CN117347626B - 人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法 - Google Patents

人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人胰岛素样生长因子结合蛋白‑1化学发光免疫分析试剂盒，包括第一试剂、第二试剂，第一试剂为链酶亲和素磁微球与生物素化的IGFBP‑1抗体溶液，第二试剂为由碱性磷酸酶标记的IGFBP‑1抗体；和样本处理液。还公开了一种所述人胰岛素样生长因子结合蛋白‑1化学发光免疫分析试剂盒的制备方法。本发明采用链酶亲和素磁微球作为载体，生物素标记一株IGFBP‑1抗体，碱性磷酸酶标记另一株IGFBP‑1抗体的化学发光体系对宫颈分泌物或阴道流出物中的IGFBP‑1进行定量检测，且与大型化学发光免疫分析仪、小型化学发光免疫分析仪及单人份化学发光免疫分析仪均可配套使用，满足临床不同需求。

Description

人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及 其制备方法
技术领域
本发明涉及生物蛋白检测技术领域，特别是涉及一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术
胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBPs）家族是一组可特异限制、调节胰岛素生长因子Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ、Ⅱ）的可溶性蛋白质，包括6种相继发现的IGFBP,分别命名为IGFBP1-6。IGFBP-1由234个氨基酸组成，分子量约为25KD。血液循环中的IGFBP-1主要由肝细胞产生，作为一种自分泌和旁分泌因子，在女性生殖系统中起重要作用，特别是对排卵、受精卵着床到胎儿分娩。羊水中的IGFBP-1由母体肝脏、蜕膜和胎儿合成并分泌。妊娠早期胚外体腔有很高的IGFBP-1，羊水中很少，妊娠中期羊膜和绒毛/蜕膜融合，羊水中IGFBP-1浓度升高几个数量级，比母体血清高100-1000倍，且不受宫颈粘液、尿液、精液的影响。在妊娠12周后，正常在宫颈分泌物中检测不到IGFBP-1，但当先兆早产，蜕膜与绒毛膜分离，IGFBP-1可释放到宫颈分泌物中。因此，通过IGFBP-1的测定可预测早产。胎膜早破是围产期母儿发病率和死亡率的主要原因之一，发生率约为10-17%。胎膜早破时，羊水中IGFBP-1渗漏入宫颈粘液中，因此，检测阴道或宫颈分泌液中IGFBP-1可辅助诊断胎膜早破，且其敏感性和特异性均优于传统诊断指标。
重庆乾德生物技术有限公司申报的发明专利《一种胰岛素样生长因子结合蛋白-1检测试剂盒》采用的是硝酸纤维素膜上包被检测抗体，荧光微球标记标记抗体的检测试纸卡的定量检测方法；上海凯璟生物科技有限公司申报的发明专利《基于上转换发光的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)芯片检测系统及试剂》采用的是上转换发光UCP颗粒标记标记抗体，手工滴加样本入检测杯中反应后再插入荧光检测仪检测。上述胶体金/量子点荧光检测均存在准确度、重复性、灵敏度不够的问题，且手工操作难免会带来检测误差，因此亟需提供一种新型的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法，采用的是链酶亲和素磁微球作为载体，生物素标记一株IGFBP-1抗体，碱性磷酸酶标记另一株IGFBP-1抗体的化学发光体系对宫颈分泌物或阴道流出物中的IGFBP-1进行定量检测，且与大型化学发光免疫分析仪、小型化学发光免疫分析仪及单人份化学发光免疫分析仪均可配套使用。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：
第一试剂，为链酶亲和素磁微球与生物素化的IGFBP-1抗体溶液；和
第二试剂，为由碱性磷酸酶标记的IGFBP-1抗体；和
样本处理液。
