CN113504379A - 一种性激素解离剂及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种性激素解离剂及检测试剂盒,所述性激素解离剂为检测性激素配套使用的一种组分,包含0.1%~5%w/v增敏剂、0.05%~10%w/v激素、0.01%~0.5%w/v表面活性剂以及液体试剂,本发明提供的性激素解离剂,可以将结合在蛋白上的雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮分离开来,而不影响这些激素的正常检测,从而提高了试剂的检测能力,具有解离速度快、效率高且不影响试剂反应性能的优点,为提高性激素检测水平和准确性提供重要保障。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,特别涉及一种性激素解离剂及检测试剂盒。
背景技术
目前主要采用免疫检测法进行人体内性激素的测定,受不同的内源性化合物的干扰,免疫检测法无法区分性激素且容易产生交叉反应,外源性激素也会干扰检测结果导致结果的高估,同时,大多数的人体内激素物质容易与蛋白结合,减少了可检测激素的浓度,直接免疫法只能检测低至30~40pg/ml的浓度水平,远远不能满足儿童、绝经期女性、男性、使用芳香酶制剂治疗女性的测量需求。
因此本领域技术人员迫切需要解决的一个技术问题就是:如何提供一种样本前处理试剂,可以简单、高效将结合蛋白部分的性激素解离释放出来,增加游离性激素水平,从而提高试剂的检测灵敏度、测量范围,满足不同人群的检测需求,特别是针对极低浓度水平的性激素测量,便于全自动平台高效精准的检测性激素含量。
发明内容
本发明提供了一种性激素解离剂及检测试剂盒,通过对检测样本结合本发明所提供的性激素解离剂进行预处理,可有效解离和释放样本中的性激素,提高试剂检测的灵敏度和线性范围。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种性激素解离剂,按照质量浓度计,所述性激素解离剂包含0.1%~5%w/v增敏剂、0.05%~10%w/v激素以及0.01%~0.5%w/v表面活性剂,所述性激素解离剂可将结合蛋白部分的性激素解离释放。
作为优选方案,所述性激素解离剂还包含0.5%~5%w/v保护剂、0.02%~0.2%w/v防腐剂以及液体试剂。
作为优选方案,所述液体试剂是0.02-0.2mol/l,PH值为6.0-9.0的缓冲液,所述缓冲液选自硼酸、Tris、MES、HEPES、PIPES、TES、TAPSO、Bicine、MOPS中的至少一种。
作为优选方案,所述增敏剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种。
作为优选方案,所述激素类物质选自美雄诺龙、异噻唑啉酮、美睾酮、皮质醇、地塞米松、N辛基异噻唑啉酮、甲羟孕酮中的至少一种。
作为优选方案,所述表面活性剂选自壬基酚聚氧乙烯醚、仲醇乙氧化合物系列、仲链烷醇聚醚-9、辛基酚聚氧乙烯醚、十六烷基氯化铵中的至少一种。
作为优选方案,所述保护剂选自BSA、卵清蛋白、蔗糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种。
作为优选方案,所述防腐剂选自庆大霉素、KroVin系列、NaN3、Proclin-300中的至少一种。
本发明还提供一种性激素检测试剂盒,所述检测试剂盒包括以上所述的性激素解离剂。
作为优选方案,所述检测试剂盒还包括性激素磁微粒试剂、磁微粒抗体试剂。
作为优选方案,所述性激素磁微粒试剂中的磁微粒选自氨基化的超顺磁珠、羧基化的超顺磁珠、苯甲酰基磁珠、链霉亲和素磁珠中的至少一种。
本发明提供一种性激素解离方法,使用以上所述的性激素解离剂,将待测样品与所述性激素解离剂进行混合解离。
所述性激素检测试剂盒可同时进行雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮的检测,检测方法为:将待测样品先与所述性激素解离剂进行混合以进行解离处理,取解离后的样品与雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮抗体试剂一起混合,35-40℃环境下温育反应10分钟;然后加入与雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮(或相应衍生物)磁微粒试剂,再次在35-40℃环境下温育反应10分钟,之后清洗去除未反应物,加入化学发光底物液,检测雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮的发光信号值,通过剂量反应曲线,计算雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮相应的浓度值。
