CN108440666B - 一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶联免疫技术领域，公开了一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺。本发明通过改进的生物素化工艺对insulin抗原进行生物素化，获得式1所示结构的生物素化的insulin抗原，再经预先包被亲和素放大作用，大大提高了抗原insulin的包被效率，从而能显著提高以其制备的insulin抗体检测试剂或试剂盒的灵敏度，可大大提高insulin抗体检测的阳性率，减少漏检或误检的几率；
Description
技术领域
本发明涉及酶联免疫技术领域，具体涉及一种生物素化的insulin抗原及其生物素化工艺。
背景技术
胰岛素(insulin)自身抗体的检测可作为自身免疫性β细胞损伤的标志，可用于早期发现和预防1型糖尿病，现在使用较广的是间接酶联免疫法，微孔板上包被胰岛素抗原，加待测血清，其中血清中的胰岛素自身抗体与微孔板上包被胰岛素抗原反应，洗涤，加酶标二抗，洗涤，加底物显色。
生物素化是将生物素共价连接到蛋白质、核酸、或其他分子的过程。生物素能与亲和素或链霉亲和素结合，每个亲和素或链霉亲和素能结合四个分子生物素分子，且亲和力极强，亲和常数k＝1015L/mol，比抗原抗体间亲和力(K＝10.5-11L/mol)至少高100倍，两者结合特异性高，稳定性好。利用生物素-亲合素系统具有的特异性强和稳定性好的亲和作用，可将蛋白质生物素化后，再与亲和素/链霉亲和素特异性的结合，从而实现信号的放大、提高检测灵敏度的目的。目前市场上已有不少成熟的生物素化试剂，如thermo公司的
Sulfo-NHS-LC-Biotin用于抗体、蛋白质的生物素化。
但是，常规的insulin生物素化方法，如使用
Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒获得的insulin-生物素偶联物，用于开发的insulin抗体检测试剂盒存在灵敏度不足，阳性率低的缺点，存在漏检或误检等风险，均无法达到要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物素化的insulin抗原及其制备工艺，使得所述insulin抗原能够显著提高检测糖尿病胰岛素自身抗体(IAA)的阳性率；
本发明的另外一个目的在于提供上述insulin抗原在制备酶联免疫试剂盒中的应用，特别是用于检测糖尿病的相关试剂盒；
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种生物素化的insulin抗原，具有式1所示结构：
其中，圆形表示胰岛素氨基酸链，1≤x≤n，n表示胰岛素氨基酸链上氨基的数目，x和n均为整数；椭圆代表大分子蛋白氨基酸链，y+z≤m，z≥10，y≥1，m表示大分子蛋白氨基酸链上的氨基数目，y、z和m均为整数，若z/x为非整数，则z/x取整数且在整数位上加1。
针对现有技术中insulin的生物素化效率不高，效果不好而导致的其用于开发insulin抗体检测的试剂或试剂盒灵敏度不足，阳性率偏低的问题，本发明通过改进的工艺将多个胰岛素分子通过SATA以及SMCC偶联到大分子蛋白氨基上，同时大分子蛋白偶联上生物素，形成的Biotin-大分子蛋白-insulin偶联物(式1结构)，结合多个insulin分子和生物素分子(示意图见图1)，再经预先包被亲和素放大作用，大大提高了抗原insulin的包被效率，从而能显著提高以其制备的insulin抗体检测试剂或试剂盒的灵敏度，可大大提高insulin抗体检测的阳性率，减少漏检或误检的几率。
作为优选，所述大分子蛋白为HBA、BSA、OVA或酪蛋白；所述x优选为1。
经过试验验证，采用常规方法获得的生物素化的insulin与本发明生物素化的insulin抗原，在用于检测时，本发明能够获得更高的IAA阳性率，避免样本因较低浓度而被漏检或错判。
因此，本发明提出了所述生物素化的insulin抗原在制备酶联免疫试剂盒中的应用，特别是在制备糖尿病酶联免疫检测试剂盒中的应用。
根据所述应用，本发明提供了一种糖尿病抗体谱检测试剂盒，包括包被有糖尿病自身抗原的蛋白芯片，所述糖尿病自身抗原通过亲和素化的蛋白芯片与生物素化的糖尿病自身抗原相互结合包被，所述生物素化的糖尿病自身抗原本发明所述insulin抗原。其中，亲和素优选为链霉亲和素。
作为优选，所述试剂盒还包括酶联免疫吸附试剂盒其他常用组分，如酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液。本发明所述酶标抗体中酶标记物可选择常规的酶以及对应的显色液，如辣根过氧化物酶和TMB显色剂。
作为优选，所述糖尿病自身抗原选自IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8、insulin中的一种或两种以上；在本发明具体实施方式中，所述糖尿病自身抗原为IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8和insulin。
