CN101377514A - 胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种采用生物素－亲和素系统的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：阴性和阳性对照品；样品稀释液；亲和素化的固相载体；生物素化的胰岛素抗原；碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体；化学发光底物和浓缩洗涤液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：配制阴性和阳性对照品；配制样品稀释液；以亲和素包被固相载体；使胰岛素抗原生物素化；以碱性磷酸酶标记羊抗人IgG抗体；配制化学发光底物；配制浓缩洗涤液；分装上述各组分并组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种采用生物素-亲和素系统的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

胰岛素自身抗体(Insulin autoantibodies，IAA)是胰岛素依赖型糖尿病(Insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)或称I型糖尿病个体的一种特异性免疫学标志物，IDDM是由于胰腺中的β细胞遭到免疫破坏，最终导致胰岛素分泌不足引起的。在有患IDDM基因倾向的个体中，对β细胞的免疫性破坏发生于一个无症状的时期，这个时期被称为糖尿病前期，在IDDM的临床诊断之前，糖尿病前期就已经存在多年，在这个时期，人体血清中可检测出胰岛素自身抗体和胰岛细胞抗体。因此，检测胰岛素自身抗体对于IDDM的早期诊断具有重要的临床意义。

目前，胰岛素自身抗体的检测方法主要有放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)。放射免疫分析法必须使用放射性标记物，对操作人员存在放射性危害，同时，由于其使用的放射性物质时刻都在衰变，试剂保存时间不长，为临床应用带来诸多不便；而使用较广的酶免疫分析方法存在检测范围窄，灵敏度低等缺点，也不能满足临床需求。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫和酶免疫相似，不同之处是以发光物质代替放射性核素或酶联显色底物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。

生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，它们均可与抗原抗体等大分子生物活性物质偶联，它们的结合迅速、专一、稳定，可以增加参与反应的有活性的抗原或抗体数，与固相直接包被相比，提高了测定的灵敏度，节省了原料和成本，同时便于产业化生产和控制。

目前，化学发光免疫分析技术结合生物素—亲和素系统还未见应用于胰岛素自身抗体免疫分析产品中。现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。

发明内容

本发明很好地解决了上述问题，即将化学发光技术与生物素-亲和素系统有效结合，应用于检测胰岛素自身抗体，并提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测胰岛素自身抗体的试剂盒。该试剂盒既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速等特点，易于标准化操作，且测试中不使用有放射性的试剂，试剂保存时间长，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可应用于全自动的测量系统，可实现大批量快速检测，使用成本低，适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种化学发光免疫分析测定胰岛素自身抗体的试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品；2)样品稀释液；3)亲和素化的固相载体；4)生物素化的胰岛素抗原；5)碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体；6)化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；以及7)浓缩洗涤液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述样品稀释液为灭活的小牛血清；所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：1)配制胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品；2)配制样品稀释液；3)固相载体包被亲和素；4)使胰岛素抗原生物素化；5)用碱性磷酸酶标记羊抗人IgG抗体；6)配制化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；7)配制浓缩洗涤液；8)分装上述阴、阳性对照品、样品稀释液、生物素化抗原、酶标记抗体、化学发光底物和浓缩洗涤液；以及9)组装为成品。

根据本发明的方法，优选，所述固相载体包被亲和素的步骤3)包括以下步骤：用0.05M的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；然后进行洗涤、BSA封闭、除湿干燥并用铝箔袋封装。

在上述方法中，优选，所述样品稀释液为灭活的小牛血清；所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

本发明“胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒”可以非常专一地检测出样本中是否含有胰岛素自身抗体，从而为I型糖尿病的诊断提供重要的临床依据。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒的各项指标均优于酶免疫分析法的水平。并且，本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供了一种非常有价值的检测手段。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，同时又结合生物素-亲和素系统，因而具有与酶免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，可为胰岛素自身抗体的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

具体实施方式

实施例1制备本发明的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒

在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，然后对包被方法进行了研究，选择出了最合适的包被缓冲液和封闭液，找到了最佳的浓度条件，并且，制备出了具有较高活性的酶标记物以及相应的化学发光底物液。

一、酶标抗体和生物素化抗原的制备

1.碱性磷酸酶标记抗体的制备

用戊二醛法将羊抗人IgG抗体与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，—20℃以下保存。

2.生物素偶联胰岛素抗原的制备

(1)用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/mL；

(2)用0.1mol/L pH值为9.0的NaHCO₃将纯化的胰岛素抗原稀释为1～2mg/mL；

(3)按BNHS与抗体容积比为1：8或重量比1：7左右混合，室温搅拌下反应2～4h；

(4)装入透析对0.05mol/LpH值为7.2的PBS，4℃透析过夜，结合物加等体积甘油，小量分装，—20℃以下保存。

二、胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品的制备

阳性对照品：将经确切方法确定的高滴度胰岛素自身抗体阳性人血清混合成阳性血浆(Positive Pool，血浆份数大于5)，56℃ 1小时加温灭活后，使用新生牛血清进行适当稀释，加入生物防腐剂和万分之一(W/V)的食品红使之成为红色，除菌过滤，2～8℃保存。