本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)本发明提供的性激素解离剂以及检测试剂盒,由于解离剂能够快速、高效的释放与蛋白结合的性激素物质,大大提高了试剂检测灵敏度。其中雌二醇检测下限可达1pg/mL,雌三醇检测下限可达5pg/mL,孕酮检测下限可达10pg/mL,硫酸脱氢表雄酮检测下限可达1pg/mL,和睾酮检测下限可达8pg/mL,更低的检测下限为临床的准确诊断提供依据。
(二)利用本发明提供的检测试剂盒,由于增敏剂、解离剂和表面活性剂的协同作用,使所制备的试剂盒具有较好的精密度:批内CV≤5%;批间CV≤6%,确保单次测量结果的准确性。
(三)利用本发明提供的性激素检测试剂盒,先采用性激素解离剂一次处理样本,将相关与蛋白结合的性激素完全释放出来,再对解离后的样本进行5个性激素项目的联合检测,不仅降低了对患者大量采血的痛苦,节约样本用量、相比于现有技术中单个项目逐一进行样本处理再单独检测,可大大提高检测效率,同时避免样本反复处理,也减轻医务人员的工作量和劳动时间。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,本领域普通技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
本发明公开了一种性激素解离剂,按照质量浓度计,包含0.1%~5%w/v增敏剂、0.05%~10%w/v激素类物质以及0.01%~0.5%w/v表面活性剂,以及0.5%~5%w/v保护剂、0.02%~0.2%w/v防腐剂,以及液体试剂,所述性激素解离剂可将结合蛋白部分的性激素解离释放。所述液体试剂是0.02-0.2mol/l,PH值为6.0-9.0的缓冲液,所述缓冲液选自硼酸、Tris、MES、HEPES、PIPES、TES、TAPSO、Bicine、MOPS中的至少一种,缓冲液的加入可以更好的稳定PH值,且能作为蛋白质的溶剂,有助于样本的保存和稳定。所述增敏剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种,增敏剂的加入能够使性激素解离剂在特有的环境中,提高免疫反应的信号值,从而提高试剂的检测下限。所述激素类物质选自美雄诺龙、异噻唑啉酮、美睾酮、皮质醇、地塞米松、N辛基异噻唑啉酮、甲羟孕酮中的至少一种,人体中的性激素极易与蛋白结合,如血液循环中98%的睾酮被蛋白结合,添加其他的性激素物质,可以置换部分要检测的激素,提高样本中被检测激素的浓度,从而起到解离的作用。所述表面活性剂选自壬基酚聚氧乙烯醚、仲醇乙氧化合物系列、仲链烷醇聚醚-9、辛基酚聚氧乙烯醚、十六烷基氯化铵中的至少一种,表面活性剂在溶液中具有润湿、分散、洗涤的作用,表面活性剂的加入能够使解离的激素物质,迅速脱离蛋白质而到达游离状态,从而提高可检测激素的浓度。所述保护剂选自BSA、卵清蛋白、蔗糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种;所述防腐剂选自庆大霉素、KroVin系列、NaN3、Proclin-300中的至少一种,保护剂和防腐剂的加入能够保护样本中各成分的稳定,不被微生物破坏和降解。
本发明进一步公开了一种性激素检测试剂盒,包括上述性激素解离剂以及性激素磁微粒试剂,抗体试剂以及化学发光底物液,进一步,性激素磁微粒试剂为雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、孕酮(P)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)和睾酮(T)(或相应衍生物)的磁微粒试剂,抗体试剂为雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮抗体试剂。
进一步,所述雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮(或相应衍生物)的磁微粒试剂中磁性微粒选自氨基化的超顺磁珠、羧基化的超顺磁珠、苯甲酰基磁珠、链霉亲和素磁珠中的至少一种。
