CN110142068B - 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 - Google Patents
一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110142068B CN110142068B CN201910506559.4A CN201910506559A CN110142068B CN 110142068 B CN110142068 B CN 110142068B CN 201910506559 A CN201910506559 A CN 201910506559A CN 110142068 B CN110142068 B CN 110142068B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- epithelial
- microfluidic
- ctcs
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 210000005266 circulating tumour cell Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 127
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 48
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 32
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 29
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 29
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 29
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 22
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 17
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 16
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 claims description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 10
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 10
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 16
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 10
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 10
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 9
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 9
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 7
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 4
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000003087 receptor blocking agent Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
- B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
- B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
- B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
Abstract
本发明公开了一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及上皮间质混合型PD‑L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，该试剂盒，包括试剂盒盒体以及试剂盒盒盖，试剂盒盒体内壁紧贴有保温隔水层，试剂盒盒体内底部设有冷盒，冷盒上设置有底座，底座内设置有多个放置槽和多个放置孔，多个放置槽内设置有螺旋样品室和微流控芯片，多个放置孔内设置有多个试剂瓶，多个试剂瓶形成试剂瓶组。该试剂盒设计组合合理、使用存放节约、运输方便的可以直接用于常温环境使用保存与运输，确保了上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒中的试剂耗材组合用于上皮型、上皮间质混合型与间质型的CTCs富集捕获与检测过程的有效性。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒以及上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测领域，具体涉及一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及上皮间质混合型PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。CTCs主要是由上皮型CTCs、上皮间质混合型CTCs和间质型CTCs亚群组成的异质性种群。
肿瘤转移扩散是导致癌症进展与相关死亡的主要原因。CTCs在肿瘤形成远端转移的过程中扮演着重要的角色。恶性肿瘤患者血液中若含有较多数量的CTCs，则预示着预后不良与肿瘤转移的概率增加。CTCs诱发的肿瘤转移主要涉及上皮间质转化（Epithelial toMesenchymal Transition，EMT）与间质上皮转化（Mesenchymal to EpithelialTransition，MET）两个动态过程，其中EMT过程涉及肿瘤细胞从原发灶脱落入血形成具有转移侵袭性的上皮间质混合型CTCs，MET过程参与了远端转移灶的形成、稳定和增殖过程。在上述CTCs发生EMT与MET的过程中伴随着上皮型、上皮间质混合型和间质型不同表型间的CTCs转变，且在肿瘤发生发展的不同阶段（早期、进展期与转移期）中对于上述不同亚群的CTCs检测具有不同的临床应用价值：上皮型CTCs的检测分析可应用于肿瘤的早期辅助鉴别诊断与预后评估等方向；上皮间质混合型与间质型CTCs检测分析可指导进展期和转移期的肿瘤患者的转移复发监测和疗效监测等。因此，以无创的方式获取与检测肿瘤患者外周血中的不同亚群的CTCs对肿瘤患者临床肿瘤早期辅助诊断、预后判断、肿瘤治疗疗效监测与评价、肿瘤转移复发监测以及早期预警、个体化治疗指导和改善肿瘤患者的生存状态都有着重要的临床应用价值。
CTCs在外周血中的数量非常稀少，仅占外周血白细胞的1/106~1/107，因此对于不同类型CTCs的有效富集与检测技术瓶颈更高、难度更大，一直影响着CTCs的实际应用。目前CTCs的富集检测主要采用以下2种形式：①依赖抗EpCAM富集捕获CTCs与抗细胞角蛋白（CK8、CK18和CK19等）抗体及CD45鉴别检测CTCs的方法（代表为CellSearch系统），此种方法仅针对上皮型CTCs的富集与检测，无法检测间质表型与上皮间质混合型的CTCs；②不依赖捕获标记物富集CTCs（膜过滤法、梯度离心法等），虽然克服了富集捕获标志物的限制，但是此种方式的富集特异性不高，会漏检具有特殊生物物理特性的CTCs，且仍存在无法检测上皮间质混合型的CTCs。因此常规CTCs的富集与检测往往局限于单一类群的CTCs的富集与检测，无法检测上皮间质混合型的CTCs，由于CTCs的异质性、动态演化等原因影响，单一类型的富集检测方法很大程度限制了CTCs的临床应用效果。
为克服现有CTCs富集检测技术缺陷局限，本发明设计了一种设计组合合理、使用存放运输节约方便的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，确保上皮间质混合型、上皮型与间质型的CTCs进行富集捕获与检测试剂组合性能，从而为基于CTCs的肿瘤的精准治疗临床应用提供更加可靠的诊断、治疗和预后判断证据奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及上皮间质混合型PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，该试剂盒设计组合合理、使用存放节约、运输方便的可以直接用于常温环境使用保存与运输的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，克服了低温保藏试剂繁琐的低温环境维持冷链运输储存及使用过程，节约储存运输使用能耗。确保了上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒中的试剂耗材组合用于上皮型、上皮间质混合型与间质型的CTCs富集捕获与检测过程的有效性。