在本发明一个较佳实施例中，所述链霉亲和素磁微球为活化羧基磁微球与链霉亲和素共价偶联制备。
在本发明一个较佳实施例中，所述第一试剂的浓度为50ug/mL-300ug/mL。
在本发明一个较佳实施例中，所述第二试剂的浓度为0.05ug/ml-0.200ug/ml。
在本发明一个较佳实施例中，所述样本处理液按质量分数包括以下组分：
基质缓冲液 0.02-0.1M/L
NaCl 0.9%
基质金属蛋白酶抑制剂 10.0-50.0mM/mL
Brij-35 0.5%
聚乙烯吡咯烷酮 0.05%-0.3%
十二烷基硫酸钠 0.01%-0.025%
海藻糖 0.05%-0.5%
BSA 0.1%-0.5%
二硫苏糖醇 0.005%-0.03%
亚硫酸氢钠 0.02%-0.1%
醋酸氯己定 0.02%-0.05%。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种如上所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1：第一试剂的制备：
S101：羧基磁微球活化：取悬浮磁微球液到离心管中；移去上清，加入0.1M MES，悬浮磁微球，重复清洗磁微球3-5次；加入EDC溶液及N-羟基琥珀酰亚胺溶液活化磁微球，再重复清洗磁微球2-5次；
S102：活化磁微球与链霉亲和素的共价偶联：制备反应液，将活化的羧基磁微球加入到所述反应液中，充分混匀悬浮磁微球反应，移去离心管中的上清液，加入0.1M MES，悬浮磁微球，重复清洗磁微球3-5次；加所述反应液入清洗过的磁微球中，充分混匀悬浮磁微球反应，移去离心管中的上清液，用TBST 溶液对磁微球进行清洗，并重复清洗3-5次；
S103：生物素化抗体：制备生物素标记试剂NHS-Biotin，取NHS-Biotin置于离心管中，加入经过PBS缓冲液纯化的IGFBP-1抗体，充分吹打混匀，37℃避光静置15min后，室温避光旋转孵育45min；将反应好的生物素化抗体转移到透析袋中透析，并转移至离心管中；
S104：链霉亲和素磁微球与生物素化抗体连接：制备连接反应液；取链酶亲和素磁微球置于磁分离架上，移去上清；加入所述连接反应液，再置于磁分离架上，移去上清，重复清洗2-3次；用所述连接反应液悬浮链酶亲和素磁微球，加入生物素化抗体，用所述连接反应液补充反应体积，并反应，移去离心管中的上清液，重复清洗3-5次；
S2：第二试剂的制备：
S201：抗体处理：取调整浓度后的抗体，加入SATA溶液中，室温避光旋转反应，反应结束后用PBS缓冲液纯化浓缩5-8次；收集抗体加入盐酸羟胺溶液，室温反应，反应结束后用PBS缓冲液纯化浓缩5-8次；
S202：碱性磷酸酶活化：称取SMCC溶解于DMSO中，制成SMCC；取SMCC溶液加入PBS溶液中，得到SMCC溶液；取ALP溶液加入SMCC溶液，室温反应；反应结束后用PBS缓冲液透析；
S203：标记：收集透析纯化后的ALP活化酶，加入处理的抗体，用PBS缓冲液补充体积，室温避光反应；反应结束后用PBS缓冲液透析；收集透析纯化后抗体，用标记缓冲液稀释到使用浓度；
S3：配备样本处理液。
在本发明一个较佳实施例中，将0.15mg链酶亲和素溶解于1.35mL 0.1M MES溶液中，MES溶液的pH为4.0-7.0，再加入用四氢呋喃溶解的1-羟基苯并三氮唑150ul，1-羟基苯并三氮唑的浓度为10mg/mL，充分混匀。
在本发明一个较佳实施例中，称取0.05g聚乙二醇、0.09g NaCl溶于10mL 10mMPBS缓冲液中，得到连接反应液的pH为8.0—8.5。
本发明的有益效果是：
（1）本发明采用链酶亲和素磁微球作为载体，生物素标记一株IGFBP-1抗体，碱性磷酸酶标记另一株IGFBP-1抗体的双抗体夹心法对宫颈分泌物或阴道流出物中的IGFBP-1进行定量检测，其灵敏度、重复性等性能均优于免疫层析法、手工操作等；
（2）本发明将试剂各组分分装入特定试剂条或试剂瓶中，实现与单人份化学发光免疫分析仪、小型化学发光免疫分析仪、大型化学发光免疫分析仪均可配套使用，满足临床不同需求，不仅解决了目前胶体金/量子点荧光检测准确度、重复性、灵敏度不够的问题，也实现了全自动操作，避免手工操作带来的误差，实现宫颈分泌物或阴道流出物中的IGFBP-1的定量检测。
