CN109060782B - 一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法，将松弛素抗体R021与吖啶酯离心浓缩除去杂质，按照3：1质量比将松弛素抗体R021与吖啶酯充分混匀进行标记偶联，室温下，pH 6.3的条件下，轻轻震荡标记3h，用0.1M的PBS透析，除去未结合的吖啶酯，经过Sephadex G50凝胶层析柱纯化，化学发光仪上收集发光强度高的产物，合并纯化后的松弛素抗体R021与吖啶酯偶联物，保存在发光试剂缓冲液，分装，保存备用，本试剂填补国内没有猫早孕检测试剂的空白，实现猫松弛素的定性、定量、快速检测。在交配后14天，即可检测出是否怀孕，大大早于外部观察法、触诊法和超声波的30天检测，真正实现早早孕检测。

Description

一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法及应用
技术领域
本发明是一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法及应用，属于生物制剂领域。
背景技术
现有技术中，母猫的妊娠诊断方法很多，目前较常用的方法有外部观察法、触疹检查法、超声波探测法等，外部观察法和触诊法均需要有相当经验的人才能作出较正确的诊断。超声波探测一般怀孕30天的孕猫检测成功率较高，存在检查时间较长的问题，而国内还没有专门针对猫早孕的检测试剂，与人的HCG不同(即猫妊娠用人和犬的早孕试剂是检测不出来，或者不准确的。有种属差异)，猫妊娠的最佳检测指标，现在公认的或者外国成熟的检测指标就是松弛素(Relaxin)。妊娠期猫松弛素的分泌量随着妊娠期增长而逐渐增多，在分娩后或自发流产前迅速下降至无法检测，所以需要一些新的检测试剂要解决上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：将松弛素抗体R021与吖啶酯离心浓缩除去杂质，按照3：1质量比将松弛素抗体R021与吖啶酯充分混匀进行标记偶联，室温下，pH 6.3的条件下，轻轻震荡标记3h，用0.1M的PBS透析，除去未结合的吖啶酯；
S2：经过Sephadex G50凝胶层析柱纯化，化学发光仪上收集发光强度高的产物，合并纯化后的松弛素抗体R021与吖啶酯偶联物，保存在发光试剂缓冲液，分装，保存备用。
进一步地，所述发光试剂缓冲液采用PBS、1％海藻糖以及0.5％TrionX-100混合，发光试剂缓冲液的pH为6.3。
进一步地，所述松弛素抗体R021采用EDC/NHS法将羧基磁珠活化后与松弛素抗体F102偶联，以制得抗体磁珠，其间通过用pH 6.0的包被缓冲液，清洗羧基磁珠3次，随后加入等质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且1mg磁珠对应1.2mg EDC，置于室温下活化30min；用包被缓冲液洗去未反应的活化剂，加入抗体F102室温反应2h；用封闭缓冲液置换反应液3次后，再加入封闭缓冲液将固相试剂浓度调整为2mg/ml，置于4℃的冰箱保存。
进一步地，所述封闭缓冲液采用0.05M Tris、2％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100以及0.09％叠氮化钠混合制成，所述封闭缓冲液pH为7.5。
进一步地，所述包被缓冲液采用0.05M吗啉乙磺酸(MES)混合制成，所述包被缓冲液pH为6.0。