为弥补现有技术无法有效富集检测上皮间质混合型CTCs的缺陷，本发明的目的还在于利用上皮间质混合型循环肿瘤细胞特异性捕获抗体组合与检测特异性抗体试剂组合，提供一种简捷高效的上皮间质混合型CTCs的检测方式。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括试剂盒盒体以及与所述试剂盒盒体配合的试剂盒盒盖，所述的试剂盒盒体内壁紧贴有保温隔水层，所述的试剂盒盒体内底部设有冷盒，所述的冷盒上设置有底座，所述的底座内设置有多个放置槽和多个放置孔，所述的多个放置槽内设置有螺旋样品室和微流控芯片，所述的多个放置孔内设置有多个试剂瓶，多个试剂瓶形成试剂瓶组。
本发明中，所述的试剂盒盒体有保温隔水层，由底座隔断分为上下两层：试剂盒盒体上层为包括底座的试剂瓶、螺旋样品室和微流控芯片放置层，下层为冷盒放置层，所述底座上有若干个放置孔和放置槽，所述的试剂瓶组的试剂瓶依次放置在放置孔中、螺旋样品室和微流控芯片放置在放置槽中；所述的冷盒放置层，放置已经过低温冷冻处理的冷盒；所述的试剂瓶组采用上皮间质混合型CTCs捕获检测试剂组包括盛装在试剂板内的上皮间质混合型CTCs特异性捕获抗体组与盛装在试剂瓶组中的带有荧光标记物的上皮间质混合型CTCs特异性检测抗体组和反应体系辅助试剂。冷盒可在常温环境中维持试剂盒整体低温状态确保试剂性能，便于试剂盒的常温快捷保存、运输与使用。所述的放置孔大小与试剂瓶尺寸一一吻合对应，并且能够适当固定试剂瓶；所述的放置槽中有若干个隔断，每个隔断空间大小与单个螺旋样品室和单个微流控芯片的外包装尺寸对应，保证螺旋样品室和微流控芯片被放置槽适当卡住，不会随意移动或掉出，可更好地保护和固定螺旋样品室和微流控芯片。
以下作为本发明的优选技术方案：
所述的保温隔水层包括珍珠棉、覆合在所述珍珠棉上的铝箔以及贴合在所述铝箔上的PVC层，即所述的保温隔水层为双面贴合PVC含有珍珠棉覆合铝箔的防水隔热层，PVC为聚氯乙烯（Polyvinyl chloride)。
本发明所述试剂盒盒体内的保温隔水层为双面贴合PVC含有珍珠棉覆合铝箔的防水隔热层，保温时效可达18小时以上，同时可根据运输保存使用环境温度情况配合更换冷盒，更长时间维持所述试剂组与耗材的低温状态确保试剂性能。
本发明所述的底座的材料为低密度发泡材料。低密度发泡材料质量轻，无污染，加工塑型方便，可重复使用，具有极好的防震抗冲击防潮性能，能有效固定以及保护试剂瓶组、螺旋样品室和微流控芯片。此外，发泡材料具有一定的低温保温性能可以协助维持试剂的低温状态。
本发明所述的冷盒为无冰、无电源可重复使用的长效供冷冷源，可保证试剂盒使用、储藏与运输过程中的冷源供应，以持续维持低温环境。
所述的试剂盒盒体通过所述底座隔断分为上下两层，上层为包括底座的试剂瓶组、螺旋样品室和微流控芯片放置层，下层为冷盒放置层。
本发明所述的底座的放置孔为有底的圆孔，所述的放置槽为通槽。实际应用中，放置孔的形状是根据试剂瓶设计的，试剂瓶竖直放置在放置孔内，有底的圆孔便于加工且可以更好地吻合试剂瓶尺寸并保护试剂瓶；放置槽的形状是根据螺旋样品室和微流控芯片外包装的形状设计而成，为薄片状或长条状通槽，一方通槽面便于生产加工，另一方面可以增加螺旋样品室和微流控芯片的存放数量有效地利用试剂盒空间。
所述的底座上放置有试剂板，所述的试剂板为含有上皮间质混合型CTCs特异性捕获抗体组冻干粉的96孔板，所述96孔板上覆盖有隔潮密封铝膜。
本发明所述的试剂瓶组包括细胞分离液试剂瓶、洗涤缓冲液试剂瓶、抗体稀释液试剂瓶、染色剂A试剂瓶、染色剂B试剂瓶、染色剂C试剂瓶、染色剂D试剂瓶、捕获增强剂试剂瓶、核酸染色剂试剂瓶、细胞清洗液试剂瓶、细胞固定剂试剂瓶、染色阻断剂A试剂瓶、染色阻断剂B试剂瓶和细胞通透剂试剂瓶。所述试剂瓶组分别盛装相应名称的带有荧光标记物的上皮间质混合型CTCs特异性检测抗体组和反应体系辅助试剂，并按照实验操作先后顺序依次排布在试剂盒中。
一种上皮间质混合型PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，采用上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，所述的试剂瓶组中的各试剂瓶分别装有生物素标记的EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体、生物素标记的的抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体、荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、PD-L1一抗、荧光素标记的PD-L1二抗，该方法具体包括以下步骤：
1）生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备；
所述的生物素标记的上皮间质混合抗体采用生物素标记的EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体和生物素标记的的抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体；
2）上皮间质混合型CTCs的分离富集；
3）采用荧光素标记的上皮间质混合型抗体对不同亚型CTCs的免疫检测；
所述的荧光素标记的上皮间质混合型抗体采用荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体；
4）采用PD-L1一抗与荧光素标记的PD-L1二抗对步骤3）中捕获的不同亚型CTCs的PD-L1表型检测。
本发明中，利用上皮间质特异性捕获与检测抗体标志物、特异性免疫检查点抗体标志物与捕获染色增强液组合结合微流控技术富集检测上皮型CTCs、间质型CTCs与上皮间质混合型CTCs及其不同类型CTCs的PD-L1免疫表型；其中所述的上皮间质特异性捕获与检测抗体标志物包括：抗EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体、抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体、抗PanCK抗体、抗Vimentin（波形蛋白）抗体、抗CD45抗体；所述的特异性免疫检查点抗体标志物包括：抗PD-L1一抗及抗PD-L1二抗；该方法利用上皮间质特异性捕获与检测抗体标志物、特异性免疫检查点抗体标志物与捕获增强液与染色增强液组合结合微流控技术不仅解决了现有CTCs检测技术用血量大的问题，提高了CTCs的检测敏感性，而且在此基础上同时解决了现有CTCs检测技术不能检测不能富集检测上皮间质混合型CTCs的技术缺陷，不仅可以简捷高效特异地富集检测上皮间质混合型CTCs，而且可以富集检测上皮型与间质型CTCs。该方法具体为一种用血量小、可简捷高效灵敏特异的富集检测上皮型、间质型、上皮间质混合型CTCs与上皮型PD-L1阳性表型、上皮间质混合型PD-L1阳性表型与间质型PD-L1阳性表型CTCs的方法。
以下作为本发明的优选技术方案：
步骤1）中，所述的生物素标记的上皮间质混合抗体中生物素标记的EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体的质量百分数为35%~60%；所述的生物素标记的上皮间质混合抗体中生物素标记的的抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体的质量百分数为25%~50%。
优选的，微流控技术为微流控载体芯片技术；更优选的，为包括含有PDMS（聚二甲基硅氧烷）的蚀刻人字形微涡旋流体甬道顶层与含有纳米底物涂层结构基片的微流控装置。
所述的生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备具体包括：
用移液器吸取链霉亲和素溶液，加入微流控载体，在10~35℃下孵育3~5h后放置在环境湿度低于30%的干燥室干燥20~28h，直至微流控载体内无液体残留，用乙醇处理微流控载体，然后立即用PBS缓冲液冲洗微流控载体；
将生物素标记的抗EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体和生物素标记的抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体的混合液，加入微流控载体内35~39℃孵育25~35min后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，加入捕获增强液至微流控载体内，10~35℃孵育0.5~1.5h，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备，将其置于湿盒备用。
所述的捕获增强液为含有质量百分浓度为0.2%~2%的表面活性剂、质量百分浓度为0.5%~10%的BSA（牛血清白蛋白）与质量百分浓度为88%~99.3%封闭血清的混合溶液；
步骤2）中，上皮间质混合型CTCs的分离富集具体包括：
用PBS缓冲液稀释外周血，之后加入到含有单核细胞分离液的梯度离心管的多孔屏障上方，离心后，吸取PBMCs（单核细胞）层，并将其转移至无菌离心管中，使用细胞清洗液洗涤PBMCs（单核细胞），离心，弃除上清液，再加入细胞清洗液轻柔重悬PBMCs（单核细胞），完成CTCs的粗分离液的制备；
采用微流泵系统吸取CTCs的粗分离液，以3~4 mL/h的注入速度缓慢匀速注入步骤1）中制备好的生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体中，然后吸取PBS缓冲液冲洗微流控免疫捕获载体，完成上皮间质混合型CTCs的富集，得到富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体。