在包被中，所述糖尿病自身抗原采用CB缓冲液或Tris缓冲液为抗原稀释缓冲液进行包被；作为优选，所述缓冲液选自PH9.6的CB缓冲液或PH8.5的Tris缓冲液，更优选地，在缓冲液中添加PEG或者PVP，Proclin300，同时添加了水溶性的环糊精，可使包被更稳定、抗原包被点更规则、更圆，CV更小。
其中，水溶性环糊精可以是Captisol、2-羟基-β-环糊精或羧甲基-β-环糊精等，浓度为0.02％；PEG或者PVP的浓度为5％，Proclin300浓度为0.05％，所述百分比中除Proclin300是体积百分比之外，其余都是质量百分比(w/v)。
在本发明具体实施方式中，GAD和CPH的稀释缓冲液为PH8.5的0.02M Tris缓冲液(含5％的PEG、0.05％的Proclin300，0.02％Captisol，以及15％的甘油)，终浓度分别为8ug/ml、30ug/ml。
IA-2、IC、insulin、ZnT8的稀释缓冲液为PH9.6的CB缓冲液，终浓度分别为10ug/ml、10ug/ml、80ug/ml、15ug/ml。
此外，本发明试剂盒中的蛋白芯片还包括阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点中的一个或两个以上；更为具体地，至少有一个阴性质控点(NC)和一个阳性质控点(PC)；至少一个样品点质控点(SC)和一个酶标质控点(EC)；至少3个参考曲线点(S1-S3)以及一个芯片本身包被的位置参考点(Loc)。
在具体实施方式中，本发明蛋白芯片上还包含一个阴性质控点(NC)和一个阳性质控点(PC)；一个样品点质控点(SC)和一个酶标质控点(EC)；3个参考曲线点(S1-S3)以及一个芯片本身包被的位置参考点(Loc)。
其中，阳性质控点可以是人IgG，则对应使用的酶标抗体就是抗人IgG的酶标。阳性质控点也可以是包被BSA偶联的DNP，则对应使用的酶标抗体就是抗人IgG的酶标以及抗DNP的酶标的混合液。
而阴性质控点可以是低于反应信号值的微量浓度的人IgG，或采用其他的无关蛋白来替代；样品质控点可以是羊抗人的IgG或其他的抗人IgG；酶标质控点可以是人IgG，或其他的抗兔的抗体(酶标用的是兔抗人IgG)，例如羊抗兔IgG抗体。所述参考曲线点在具体实施过程中是低、中、高三种浓度的人IgG。
蛋白芯片本身的位置参考点是人IgG溶液，主要对蛋白芯片上阵列取值时的定位作用。
优选地，上述阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点也通过预先生物素化与亲和素化的底板包被。
同时，本发明还提供了所述生物素化的insulin抗原的制备工艺，具体如下：
步骤1、将insulin与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯(SATA，购自Thermo)室温反应，透析纯化(副产物是小分子可以透过透析袋，大分子insulin-SH-P不能透过透析袋，通过多次透析的方式可以除去副产物)后获得insulin-SH-P，反应式如下：
insulin-SH-P中，insulin表示胰岛素，SH表示活性巯基基团，P表示保护基团，即
insulin结构式中，圆形表示胰岛素氨基酸链，n表示胰岛素氨基酸链上氨基的数目，1≤x≤n，x和n均为整数，x优选为1。
insulin-SH-P与含EDTA(螯合溶液中的金属离子，除去溶液中金属离子的干扰)和盐酸羟胺的PBS室温反应去掉保护基团，经葡聚糖凝胶柱纯化后形成含活性巯基基团的insulin-SH，备用，反应式如下：
大分子蛋白、Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐(SMCC，购自Thermo)和琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素室温反应，经过PBS透析3次纯化(副产物是小分子可以透过透析袋，大分子蛋白不能透过透析袋，通过多次透析的方式可以除去副产物)获得Biotin-大分子蛋白-SMCC，所述大分子蛋白为HBA、BSA、OVA或酪蛋白，反应式如下：
根据上述反应过程，在添加反应物时，既可以将大分子蛋白、Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐(SMCC)和琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素一同添加完成反应，也可以先将大分子蛋白和琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素反应，然后再添加SMCC分两步完成，反应实质不会发生改变。在该步反应中，椭圆代表大分子蛋白氨基酸链，m表示大分子蛋白氨基酸链上的氨基数目，y+z≤m，z≥10，y≥1，y、z和m均为整数。