一种猫早孕的发光检测试剂的应用，取血清样本，用样本稀释液进行适当稀释，在透明的反应管中，依次加入50μL待测血清标本、50μL发光试剂、100μL抗体磁珠，震荡混匀，于室温下孵育反应20min，随后在磁场作用下采用0.05％PBST清洗3次，当反应管进入检测暗室后，全自动发光仪先后泵入底物激发液A和底物激发液B，所述底物激发液A包括0.1M浓硝酸、0.15％过氧化氢和0.1％TrionX-100，所述底部激发液B包括0.35M氢氧化钠和2.5％TrionX-100，化学发光仪上读出各孔相对发光度RLU，RLU值与标本中的抗原浓度成正相关，松弛素浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算。
本发明的有益效果：本发明的一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法及应用，本试剂填补国内没有猫早孕检测试剂的空白，实现猫松弛素的定性、定量、快速检测。在交配后14天，即可检测出是否怀孕，大大早于外部观察法、触诊法和超声波的30天检测，真正实现早早孕检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明一种猫早孕的发光检测试剂的稳定性实验结果的折线图；
图2为本发明一种猫早孕的发光检测试剂的灵敏度实验结果的折线图；
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
请参阅图1-图2，本发明提供一种技术方案：一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法及应用，包括如下步骤：
S1：将松弛素抗体R021与吖啶酯离心浓缩除去杂质，按照3：1质量比将松弛素抗体R021与吖啶酯充分混匀进行标记偶联，室温下，pH 6.3的条件下，轻轻震荡标记3h，用0.1M的PBS透析，除去未结合的吖啶酯；
S2：经过Sephadex G50凝胶层析柱纯化，化学发光仪上收集发光强度高的产物，合并纯化后的松弛素抗体R021与吖啶酯偶联物，保存在发光试剂缓冲液，分装，保存备用。
发光试剂缓冲液采用PBS、1％海藻糖以及0.5％TrionX-100混合，发光试剂缓冲液的pH为6.3。
所述松弛素抗体R021采用EDC/NHS法将羧基磁珠活化后与松弛素抗体F102偶联，以制得抗体磁珠，其间通过用pH 6.0的包被缓冲液，清洗羧基磁珠3次，随后加入等质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且1mg磁珠对应1.2mg EDC，置于室温下活化30min；用包被缓冲液洗去未反应的活化剂，加入抗体F102室温反应2h；用封闭缓冲液置换反应液3次后，再加入封闭缓冲液将固相试剂浓度调整为2mg/ml，置于4℃的冰箱保存。
封闭缓冲液采用0.05M Tris、2％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100以及0.09％叠氮化钠混合制成，所述封闭缓冲液pH为7.5。
包被缓冲液采用0.05M吗啉乙磺酸(MES)混合制成，所述包被缓冲液pH为6.0。
一种猫早孕的发光检测试剂的应用，取血清样本，用样本稀释液进行适当稀释，在透明的反应管中，依次加入50μL待测血清标本、50μL发光试剂、100μL抗体磁珠，震荡混匀，于室温下孵育反应20min，随后在磁场作用下采用0.05％PBST清洗3次，当反应管进入检测暗室后，全自动发光仪先后泵入底物激发液A和底物激发液B，所述底物激发液A包括0.1M浓硝酸、0.15％过氧化氢和0.1％TrionX-100，所述底部激发液B包括0.35M氢氧化钠和2.5％TrionX-100，化学发光仪上读出各孔相对发光度RLU，RLU值与标本中的抗原浓度成正相关，松弛素浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算。
1.标准曲线，见附图2，标准曲线的相关系数分别为R2＝0.9964，表明线性相关性良好。检测灵敏度为0.07ng/ml.
2.回收率实验
向10份未妊娠的猫血清中加入高、中、低浓度的RLN重组抗原，测定血清回收率。得到RLN在血清中的回收率在98％-103.5％之间变化。
表1回收率实验
Figure GDA0002959584360000051
3.精密度实验(批内和批间)
采用本发明检测试剂盒对精确定量的高、中、低三个标准品浓度进行测定，各设置10各复孔。如表2所示，本试剂盒的批内变异系数和批间变异系数均较小，符合试剂盒规定要求。
表2精密度实验
Figure GDA0002959584360000052
Figure GDA0002959584360000061
4.稳定性实验
本研究采用热稳定加速实验确定本化学发光试剂盒的稳定性，将制备好的检测试剂封口后在37℃电热鼓风干燥箱放置30天，每5天检测1ng/ml、10ng/ml和50ng/ml的RLN重组抗原标准品，考察本方法的加速稳定性情况。结果见表1，37℃加速30天相当于4℃放置超过两年。因此本化学发光试剂在4℃保存时可以保持相对稳定。
5.特异性实验
选取几个血清中常见的妊娠检测指标进行特异性分析，孕酮、β-HCG、白蛋白。用此试剂盒测定，结果见表3，本试剂盒测定高浓度孕酮、β-HCG、白蛋白时，测定浓度均远低于理论浓度，说明该方法的特异性较好。
表3特异性实验(ng/ml)
Figure GDA0002959584360000062
实施例1：检测步骤：取血清样本，用样本稀释液进行适当稀释。在透明的反应管中，依次加入50μL待测血清标本(标准品或质控品)、50μL发光试剂、100μL抗体磁珠，震荡混匀，于室温下孵育反应20min，随后在磁场作用下清洗3次(0.05％PBST)。当反应管进入检测暗室后，全自动发光仪先后泵入底物激发液A(0.1M浓硝酸，0.15％过氧化氢，0.1％TrionX-100)和B(0.35M氢氧化钠，2.5％TrionX-100。)，化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)，发光值与标本中的抗原浓度成正相关。松弛素浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算，结果显示妊娠15天的孕猫血清松弛素浓度为1.42±0.55ng/ml，20天孕猫血清松弛素浓度为10.26±2.45ng/ml，25天孕犬血清松弛素浓度为18.85±3.07ng/ml，30天孕犬血清松弛素浓度为22.47±3.14ng/ml,60天孕犬血清松弛素浓度为15.24±4.69ng/ml，本发明试剂盒可用于猫早孕检测及猫分娩监控。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1：将松弛素抗体R021与吖啶酯离心浓缩除去杂质，按照3：1质量比将松弛素抗体R021与吖啶酯充分混匀进行标记偶联，室温下，pH 6.3的条件下，轻轻震荡标记3h，用0.1M的PBS透析，除去未结合的吖啶酯；
S2：经过Sephadex G50凝胶层析柱纯化，化学发光仪上收集发光强度高的产物，合并纯化后的松弛素抗体R021与吖啶酯偶联物，保存在发光试剂缓冲液，分装，保存备用；
所述发光试剂缓冲液采用PBS、1％海藻糖以及0.5％TrionX-100混合，发光试剂缓冲液的pH为6.3；
所述松弛素抗体R021采用EDC/NHS法将羧基磁珠活化后与松弛素抗体F102偶联，以制得抗体磁珠，其间通过用pH 6.0的包被缓冲液，清洗羧基磁珠3次，随后加入等质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且1mg磁珠对应1.2mg EDC，置于室温下活化30min；用包被缓冲液洗去未反应的活化剂，加入抗体F102室温反应2h；用封闭缓冲液置换反应液3次后，再加入封闭缓冲液将固相试剂浓度调整为2mg/ml，置于4℃的冰箱保存；
所述封闭缓冲液采用0.05M Tris、2％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100以及0.09％叠氮化钠混合制成，所述封闭缓冲液pH为7.5。
2.根据权利要求1所述的一种猫早孕的发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述包被缓冲液采用0.05M吗啉乙磺酸(MES)混合制成，所述包被缓冲液pH为6.0。
3.根据权利要求1所述的一种猫早孕的发光检测试剂的应用，其特征在于：取血清样本，用样本稀释液进行适当稀释，在透明的反应管中，依次加入50μL待测血清标本、50μL发光试剂、100μL抗体磁珠，震荡混匀，于室温下孵育反应20min，随后在磁场作用下采用0.05％PBST清洗3次，当反应管进入检测暗室后，全自动发光仪先后泵入底物激发液A和底物激发液B，所述底物激发液A包括0.1M浓硝酸、0.15％过氧化氢和0.1％TrionX-100，所述底部激发液B包括0.35M氢氧化钠和2.5％TrionX-100，化学发光仪上读出各孔相对发光度RLU，RLU值与标本中的抗原浓度成正相关，松弛素浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算。
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