步骤3）中，采用荧光素标记的上皮间质混合型抗体对不同亚型CTCs的免疫检测，具体包括：
取细胞固定液，注入步骤2）中富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体中，10~35℃反应15~25min后，吸取PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成细胞固定；
用移液器吸取细胞通透液，注入已完成细胞固定的微流控载体内，置于避光湿盒中10~35℃作用8~12min后，吸取PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成细胞通透；
将荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液的混合液加入到已完成细胞通透的微流控载体内10~35℃避光孵育1.5~2.5h后，用PBS缓冲液缓慢微流控载体，接着吸取核酸染色液注入微流控载体，置于避光湿盒中10~35℃孵育10~20min，用 PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成上皮型CTCs、上皮间质混合型CTCs、与间质型CTCs的免疫检测，用倒置荧光显微镜观察荧光显色情况。
进一步优选的，所述的荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、染色阻断液A与染色阻断液B混合的体积比为1：1：1：1：1。
所述的染色阻断液A为含有FC受体阻断剂的溶液；所述的染色阻断液B为含有鼠血清、兔血清、羊血清中的一种以上（包括一种）成分的溶液；所述的抗体稀释液包括含有质量百分浓度为2%~10% BSA（牛血清白蛋白）与质量百分浓度为0.3%~5%蛋白保护稳定剂的溶液。
优选的，所述的蛋白保护稳定剂为甘油与化学惰性高分子聚合物的混合物。更优选的，化学惰性高分子聚合物为PEG。
步骤4）中，采用PD-L1一抗与荧光素标记的PD-L1二抗对步骤3）中捕获的不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，具体包括：
将PD-L1一抗、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液混合液加入步骤3）中已反应完成的微流控载体中，置于湿盒中避光10~35℃孵育1.5~2.5h后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体；
将荧光素标记的PD-L1二抗用抗体稀释液缓慢加入已完成PD-L1一抗反应的微流控载体中，置于湿盒中避光10~35℃孵育1.5~2.5h后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，用倒置荧光显微镜观察染色结果。
所述PD-L1一抗与染色阻断液A、染色阻断液B混合的体积比为1：2：2；所述的荧光素标记的PD-L1二抗用抗体稀释液中荧光素标记PD-L1二抗的体积百分数为2%~5%。
所述抗PanCK抗体、抗Vimentin抗体、抗CD45抗体与抗PD-L1二抗各自均标记了可以相互区别的不同发射波长的荧光素。根据本领域技术人员公知的，为了区分不同的特异性检测抗体，本发明采用的不同荧光素标记，可以通过荧光显微镜在不同的滤光片下可以完全区分开。标记荧光素可以采用本领域任何常用的荧光染料，更优选的，包括FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、Alexa Fluor系列分子、PerCP （多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物）、APC（别藻青蛋白）、TRITC （四甲基异硫氰酸罗丹明）等，荧光显色各不相同可相互区别；
一种上皮间质混合型PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，包括以下步骤：
1）采用生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备
用移液器吸取300μL链霉亲和素溶液，加入微流控载体，在常温下孵育4h后放置在环境湿度低于30%的干燥室干燥24h，直至微流控载体内无液体残留。用300μL 95%的乙醇处理微流控载体1次，然后立即用PBS缓冲液冲洗微流控载体两次。
将生物素标记抗EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体、生物素标记抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体混合液200μL，加入微流控载体内37℃孵育30min后，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，加入200μL捕获增强液至微流控载体内，室温孵育1h，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，完成上皮间质混合体捕获微流控载体的制备，将其置于湿盒备用。
2）上皮间质混合型CTCs的分离富集
用PBS缓冲液1：1稀释2mL外周血，将其加入到含有3mL单核细胞分离液的梯度离心管的多孔屏障上方，室温1000×g离心10min后，小心缓慢吸取PBMCs（单核细胞）层，并将其转移至无菌离心管中使用15mL细胞清洗液缓慢洗涤PBMCs，室温300×g离心10min，小心弃除上清液，再加入1mL细胞清洗液轻柔重悬PBMCs，完成CTCs的粗分离液的制备。
采用微流泵系统吸取上述1mL CTCs粗分离液，在室温下以3.6mL/h的注入速度缓慢匀速注入步骤1）中制备好的微流控载体中，然后吸取300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，完成上皮间质混合型CTCs的富集。
3）上皮间质混合型CTCs的免疫检测
取200μL细胞固定液，注入步骤2）中富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体中，室温反应20min后，吸取300μL PBS缓冲液冲洗微流控载体两次，完成细胞固定。
用移液器吸取200μL细胞通透液，注入已完成细胞固定的微流控载体内，置于避光湿盒中室温作用10min后，吸取300μL PBS缓冲液冲洗微流控载体三次，完成细胞通透。
将荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液的混合液250μL加入微流控载体内室温避光孵育2h后，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，接着吸取150μL核酸染色液缓慢注入上述微流控载体，置于避光湿盒中室温孵育15min，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，完成上皮型CTCs、上皮间质混合型CTCs、与间质型CTCs的免疫检测，用倒置荧光显微镜观察荧光显色情况。
4）不同亚型CTCs的PD-L1表型检测
将PD-L1一抗、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液混合液150μL缓慢加入步骤3）中已反应完成的微流控载体中，置于湿盒中避光室温孵育2h后，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体三次。
将荧光素标记的PD-L1二抗用抗体稀释液稀释至300μL后缓慢加入上述已完成PD-L1一抗反应的微流控载体中，置于湿盒中避光室温孵育2h后，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体三次，完成不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，用倒置荧光显微镜观察染色结果。
优选的，步骤2）中所述的单核细胞分离液为含有聚蔗糖（Ficoll）与泛影酸葡甲胺的人淋巴细胞分离液，密度为1.077±0.001g/mL；所述的梯度离心管为内部含有一个多孔屏障隔板的离心管，可以辅助PBMCs的分离，能有效维持PBMCs分层状态，便于CTCs分离操作；所述的细胞清洗液优选为含有细胞培养基与2%胎牛血清的混合液。所述的微流泵系统为含有多向阀与管线组合的，可以通过控制软件定速定量操控微小流体的微流体泵。更优选的，所述的微流体泵的最大容积为500微升。
优选的，步骤3）所述的细胞固定液优选为含有2%PFA（多聚甲醛）的水溶液；所述的细胞通透液优选为含有0.4% Triton X-100的水溶液；所述的核酸染色液为常见细胞核染液优选为Hoechst33342或DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）中的一种。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，试剂盒结构设计合理，可以直接通过内置冷盒维持盒内试剂瓶组中的上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂、螺旋样品室和微流控芯片低温保护环境，无须使用保存冰箱、特殊运输外包装材料与运输冷链专用设备维持低温环境，可直接在常温环境中实施试剂的保存与运输，在稳定试剂性能的同时节约了运输材料与过程能耗，环保便捷，降低了运输成本；试剂盒具有一定的防潮耐冲击性，强度好，不易损耗，可回收重复使用，环保节约。检测时，试剂盒可作为试剂瓶组与耗材的托架，同时可以直接提供低温保护环境，无须取用碎冰维持试剂低温环境，简化操作。试剂瓶组合布局合理，取用方便，便于上皮型、上皮间质混合型与间质型CTCs的富集捕获与检测。