附图说明
图1是本发明试剂盒零浓度标准品与五个浓度标准品批次1的剂量-反应曲线示意图；
图2是本发明试剂盒零浓度标准品与五个浓度标准品批次2的剂量-反应曲线示意图；
图3是本发明试剂盒零浓度标准品与五个浓度标准品批次3的剂量-反应曲线示意图；
图4是利用本发明研制试剂和对比试剂（胶体金）进行临床样本相关性比较的示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒，对宫颈分泌物或阴道流出物中的IGFBP-1进行定量检测，其包括检测试剂，所述检测试剂包括第一试剂、第二试剂和样本处理液。第一试剂为链酶亲和素磁微球与生物素化的IGFBP-1抗体溶液，第二试剂为由碱性磷酸酶标记的IGFBP-1抗体。
优选的，所述链霉亲和素磁微球为活化羧基磁微球与链霉亲和素共价偶联制备。生物素标记通过偶联方法将抗体标记上生物素。
所述样本处理液按质量分数包括以下组分：
基质缓冲液 0.02-0.1M/L
NaCl 0.9%
基质金属蛋白酶抑制剂 10.0-50.0mM/mL
Brij-35 0.5%
聚乙烯吡咯烷酮 0.05%-0.3%
十二烷基硫酸钠 0.01%-0.025%
海藻糖 0.05%-0.5%
BSA 0.1%-0.5%
二硫苏糖醇 0.005%-0.03%
亚硫酸氢钠 0.02%-0.1%
醋酸氯己定 0.02%-0.05%。
其中，基质缓冲液为pH 7.5- 8.5、浓度为0.02-0.1M/L的PB溶液。
采用自制样本处理液对采集的样本进行处理，使采集的宫颈分泌物或阴道流出物完全洗脱，IGFBP-1在样本处理液中2-8℃可稳定保存48h。
需要说明的是，IGFBP-1抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，在此不作限定。
本发明示例中还提供一种如上所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1：第一试剂的制备：
S101：羧基磁微球活化：
（1） 用漩涡混合器充分悬浮磁微球，取5.0mg-20.0mg悬浮磁微球液到离心管中；
（2）将离心管置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；加入1mL 0.1M MES（pH4.0-7.0），悬浮磁微球；再置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清（重复清洗磁微球3-5次）；
（3） 加入5μL-120μL 10mg/mL的EDC溶液及5μL-120μL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液，用漩涡混合器充分混匀室温活化磁微球30min；
（4） 将活化磁微球置于磁分离架上，按步骤（2）方法重复清洗磁微球2-5次。
S102：活化磁微球与链霉亲和素的共价偶联：
（1） 反应液：将0.15mg链酶亲和素溶解于1.35mL 0.1M MES（pH 4.0-7.0）溶液中，再加入用四氢呋喃溶解的1-羟基苯并三氮唑（HOBt）150ul（HOBt的浓度为10mg/mL），充分混匀。
（2） 将5.0mg-20.0mg活化的羧基磁微球加入到0.5mL-1.0mL的反应液中，并用漩涡混合器室温充分混匀悬浮磁微球反应2小时，再2-8℃充分混匀悬浮磁微球反应5-8小时。
（3） 将离心管置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；用0.1M MES（pH 4.0-7.0）溶液，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁微球，置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清（重复清洗磁微球3-5次）。
（4）加0.2mL-0.5mL的反应液入清洗过的磁微球中，并用漩涡混合器2-8℃充分混匀悬浮磁微球反应2-3小时。
