蛋白的抗体的情况下，可通过测定与在它们的表面上表达或不表达波形蛋白的细胞的差异性结合来确定用于检测细胞表面波形蛋白的选择性。

单克隆抗体是单一种类的抗体，其中每个抗体分子都识别相同表位，因为所有抗体产生性细胞都源于单一B淋巴细胞细胞系。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常沿与用于制备多克隆抗体的那些品系相同的品系开始。在一些实施方案中，如小鼠和大鼠的啮齿动物用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是熟知的，并且可提供某些优势。小鼠(例如BALB/c小鼠)被常规使用，并且通常产生高百分比的稳定融合。

杂交瘤技术涉及使来自先前用波形蛋白抗原免疫的小鼠的单一B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。这个技术提供一种持续无限数目的世代来繁殖单一抗体产生性细胞，以使可产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同抗体(单克隆抗体)的方法。

在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如包含移植于异源非人、人、或人源化序列(例如框架和/或恒定结构域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。已开发用人来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，从而保持外来抗体的可变区完整的方法。或者，在关于人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。也已开发通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)氨基酸序列与人氨基酸序列两者的抗体可变结构域来使单克隆抗体的可变结构域转化成更似人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR源于小鼠单克隆抗体，而框架和恒定区源于人氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。据认为用见于人抗体的相应位置中的氨基酸序列替换抗体中是啮齿动物所特有的氨基酸序列将降低治疗使用期间不利免疫反应的可能性。也可使产生抗体的杂交瘤或其它细胞经受可或可不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性的遗传突变或其它变化。

用于在各种动物物种中产生多克隆抗体，以及用于产生各种类型(包括人源化、嵌合和完全人)的单克隆抗体的方法在本领域中是熟知以及高度可预测的。举例来说，以下美国专利和专利申请提供使得能够实现所述方法的描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。本文以及其中引用的所有专利、专利申请公布和其它出版物都据此以引用的方式并入本申请。

抗体可从任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物产生。优选地，抗体是羊类、鼠类(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。此外，更近期技术允许从人组合抗体文库开发和筛选人抗体。举例来说，噬菌体抗体表达技术允许在不存在动物免疫下产生特异性抗体，如以引用的方式并入本文的美国专利号6,946,546中所述。这些技术进一步描述于以下中：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等(1992)；Barbas等(1994)；以及Schier等(1996)。

充分预期的是无论抗体的动物物种、单克隆细胞系或其它来源如何，针对细胞表面波形蛋白的抗体都将能够结合CTC。某些动物物种用于产生治疗性抗体的优选性可较小，因为由于通过抗体的“Fc部分”使补体系统活化，它们可更可能导致过敏反应。然而，整个抗体可被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。移除Fc部分会降低抗原抗体片段将引发不合需要的免疫应答的可能性，并且因此，无Fc的抗体可优先用于防治性或治疗性治疗。如上所述，抗体也可被构建以致是嵌合的或部分或完全人性的，以便减轻或消除由向动物施用已在其它物种中产生或具有来自其它物种的序列的抗体所致的不利免疫后果。

取代性变体通常含有在蛋白质内的一个或多个位点处进行的一个氨基酸向另一氨基酸的交换，并且可被设计以在损失或不损失其它功能或性质下调节多肽的一种或多种性质。取代可为保守的，也就是说一个氨基酸被具有类似形状和电荷的一个氨基酸替换。保守性取代在本领域中是熟知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸向丝氨酸；精氨酸向赖氨酸；天冬酰胺向谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸向谷氨酸；半胱氨酸向丝氨酸；谷氨酰胺向天冬酰胺；谷氨酸向天冬氨酸；甘氨酸向脯氨酸；组氨酸向天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸向亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸向缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸向精氨酸；甲硫氨酸向亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸向酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸向苏氨酸；苏氨酸向丝氨酸；色氨酸向酪氨酸；酪氨酸向色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸向异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可为非保守的以使多肽的功能或活性受影响。非保守性变化通常涉及用化学相异残基取代残基，如极性或带电荷氨基酸取代非极性或不带电荷氨基酸，并且反之亦然。

蛋白质可为重组的，或在体外合成。或者，非重组或重组蛋白可从细菌分离。也预期含有所述变体的细菌可在组合物和方法中加以实施。因此，蛋白质无需被分离。

预期在组合物中，每ml存在介于约0.001mg与约10mg之间的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，组合物中的蛋白质的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或大于10.0mg/ml(或其中可导出的任何范围)。其中，约约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可为结合细胞表面波形蛋白的抗体。

可使抗体或优选是抗体的免疫部分化学缀合于其它蛋白质，或表达为与其它蛋白质的融合蛋白。出于本说明书和随附权利要求的目的，所有所述融合蛋白都被包括在对抗体或抗体的免疫部分的定义中。

实施方案提供连接于至少一种试剂以形成抗体缀合物或有效载荷的针对细胞表面波形蛋白、多肽和肽的抗体和抗体样分子。为增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，常规的是连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。所述分子或部分可为但不限于至少一种效应物或报道体分子。效应物分子包括具有所需活性，例如细胞毒性活性的分子。已连接于抗体的效应物分子的非限制性实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比来说，报道体分子被定义为可使用测定检测的任何部分。已被缀合于抗体的报道体分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色粒子或配体，如生物素。

用于使抗体连接或缀合于它的缀合部分的若干方法在本领域中是已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物复合物，其采用例如有机螯合剂，如二乙三胺五乙酸酐(DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6α-二苯基甘脲-3连接于抗体。也可使单克隆抗体与酶在如戊二醛或高碘酸盐的偶联剂存在下反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光素标志物的缀合物。

II.循环肿瘤细胞

可在任何适合样品类型中检测CTC。如本文所用，术语“样品”是指适于由本发明提供的方法的任何样品。样品可为包括适于检测的CTC的任何样品。样品的来源包括全血、骨髓、胸膜液、腹膜液、中枢脊髓液、尿、唾液和支气管洗涤液。在一个方面，样品是血液样品，包括例如全血或其任何部分或组分。适于与本发明一起使用的血液样品可从包括血细胞或其组分的任何已知来源，如静脉、动脉、外周、组织、索等提取。举例来说，可使用熟知和常规临床方法(例如用于抽取和处理全血的程序)获得并处理样品。在一个方面，示例性样品可为从具有癌症的受试者抽取的外周血液。

如本文所用的术语“癌症”包括本领域中熟知的多种癌症类型，包括但不限于发育不良、增生、实体肿瘤和造血性癌症。已知许多类型的癌症会转移以及脱落循环肿瘤细胞或具有转移性，例如由已转移的原发性癌症所致的继发性癌症。其它癌症可包括但不限于以下器官或系统：脑、心脏、肺、胃肠、泌尿生殖道、肝、骨、神经系统、妇科学、血液学、皮肤、乳房和肾上腺。其它类型的癌细胞包括神经胶质瘤(神经鞘瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤)、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、脑脊髓膜瘤、肾上腺皮质癌、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾癌、各种类型的血管癌、成骨性骨癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫平滑肌瘤、唾液腺癌、脉络丛癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和成巨核细胞性白血病；以及皮肤癌(包括恶性黑素瘤)、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、胎记发育不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、疤痕疙瘩、肉瘤(如纤维肉瘤或血管肉瘤)和黑素瘤。