该方法利用上皮间质特异性捕获与检测抗体标志物、特异性免疫检查点抗体标志物与捕获增强液与染色增强液组合结合微流控技术不仅解决了现有CTCs检测技术用血量大的问题，提高了CTCs的检测敏感性，而且在此基础上同时解决了现有CTCs检测技术不能检测不能富集检测上皮间质混合型CTCs的技术缺陷，不仅可以简捷高效特异地富集检测上皮间质混合型CTCs，而且可以富集检测上皮型与间质型CTCs。同时，本发明以无创的方式提供了一种不同类型CTCs的PD-L1免疫表型的检测方法，更加简捷经济，弥补了现有技术检测PD-L1的缺陷。
此外，本发明通过捕获染色增强液组合，充分暴露CTCs细胞膜表面的抗原决定簇，增加了CTCs捕获与检测的灵敏度与特异性，更好地展现了CTCs荧光显色形态，利于细胞病理形态与表型分析。
附图说明
图1是本发明试剂盒组合示意图；
图2是本发明试剂盒盒体结构与冷盒示意图；
图3是本发明底座及其试剂瓶耗材排布与试剂板示意图；
图1~3中：1、试剂盒盒体，2、试剂盒盒盖，3、保温隔水层，4、底座，5、试剂瓶组，6、螺旋样品室，7、微流控芯片，8、试剂板，9、PVC层，10、铝箔，11、珍珠棉，12、冷盒，13、洗涤缓冲液试剂瓶，14、细胞分离液试剂瓶，15、细胞清洗液试剂瓶，16、捕获增强剂试剂瓶，17、细胞固定剂试剂瓶，18、细胞通透剂试剂瓶，19、抗体稀释液试剂瓶，20、染色阻断剂A试剂瓶，21、染色阻断剂B试剂瓶，22、染色剂A试剂瓶，23、染色剂B试剂瓶，24、染色剂C试剂瓶，25、染色剂D试剂瓶，26、核酸染色剂试剂瓶，27、放置孔，28、放置槽；
图4是上皮型循环肿瘤细胞的显色示意图；
图5是间质型循环肿瘤细胞的显色示意图；
图6是上皮间质混合型循环肿瘤细胞的显色示意图；
图7 是上皮型循环肿瘤细胞PD-L1阳性表达的显色示意图；
图8是间质型循环肿瘤细胞PD-L1阳性表达的显色示意图；
图9 是上皮间质混合型循环肿瘤细胞PD-L1阳性表达显色示意图；
图4~9中：以上不同类群的循环肿瘤细胞均来自临床肺癌样本，图中白色箭头指示不同类群的CTCs， A为合并图像，B 为Hoechst33342 标记CTCs细胞核显色图像（实际为蓝色），C为CD45-PE 显色图像（实际为橘色），D为PanCk- PerCP显色图像（实际为深红色），E为Vimentin-FITC显色图像（实际为绿色），F为PD-L1- Alexa 647（远红外，显微镜扫描赋以黄色）。
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1（上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒）
如图1~3所示，一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括试剂盒盒体1以及与试剂盒盒体1配合的试剂盒盒盖2，试剂盒盒体1内壁紧贴有保温隔水层3，试剂盒盒体1内底部设有冷盒12，冷盒12上设置有底座4，底座4内设置有多个放置槽28和多个放置孔27，多个放置槽28内设置有螺旋样品室6和微流控芯片7，多个放置孔27内设置有多个试剂瓶，多个试剂瓶形成试剂瓶组5。保温隔水层3包括珍珠棉11、覆合在珍珠棉11上的铝箔10以及贴合在铝箔10上的PVC层9。底座4的放置孔27为有底的圆孔，放置槽28为通槽。底座4上放置有试剂板8。试剂板8为96孔板。
如图1~3所示，本实施例包括：试剂盒盒体1、与试剂盒盒体1一侧边相连的试剂盒盒盖2、试剂盒盒体1内层由PVC层9、铝箔10与珍珠棉11组成的保温隔水层3、放置在试剂盒盒体1上层的隔断底座4、放置在底座4上放置孔27中的试剂瓶组5（包含洗涤缓冲液试剂瓶13、细胞分离液试剂瓶14、细胞清洗液试剂瓶15、捕获增强剂试剂瓶16、细胞固定剂试剂瓶17、细胞通透剂试剂瓶18、抗体稀释液试剂瓶19、染色阻断剂A试剂瓶20、染色阻断剂B试剂瓶21、染色剂A试剂瓶22、染色剂B试剂瓶23、染色剂C试剂瓶24、染色剂D试剂瓶25、和核酸染色剂试剂瓶26、放置在底座4上放置槽28中的螺旋样品室6与微流控芯片7、试剂板8、放置在试剂盒盒体1下层的冷盒12。
如图2~3所示，在本实施例中，在实际保存与运输时，首先将低温处理过的冷盒12放置在试剂盒内保温隔水层3底部作为低温源，再将底座4放置在冷盒12上方，底座4的外表面贴合保温隔水层3并适当卡住，其次将洗涤缓冲液试剂瓶13、细胞分离液试剂瓶14、细胞清洗液试剂瓶15、捕获增强剂试剂瓶16、细胞固定剂试剂瓶17、细胞通透剂试剂瓶18、抗体稀释液试剂瓶19、染色阻断剂A试剂瓶20、染色阻断剂B试剂瓶21、染色剂A试剂瓶22、染色剂B试剂瓶23、染色剂C试剂瓶24、染色剂D试剂瓶25、与核酸染色剂试剂瓶26从前至后依次排放在底座的放置孔27中，将螺旋样品室6与微流控芯片7依次放置在放置槽28中，最后将试剂板8放置在试剂盒内保温隔水层3的最上层，盖上试剂盒盒盖2将试剂盒盒体1开口封住，直接常规储存或运输。
如图1所示，实际使用时，试剂瓶组5可不从底座4中取出，直接打开试剂瓶盖使用，将底座4当做试剂架，将其下方的冷盒直接作为低温源使用，无须取用碎冰维持低温。
以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例2（肺癌循环肿瘤细胞分型检测及其PD-L1的表达检测）
采用上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，试剂瓶组5中各试剂瓶装有检测所需要的具体试剂；
材料：微流控载体采用微流控芯片，微流泵系统采用循环肿瘤细胞分析仪（WY-C3000，杭州华得森生物技术有限公司生产）
1.生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备
1.1.用移液器吸取300μL浓度为5μg/mL链霉亲和素溶液，加入微流控芯片中，在常温25℃下孵育4h后放置在环境湿度低于30%的干燥室干燥24h，直至微流控芯片内无液体残留。
1.2.吸取300μL 体积百分述95%的乙醇注入微流控芯片中，然后立即用1×PBS缓冲液冲洗两次。
1.3.将生物素标记抗EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体、生物素标记抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体混合液200μL（两种抗体混合后的质量百分比为：生物素标记的抗EpCAM抗体50%；生物素标记抗CSV抗体50%），加入微流控载体内37℃孵育30min后，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控芯片两次。
1.4.用移液器吸取200μL捕获增强液注入微流控芯片中，室温25℃孵育1h。捕获增强液为含有质量百分数为0.4%的Triton X-100、质量百分数为3 %的BSA（牛血清白蛋白）与质量百分数为87%封闭血清的混合溶液，余量为水。
1.5.用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，完成上皮间质混合抗体捕获微流控芯片的制备，将其置于湿盒备用。
2.上皮间质混合型CTCs的分离富集
2.1用2mL PBS缓冲液稀释2mL外周血，将4mL稀释血样其加入到含有3mL 单核细胞分离液 Histopaque®-1077密度梯度离心液的Leucosep®梯度离心管的多孔屏障上方，室温25℃ 1000×g离心10min。单核细胞分离液为含有聚蔗糖（Ficoll）与泛影酸葡甲胺的人淋巴细胞分离液，密度为1.077±0.001g/mL；梯度离心管为内部含有一个多孔屏障隔板的离心管，可以辅助PBMCs的分离，能有效维持PBMCs分层状态，便于CTCs分离操作；
2.2小心缓慢吸取PBMCs（单核细胞）层，并将其转移至无菌离心管中。
2.3向离心管中加入15mL细胞清洗液缓慢洗涤PBMCs，室温25℃ 300×g离心10min。细胞清洗液为含有质量百分数98%细胞培养基RPMI1640与质量百分数2%胎牛血清的混合液。
2.4用移液器小心弃除上清液，再加入1mL细胞清洗液轻柔重悬PBMCs，完成CTCs的粗分离液的制备。
2.5用微流泵系统[循环肿瘤细胞分析仪（WY-C3000）]吸取上述1mL CTCs粗分离液，在室温25℃下以3.6mL/h的注入速度缓慢匀速注入步骤1中制备好的微流控芯片中，然后吸取300μL 1×PBS缓冲液缓慢冲洗微流控芯片两次，完成上皮间质混合型CTCs的富集。微流泵系统为含有多向阀与管线组合的，可以通过控制软件定速定量操控微小流体的微流体泵。微流体泵的最大容积为500微升。
3.上皮间质混合型CTCs的免疫检测
3.1.移液器取200μL细胞固定液，注入步骤2中富集有上皮间质混合型CTCs的微流控芯片中，室温25℃反应20min后，吸取300μL 1×PBS缓冲液冲洗微流控芯片两次，完成细胞固定。细胞固定液采用含有质量百分数2%PFA（多聚甲醛）的水溶液；
3.2.用移液器吸取200μL细胞通透液，注入已完成细胞固定的微流控芯片内，置于避光湿盒中室温作用10min后，吸取300μL 1×PBS缓冲液冲洗微流控芯片三次，完成细胞通透。细胞通透液采用含有质量百分数0.4% Triton X-100的水溶液；
3.3.将荧光素PerCP标记的抗PanCK抗体10μL、荧光素FITC标记的抗Vimentin抗体10μL、荧光素PE标记的抗CD45抗体10μL、染色阻断液A 10μL、染色阻断液B 10μL与抗体稀释液200μL混匀后加入微流控芯片内，室温25℃避光孵育2h。染色阻断液A为含有FC受体阻断剂的溶液；染色阻断液B为含有鼠血清和兔血清的溶液；抗体稀释液为含有质量百分数为2%BSA与质量百分数为0.5%蛋白保护稳定剂的溶液。蛋白保护稳定剂为甘油与和PEG。