步骤2、将备用的insulin-SH和Biotin-大分子蛋白-SMCC混合室温反应，经过葡聚糖凝胶柱纯化后获得Biotin-大分子蛋白-Insulin，具有式1所示结构，作为生物素化的insulin抗原，反应式如下：
Biotin-大分子蛋白-Insulin中，若z/x为非整数，则z/x取整数且在整数位上加1。
其中，insulin与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯分别优选以PBS(优选为pH值为7.0、0.01M的PBS，以下PBS均优选于此)和二甲基亚砜为溶剂配制反应溶液，即insulin的PBS溶液，insulin浓度为2-4mg/mL；S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液，S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯浓度为40-80mmol/L。insulin的PBS溶液与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液的体积比为1mL：10μL。
含EDTA和盐酸羟胺的PBS中，EDTA浓度为20mmol/L，盐酸羟胺浓度为0.5mol/L，pH值为7.0；insulin-SH-P和含EDTA和盐酸羟胺的PBS的体积比为(6-10):1。
HBA和Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐优选采用PBS作为溶剂配制反应溶液，琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素以二甲基亚砜为溶剂配制反应溶液，即人血白蛋白(HBA)的PBS溶液，HBA浓度为10-20mg/mL；Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐的PBS溶液，Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐浓度为10-15mg/mL；琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素的二甲基亚砜溶液，琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素的浓度为0.25-0.4mol/L。Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐的PBS溶液与琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素的二甲基亚砜溶液等比例混合溶液与人血白蛋白(HBA)的PBS溶液的体积比为(10-20μL)：1mL。
在本发明具体实施方式中，上述生物素化的方法可具体如下：
准备2-4mg/mL的胰岛素PBS溶液，配置浓度约为40-80mmol/L的S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液(A溶液)，将1-10微升的A溶液加入到1毫升的胰岛素PBS溶液中混匀室温反应1-4小时，反应产物在PBS中透析3次后回收得到insulin-SH-P,4度暂存备用；
以PBS为溶剂配置0.5mol/L的盐酸羟胺(含20mmol/L的EDTA，pH7.0)作为B溶液，按insulin-SH-P和含EDTA和盐酸羟胺的PBS的体积比为(6-10):1，混合室温反应1-2小时脱去保护基团，经葡聚糖凝胶柱纯化后形成含活性巯基基团的insulin-SH；
准备10-20mg/mL的人血白蛋白(HBA)的PBS溶液，配置10-15mg/mL的Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐的PBS溶液作C溶液，另配置浓度为0.25-0.4mol/L琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素的二甲基亚砜溶液作D溶液，将C溶液与D溶液按1：1比例混合后取10-20微升加入到1mL 10-20mg/mL的人血白蛋白PBS溶液中混匀室温反应1-2小时，用PBS透析3次纯化得到Biotin-HBA-SMCC；
将上述纯化的insulin-SH与Biotin-HBA-SMCC按体积比10:(1-4)混合室温反应30-60分钟后得到Biotin-大分子蛋白-Insulin，作为生物素化的insulin抗原。
由以上技术方案可知，本发明通过改进的生物素化工艺对insulin抗原进行生物素化，获得式1所示结构的生物素化的insulin抗原，再经预先包被亲和素放大作用，大大提高了抗原insulin的包被效率，从而能显著提高以其制备的insulin抗体检测试剂或试剂盒的灵敏度，可大大提高insulin抗体检测的阳性率，减少漏检或误检的几率。