本发明所提供的性激素检测试剂盒可同时进行雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮的检测,将待测样品先与性激素解离剂进行解离处理,取解离后的样品与雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮抗体试剂一起混合,35-40℃环境下温育反应10分钟,温度优选为37°;然后加入与雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮(或相应衍生物)磁微粒试剂,再次在35-40℃环境下温育反应10分钟,温度优选为37°,之后清洗去除未反应物,加入发光底物液,检测雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮的发光信号值,通过剂量反应曲线,计算雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮相应的浓度值。
下面将结合实施例对本发明所提供的技术方案进行详细的说明,但不能理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例为本发明技术方案的对比例,提供的检测试剂盒基于磁微粒化学发光法,检测试剂盒包含样本稀释液、磁微粒试剂和抗体试剂。
所述检测试剂盒的制备方法具体如下:
1、溶液的配制
活化液的配制:称量10.66g活化剂MES于烧杯中,加入纯化水1L,搅拌混匀后,用NaOH溶液调pH至6.0,4℃保存备用。
偶联液的配制:称量2.865g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中,依次称取0.272g的KH2PO4·H2O、7.948g的NaCl和1.983g的KCl加入上述烧杯中,用1L纯化水定容,搅拌混匀后,调pH至7.4,4℃保存备用。
样本稀释液的配制:配制0.1M的Tris缓冲液,pH8.0,含有0.2M的NaCl,1%(w/v)BSA,0.1%(w/v)Proclin-300,4℃保存备用。
2、磁微粒试剂制备
(1)微球活化:向1mg/ml微球1ml中加入用50mM,pH6.0 MES溶解的1mg EDC和10mgNHS,活化30min,磁吸处理10min,弃上清,沉淀用偶联液重悬,得到1mg/ml活化的微球溶液。
(2)蛋白的偶联:将0.2mg蛋白(对应雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮的抗原或其衍生物)加入1mg/ml活化的微球溶液中,室温混匀2~4h,磁吸处理10min,弃上清,沉淀用含5mg BSA的50mM PBS溶液封闭60min,搅拌混匀,磁吸处理10min,收集的沉淀保存于100ml含5mg BSA的50mM PBS溶液,即为磁微粒试剂。
3、抗体试剂制备
将0.2mg抗体(对应雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮的抗体)加入10ul吖啶酯溶液中,避光反应2小时,转移到14kD透析袋中,在PBS中透析过夜,收集透析袋中的液体保存于200ml含10mg BSA的50mM PBS溶液,即为抗体试剂。
4、试剂盒的制备
将上述制备的溶液,以样本稀释液10ml:磁微粒试剂6ml:抗体试剂10ml的规格分装在试剂瓶中,即为成品检测试剂盒。
实施例2
本实施例提供的试剂盒基于磁微粒化学发光法,试剂盒包含解离剂、磁微粒试剂和抗体试剂。其中,解离剂含有0.1%~5%w/v增敏剂,0.05%~10%w/v解离物质,0.01%~0.5%w/v表面活性剂,0.5%~5%w/v保护剂和0.02%~0.2%w/v防腐剂;磁微粒试剂采用化学交联法,通过水溶性碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺使雌二醇、雌三醇、孕酮、硫酸脱氢表雄酮和睾酮(或相应衍生物)与磁性微球偶联,制备相应的磁微粒试剂;抗体试剂采用抗体与吖啶酯结合而成。
所述试剂盒的制备方法具体如下:
1、溶液的配制
活化液的配制:称量10.66g活化剂MES于烧杯中,加入纯化水1L,搅拌混匀后,用NaOH溶液调pH至6.0,4℃保存备用。
偶联液的配制:称量2.865g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中,依次称取0.272g的KH2PO4·H2O、7.948g的NaCl和1.983g的KCl加入上述烧杯中,用1L纯化水定容,搅拌混匀后,调pH至7.4,4℃保存备用。
解离剂的配制:配制0.1M的Tris缓冲液,pH8.0,含有0.2M的NaCl,0.5%(w/v)PEG8000,1%(w/v)BSA,0.1%仲链烷醇聚醚-9,1.25%(w/v)异噻唑啉酮,0.5%(w/v)美睾酮,0.1%(w/v)Proclin-300,4℃保存备用。
2、磁微粒试剂制备
(1)微球活化:向1mg/ml微球1ml中加入用50mM,pH6.0 MES溶解的1mg EDC和10mgNHS,活化30min,磁吸处理10min,弃上清,沉淀用偶联液重悬,得到1mg/ml活化的微球溶液。
(2)蛋白的偶联:将0.2mg蛋白(对应雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮的抗原或其衍生物)加入1mg/ml活化的微球溶液中,室温混匀2~4h,磁吸处理10min,弃上清,沉淀用含5mg BSA的50mM PBS溶液封闭60min,搅拌混匀,磁吸处理10min,收集的沉淀保存于100ml含5mg BSA的50mM PBS溶液,即为磁微粒试剂。
3、抗体试剂制备
将0.2mg抗体(对应雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮的抗体)加入10ul吖啶酯溶液中,避光反应2小时,转移到14kD透析袋中,在PBS中透析过夜,收集透析袋中的液体保存于200ml含10mg BSA的50mM PBS溶液,即为抗体试剂。
4、试剂盒的制备
将上述制备的溶液,以解离剂10ml:磁微粒试剂6ml:抗体试剂10ml的规格分装在试剂瓶中,即为成品检测试剂盒。
实施例3
本实施例提供的试剂盒基于磁微粒化学发光法,试剂盒包含解离剂、磁微粒试剂和抗体试剂。所述试剂盒的制备方法具体如下:
1、溶液的配制
活化液的配制:称量10.66g活化剂MES于烧杯中,加入纯化水1L,搅拌混匀后,用NaOH溶液调pH至6.0,4℃保存备用。
偶联液的配制:称量2.865g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中,依次称取0.272g的KH2PO4·H2O、7.948g的NaCl和1.983g的KCl加入上述烧杯中,用1L纯化水定容,搅拌混匀后,调pH至7.4,4℃保存备用。
解离剂的配制:配制0.1M的Tris缓冲液,pH8.0,含有0.2M的NaCl,1%(w/v)PEG6000,0.5%(w/v)蔗糖,0.1%辛基酚聚氧乙烯醚,0.3%(w/v)皮质醇,0.5%(w/v)甲羟孕酮,0.1%(w/v)Proclin-300,4℃保存备用。
2、磁微粒试剂制备
(1)微球活化:向1mg/ml微球1ml中加入用50mM,pH6.0 MES溶解的1mg EDC和10mgNHS,活化30min,磁吸处理10min,弃上清,沉淀用偶联液重悬,得到1mg/ml活化的微球溶液。
(2)蛋白的偶联:将0.2mg蛋白(对应雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮的抗原或其衍生物)加入1mg/ml活化的微球溶液中,室温混匀2~4h,磁吸处理10min,弃上清,沉淀用含5mg BSA的50mM PBS溶液封闭60min,搅拌混匀,磁吸处理10min,收集的沉淀保存于100ml含5mg BSA的50mM PBS溶液,即为磁微粒试剂。
3、抗体试剂制备
将0.2mg抗体(对应雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮的抗体)加入10ul吖啶酯溶液中,避光反应2小时,转移到14kD透析袋中,在PBS中透析过夜,收集透析袋中的液体保存于200ml含10mg BSA的50mM PBS溶液,即为抗体试剂。
4、试剂盒的制备
将上述制备的溶液,以解离剂10ml:磁微粒试剂6ml:抗体试剂10ml的规格分装在试剂瓶中,即为成品检测试剂盒。
实施例的应用
1、适用仪器:全自动发光分析仪。
2、待测样本:临床标准方法收集的血清或血浆,2-8℃可稳定保存一周。
3、样本检测程序:取100ul样本3份,各加入实施例1制备的样本稀释液、实施例2制备的解离剂液、实施例3制备的解离剂液100ul,混合均匀后,取混合后的样本各30ul用于性激素项目(雌二醇/雌三醇/孕酮/硫酸脱氢表雄酮/睾酮)的单项或组合检测,将混合后的样本各与100ul抗体试剂一起37℃温育反应10min,再加入磁微粒试剂37℃温育反应10min,清洗出去未结合物质,加入化学发光底物液,读取各项目发光信号值,通过校准曲线计算相应的浓度值。
实验数据
将本发明实施例1、实施例2、实施例3制备的试剂,配套全自动发光分析仪组成系统,进行灵敏度,线性范围,精密度实验,结果如下。
(1)实施例2中试剂灵敏度检测结果见表1:
表1灵敏度检测结果
结果表明,本发明实施例二所提供的检测试剂盒具有较高的灵敏度,其中雌二醇检测下限可达1pg/mL,雌三醇检测下限可达5pg/mL,孕酮检测下限可达10pg/mL,硫酸脱氢表雄酮检测下限可达1pg/mL,和睾酮检测下限可达8pg/mL。
(2)实施例1、实施例2、实施例3试剂线性范围检测结果见表2:
表2线性范围检测结果比较
结果表明,本发明试剂盒线性范围为雌二醇E2:1-5000pg/mL,雌三醇E3:5-5000pg/mL,孕酮P:10-20000pg/ml,硫酸脱氢表雄酮DHEA-S:1-10000pg/mL,睾酮8-10000pg/mL;而且通过对比实施例1与实施例2、实施例3的数据表明,本发明检测试剂盒在添加了包含激素类物质和增敏剂、表面活性剂的性激素解离剂之后,灵敏度更好且线性检测范围更优。
(3)实施例3试剂精密度实验结果见表3:
表3精密度实验结果
结果表明,本发明实施例3所提供的检测试剂盒测试高浓度和低浓度两类样品的精密度CV均小于5%值,具有较好的精密度。
综合以上实施例可知,本发明提供的性激素解离剂以及检测试剂盒,能够快速、高效的释放与蛋白结合的性激素物质,大大提高了试剂检测灵敏度和精准度,为提高性激素检测水平和准确性提供重要保障。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。以上所述的本发明实施方式,并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (11)
1.一种性激素解离剂,其特征在于,按照质量浓度计,所述性激素解离剂包含0.1%~5%w/v增敏剂、0.05%~10%w/v激素以及0.01%~0.5%w/v表面活性剂,所述性激素解离剂可将结合蛋白部分的性激素解离释放。
2.根据权利要求1所述的一种性激素解离剂,其特征在于,所述性激素解离剂还包含0.5%~5%w/v保护剂、0.02%~0.2%w/v防腐剂以及液体试剂。
3.根据权利要求2所述的一种性激素解离剂,其特征在于,所述液体试剂是0.02-0.2mol/l,PH值为6.0-9.0的缓冲液,所述缓冲液选自硼酸、Tris、MES、HEPES、PIPES、TES、TAPSO、Bicine、MOPS中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种性激素解离剂,其特征在于,所述增敏剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种性激素解离剂,其特征在于,所述激素选自美雄诺龙、异噻唑啉酮、美睾酮、皮质醇、地塞米松、N辛基异噻唑啉酮、甲羟孕酮中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种性激素解离剂,其特征在于,所述表面活性剂选自壬基酚聚氧乙烯醚、仲醇乙氧化合物系列、仲链烷醇聚醚-9、辛基酚聚氧乙烯醚、十六烷基氯化铵中的至少一种。
7.根据权利要求2所述的一种性激素解离剂,其特征在于,所述保护剂选自BSA、卵清蛋白、蔗糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种;所述防腐剂选自庆大霉素、KroVin系列、NaN3、Proclin-300中的至少一种。
8.一种检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的性激素解离剂。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒还包括性激素磁微粒试剂、抗体试剂。
10.一种性激素解离方法,其特征在于,使用权利要求1-7任一项所述的性激素解离剂,将待测样品与所述性激素解离剂进行混合解离。
11.一种性激素检测方法,其特征在于,使用权利要求9所述的检测试剂盒,包括以下步骤:
步骤一:将待测样品与所述性激素解离剂进行混合,形成混合样本;
步骤二:将所述混合样本与所述抗体试剂混合,进行第一次温育反应;
步骤三:完成第一次温育反应后,在所述混合样本中加入所述性激素磁微粒试剂,进行第二次温育反应;
步骤四:加入化学发光底物液,读取数值。
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