（5）将离心管置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；用1mL TBST 溶液对磁微球进行清洗，重复清洗3-5次。用TBST 溶液稀释至20mg/mL，存放于2-8℃待用。
S103：生物素化抗体：
（1）生物素：称取1.0mg NHS-Biotin溶于100μLDMSO中，取50ul溶解的NHS-Biotin加入950μL10mM PBS缓冲液中（pH7.0-8.0），制成0.5mg/mL NHS-Biotin。
（2）取30μL-100μL 0.5mg/mL NHS-Biotin置于1.5mL 离心管中，加入0.1mg经过10mM PBS缓冲液（pH7.0-8.0）纯化的IGFBP-1抗体，充分吹打混匀。37℃避光静置15min后，室温避光旋转孵育45min。
（3）将反应好的生物素化抗体转移到透析袋中，用10mM PBS缓冲液（pH7.0-8.0）透析6-8h，更换缓冲液一次。将透析好的生物素化抗体转移至离心管中。
S104：链霉亲和素磁微球与生物素化抗体连接：
（1）连接反应液：称取0.05g聚乙二醇、0.09g NaCl溶于10mL 10mM PBS缓冲液中，最终pH为8.0-8.5。
（2）取20mg/mL链酶亲和素磁微球置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；加入1mL 连接反应液，再置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清（重复清洗2-3次）。
（3）用0.5mL连接反应液悬浮链酶亲和素磁微球，加入0.1mg生物素化抗体，用连接反应液补充反应体积至1.0mL。置于2-8℃反应1-2h。
（4）将离心管置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；用1mL TBST 溶液进行清洗，重复清洗3-5次。将磁微球用TBST溶液稀释至使用浓度，存放于2-8℃待用。
S2：第二试剂的制备：
S201：抗体处理：
用0.02-0.10M PBS（pH 6.50-8.00）溶液将抗体浓度调至5.0mg/mL，取5.0mg/mL的抗体50.0-100.0μL，加入50.0-100.0μL的0.1-0.6mg/mL SATA溶液，室温避光旋转反应20-60min。反应结束后用50kD超滤离心管、0.02-0.10M PBS（pH6.50-8.00）缓冲液纯化浓缩5-8次。收集约100μL抗体，加入50-100μL的0.1-0.5M盐酸羟胺溶液，室温反应1-3h。反应结束后用50kD超滤离心管、0.02-0.10M PBS（pH 6.50-8.00）缓冲液纯化浓缩5-8次。收集约100μL抗体。
S202：碱性磷酸酶活化：
称取2.0-8.0 mg SMCC溶解于1.0mL DMSO中，制成2.0-8.0mg/mL SMCC；取100μL2.0-8.0mg/mL SMCC溶液加入0.9mL 0.1M PBS（pH 6.50-8.00）溶液中，得到0.2-0.8 mg/mL SMCC溶液。取10-50μL的浓度为 10.0-40.0mg/mL的 ALP溶液，再加入 50.0-150.0μL浓度为0.2-0.8 mg/mL的 SMCC溶液，室温反应40-90min。反应结束后用0.01-0.02 M PBS（PH6.50-8.00）缓冲液透析6-8h。
S203：标记：
收集透析纯化后的ALP活化酶，加入处理的抗体，用0.1M PBS（pH 6.50-8.00）缓冲液补充体积为1mL，室温避光反应4-8h。反应结束后，用0.01-0.02 M PBS（PH6.50-8.00）缓冲液透析8-12h。收集透析纯化后抗体，用标记缓冲液稀释到使用浓度，存放于2-8℃待用。
S3：配备样本处理液。
配备的样本处理液如上所述，此处不再赘述。
所述人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
第一步：将取样后的取样棉签插入存有样本处理液的离心管中，折断棉签，盖紧离心管管盖，将离心管置于震荡器震荡1-3min，使分泌物或流出物充分洗脱，获得合格的样本。
第二步：将10ul-30ul待测样本（样本处理液处理的样本）、20ul-50ul磁微球-生物素标记IGFBP-1抗体溶液（浓度为：50ug/mL-300ug/mL）和10ul-30ul碱性磷酸酶标记IGFBP-1抗体溶液（浓度为：0.05ug/ml-0.200ug/ml）37℃混匀反应10min；
第三步：吸取200ul洗液，重复洗涤3次；
第四步：向洗涤后的反应杯/孔中加入200ul底物液，反应3-5min后，仪器自动测定发光值；
第五步：利用已知浓度的校准曲线，将所得的发光值代入标准曲线方程中，计算得出所测样本中IGFBP-1的浓度。
配套检测仪包括大型化学发光免疫分析仪、小型化学发光免疫分析仪及单人份化学发光免疫分析仪。
具体的，该测定方法的原理为双抗体夹心酶促化学发光法。
下面对本发明提供的试剂盒选取三个批次进行性能测试。
1. 线性及灵敏度
零浓度标准品（S0）溶液设置20个复孔，其他5个浓度标准品S1-S5设置单孔。以标准品理论浓度和发光值绘制标准曲线，得出试剂盒剂量-反应曲线，结果见图1、图2、图3，三批次R2分别为：0.9994、0.9991、0.9987。计算20个S0发光值的平均值（Mean）和标准差（SD），根据拟合方程计算出 Mean+2SD 的浓度值，即为试剂盒灵敏度，试剂盒灵敏度检测结果见表1，三批次试剂盒灵敏度均不高于：0.24ng/ml。
取高（120.00ng/ml）、低（25.00ng/ml）浓度样本，分别用三批试剂盒对每个样本进行10次重复检测。试剂盒重复性检测结果（表2）显示试剂盒批内差：＜3.00%，批间差：＜3.10%。
3. 特异性
向高（120.00ng/ml）、低（25.00ng/ml）浓度样本中分别添加浓度为5.0mg/ml、15.0mg/ml的血红蛋白和10U/ml、200U/ml的白细胞酯酶，获得待测样本。各个样本用批次1试剂进行检测，测量结果的均值应在目标浓度平均值（M）±2 标准差（SD）范围内。
高浓度样本特异性实验结果结果见表3、低浓度样本特异性实验结果表4：高、低浓度样本中，分别加入不同浓度的血红蛋白、白细胞酯酶，检测结果的均值在111.77ng/ml—115.97ng/ml和20.50ng/ml—21.58ng/ml目标浓度范围内。
4. 准确度
将试剂盒校准品（浓度值：校1：2.00ng/ml；校2：20.00ng/ml；校3：100.00ng/ml）作为样品，每个重复测定3次测试结果记为（Xi）,按公式（1）分别计算相对偏差（Bi），相对偏差在±10%范围内。结果显示相对偏差均在±10%范围内（准确度检测结果见表5）。
Bi=（Xi-T）/T×100% （1）
注：式中，Bi —相对偏差；Xi —测量浓度；T—标定浓度。
5.临床样本相关性检测
共收集临床样本33份，用本发明研制试剂和对比试剂（胶体金）分别进行检测比较，结果显示，相关性R2=0.9972，相关性良好（图4）。化学发光检测试剂盒检测结果相较于胶体金检测结果可见：灵敏度更高，线性范围更广。
6.样本处理液稳定性评价
将取得的33份临床样本置于2-8℃保存，分别于24h、48h、72h、96h进行检测，从表6样本2-8℃保存不同时间段检测结果可见，用本发明提供的样本处理液对采集样本进行保存，24小时结果显示最大相对偏差为-6.1%，平均偏差为-0.25%；48小时结果显示最大偏差为-7.14%，平均偏差为-1.40%；72小时结果显示最大偏差为-36.4%，平均偏差为-13.77%；96小时结果显示最大偏差为-61.77%，平均偏差为-24.98%。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (7)

1.一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：
第一试剂，为链霉亲和素磁微球与生物素化的IGFBP-1抗体溶液；和
第二试剂，为由碱性磷酸酶标记的IGFBP-1抗体；和
样本处理液；
所述样本处理液按质量分数包括以下组分：
基质缓冲液 0.02-0.1M/L
NaCl 0.9%
基质金属蛋白酶抑制剂 10.0-50.0mM/mL
Brij-35 0.5%
聚乙烯吡咯烷酮 0.05%-0.3%
十二烷基硫酸钠 0.01%-0.025%
海藻糖 0.05%-0.5%
BSA 0.1%-0.5%
二硫苏糖醇 0.005%-0.03%
亚硫酸氢钠 0.02%-0.1%
醋酸氯己定 0.02%-0.05%。
2.根据权利要求1所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微球为活化羧基磁微球与链霉亲和素共价偶联制备。
3.根据权利要求1所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述第一试剂的浓度为50ug/mL-300ug/mL。
4.根据权利要求1所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述第二试剂的浓度为0.05ug/ml-0.200ug/ml。
5.一种如权利要求1至4任一项所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：第一试剂的制备：
S101：羧基磁微球活化：取悬浮磁微球液到离心管中；移去上清，加入0.1M MES，悬浮磁微球，重复清洗磁微球3-5次；加入EDC溶液及N-羟基琥珀酰亚胺溶液活化磁微球，再重复清洗磁微球2-5次；
S102：活化磁微球与链霉亲和素的共价偶联：制备反应液，将活化的羧基磁微球加入到所述反应液中，充分混匀悬浮磁微球反应，移去离心管中的上清液，加入0.1M MES，悬浮磁微球，重复清洗磁微球3-5次；加所述反应液入清洗过的磁微球中，充分混匀悬浮磁微球反应，移去离心管中的上清液，用TBST 溶液对磁微球进行清洗，并重复清洗3-5次；
S103：生物素化抗体：制备生物素标记试剂NHS-Biotin，取NHS-Biotin置于离心管中，加入经过PBS缓冲液纯化的IGFBP-1抗体，充分吹打混匀，37℃避光静置15min后，室温避光旋转孵育45min；将反应好的生物素化抗体转移到透析袋中透析，并转移至离心管中；
S104：链霉亲和素磁微球与生物素化抗体连接：制备连接反应液；取链霉亲和素磁微球置于磁分离架上，移去上清；加入所述连接反应液，再置于磁分离架上，移去上清，重复清洗2-3次；用所述连接反应液悬浮链霉亲和素磁微球，加入生物素化抗体，用所述连接反应液补充反应体积，并反应，移去离心管中的上清液，重复清洗3-5次；
S2：第二试剂的制备：
S201：抗体处理：取调整浓度后的抗体，加入SATA溶液中，室温避光旋转反应，反应结束后用PBS缓冲液纯化浓缩5-8次；收集抗体加入盐酸羟胺溶液，室温反应，反应结束后用PBS缓冲液纯化浓缩5-8次；
S202：碱性磷酸酶活化：称取SMCC溶解于DMSO中，制成SMCC；取SMCC溶液加入PBS溶液中，得到SMCC溶液；取ALP溶液加入SMCC溶液，室温反应；反应结束后用PBS缓冲液透析；
S203：标记：收集透析纯化后的ALP活化酶，加入处理的抗体，用PBS缓冲液补充体积，室温避光反应；反应结束后用PBS缓冲液透析；收集透析纯化后抗体，用标记缓冲液稀释到使用浓度；
S3：配备样本处理液。
6.根据权利要求5所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S102中，所述反应液的制备方法为：
将0.15mg链霉亲和素溶解于1.35mL 0.1M MES溶液中，MES溶液的pH为4.0-7.0，再加入用四氢呋喃溶解的1-羟基苯并三氮唑150ul，1-羟基苯并三氮唑的浓度为10mg/mL，充分混匀。
7.根据权利要求5所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S104中，所述连接反应液的制备方法为：
称取0.05g聚乙二醇、0.09g NaCl溶于10mL 10mM PBS缓冲液中，得到连接反应液的pH为8.0-8.5。
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