附图说明
图1所示为本发明所述生物素化的insulin抗原的结构示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种生物素化的insulin抗原及其制备工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述生物素化的insulin抗原、制备工艺和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的生物素化的insulin抗原、制备工艺和相关应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明所述insulin抗原的式1结构中，大分子蛋白(一般在几十Kda以上，如HBA为66Kda)相对于胰岛素(5.8Kda)而言，分子很大，其上的氨基数目m远远大于胰岛素上的氨基数目n；同时，由于大分子蛋白上存在数量很多的氨基，故可以通过控制反应物的用量，实现SMCC和琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素共用大分子蛋白上的氨基进行偶联。
对于本发明式1结构的insulin抗原，x无论为1还是为胰岛素上的氨基数目n，都不影响在同一个大分子蛋白上连接多个胰岛素的效果，但x＝1时所连接的胰岛素数量最多。
以下就本发明所提供的一种生物素化的insulin抗原及其制备工艺做进一步说明。
实施例1：本发明所述生物素化的insulin抗原的制备
准备2mg/mL的胰岛素PBS溶液，配置浓度约为50mmol/L的S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液(A溶液)，将10微升的A溶液加入到1毫升的胰岛素PBS溶液中混匀室温反应1小时，反应产物在PBS中透析3次后回收得到insulin-SH-P,红外和核磁检测显示与预期结构一致，4度暂存备用；
以PBS为溶剂配置0.5mol/L的盐酸羟胺(含20mmol/L的EDTA，pH7.0)作为B溶液，在上述1mL的insulin-SH-P中加入100微升的B溶液，混合室温反应1小时，脱盐柱脱盐纯化得到insulin-SH，红外和核磁检测显示与预期结构一致。
准备10mg/mL的人血白蛋白(HBA)的PBS溶液，配置10mg/mL的Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐的PBS溶液作C溶液，另配置浓度为0.25mol/L琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素的二甲基亚砜溶液作D溶液，将C溶液与D溶液按1：1比例混合后取20微升加入到1mL10mg/mL的人血白蛋白PBS溶液中混匀室温反应1小时，用PBS透析3次纯化得到Biotin-HBA-SMCC，红外和核磁检测显示与预期结构一致；
将上述纯化的insulin-SH与Biotin-HBA-SMCC按体积比10:1混合室温反应30分钟后得到Biotin-HBA-Insulin，作为生物素化的insulin抗原，红外和核磁检测显示与式1预期结构一致。
实施例2：常规生物素化的insulin抗原的制备
用Thermo公司的
Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒对insulin进行生物素化获得Biotin-Insulinn偶联物。
实施例3：实施例1与实施例2制备的抗原对insulinA的检测效果比较
将上述实施例1与实施例2分别制备的生物素化胰岛素抗原，分别同时进行包被，并检测insulin抗体(insulinA)阳性和阴性血清，对检测结果进行比较。具体步骤如下：
1、芯片的预处理：
将稀释了6K倍的链霉亲和素(稀释液为PH7.4的0.01M的PBS)，加入96孔板中，50ul/孔，然后于37℃恒温箱中静置2h。
取出96孔板，用PBS洗涤3次，最后用纯化水洗涤一次，吸干。洗涤条件：300ul/孔，静置30sec/次。
包被：将以上两种生物素化的insulin抗原分别用PH9.6的CB缓冲液(含5％的PEG、0.05％的Proclin300，以及0.02％的Captisol)进行稀释，至终浓度80ug/mL，分别用0.22um滤膜过滤，然后通过BioDot精密点样仪，以10nL的体积进行包被，然后于4℃，包被24-30h。
封闭：取出包被的芯片，用PH7.4的PBST洗涤液清洗3次,然后每孔加入150ul的封闭液(PH7.4，含有1％BSA的磷酸氢二钠溶液，其中添加了0.8％甘露醇，1％的PVA2W、0.05％的叠氮钠防腐剂)，室温封闭1h，然后拍干，于湿度15％以下，室温放置，干燥4h，后密封、2-8℃保存。
检测：
4.1取出包被板及反应液，平衡至室温；
4.2加样：将阴性和阳性对照血清、以及用样品稀释液稀释了101倍的待测样品，每孔100uL加入待测反应孔中反应。