3.4.用移液器吸取300μL 1×PBS缓冲液缓慢冲洗微流控芯片两次。
3.5.接着吸取150μL核酸染色液Hoechst33342缓慢注入上述微流控芯片内，置于避光湿盒中室温25℃孵育15min，用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体两次，完成上皮型CTCs、上皮间质混合型CTCs、与间质型CTCs的免疫检测，用倒置荧光显微镜观察荧光显色情况。
4. CTCs分型的倒置荧光显微镜观察结果判读
4.1.上皮型CTCs表型，图4：Hoechst33342+、PanCK+、Vimentin-、CD45-；
4.2.间质型CTCs表型，图5：Hoechst33342+、PanCK-、Vimentin+、CD45-；
4.3.上皮间质混合型CTCs表型，图6：Hoechst33342+、PanCK+、Vimentin+、CD45-
5.不同亚型CTCs的PD-L1表型检测
5.1.用移液器分别吸取PD-L1一抗6μL、染色阻断液A 12μL、染色阻断液B 12μ与抗体稀释液120μL混合均匀后，缓慢加入步骤3中已反应完成的微流控芯片中，置于湿盒中避光室温孵育2h
5.2.用300μL 1×PBS缓冲液缓慢冲洗微流控芯片三次。
5.3.将荧光素Alexa 647标记的PD-L1二抗6μL用294μL抗体稀释液稀释至300μL后，缓慢加入5.2中已完成PD-L1一抗反应的微流控芯片中，置于湿盒中避光室温25℃孵育2h；
5.4.用300μL PBS缓冲液缓慢冲洗微流控载体三次，完成不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，用倒置荧光显微镜观察PD-L1的染色结果。
6. CTCs分型的倒置荧光显微镜观察结果判读
6.1. PD-L1阳性表型的上皮型CTCs，图7：Hoechst33342+、PanCK+、Vimentin-、CD45-、PD-L1+；
6.2. PD-L1阳性表型的间质型CTCs，图8：Hoechst33342+、PanCK-、Vimentin+、CD45-、PD-L1+；
6.3. PD-L1阳性表型的上皮间质混合型CTCs，图9：Hoechst33342+、PanCK+、Vimentin+、CD45-、PD-L1+；
对比例：与实施例2的区别在于，本实施例中按照传统技术方法设置a组（捕获抗体仅使用抗EpCAM抗体捕获检测仅使用抗PanCK抗体与抗CD45抗体）与b组（捕获抗体仅使用抗CSV抗体检测抗体仅使用抗CSV抗体与抗CD45抗体）与本技术方案做对比实验。
材料：1）不同时期的乳腺癌细胞系BT474、MCF7、SKBR3与MDAMB231；2）6份2ml健康人外周血。
将BT474 150颗、MCF7 150颗、SKBR3 150颗与MDAMB231150颗的细胞悬液混合为含有600颗左右细胞的悬液6份，分别掺入6份2ml的健康人外周血中，制备为模拟血样。
按照实施例2中的方法：对比组a组用200μL生物素标记抗EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体制备微流控免疫捕获载体，检测抗体采用抗PanCK与抗CD45抗体1：1的质量百分比；对比组b组用200μL生物素标记抗CSV（细胞表面波形蛋白）抗体制备微流控免疫捕获载体，检测抗体采用抗CSV与抗CD45抗体1：1的质量百分比；实验组c组采用实施例2中的方法制备上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体；上述3组CTCs的分离富集、检测与倒置荧光显微镜观察结果判读均采用实施例2中的方法，每个实验重复1次，结果计算上皮型CTCs的捕获效率、间质型CTCs的捕获效率与上皮间质混合型CTCs的捕获效率，捕获效率%=芯片上的细胞数量/投入细胞数量。
具体结果如表1所示，结果表明：c组完全采用实施例2的方法对不同类型CTCs的捕获效率总体高于对比方法a组与b组分别采用传统单一富集与检测抗体的方法。
表1
注：*,CTCs的总体捕获率%=上皮型CTCs的平均捕获率+间质型CTCs的平均捕获率+上皮间质混合型CTCs的平均捕获率
本说明书中没有详细描述的部分均采用本领域技术人员所公知的结构和原理，均为现有技术。
通过上述描述，本领域的技术人员已能实施。
此外，需要说明的是，以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种上皮间质混合型PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法，其特征在于，采用上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒，检测试剂盒包括试剂盒盒体以及与所述试剂盒盒体配合的试剂盒盒盖，所述的试剂盒盒体内壁紧贴有保温隔水层，所述的试剂盒盒体内底部设有冷盒，所述的冷盒上设置有底座，所述的底座内设置有多个放置槽和多个放置孔，所述的多个放置槽内设置有螺旋样品室和微流控芯片，所述的多个放置孔内设置有多个试剂瓶，多个试剂瓶形成试剂瓶组，所述的试剂瓶组中各试剂瓶装有所需要的具体试剂，所述的方法具体包括以下步骤：
1）生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备具体包括：
用移液器吸取链霉亲和素溶液，加入微流控载体，在10~35℃下孵育3~5h后放置在环境湿度低于30%的干燥室干燥20~28h，直至微流控载体内无液体残留，用乙醇处理微流控载体，然后立即用PBS缓冲液冲洗微流控载体；
将生物素标记的抗EpCAM抗体和生物素标记的抗CSV抗体的混合液，加入微流控载体内35~39℃孵育25~35min后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，加入捕获增强液至微流控载体内，10~35℃孵育0.5~1.5h，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体的制备，将其置于湿盒备用；所述的捕获增强液为含有质量百分浓度为0.2%~2%的表面活性剂、质量百分浓度为0.5%~10%的BSA（牛血清白蛋白）与质量百分浓度为88%~99.3%封闭血清的混合溶液；
2）上皮间质混合型CTCs的分离富集具体包括：
用PBS缓冲液稀释外周血，之后加入到含有单核细胞分离液的梯度离心管的多孔屏障上方，离心后，吸取单核细胞层，并将其转移至无菌离心管中，使用细胞清洗液洗涤单核细胞，离心，弃除上清液，再加入细胞清洗液轻柔重悬单核细胞，完成CTCs的粗分离液的制备；
采用微流泵系统吸取CTCs的粗分离液，以3~4 mL/h的注入速度缓慢匀速注入步骤1）中制备好的生物素标记的上皮间质混合抗体的微流控免疫捕获载体中，然后吸取PBS缓冲液冲洗微流控免疫捕获载体，完成上皮间质混合型CTCs的富集，得到富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体；
3）采用荧光素标记的上皮间质混合型抗体对不同亚型CTCs的免疫检测，具体包括：
取细胞固定液，注入步骤2）中富集有上皮间质混合型CTCs的微流控载体中，10~35℃反应15~25min后，吸取PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成细胞固定；
用移液器吸取细胞通透液，注入已完成细胞固定的微流控载体内，置于避光湿盒中10~35℃作用8~12min后，吸取PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成细胞通透；
将荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液的混合液加入到已完成细胞通透的微流控载体内10~35℃避光孵育1.5~2.5h后，用PBS缓冲液缓慢微流控载体，接着吸取核酸染色液注入微流控载体，置于避光湿盒中10~35℃孵育10~20min，用 PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成上皮型CTCs、上皮间质混合型CTCs、与间质型CTCs的免疫检测，用倒置荧光显微镜观察荧光显色情况；4）采用PD-L1一抗与荧光素标记的PD-L1二抗对步骤3）中捕获的不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，具体包括：
将PD-L1一抗、染色阻断液A、染色阻断液B与抗体稀释液混合液加入步骤3）中已反应完成的微流控载体中，置于湿盒中避光10~35℃孵育1.5~2.5h后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体；
将荧光素标记的PD-L1二抗用抗体稀释液加入已完成PD-L1一抗反应的微流控载体中，置于湿盒中避光10~35℃孵育1.5~2.5h后，用PBS缓冲液冲洗微流控载体，完成不同亚型CTCs的PD-L1表型检测，用倒置荧光显微镜观察染色结果。
2.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，所述的保温隔水层包括珍珠棉、覆合在所述珍珠棉上的铝箔以及贴合在所述铝箔上的PVC层。
3.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，所述的试剂盒盒体通过所述底座隔断分为上下两层，上层为包括底座的试剂瓶组、螺旋样品室和微流控芯片的放置层，下层为冷盒的放置层。