阴性对照品：将胰岛素自身抗体检测为阴性的人血清混合(血浆份数大于10)，56℃ 1小时加温灭活后，除菌过滤，2～8℃保存。

三、酶标抗体浓度选定

采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度为1：8000。

四、亲和素化的微孔板制备

(1)包被

称取无水碳酸钠0.795g，碳酸氢钠1.47g，用500mL双蒸水溶解混匀后，调整pH至9.6，加入适量的亲和素混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔130μL，4℃放置24小时。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭

称取NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，BSA 10g，Proclin 300 1mL，加双蒸水定容至1000mL，溶解混匀，测定pH值为7.0。

将配制好的封闭液加入洗涤后的微孔板各孔中，每孔300μL，4℃放置24小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行封袋。封袋后放置15分钟检查有无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。

五、样品稀释液

基于1000mL的小牛血清，加1mL Proclin 300混匀。

六、化学发光底物

本发明所使用的碱性磷酸酶的化学发光底物液的配制方法：

Tris         24g

NaCl         160g

KCl          4g

HCl          15mL

Proclin 300  1mL

AMPPD        200mL

双蒸水       定容至1000mL溶解，混匀后分装

七、浓缩洗涤液配方

Tris         24g

NaCl         160g

KCl          4g

HCl          15mL

双蒸水       定容至1000mL

调整pH值至7.4。

八、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

实施例2～3制备本发明的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒

除以塑料珠、塑料管为固相载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒。

实施例4制备本发明的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒

除以磁性颗粒为固相载体，以经典的戊二醛法将亲和素联结于磁性颗粒表面外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒。

实施例5本发明的试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒的具体操作如下：

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15～30分钟。

2)取出所需量的包被板条，插入板架上。

3)设阴性对照三孔，阳性对照两孔，空白孔一孔，分别加入50μL阴性对照、阳性对照和血清样品(样品预先用样品稀释液以1：100倍稀释)于相应的孔中，然后各孔再加入50μL生物素化抗原(空白孔除外)，用封口膜将板条封好，置37℃温育1小时。

4)甩去反应液，每孔加满20倍稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

5)每孔加入酶标记物100μL，空白孔除外，用封口膜将板封好，置37℃温育1小时。

6)甩去反应液，每孔加满20倍稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

7)每孔加化学发光底物100μL，用微量震荡器混匀，室温(20～25℃)避光反应30分钟。必须于加化学发光底物液后的第30～90分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

8)各孔的RLU值与Cut off值进行比较，Cut off值＝15倍阴性对照平均值，样品测定值大于Cut off值，则判断为阳性，否则为阴性。

实施例6本发明的试剂盒与酶联免疫试剂盒的平行对比试验

(1)试剂盒的准备

1)胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒的制备如实施例1；

2)外购胰岛素自身抗体酶联免疫测定试剂盒；

(2)检测样本来源

从医院收集正常人血清样本183例，确诊I型糖尿病血清样本60例，甲状腺功能亢进血清样本35例及肾脏疾病血清样本52例。

(3)检测方法

采用上述两种胰岛素自身抗体检测试剂进行平行检测，测定程序和结果判断严格按照各试剂盒的说明书进行。

对上述两种胰岛素自身抗体测定试剂盒分别进行灵敏度、精密性、稳定性等性能指标评价。

(4)检测结果

表1  两种测定试剂盒的性能指标评价

表2  两种测定试剂盒对样本的检测结果

表1和表2所述数据表明，本发明试剂盒的精密性和稳定性优于酶联免疫检测试剂盒，灵敏度显著提高。酶联免疫检测试剂盒出现2份假阳性、4份假阴性，临床符合率为98.18％，而本发明试剂盒只有1例假阳性，临床符合率为99.70％，显著优于酶联免疫检测试剂盒，充分显示了本发明试剂盒的优越性。

Claims (9)

1、一种胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品；2)样品稀释液；3)亲和素化的固相载体；4)生物素化的胰岛素抗原；5)碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体；6)化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；以及7)浓缩洗涤液。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为灭活的小牛血清。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：1)配制胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品；2)配制样品稀释液；3)固相载体包被亲和素；4)使胰岛素抗原生物素化；5)用碱性磷酸酶标记羊抗人IgG抗体；6)配制化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；7)配制浓缩洗涤液；8)分装上述阴、阳性对照品、样品稀释液、生物素化抗原、酶标记抗体、化学发光底物和浓缩洗涤液；以及9)组装为成品。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品稀释液为灭活的小牛血清。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固相载体包被亲和素的步骤3)采用以下方法：用0.05M的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；然后进行洗涤、BSA封闭、除湿干燥并用铝箔袋封装。

8、如权利要求5或7所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。