4.3温育：室温静置反应30min。加300uL洗涤液(0.02MTris，0.15MNaCl，0.05％Tween20，pH7.4)，洗涤3次，每次静置1min。
4.4加酶标抗体：每孔加入50uL酶标抗体(酶标稀释液稀释了4K倍的HRP标记的兔抗人IgG)。
4.5温育：室温静置反应30min。加300uL洗涤液，洗涤3次，每次静置1min。
4.6显色：每孔加入TMB显色剂50uL，室温静置，避光反应30min。
4.7测定：30min内，用检测仪读取并判断每个反应孔对应抗体的信号值。
检测结果：
选取了8个阳性样本，8个弱阳性样本以及5个阴性样本，对比检测结果见下表。
表1
由表1可以看出，与本发明中生物素化的insulin抗原比较，采用一般的生物素化insulin抗原对阳性样本的检测效果不如本发明，使用本发明生物素化的insulin抗原可以大幅提高insulinA的阳性率，效果比使用一般的生物素化试剂盒明显要好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种生物素化的insulin抗原，其特征在于，具有式1所示结构：
其中，圆形表示胰岛素，1≤x≤n，n表示胰岛素上氨基的数目，x和n均为整数；椭圆代表大分子蛋白HBA、BSA、OVA或酪蛋白，y+z≤m，z≥10，y≥1，m表示大分子蛋白上的氨基数目，y、z和m均为整数，若z/x为非整数，则z/x取整数且在整数位上加1。
2.权利要求1所述生物素化的insulin抗原在制备酶联免疫试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒为糖尿病免疫检测试剂盒。
4.权利要求1所述生物素化的insulin抗原的制备工艺，其特征在于，包括：步骤1、将insulin与S-乙酰硫基乙酸琥珀酰亚胺酯室温反应，透析纯化后获得insulin-SH-P：n表示insulin上氨基数目，1≤x≤n，x和n均为整数；
insulin-SH-P与盐酸羟胺的PBS室温反应去掉保护基团，经葡聚糖凝胶柱纯化后形成含活性巯基基团的insulin-SH，备用；
大分子蛋白、Sulfo-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐和琥珀酸亚酰胺-十二聚乙二醇-生物素室温反应，经过PBS透析纯化获得Biotin-大分子蛋白-SMCC；m表示大分子蛋白上的氨基数目，2≤y+z≤m，y、z和m均为整数
步骤2、将备用的insulin-SH和Biotin-大分子蛋白-SMCC混合室温反应，经过葡聚糖凝胶柱纯化后获得Biotin-大分子蛋白-Insulin，具有式1所示结构，作为生物素化的insulin抗原；
其中，圆形表示胰岛素，1≤x≤n，n表示胰岛素上氨基的数目，x和n均为整数；椭圆代表大分子蛋白，2≤y+z≤m，m表示大分子蛋白上的氨基数目，y、z和m均为整数，若z/x为非整数，则z/x取整数且在整数位上加1。
5.一种糖尿病抗体谱检测试剂盒，其特征在于，包括包被有糖尿病自身抗原的蛋白芯片，蛋白芯片上包被的糖尿病自身抗原通过将其生物素化并和亲和素化的蛋白芯片相互结合的方式包被在蛋白芯片上，所述生物素化的糖尿病自身抗原包含权利要求1所述生物素化的insulin抗原。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述糖尿病自身抗原选自IA-2、GAD、IC、CPH、ZnT8、insulin中的一种或两种以上。
7.根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，所述糖尿病自身抗原采用CB缓冲液或Tris缓冲液为抗原稀释缓冲液进行包被。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述蛋白芯片还包括阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点中的一个或两个以上。
9.根据权利要求5-6任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述蛋白芯片还包括阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点中的一个或两个以上。
10.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液。
11.根据权利要求5-6、8任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液。
12.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，还包括酶标抗体、样品稀释液、洗涤液和显色液。
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