4.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，所述的底座的放置孔为有底的圆孔，所述的放置槽为通槽。
5.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，所述的底座上放置有试剂板。
6.根据权利要求5所述的富集检测方法，其特征在于，所述的试剂板为96孔板。
7.根据权利要求1所述的富集检测方法，其特征在于，步骤1）中，所述的生物素标记的抗EpCAM抗体和生物素标记的抗CSV抗体的混合液中生物素标记的抗EpCAM抗体的质量百分数为35%~60%；所述的生物素标记的抗EpCAM抗体和生物素标记的抗CSV抗体的混合液中生物素标记的抗CSV抗体的质量百分数为25%~50%；
步骤3）中，所述的荧光素标记的抗PanCK抗体、荧光素标记的抗Vimentin抗体、荧光素标记的抗CD45抗体混合的体积比为1：1：1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910506559.4A CN110142068B (zh) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910506559.4A CN110142068B (zh) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110142068A CN110142068A (zh) | 2019-08-20 |
| CN110142068B true CN110142068B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=67591273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910506559.4A Active CN110142068B (zh) | 2019-06-12 | 2019-06-12 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110142068B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111443197A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-07-24 | 厦门大学 | 一种肝癌循环肿瘤细胞表型分析方法 |
Citations (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190885B1 (en) * | 1990-02-02 | 2001-02-20 | Cancer Research Fund Of Contra Costa | Fusion protein containing HMFG Epitop E (S) |
| CN101874205A (zh) * | 2007-10-02 | 2010-10-27 | 赛拉诺斯股份有限公司 | 模块化现场护理装置及其应用 |
| CN103472227A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-25 | 上海卫恒医疗器械有限公司 | 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用 |
| CN105115878A (zh) * | 2015-09-11 | 2015-12-02 | 上海交通大学 | 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN105785005A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-07-20 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及其应用 |
| JP2017058326A (ja) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | 東ソー株式会社 | 腫瘍細胞の検出方法 |
| CN206089663U (zh) * | 2016-10-17 | 2017-04-12 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 循环肿瘤细胞检测试剂盒 |
| CN206298600U (zh) * | 2016-12-23 | 2017-07-04 | 西安医臻生物医药科技有限公司 | 一种循环肿瘤细胞捕获试剂盒 |
| CN206457502U (zh) * | 2016-12-13 | 2017-09-01 | 天津安必森生物技术有限公司 | 一种人乳头瘤病毒16，18型核酸检测试剂盒 |
| CN107402296A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-28 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的免疫荧光染色及判读方法 |
| WO2017213587A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-14 | Star Array Pte Ltd | Moving heat blocks for amplification of nucleic acids |
| CN107656044A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-02-02 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及检测方法 |
| WO2018029858A1 (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 日立化成株式会社 | 血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法 |
| CA3035806A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-03-15 | University Of Canberra | Lysine specific histone demethylase-1 inhibitors and uses therefor |
| CN108179134A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-19 | 武汉大学 | 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用 |
| CN207620215U (zh) * | 2017-12-13 | 2018-07-17 | 浙江丽尚建材科技有限公司 | 一种轻质隔热集成墙板 |
| CN108441477A (zh) * | 2017-05-22 | 2018-08-24 | 浙江大学 | 一种基于csv抗体富集捕获胰腺癌循环肿瘤细胞的方法 |
| CN207870115U (zh) * | 2017-12-14 | 2018-09-18 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种鱼类增殖放流运输密度胁迫实验装置 |
| CN207907562U (zh) * | 2018-01-10 | 2018-09-25 | 杭州艾劲科技有限公司 | 一种循环肿瘤dna捕获试剂盒 |
| WO2018196335A1 (en) * | 2017-04-24 | 2018-11-01 | Wwhs Biotech, Inc | Method for screening circulating tumor cells with multi-enhanced near-infrared fluorescence biochip |
| CN108753571A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种细胞分型捕获芯片及方法 |
| CN208297530U (zh) * | 2018-06-12 | 2018-12-28 | 中国人民解放军新疆军区总医院 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒 |
| CN109136065A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-04 | 重庆金域医学检验所有限公司 | 一种远程hpv检测试剂盒 |
| CN109239030A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-18 | 北京莱尔生物医药科技有限公司 | 一种检测循环肿瘤细胞her2不同位点和er、pr的试剂盒及应用 |
| CN208666021U (zh) * | 2018-09-14 | 2019-03-29 | 重庆金域医学检验所有限公司 | 一种利于样品保存的试剂盒 |
| CN208933372U (zh) * | 2019-01-18 | 2019-06-04 | 柯尊富 | 一种尿路上皮患者外周血循环肿瘤细胞鉴定试剂盒 |
| CN109856388A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-06-07 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒 |
| CN210846424U (zh) * | 2019-06-12 | 2020-06-26 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005509870A (ja) * | 2001-11-20 | 2005-04-14 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 細胞及び組織アレイ及びマイクロアレイと使用方法 |
| WO2003087410A1 (en) * | 2002-04-11 | 2003-10-23 | Sequenom, Inc. | Methods and devices for performing chemical reactions on a solid support |
| EP1984030B1 (en) * | 2006-01-30 | 2013-05-08 | The Scripps Research Institute | Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject |
| CA2657621A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample |
| WO2010009735A2 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| US10446272B2 (en) * | 2009-12-09 | 2019-10-15 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for classification of samples |
| US9057055B2 (en) * | 2012-12-05 | 2015-06-16 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Method of obtaining circulating cancer cell populations |
| GB2546213B (en) * | 2013-02-02 | 2017-12-06 | Univ Duke | Method of isolating circulating tumour cells |
| US20150233932A1 (en) * | 2013-02-19 | 2015-08-20 | Ching-Ping Tseng | Methods, Systems, and Compositions for Enrichment of Rare Cells |
| JP2016512197A (ja) * | 2013-03-05 | 2016-04-25 | ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 間葉及び上皮間葉形質転換循環腫瘍細胞のための特異的検出ツール |
| US9248448B2 (en) * | 2013-04-24 | 2016-02-02 | William Marsh Rice University | Multisample bionanochip platform |
| MX2016011821A (es) * | 2014-03-11 | 2017-04-27 | Molecular Templates Inc | Proteinas que comprenden regiones efectoras de subunidad a de toxina shiga proximas a amino terminal y regiones de union de tipo inmunoglobulina de direccionamiento selectivo celular. |
| JP6935195B2 (ja) * | 2014-03-11 | 2021-09-15 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 結合領域、志賀毒素ａサブユニットのエフェクター領域、及びカルボキシ末端小胞体局在化シグナルモチーフを含むタンパク質 |
| US9623408B2 (en) * | 2014-10-13 | 2017-04-18 | University Of Macau | Microfluidics separation method and system thereof |
| SG11201901991QA (en) * | 2016-09-06 | 2019-04-29 | Incelldx Inc | Methods of detecting per cell pd-l1 expression and uses thereof |
| US20180267046A1 (en) * | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Micareo Taiwan Co., Ltd. | Methods for diagnosing and treating cancer |
-
2019
- 2019-06-12 CN CN201910506559.4A patent/CN110142068B/zh active Active
Patent Citations (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190885B1 (en) * | 1990-02-02 | 2001-02-20 | Cancer Research Fund Of Contra Costa | Fusion protein containing HMFG Epitop E (S) |
| CN101874205A (zh) * | 2007-10-02 | 2010-10-27 | 赛拉诺斯股份有限公司 | 模块化现场护理装置及其应用 |
| CN103472227A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-25 | 上海卫恒医疗器械有限公司 | 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用 |
| CN105115878A (zh) * | 2015-09-11 | 2015-12-02 | 上海交通大学 | 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用 |
| JP2017058326A (ja) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | 東ソー株式会社 | 腫瘍細胞の検出方法 |
| CN105785005A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-07-20 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及其应用 |
| WO2017213587A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-14 | Star Array Pte Ltd | Moving heat blocks for amplification of nucleic acids |
| WO2018029858A1 (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 日立化成株式会社 | 血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法 |
| CA3035806A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-03-15 | University Of Canberra | Lysine specific histone demethylase-1 inhibitors and uses therefor |
| CN206089663U (zh) * | 2016-10-17 | 2017-04-12 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 循环肿瘤细胞检测试剂盒 |
| CN206457502U (zh) * | 2016-12-13 | 2017-09-01 | 天津安必森生物技术有限公司 | 一种人乳头瘤病毒16，18型核酸检测试剂盒 |
| CN206298600U (zh) * | 2016-12-23 | 2017-07-04 | 西安医臻生物医药科技有限公司 | 一种循环肿瘤细胞捕获试剂盒 |
| WO2018196335A1 (en) * | 2017-04-24 | 2018-11-01 | Wwhs Biotech, Inc | Method for screening circulating tumor cells with multi-enhanced near-infrared fluorescence biochip |
| CN108441477A (zh) * | 2017-05-22 | 2018-08-24 | 浙江大学 | 一种基于csv抗体富集捕获胰腺癌循环肿瘤细胞的方法 |