检测的包括在CTC群体中的CTC的总数部分地取决于初始样品体积。在各个方面，检测广泛范围的初始样品体积中的CTC足以产生能够提供临床显著结果的检测CTC数目。因此，初始样品体积可小于约25μl、50μl、75μl、100μl、125μl、150μl、175μl、200μl、225μl、250μl、300μl、400μl、500μl、750μl、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml或大于约10ml。在一示例性方面，初始样品体积在约100与200μl之间。在另一示例性方面，如本文所述处理的样品包括大于约1、2、5、7、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或甚至1000个揭示的CTC。

如本文所用，分析包括允许直接或间接目视观察CTC，并且可在体内或离体执行的任何方法。举例来说，分析可包括但不限于离体显微或细胞测量检测和目视观察结合于固体基质的细胞、流式细胞计量术、荧光成像等。在一示例性方面，使用针对细胞表面波形蛋白的抗体检测CTC，并且随后结合于固体基质并使用显微或细胞测量检测来目视观察。

在另一实施方案中，通过通常用于富集样品的CTC的技术来捕集CTC，所述技术例如涉及免疫特异性相互作用的那些，如免疫磁性捕集。免疫磁性捕集，也称为免疫磁性细胞分离，通常涉及使针对见于特定细胞类型上的蛋白质的抗体连接于小顺磁性珠粒。当抗体涂布的珠粒与如血液的样品混合时，它们连接于并包围特定细胞。接着将样品放置在强磁场中，从而导致珠粒向一侧集结。在移除血液之后，捕集的细胞与珠粒一起被保留。这个一般性方法的许多变化形式在本领域中是熟知的，并且适用于分离CTC。

使用本发明方法检测、分离和表征CTC适用于评估癌症预后以及监测治疗功效以对可导致疾病复发的治疗失效进行早期检测。此外，根据本发明的CTC分析使得能够检测已完成疗程的症状发生前患者的早期复发。这是可能的，因为CTC的存在已与肿瘤进展和散布、对疗法的不良响应、疾病的复发、和/或历经某一时期的存活期降低相关联和/或相联系。因此，计数和表征CTC会提供关于基于对疗法的响应来预测初始风险和随后风险的基线特征将患者分层的方法。

如本文所用的术语“受试者”是指对其执行主题方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但如将由本领域人士所了解，受试者可为动物。因此，受试者的定义内包括其它动物，包括哺乳动物，如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括母牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。

因此，在另一实施方案中，本发明提供一种用于诊断或预测受试者的癌症的方法。可分析根据本文公开的方法分离的CTC以诊断或预测受试者的癌症。因此，本发明方法可例如用于评估癌症患者和癌症风险者。在任何本文所述的诊断或预测方法中，存在或不存在癌症的一种或多种指示(如癌细胞)或任何其它病症的一种或多种指示可用于产生诊断或预测。

在一个方面，从患者抽取血液样品，并且如本文所述检测CTC。使用本发明方法，测定血液样品中CTC的数目，并且可随后分析CTC。举例来说，细胞可用一种或多种结合细胞表面波形蛋白、细胞角蛋白或EpCAM的抗体标记，并且抗体可具有共价结合的荧光标记。可接着进行分析以测定样品中CTC的数目和特征，并且根据这个测量结果，可确定初始血液样品中存在的CTC的数目。可通过目视定量和表征CTC的细胞测量或显微技术来测定CTC的数目。

在各个方面，可以各种间隔历经特定时程对受试者的CTC数目和特征进行分析以评估受试者的进展和病理。举例来说，可在如一天、两天、三天、一周、两周、一个月、两个月、三个月、六个月或一年的定期间隔下进行分析以追踪随时间变化的CTC水平和特征。在患者存在癌症的情况下，这提供对疾病进展的有用指示，并且协助医学从业者基于CTC的增加、降低或缺乏变化进行适当治疗选择。CTC随时间的任何增加(无论是2倍、5倍、10倍或高于10倍)都降低患者的预后，并且是患者应改变疗法的早期指示。类似地，任何增加(无论是2倍、5倍、10倍或高于10倍)都指示患者应经受进一步测试(如成像)以进一步评估预后和对疗法的响应。CTC随时间的任何降低(无论是2倍、5倍、10倍或高于10倍)都显示疾病稳定化以及患者对疗法响应，并且是不改变疗法的指示。对于癌症风险者，检测的CTC的数目突然增加可提供患者已显现肿瘤的早期警告，从而提供早期诊断。在一个实施方案中，CTC的检测使癌症的分级增加。

在任何本文提供的方法中，也可进行其它分析以表征CTC来提供其它临床评估。举例来说，除图像分析和总体数目测量之外，也可采用PCR技术，如用对特定癌症标志物具有特异性的引物进行多路化以获得如CTC所源于的肿瘤的类型、转移状态和恶性程度的信息。另外，细胞尺寸、DNA或RNA分析、蛋白质组分析、或代谢组分析可作为一种评估关于对患者的癌症的表征的其它信息的手段来进行。

举例来说，其它分析可提供足以确定受试者对特定治疗方案的响应性，或确定候选药剂治疗癌症的有效性的数据。因此，本发明提供一种通过如本文所述检测/分离受试者的CTC以及分析所述CTC来确定所述受试者对特定治疗方案的响应性或确定候选药剂治疗癌症的有效性的方法。举例来说，一旦向患者施用药物治疗，即有可能使用本发明方法确定所述药物治疗的功效。举例来说，可使用本发明方法处理在药物治疗之前取从患者的样品以及一个或多个与药物治疗并行或在药物治疗之后取从患者的细胞样品。通过比较各处理样品的分析结果，可确定药物治疗的功效或患者对药剂的响应性。以这个方式，可早期鉴定失效化合物或可早期验证有前途化合物。

III.疾病治疗

本发明的某些方面可用于预防或治疗与循环肿瘤细胞相关的疾病或病症。可通过阻止CTC生长和组织定殖的任何适合药物来降低CRC的转移潜力。优选地，所述物质将包括抗细胞表面波形蛋白抗体。

“治疗(Treatment)”和“治疗(treating)”是指出于获得疾病或健康相关病状的治疗益处的目的向受试者施用或应用治疗剂或程序或模态对受试者的性能。举例来说，治疗可包括施用药学上有效量的抑制CTC生长和组织定殖的抗体。

如本申请整篇所用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指就对这个病状的医学治疗而论促进或增强受试者的健康的任何事物。这包括但不限于疾病的征象或症状的频率或严重性降低。举例来说，治疗癌症可涉及例如降低肿瘤的侵袭性，降低癌生长速率，或防止转移。治疗癌症也可涉及延长具有癌症的受试者的存活期。

A.药物制剂

当进行含有抗细胞表面波形蛋白抗体的治疗性组合物的临床应用时，将通常有益的是制备适于预定应用的药物组合物或治疗性组合物。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方案中，活性化合物可占单位的重量的约2％至约75％之间，或例如约25％至约60％之间，以及其中可导出的任何范围。

本发明的治疗性组合物有利地以呈液体溶液或混悬液形式的可注射组合物形式施用；也可制备适于在注射之前溶解或混悬于液体中的固体形式。这些制剂也可被乳化。

短语“药物或药理学上可接受”是指分子实体和组合物在向动物(适当时，如人)施用时不产生不利、过敏性或其它不适当反应。制备包含抗体或其它活性成分的药物组合物将为本领域技术人员鉴于本公开所知。此外，对于动物(例如人)施用，应了解制剂应满足如由FDA Office of Biological Standards所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如水、醇溶液/水溶液、盐水溶液、胃肠外媒介物，如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，如油酸乙酯)、分散介质、包覆剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂、所述类似物质及其组合，如将为本领域普通技术人员所知。根据熟知参数调整pH和药物组合物中各种组分的精确浓度。药学上可接受的载体被特别配制以向人施用，但在某些实施方案中，可合乎需要的是使用被配制以向非人动物施用，但将不可为向人施用所接受(例如由于政府规章)的药学上可接受的载体。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则预期它用于治疗性组合物或药物组合物中。

术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者中的物理离散单元，各单元含有被计算以产生以上联合它的施用(即适当途径和治疗方案)所讨论的所需响应的预定量的治疗性组合物。待施用的量(即根据治疗次数的量与单位剂量两者)取决于所需作用。向患者或受试者施用的本发明组合物的实际剂量可由身体和生理因素决定，所述因素如受试者的体重、年龄、健康状况和性别、所治疗的疾病的类型、疾病渗透的程度、先前或并行治疗干预、患者的特发病、施用途径、以及特定治疗性物质的效价、稳定性和毒性。举例来说，剂量也可包括每次施用每kg体重约1μg至约1000mg(这个所述范围包括间插剂量)或大于1000mg，以及其中可导出的任何范围。在可从本文所列的数值导出的范围的非限制性实例中，可施用每kg体重约5μg至约100mg、约5μg至约500mg等的范围。负责施用的从业者将在任何情况下确定组合物中活性成分的浓度和适于个别受试者的剂量。

活性化合物可被配制供胃肠外施用，例如配制供通过静脉内、肌肉内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，所述组合物可被制备成液体溶液或混悬液；也可制备适用于在注射之前在添加液体后制备溶液或混悬液的固体形式；并且制剂也可被乳化。

适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；和用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，形式都必须无菌，并且就它可易于注射而言必须是流体。它在生产和储存条件下也应是稳定的，并且必须防止如细菌和真菌的微生物的污染作用。

蛋白质组合物可被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)，并且其用无机酸(例如像盐酸或磷酸)或如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等的有机酸形成。用游离羧基形成的盐也可源于无机碱，例如像氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；以及如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。

药物组合物可包括溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合混合物和植物油。适当流动性可例如通过使用包覆剂(如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂加以维持。防止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来达成。在许多情况下，将优选的是包括等张剂，例如糖或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。

B.组合治疗

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及与第二或另一疗法组合的选择性结合CTC的针对细胞表面波形蛋白的抗体或抗体片段。所述疗法可应用于治疗与CTC相关的任何疾病。

方法和组合物(包括组合疗法)增强治疗或保护作用，和/或增加另一抗癌或抗过度增生疗法的治疗作用。治疗性和防治性方法和组合物可以有效实现所需作用，如杀灭CTC和/或防止转移的组合量提供。这个过程可涉及使细胞与抗体或抗体片段和第二疗法两者接触。可使组织、肿瘤或细胞与一种或多种包含一种或多种药剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的组合物或药理学制剂接触，或通过使所述组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌剂，或3)抗体或抗体片段与抗癌剂两者。此外，预期所述组合疗法可连同化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法一起使用。

术语“接触”和“暴露”在应用于细胞时在本文中用于描述治疗性构建体和化学治疗剂或放射冶疗剂被递送至靶标细胞中或被与所述靶标细胞直接邻近放置所依的过程。为实现细胞杀灭，例如以有效杀灭细胞或防止它分裂的组合量向细胞递送两种药剂。

相对于抗癌治疗，抗细胞表面波形蛋白抗体可在之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可处于在并行至数分钟至数天至数周的范围内的间隔下。在其中抗体或抗体片段与抗癌剂分开向患者提供的实施方案中，将通常确保有效时期在各次递送的时间之间不期满，以使两种化合物将仍然能够对患者施加有利组合作用。在所述情况下，预期可在彼此的约12至24或72小时内，并且更具体来说在彼此的约6-12小时内提供患者以抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可合乎需要的是显著延长治疗时期，其中在相应施用之间有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)时间推移。

在某些实施方案中，疗程将持续1-90天或大于90天(这个所述范围包括间插天数)。预期一种药剂可在第1天至第90天(这个所述范围包括间插天数)中的任一天或其任何组合给与，并且另一药剂在第1天至第90天(这个所述范围包括间插天数)中的任一天或其任何组合给与。在单一天(24小时时期)内，患者可被给与一次或多次药剂施用。此外，在疗程之后，预期存在一段不施用抗癌治疗的时期。视患者的状况，如它们的预后、力量、健康状况等而定，这个时期可持续1-7天和/或1-5周和/或1-12个月或大于12个月(这个所述范围包括间插天数)。预期必要时将重复治疗循环。

可采用各种组合。对于以下实施例，抗体疗法是“A”，而抗癌疗法是“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

向患者施用本发明的任何化合物或疗法都将在考虑药剂的毒性(如果有的话)下遵循用于施用所述化合物的一般性方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。

IV.实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解随后实施例中公开的技术代表由本发明者发现在实施本发明方面良好地起作用的技术，并且因此可被视为构成它的优选实施模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应了解可在不脱离本发明的精神和范围下，在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍然会获得相似或类似结果。

实施例1–材料和方法

细胞系。DLD-1、GEO和HUVEC细胞从Lee Ellis博士(MD Anderson Cancer Center)获得。LM7、SAOS-2、K7、K7M3、LM-8和DUNN细胞由Eugenie S Kleinerman博士(MD AndersonCancer Center)友情提供。HOS、MG-263、OS-D、OS-O和OS-25细胞由Dennis Hughes博士(MDAnderson Cancer Center)友情提供。SNU398、HEP3B和SNU 449细胞由Lopa Mishra博士(MDAnderson Cancer Center)友情提供。SKNAS、SKNBE2、SK-N-SH、NGP、CHP134、SH-SY5Y、LAN5和KCN细胞由Patrick Zweidler-McKay博士(MD Anderson Cancer Center)友情提供。用于这个研究中的所有其它细胞系都从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA,USA)获得。来自骨肉瘤患者的原发性细胞培养物由Dina Lev博士(MD Anderson Cancer Center)友情提供。根据ATCC推荐使所有细胞系生长。使无特定推荐的细胞系在具有10％胎牛血清(FBS)(Gibco,Invitrogen)、1％L-谷氨酰胺(Gibco,Invitrogen)和0.1％青霉素/链霉素(Gibco,Invitrogen)的DMEM-F12(Sigma Aldrich)中生长。除非直至指定，否则所有细胞都在37℃下于5％CO₂孵育器中维持。在具有10％热失活FBS、1％L-谷氨酰胺、100μg/mLPrimocin(Invivogen)和0.1％青霉素/链霉素的DMEM/F-12培养基中培养从人结肠癌、肝癌、肺癌和骨癌获得的原发性培养物。

在纤维结合蛋白涂布的板(Thermo Fisher)上于具有10％热失活血清(Invitrogen)并补充有生长因子的DMEM/F-12培养基中培养使用84-1抗体分离的CTC。在补充10ng/mL人表皮生长因子(hEGF)(Cell Signaling)和胰岛素生长因子(hIGF)(R&DSystems)下培养从骨肉瘤患者分离的CTC。在补充10ng/mL人EGF、IGF和碱性成纤细胞生长因子(hFGF2)下培养从结肠癌和肝患者分离的CTC。在以上提及的具有表皮生长因子、胰岛素生长因子和成纤细胞生长因子(Cell Signaling)的培养基中培养从犬和小鼠血液分离的CTC。每四天更换一次培养基。所有细胞都在37℃下于5％CO₂孵育器中维持。

Geltrex薄层方法。使HPC-1细胞在Geltrex生长因子降低的基底膜基质(Invitrogen)上生长，所述基质是从Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤纯化的可溶性形式的基底膜，其在37℃下胶凝，从而形成提供细胞培养的基质的重构基底膜。Geltrex的主要组分包括各种生长因子和层粘连蛋白(laminin)、胶原蛋白IV、巢蛋白(entactin)。根据生产商推荐，在冰上解冻Geltrex，并且100μL Geltrex用于在涂铺细胞之前1小时涂布Lab Tek腔室载片(Thermo)。稍后，以薄凝胶涂布在腔室载片上涂铺于100μL具有2％Geltrex的冷无血清DMEM/F-12培养基中的1000个HPC-1细胞。使细胞在37℃下在含5％CO₂的空气的含湿气氛围中生长，并且通过显微镜观察球体的形成。

血液收集和处理。对于小鼠样品，使用下颌下面颊放血方法从小鼠收集血液，并且在每周追踪研究期间在给定时间将200μL血液收集在EDTA管(Fisher)中。在研究结束时，使用左心室穿刺方法收集至少800μL血液。接着根据生产商推荐，使用RBC溶解缓冲液(eBioscience)，使收集的血液经受RBC溶解。接着于PBS中洗涤细胞，并且用于进一步分析。

根据IRB方案，在MD Anderson Cancer Center，在知情同意之后获得供CTC分析的人血液样品。使用CPT真空采血管(BD Bioscience)，在任何给定血液抽取时获得最多8mL血液。从Gulf Coast血液中心获得健康血液样品。根据生产商推荐分离单核细胞。接着于PBS中洗涤细胞，并且用于进一步分析。

从Gulf Coast兽医诊所获得来自犬的血液样品。选择提交至Gulf Coast兽医诊所的私有狗用于研究。除已在组织学上确认赘生疾病之外，纳入准则也包括不存在外显性心脏、肾或其它危急生命的疾病。通过获得彻底既往病史、身体检查、完全血细胞计数、血清生物化学剖析、尿分析、心电图、胸部放射照片(三视转移检查)和腹部超声(如果指示)来对狗分级。对于肿瘤类型的确认，在麻醉下通过手术获得来从原发性肿瘤的切除活检体，并且放置在10％中性缓冲福尔马林中。在固定之后，切割组织，用石蜡包埋，切片，粘着于载片，用苏木精和曙红染色，盖片，并且由委员会认证的兽医学病理学家评估。

抗体产生。具有6-His的重组人波形蛋白(rhVim)(R&D Systems)用作用于产生抗体的抗原。使用ELISA测定来测定抗波形蛋白滴度。简要来说，rhVim用作ELISA中的固体抗原。在用rhVim涂布的ELISA孔中孵育连续两倍稀释的血清2小时。在洗涤以及与过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG抗体一起孵育之后，进行显色反应，并且用邻亚苯基-二胺(OPD)来分析。在较低稀释度下显示较高O.D.的抗体被考虑用于进一步筛选。使选择用于筛选的抗体与细胞表面上具有以及不具有波形蛋白的骨肉瘤细胞系一起孵育。选择并进一步分析对CSV具有极高亲和力的抗体。84-1是可用于以高亲和力和灵敏性检测细胞表面波形蛋白的最佳克隆。接着通过ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学分析和免疫组织化学来进一步表征这个抗体的波形蛋白结合性。也表征抗体12-1对CTC的检测和分离。

84-1阳性细胞选择。首先在生产商推荐下使用EasySep^TM人CD45清除试剂盒来清除CD45阳性细胞。其次，使CD45-ve细胞部分经受84-1阳性选择。简要来说，细胞用84-1抗体标记，并且稍后添加小鼠IgG结合微珠粒至混合物中。接着使用来自Miltenyi Biotec的磁性柱提取84-1+ve细胞。从而获得的细胞是84-1阳性的以及CD45阴性的，并且准备好供进一步分析。

流式细胞计量术。通过胰蛋白酶处理来使50万个细胞脱离，洗涤，并且在冰上在黑暗中染色20分钟。对于CSV分析，细胞用84-1mAb(1:100)染色，并且用作小鼠初级抗体的同种型对照(Invitrogen)。稍后，将细胞于PBS中冲洗两次，并且使用AlexaFluor-405、AlexaFluor-488和AlexaFluor-555二级抗体(Invitrogen)进行二级抗体标记。接着于PBS中洗涤细胞两次，并且立刻用于使用Attune流式细胞仪(Applied Biosystems)来获取数据。计数10至50,000个细胞以供分析。稍后使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。使用由FlowJo软件提供的算法测量平均荧光强度，并且稍后评估CSV在表面上的存在。或者，使用针对CSV的84-1抗体和CD45抗体，使在RBC溶解之后获得的细胞经受双重染色。使用抗体捕集Abc珠粒(Invitrogen)补充样品。在CSV阳性门控和CD45阴性门控下绘制点图以计数给定样品中的CTC。同种型对照用于门控未染色和非特异性染色细胞。使用Attune流式细胞仪分析整个细胞群体的CTC，并且使用FlowJo软件进行分析。

显微术图像捕集和分析。如上所述使每个腔室总计5,000个细胞在Lab-Tek 8孔permanox腔室载片(Thermo Scientific,Rochester,NY,USA)上生长。对于细胞表面染色，使用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，用PBS(pH 7.4)洗涤，于10％胎牛血清(FCS)(Gibco,Invitrogen)中阻断1小时，并且在4℃下进行相应初级抗体(1:100)标记过夜。接着于PBS(pH 7.4)中冲洗细胞，并且使用针对相应初级抗体的Alexafluor-488和Alexafluor-555二级抗体(1:250)(Invitrogen)进行染色。

对于核染色，持续60分钟连同二级抗体一起并入DRAQ5(Cell Signaling)(1:500)。WGA(Invitrogen)在1:1000下用于使细胞表面染色5分钟。细胞接着用PBS(pH 7.4)(3×15分钟)洗涤，并且封装在Slowfade抗淬灭剂(Invitrogen)中。对于细胞内染色，如上所述固定细胞，用PBS(pH 7.4)洗涤，并且于PBS(pH 7.4)/0.2％NP40(Sigma Aldrich)中加以渗透化20分钟。如上所述进行阻断、初级抗体和二级抗体孵育以及封装。对于使3D培养球体染色，利用以上细胞外和细胞内染色方法，其中将初级抗体的孵育时间修改为36小时，并且将二级抗体的孵育时间修改为4小时。

对于在体内标记细胞，在RBC溶解之后获得的总细胞混合物于PBS(pH 7.4)中洗涤两次，并且使用84-1抗体在冰上标记20分钟，接着于PBS(pH 7.4)中洗涤染色的细胞两次，并且用针对84-1的二级抗体Alexafluor-488染色20分钟，并且在于PBS(pH 7.4)中洗涤两次之后，将细胞涂铺在培养皿上，并且在Jenco落射荧光倒置显微镜下目视观察Alexafluor-488阳性细胞并使用提供的软件获得图片。仅高强度绿色荧光细胞被考虑供分析。通过细胞外加测定来确认这个测定的灵敏性。对于活细胞成像，使激光强度保持在为获得图像所需的最低限度以使光致漂白和光毒性最小。或者，在CD45清除之后，使用相应抗体将细胞进行84-1和CD45(AbCAM)染色，并且使用Cytofuge(Iris)涂铺在玻璃载片上，并且使用共焦显微术分析84-1+和CD45-细胞。

对于共焦分析，用Zeiss LSM 510共焦显微镜，使用LSM 53.2图像捕集和分析软件(Zeiss)以8位获取图像。以数字变焦利用63×水浸物镜(NA，1.0)进行图像捕集。所有图像都由同一使用者使用相同强度和光检测器增益获取以允许定量比较不同样品之间的相对免疫反应性水平。

外加测定。为证明由84-1抗体达成的捕集精确度和可重现性，向从未处理小鼠收集的血液中外加培养的癌细胞。对于精确度证明，一式三份向1mL全血中外加～5、～25和～50个K7M3、K7、LM8和DUNN。对于细胞计数，收集培养基中的细胞，接着连续稀释以获得所需计数，其接着在显微镜下以一系列5μL斑点加以确认。在其中观察到较低/较高数目的细胞的情况下，进行计算以混合并获得为被外加所需的必要细胞计数。一式三份进行外加实验以确保方法的灵敏性和特异性。对于阴性对照，向血液中外加CSV阴性细胞，并且关于阳性选择进行分析。

突变分析。使用REPLI-g小型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)从少数CTC细胞或单细胞进行全基因组扩增。简要来说，通过在微型离心管中添加3μl缓冲液D2来溶解于4μl PBS中的细胞材料，并且在65℃下孵育10分钟。遵循生产商推荐，在相同管中进行全基因组扩增。通过用各引物进行的PCR来测试不同染色体上的所得DNA的品质。1:10稀释扩增的DNA的等分试样，并且随后用于PCR分析。对于基因突变检测，高保真DNA聚合酶(NEB,Ipswich,MA)用于针对特定突变位点扩增特定基因片段。用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)对PCR产物进行凝胶纯化，并且由MDA测序和微阵列机构(MDAnderson Cancer Center)进行Sanger测序。

标志物分析。针对特定标志物的抗体用于各类型的癌症：CD99(Abcam)、α-SMA(Abcam)、CD-31(eBioscience)和EpCAM、Slug、E-钙粘着蛋白、β-连环蛋白、c-myc(Cellsignaling)。

蛋白质印迹和免疫沉淀。将重组人波形蛋白(rhVim)(R&DSystems)装载于三个不同泳道(1、10和1000ng)中，并且使用SDS凝胶分离并转移于聚偏二氟乙烯膜上。通过使用84-1抗体(1:1000)孵育膜来检测rhVim。二级山羊抗小鼠IgG:HRP(辣根过氧化物酶)(Promega)用于检测84-1抗体。对于免疫沉淀，使用免疫沉淀缓冲液(Thermo Scientific)溶解LM7细胞，并且使用84-1和12-1抗体使波形蛋白免疫沉淀。小鼠IgG用作对照抗体。使用兔单克隆抗波形蛋白抗体(Cell Signaling)对免疫沉淀进行印迹。

原钒酸钠处理。使涂铺在8孔腔室载片上的LM8细胞和混悬WBC经受原钒酸钠(SOV)(100μM)或作为对照的PBS处理。在孵育18小时之后，接着处理细胞以使用用于细胞外染色的上述方法进行免疫荧光染色。对于流动式细胞测量检测，细胞于6孔板中用SOV(100μM)或作为对照的PBS处理。在过夜孵育之后，处理细胞以如上所述进行流动式细胞测量分析。对于人血液试样，从CPT管获得的单核细胞用SOV(100μM)或对照PBS处理15分钟。接着使用细胞外染色方法，使细胞直接经受免疫荧光染色。

动物研究。根据NIH指导方针供养5只6至8周龄C3H和Balb/c(NCI)小鼠。所有动物方案都已由在德克萨斯大学MD安德森癌症中心(University of Texas MD AndersonCancer Center)的机构动物护理和使用委员会审阅并核准。根据机构要求舍饲小鼠。LM8和CT-26癌细胞系用于体内接种，并且在具有10％FBS和0.1％青霉素/链霉素的DMEM/F-12中维持。从培养板解离汇合的CT-26和LM8细胞，并且将1×10⁵个细胞混悬于15μL PBS中供骨内(i.o.)接种。通过向右侧胫骨中直接插入27规格1/2英寸针胰岛素注射器(BDBioscience)，接着下压注射器上的柱塞来进行骨内接种。每周以如上提及的血液收集来测量肿瘤体积。下颌下放血方法用于从小鼠重复收集血液，此举的侵袭性最小。利用这个方法，收集200μL血液样品供分析CTC。不管肿瘤的存在性如何，在这些血液样品中的任一个中都不可检测到正常上皮或间质细胞。在优化测定和血液收集途径之后，计数植入有LM8和CT-26细胞的肿瘤的小鼠中的CTC。

实施例2–作为一种新颖通用循环肿瘤细胞标志物的细胞表面波形蛋白

波形蛋白过度表达常与EMT相关(综述于Satelli和Li,2011中)，所述EMT是其中细胞通过从上皮表型转变成间质表型而获得递增的侵袭和转移潜力的过程。对从癌症患者分离的CTC的单细胞剖析指示当相较于确定细胞系时波形蛋白转录物过度表达(Powell等,2012)，从而指示这些CTC中可能存在EMT表型；然而，波形蛋白在正常间质细胞(包括大多数白血细胞(WBC))中的细胞内表达限制它用作CTC标志物。包括本发明者的小组的若干小组先前已报道对癌细胞表面上的波形蛋白的检测(Satelli和Li,2011；Cutrera等,2011；Huet等,2006)。不同于细胞内波形蛋白，细胞表面波形蛋白(CSV)表达主要与癌细胞相关，并且见于上皮癌与间质癌两者中。因此，本发明者假设CSV充当CTC的潜在标志物。然而，由于CSV结合肽的限制以及特异性结合CSV的商业抗体的不可用性(图4A)，本发明者旨在产生CSV特异性单克隆抗体。鉴于此，本发明者设计一种分离仅结合癌细胞而排除正常细胞的CSV特异性抗体的策略(图1A)。简要来说，产生许多针对全长人波形蛋白(NCBI：NP_003371.2)的杂交瘤克隆，并且利用流式细胞计量术，通过靶向显示阳性结合CSV特异性肽的骨肉瘤(LM7)细胞系上的CSV来筛选结合CSV的抗体(图4B)。对于阴性结合，利用正常细胞系HFOB和NCM-356。利用这个策略，本发明者从特异性结合波形蛋白的杂交瘤84-1鉴定单克隆抗体(表7)或其细胞表面波形蛋白结合片段。使用蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光(图4C、4D和4E)进一步确认84-1对波形蛋白的特异性。

不同上皮、非上皮癌和正常细胞系的细胞表面筛选指示波形蛋白仅存在于癌细胞的表面上(图1A和1B)。重要的是，尽管先前已报道巨噬细胞、内皮细胞、嗜中性白细胞、血小板和凋亡T淋巴细胞会表达CSV(Moisan和Girard,2006；Bhattacharya等,2009；Mor-Vaknin等,2003)，但这个表达几乎不可通过84-1来检测(图5A)，从而指示84-1对癌CSV具有特异性。

本发明者已测试一定范围的源于乳房、膀胱、脑、结肠、肝、肺、胰腺、皮肤组织和血液的癌细胞系，其显示表达CSV的不同细胞群体(表1)。对人肝转移性细胞(HLM-3)的免疫细胞化学分析指示细胞表面上存在波形蛋白(图1D)，其与细胞表面标志物麦胚凝集素(WGA)共同定位，并且在正常结肠上皮细胞(NCM-356)中不可检测。渗透这些细胞指示细胞质波形蛋白仅存在于HLM-3细胞中，而NCM-356细胞是阴性的(图5B)。对从人骨肉瘤患者样品产生的原发性癌细胞系的分析(图5C)显示CSV在转移性细胞系中表达，而原发性细胞系是阴性的(表2)。进一步分析从人结肠和转移性肝(来自结肠)组织分离的癌细胞的CSV显示相较于原发性结肠癌样品，肝转移性样品中的表达极高(图1E和5D)，从而表明CSV可充当转移性癌细胞的潜在生物标志物。尽管原发性结肠癌细胞显示较低表达CSV的细胞亚型，但有可能这些细胞具有脱落进入血液循环中以向远端器官散布的侵袭性/转移性表型。这个假设由在3D球体模型中在球体的周边存在CSV阳性细胞(图1F)支持，从而表明这些细胞可能具有更具侵略性和侵袭性的表型，此由代表这些细胞的侵袭性表型的β-连环蛋白的递增核积累支持(Brabletz等,2005)(图5E)。

基于在一定范围的具有上皮来源的癌细胞系与具有非上皮来源的癌细胞系两者中均检测到CSV，本发明者假设它可充当检测CTC的生物标志物。为测试这个假设，本发明者测试对充分表征的小鼠转移性LM8细胞的检测，所述细胞被外加至7.5mL血液中，并且经受使用84-1抗体进行的免疫荧光染色(于图2A中图示)。根据显微照片，明显的是利用荧光显微术，可在全血中检测单细胞(图2B)。利用用84-1缀合的珠粒进行的磁性分离，本发明者也能够从全血分离单细胞(图2C)，并且在培养皿中对它进行目视观察，从而表明分离出活细胞。此外，使用共焦成像进一步表征分离的细胞，并且基于核的尺寸(>8μm)以及CSV染色阳性和CD45(一种白细胞标志物)染色阴性确认为癌细胞(图2D)。在罕见情况下，本发明者观察到肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用(图6A)。本发明者使用84-1染色阳性的HLM3和LM7细胞进一步评估84-1抗体的灵敏性和特异性(表5)。结果指示抗体在检测CTC方面的极高灵敏性和～100％特异性。使用另一分离的细胞表面波形蛋白结合抗体12-1进行额外外加测定(表6)。结果指示抗体在检测CTC方面的极高特异性和约40％灵敏性。此外，使用12-1抗体和DRAQ5(核染剂)针对细胞表面波形蛋白将使用12-1抗体得到的LM7细胞提取物染色(图8)。

通过体内研究进一步确证使用84-1进行的外加测定，其中本发明者利用LM8骨肉瘤细胞(对于非上皮模型)和CT26结肠癌细胞(对于上皮模型)。历经一段时期监测这些小鼠的CTC变化(图6B和6C)，并且在研究结束时，分离细胞并在培养皿中培养(图6D)，并且确认CSV+、CD45-和大核(图6E)。本发明者也利用p53突变小鼠的自发性肿瘤模型，所述小鼠显示在历经一段时期自发显现的不同类型的肿瘤中存在CTC(表4)。此外，本发明者测试具有自发性肿瘤的犬的血液中的CTC，并且引起关注的是84-1能够检测这个模型中的CTC，此由CD45阴性和CSV阳性确认，并且基于核的尺寸(图6F)。

因为84-1抗体以高特异性检测血液中的外加细胞和CTC，所以本发明者使用荧光成像测试来自健康志愿者、非上皮癌(包括骨肉瘤、平滑肌肉瘤、未鉴定的多形态肉瘤(UPS))和上皮癌(包括结肠癌和肝癌)的人血液样品的CTC(表3)，并且成功鉴定CTC。在健康血液样品中不可检测CTC。总之，相较于原发性癌样品，在转移性癌症患者样品中观察到CTC计数增加，从而指示可能检测到高度转移性CTC(图2E)。在磁性分离84-1+CD45-细胞之前，在荧光显微镜下也目视观察到来自结肠癌患者的CTC(图7A)。使用磁性珠粒分离的84-1+CD45-细胞持续数周具有活力，因此使得我们能够使用FISH和突变分析进一步分析这些细胞，从而确认它们作为癌细胞的身份(图7B)。通过突变分析来表征单细胞的肿瘤表型。对于这个分析，使用从结肠癌患者样品分离的CTC。CTC中KRAS(v-Ki-ras2柯尔斯顿(Kirsten)大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物)的突变分析指示CTC具体来说在密码子13上具有KRAS突变，而分离的CD45+细胞用作具有野生型KRAS基因的对照(图3A)。引起关注的是注意到尽管原发性肿瘤在密码子12上具有KRAS突变，但CTC关于密码子13上的突变被测试为阳性。先前研究已报道在检测从同一患者分离的CTC中的KRAS突变方面的异质性(Gasch等,2012)。此外，视KRAS状态来对具有转移性结肠直肠癌的患者的临床表征指示密码子13突变的转移性结肠直肠癌代表一种更具侵略性和侵袭性疾病，其常在临床疾病的最初表现时与局部和远端转移相关联(Modest等,2011)。此外，对结肠直肠癌中的骨髓转移和原发性肿瘤中的KRAS突变的分析指示相较于原发性肿瘤中的密码子12突变，密码子13突变处于散播的细胞中，从而突出CTC的异质性质(Tortola等,2001)。因此，这些结果指示结肠直肠癌中具有侵略性表型和转移性潜力的CTC的潜在突变热点标志物。对于间质肿瘤CTC，接着通过利用给定肿瘤的特异性标志物来验证从血液分离的84-1+CTC；CD99用作尤因肉瘤CTC的标志物，并且α-SMA用于平滑肌肉瘤(图3B)。有理由用一组大规模群体进行未来试验以抽取CSV阳性CTC与临床结果之间的任何关联。

Sieuwarts等(2009)先前已报道MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞是正常乳房样癌细胞，并且被表征具有侵袭性表型，但显示会逃脱EpCAM介导的检测。引起关注的是，可利用流式细胞计量术，使用本发明者的抗体检测这些细胞(图7C)，从而表明对可能已经受EMT的EpCAM阴性CTC的检测。因为我们的抗体能够从结肠癌患者样品检测CTC，所以本发明者想要测试这些细胞是否已经受EMT，并且因此由于CSV表达递增而可易于检测。使用共焦显微术测试分离的84-1+CD45-CTC的EpCAM、E-钙粘着蛋白、波形蛋白和Slug免疫荧光标记(图3C)。结果指示这些CTC已丧失EpCAM的表达，所述EpCAM是癌细胞的上皮表型的标志物。然而，进一步表征内部波形蛋白确认它们从上皮表型转变成间质表型。这个转变由Slug(EMT的转录调控子)的表达和膜E-钙粘着蛋白(上皮表型的标志物)的下调确认。EpCAM和E-钙粘着蛋白的下调伴随波形蛋白和Slug的表达增加指示CTC的EMT性质。显示Slug过度表达是结肠直肠癌患者的不良存活期的非依赖性预后参数(Shioiri等,2006)。此外，本发明者检测到在分离的CTC的核中存在β-连环蛋白(图3D)，此是活性EMT细胞的指示(Brabletz等,2001)。C-Myc在核中积累进一步提供β-连环蛋白进入核的证据(图3D)。总之，这些结果确认使用84-1抗体从造成现存CTC检测技术中的主要缺点的上皮癌细胞分离EMT CTC。

因为波形蛋白在上皮癌的细胞表面上的表达取决于癌细胞的时期，即EMT时期，所以本发明者想要使用特定试剂测试它们是否可诱导波形蛋白在癌细胞的表面上的表达。先前报道已表明波形蛋白易位至细胞表面依赖于磷酸化(综述于Satelli和Li,2011中)。本发明者假设抑制特定磷酸酶将增加波形蛋白的磷酸化，从而增加CSV表达。为测试这个假设，本发明者使用原钒酸钠(SOV)，即抑制特定磷酸酶并增加癌细胞中的CSV表达的抑制剂(图3E，中间图版)；然而，正常白细胞的CSV不存在变化(图3E下部图版)。此外，用SOV处理的LM7细胞显示CSV增加，从而增强以高得多的效率检测CSV(图7D)。此外，本发明者测试SOV对人结肠癌血液试样的作用，此明确指示CSV增加，如可通过荧光显微术所检测(图3F)。因此，SOV可用作CSV加强剂，从而增加CTC的产量，这是检测CTC的主要要求。因此，这些结果表明SOV可作为加强剂用于增强CTC中的CSV表达。

CTC检测在临床中已获得许多动力，并且正应用于治疗环境中；然而，关于使用现存技术检测CTC的效率的不确定性要求发现用于CTC的可增加检测效率，并且作为有价值的工具来有助于在患者中进行的治疗评估的新颖标志物。在本文中，本发明者报道在非上皮细胞类型与EMT细胞类型两者的CTC的细胞表面上均存在波形蛋白。在CTC中进行CSV检测提供超过基于现存标志物的检测技术的若干优势。首先，因为文献中不存在对存在用于检测间质肿瘤源性CTC的特定标志物的报道，所以使用CSV作为一种特异性标志物突出它超过使用标志物的组合的优越优势。其次，能够从上皮肿瘤检测EMTCTC使市场上现存CTC检测技术的检测能力增强。第三，不仅从人，而且也从犬和小鼠模型分离活CTC供进一步分子表征突出它作为临床研究工具的使用。

总之，本发明者发现一种CSV特异性单克隆抗体84-1，其不仅帮助检测，而且也帮助分离来自上皮癌与非上皮癌两者的活CTC，所述活CTC可用于进一步分析。通过CellSearch、Magsweeper、CTC芯片和其它技术来计数CTC已使CTC领域发生变革。然而，利用这些工具进行检测需要可进一步有助于检测广泛多种癌症中的CTC的强力生物标志物。因为，已知EMT转化的细胞会逃脱通过利用EpCAM和细胞角蛋白作为主要标志物的工具进行的检测，所以与84-1组合可增加这些方法的灵敏性和可靠性。单独(对于间质癌)或连同现存标志物一起(对于EMT癌)利用这个抗体，各技术在CTC检测方面可高效得多，所述CTC检测可改进对这些转移性前体子群体的了解，并且也有助于基于治疗监测来提供新颖诊断、治疗和预后选项。

实施例3–针对波形蛋白的小鼠单克隆抗体12-1和84-1的表位定位

以肽-肽重叠9、11和14个aa将波形蛋白序列翻译成10、12和15个氨基酸(aa)的肽。将各肽点样于肽阵列芯片上。所得肽微阵列含有1,406个呈双份形式(2812个肽斑点)的不同肽，并且由Flag和HA对照肽(各自116个斑点)加以框定。

在标准缓冲液中预膨胀10分钟之后，在室温下用二级山羊抗小鼠IgG(H+L)DyLight680抗体在1:5000的稀释度下对肽阵列进行预染色60分钟以探究与可干扰测定的抗原源性肽的背景相互作用。在扫描强度7下，未观察到与波形蛋白源性肽的显著背景相互作用。

随后在孵育缓冲液(PBS，pH 7.4，具有0.05％吐温20和10％Rockland阻断缓冲液)中孵育肽阵列与1μg/ml的浓度的小鼠单克隆抗体12-1和84-1，继之以用二级山羊抗小鼠IgG(H+L)DyLight680抗体(1:5000)染色，并且使用LI-COR Odyssey成像系统在扫描强度7下读出。由于高强度和复杂染色样式(特别在抗体84-1下)，在0.2μg/ml的较低浓度的抗体下重复测定。尽管染色样式的总体强度降低，但斑点样式的背景和复杂性都不降低。未鉴定出由一行连续相邻肽以对各种肽长度的明确依赖性形成的表位样斑点样式。随后，通过相应对照抗体来染色Flag和HA对照。

用分析器进行斑点强度定量和肽注释。软件算法将各斑点的荧光强度分解成原始、前景和背景信号，并且计算前景中值强度的标准偏差。基于平均前景中值强度，产生强度图，并且肽图中的结合剂由强度色码加以突出。

将用二级抗体预染色以及用针对从N末端至C末端的波形蛋白序列的各小鼠抗体进行的主要测定的平均斑点强度绘图以目视观察总体斑点强度和信噪比。使强度图与肽和强度图以及与对微阵列扫描的目视检查相关联以鉴定与抗体样品相互作用的共有基序和独特肽。

根据微阵列扫描和强度图，观察到归因于抗体12-1(图11)和抗体84-1(图12)的强烈交叉反应性的复杂和嘈杂响应而无明确表位样样式。比较小鼠单克隆抗体12-1(1ug/mL)和84-1(0.2ug/mL)的强度图揭示两个样品具有显著类似性(图13)。两种抗体均明显展现类似交叉反应性，其中抗体84-1的斑点强度近似加倍，并且不存在由具有重叠共有基序的相邻肽形成的表位样斑点样式。

对两种抗体的可能原始基序和氨基酸偏好的鉴定由MEME套件(基于基序的序列分析工具)支持(图14和15)。对于MEME分析，选择各测定的前100名肽，并且确定仅两个氨基酸的最小基序长度。所得E值对应于具有给定对数似然比(或更高)，以及具有将见于一组类似大小的随机序列中的相同宽度和位点计数的共有基序的统计显著性。E值1将被预期针对偶然鉴定一组随机肽中的某一基序；E值递减与统计显著性递增相关联。

MEME分析以顶尖基序xLQE[LE]E[DM]R和极高统计显著性强调两种抗体12-1和84-1的显著类似性。样品显示对酸性氨基酸D和E以及对疏水性氨基酸M、F、A以及特别是L的明确偏好。MEME分析进一步指示在疏水性氨基酸L与酸性氨基酸D或E之间的具有一个氨基酸的优选间隔子。基于此，存在若干可能的子基序，包括LQE、QEL、QEE、QE[xx]E[xx]R、E[x]E[M]R、L[x]E和xLxExxD。

实施例4–检测来自癌症患者的血液中的CTC

为测试检测乳腺癌患者的血液中的CTC的能力，从62名具有转移性乳腺癌的患者获得两管血液(各自7.5mL)。各自一个管用于通过84-1方法(图9A)和CellSearch方法(图9B)来计数CTC。由84-1方法与CellSearch方法两者计算CTC的平均数以产生组合方法平均值(图9C)。将患者分类为稳定(对疗法响应)和进行性(不对疗法响应，显示肿瘤进展)群体。计算各方法的检测灵敏性和特异性：84-1(分别83.3％和95％)、CellSearch(分别50％和85％)以及组合方法平均值(分别83.3％和95％)。

为测试检测前列腺癌患者的血液中的CTC的能力，从21名具有转移性前列腺癌的患者获得两管血液(各自7.5mL)。各自一个管用于通过84-1方法和CellSearch方法来计数CTC(图10)。将患者分类为稳定(对疗法响应)和进行性(不对疗法响应，显示肿瘤进展)群体。计算各方法的检测灵敏性：84-1(95％)和CellSearch(50％)。由于可用标本数受限，所以未计算检测特异性。

表1.不同细胞系中的细胞表面波形蛋白表达。

(H)：人，(M)：小鼠。使用流式细胞计量分析，通过测量CSV的平均荧光强度来对细胞表面波形蛋白评分。“-”：不可检测，“+、++、+++”：相较于同种型对照<2、<4、>4倍存在。

表2.在原发性骨肉瘤细胞系中的细胞表面波形蛋白(CSV)评估。

细胞系	疾病变体	转移	CSV
				OST-DL-390	骨肉瘤	否	-
OST-DL-391	骨肉瘤	是向肺	+
				OST-DL-393	骨肉瘤	是向肺	+
OST-DL-396a	骨肉瘤	是向脑	++
				OST-DL-399	骨肉瘤	否	-

MFI：平均荧光强度

(-)无MFI变化，(+)<2倍MFI增加，(++)>2倍MFI增加

表3.不同癌症患者样品中的CTC计数。

LN：淋巴结，HCC：肝细胞癌，LI：淋巴管侵袭，化学：化学疗法，XRT：外部放射疗法，UPS：未鉴定的多形态肉瘤，*：基于活细胞成像的检测。

表4.具有自发性肿瘤的小鼠中的CTC计数。

小鼠编号	疾病变体	转移	CTC/mL
				DD554	正常	否	0
DD616	淋巴瘤	否	0
				DD596#3	乳腺淋巴瘤	否	0
DD705	胸腺	否	0
				DD732	骨肉瘤	否	1
DD674	肉瘤	否	1

DD729	胸腺	否	1
				DD446	肝肿瘤	是向淋巴结	2
DD60	肠	否	2
				DD753	骨肉瘤	否	3
DD2992	肝肿瘤	否	4
				DD596#77	卵巢	否	7
DD701	胸腺	是向肝	7
				DD636	胸腺	是向肝	9
DD637	胸腺	是向肝	9
				DD730	胸腺	是向肺	31
DD43	骨肉瘤	是向肺	45
				DD592	骨肉瘤	是向肺	56
DD470	骨肉瘤	是向肺	80
				DD93	肠	是	154
DD493	血管肉瘤	是向肝、肺	175
				DD596#4	骨肉瘤	是向肺	258

表5.使用外加分析评估84-1灵敏性和特异性。

表6.使用外加分析评估12-1灵敏性和特异性。

方法	PBMC	外加	提取	背景
					12-1牵拉	10×10<sup>6</sup>	5	2	0
12-1牵拉	10×10<sup>6</sup>	5	1	0
					12-1牵拉	10×10<sup>6</sup>	5	2	0

表7.84-1的VH和VL CDR区。

* * *

本文公开和要求保护的所有方法都可参考本公开内容而无过度实验下进行和执行。尽管本发明的组合物和方法已就优选实施方案加以描述，但将对本领域技术人员明显的是可在不脱离本发明的构思、精神和范围下对本文所述的方法以及在方法的步骤方面或在步骤的顺序方面应用变化。更具体来说，将明显的是在化学与生理两方面均相关的某些试剂可替代本文所述的试剂，同时将获得相同或类似结果。对本领域技术人员明显的所有这种类似替代物和调整都被视为在随附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。

参考文献

以下参考文献在它们提供补充本文阐述的那些细节的示例性程序细节或其它细节的程度上以引用的方式明确并入本文。

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Claims

1.结合细胞表面波形蛋白的抗体在制备用于在获自患者的离体血液样品中选择性检测转移性活循环肿瘤细胞的产品中的应用，其中所述抗体包含：

(a) 如SEQ ID NO: 3所示的第一V_H CDR；

(b) 如SEQ ID NO: 4所示的第二V_H CDR；

(c) 如SEQ ID NO: 5所示的第三V_H CDR；

(d) 如SEQ ID NO: 6所示的第一V_L CDR；

(e) 如SEQ ID NO: 7所示的第二V_L CDR；和

(f) 如SEQ ID NO: 8所示的第三V_L CDR。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述选择性检测转移性活循环肿瘤细胞包括：

(a) 孵育从患者事先获得的血液样品与所述结合细胞表面波形蛋白的抗体；以及

(b) 检测所述抗体结合的细胞，从而选择性检测转移性活循环肿瘤细胞。

3.结合细胞表面波形蛋白的抗体在制备用于从获自患者离体血液样品中分离转移性活循环肿瘤细胞的产品中的应用，其中所述抗体包含：

(a) 如SEQ ID NO: 3所示的第一V_H CDR；

(b) 如SEQ ID NO: 4所示的第二V_H CDR；

(c) 如SEQ ID NO: 5所示的第三V_H CDR；

(d) 如SEQ ID NO: 6所示的第一V_L CDR；

(e) 如SEQ ID NO: 7所示的第二V_L CDR；和

(f) 如SEQ ID NO: 8所示的第三V_L CDR。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述分离转移性活循环肿瘤细胞包括：

(a)孵育从患者事先获得的血液样品与所述结合细胞表面波形蛋白的抗体；以及

(b)分离与所述抗体结合的细胞，由此分离转移性活循环肿瘤细胞。

5.如权利要求2所述的应用，其中所述选择性检测转移性活循环肿瘤细胞进一步包括：

(i)在所述孵育所述样品与所述结合细胞表面波形蛋白的抗体之前清除所述样品的CD45阳性细胞；

(ii)将所述样品与EpCAM或细胞角蛋白抗体一起孵育；

(iii)使用流式细胞计量术、免疫组织化学、荧光显微术、放射免疫测定或ELISA来检测所述抗体结合的细胞；或

(iv)通过使所述样品与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂一起孵育来增加细胞表面波形蛋白表达水平。

6.如权利要求4所述的应用，其中所述分离转移性活循环肿瘤细胞进一步包括：

(i)在所述孵育所述样品与所述结合细胞表面波形蛋白的抗体之前清除所述样品的CD45阳性细胞;

(ii)将所述样品与EpCAM或细胞角蛋白抗体一起孵育;

(iii)使用流式细胞计量术、免疫组织化学、荧光显微术、放射免疫测定或ELISA来检测所述抗体结合的细胞;

(iv)通过使所述样品与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂一起孵育来增加细胞表面波形蛋白表达水平；或

(v)为所分离的转移性活循环肿瘤细胞基因分型。

7.如权利要求3所述的应用，其中分离包括免疫磁性捕集、基于粘附的细胞分选、磁性激活细胞分选或荧光激活细胞分选FACS。

8.如权利要求5或6所述的应用，其中所述蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是原钒酸钠、迪憐他汀、mpV、苯胂氧化物、葡萄糖酸锑钠、BAY U6751、酪氨酸磷酸酶抑制剂混合物和RK-682，其中所述酪氨酸磷酸酶抑制剂混合物包括钒酸钠、钼酸钠、酒石酸钠和咪唑。

9.如权利要求1或3所述的应用，其中所述患者具有上皮肿瘤或间质肿瘤。

10.一种分离的抗体，其中所述抗体包含：

(a) 如SEQ ID NO: 3所示的第一V_H CDR；

(b) 如SEQ ID NO: 4所示的第二V_H CDR；

(c) 如SEQ ID NO: 5所示的第三V_H CDR；

(d) 如SEQ ID NO: 6所示的第一V_L CDR；

(e) 如SEQ ID NO: 7所示的第二V_L CDR；和

(f) 如SEQ ID NO: 8所示的第三V_L CDR。

11.如权利要求10所述的抗体，其中，所述抗体包含于组合物中，且在所述组合物中，所述抗体包含在药学上可接受的载体中。