| CN107402296A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-28 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的免疫荧光染色及判读方法 |
| CN107656044A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-02-02 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及检测方法 |
| CN207620215U (zh) * | 2017-12-13 | 2018-07-17 | 浙江丽尚建材科技有限公司 | 一种轻质隔热集成墙板 |
| CN207870115U (zh) * | 2017-12-14 | 2018-09-18 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种鱼类增殖放流运输密度胁迫实验装置 |
| CN108179134A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-19 | 武汉大学 | 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用 |
| CN207907562U (zh) * | 2018-01-10 | 2018-09-25 | 杭州艾劲科技有限公司 | 一种循环肿瘤dna捕获试剂盒 |
| CN108753571A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种细胞分型捕获芯片及方法 |
| CN208297530U (zh) * | 2018-06-12 | 2018-12-28 | 中国人民解放军新疆军区总医院 | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒 |
| CN109239030A (zh) * | 2018-08-10 | 2019-01-18 | 北京莱尔生物医药科技有限公司 | 一种检测循环肿瘤细胞her2不同位点和er、pr的试剂盒及应用 |
| CN109136065A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-04 | 重庆金域医学检验所有限公司 | 一种远程hpv检测试剂盒 |
| CN208666021U (zh) * | 2018-09-14 | 2019-03-29 | 重庆金域医学检验所有限公司 | 一种利于样品保存的试剂盒 |
| CN109856388A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-06-07 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒 |
| CN208933372U (zh) * | 2019-01-18 | 2019-06-04 | 柯尊富 | 一种尿路上皮患者外周血循环肿瘤细胞鉴定试剂盒 |
| CN210846424U (zh) * | 2019-06-12 | 2020-06-26 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Biology and clinical significance of circulating tumor cell subpopulations in lung cancer;Linda O’Flaherty;《TRANSLATIONAL LUNG CANCER RESEARCH》;全文 * |
| Dynamic change of PD-L1 expression on circulating tumor cells in advanced gastrointestinal tumor patients undergoing PD-1 blockade therapy;Chunyan Yue;《Journal of Clinical Oncology》;全文 * |
| Vimentin联合CK、EpCAM用于中晚期乳腺癌患者循环肿瘤细胞的检测;梁容瑞;石立彦;史悦;石凤灵;李伟;陶敏;李大鹏;;广西医科大学学报(01);全文 * |
| 应用微流控芯片富集循环肿瘤细胞的发展现状及展望;臧彬;于敏;方瑾;;解剖科学进展(05);全文 * |
| 精准医学背景下CTC检测的应用;高阳;张景春;康熙雄;;中国医疗器械信息(11);全文 * |
| 肝癌患者循环肿瘤细胞PD-L1表达及其临床意义;林俊龙;黄贻培;罗伟鑫;许磊波;刘超;;中华肝脏外科手术学电子杂志(03);全文 * |
| 表面蛋白EpCAM检测循环肿瘤细胞缺陷的研究进展;谢瑞芝;黎必非;练殊;李书慧;贾力;;癌症进展(10);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110142068A (zh) | 2019-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110389219B (zh) | 一种上皮间质混合型及pd-l1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法 | |
| CN106076445B (zh) | 微流控试剂卡及其检测方法和应用 | |
| CN105785005A (zh) | 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及其应用 | |
| Sheng et al. | Comparison of analytic performances of Cellsearch and iFISH approach in detecting circulating tumor cells | |
| EP2753924B1 (en) | Methods and compositions for cytometric detection of circulating tumor cells in a sample | |
| US10365266B2 (en) | Molecular characterization of circulating tumor cells | |
| CN105137096B (zh) | 一种用于血型抗体检测的试剂盒及其应用 | |
| CN105435867A (zh) | 检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片 | |
| CN103592432A (zh) | 一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法 | |
| CN109211868A (zh) | 一种快速定量检测myo的微流控荧光免疫芯片 | |
| CN101377514A (zh) | 胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN105891511A (zh) | 用于循环肿瘤细胞和中性粒细胞鉴定的探针及试剂盒 | |
| CN109211867A (zh) | 一种快速定量检测bnp的微流控荧光免疫芯片 | |
| CN110142068B (zh) | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法 | |
| Li et al. | Micro-plate magnetic chemiluminescence immunoassay and its applications in carcinoembryonic antigen analysis | |
| ITRM20130700A1 (it) | Metodo per il rilevamento di cellule tumorali circolanti | |
| CN111812323A (zh) | 己糖激酶2用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测及试剂盒 | |
| CN110174519B (zh) | 一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法 | |
| CN106996976A (zh) | 基于微流控技术的ctc蛋白质分型试剂盒 | |
| CN210846424U (zh) | 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒 | |
| CN201477095U (zh) | 灵敏快速的肝硬化和肝癌磁珠酶免法诊断试剂盒与磁珠 | |
| CN205067292U (zh) | 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒 | |
| CN109211866A (zh) | 一种快速定量检测ck-mb的微流控荧光免疫芯片 | |
| Pugia et al. | Enrichment and detection of circulating tumor cells and other rare cell populations by microfluidic filtration | |
| CN205749526U (zh) | 一种elisa检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |