CN104020288B - 一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的人胰岛素检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括所述人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的人胰岛素检测试剂盒。本发明的人胰岛素单克隆抗体在与磁微粒交联之前，利用非离子表面活性剂进行了前处理。本发明的人胰岛素检测试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强、药物干扰小、结果稳定性好等优点；从而可以大规模适用于糖尿病临床辅助诊断筛查。

Description

一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的人胰岛素检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断医学检验领域。具体地说，本发明涉及一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的人胰岛素检测试剂盒。

背景技术

胰岛素是51个氨基酸组成的蛋白激素，它由两条肽链，即，A链(含有21个氨基酸)和B链(含有30个氨基酸)通过二硫键连接组成，相对分子量为5808。胰岛素在分子构象上分为三大区域：分子内核，分子表面疏水区和分子表面极性区。分子内核都是由疏水残疾构成，包括大部分支链氨基酸残基和A6、A11、A20、B19四个半胱氨酸残基。

胰岛素分泌后主要有两种用途。一部分是为了维持机体空腹血糖正常而存在的胰岛素，称作基础胰岛素；另一部分是为了降低餐后血糖升高，以及维持餐后血糖正常而存在的胰岛素，称作餐时胰岛素。餐时胰岛素的分泌其作用是抑制肝脏内源性葡萄糖的产生。机体在这种机制下受到保护，血糖在其他时候被控制在空腹状态水平左右，而餐后的血糖被控制在7.0mmol/L以下。

胰岛素的检测在临床中主要应用于：I型糖尿病和II型糖尿病的诊断、II型糖尿病患者口服糖尿病药物的选择、低血糖综合症诊断及胰岛素自身免疫综合征、胰岛素结构异常、胰岛素受体异常、NIDDM(Non-Insulin-DependentDiabetesMellitus,NIDDM)合并高血压、胰腺炎、多囊卵巢综合征等疾病的诊断。

目前临床上胰岛素的检测方法主要有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)等。RIA方法由于试剂具有放射性，对操作者具有一定危害性，且操作复杂，试剂有效期短等缺点，早已不推荐作为胰岛素临床诊断；ELISA法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，线性范围有限，无法持续监控患者胰岛素水平；TRFIA虽然测值较为准确，但依然存在反应时间较长，对环境要求较高，容易受空气尘埃影响，且多为96人份/盒，使用稀土标记物等缺点也使得此免疫方法无法大规模使用；CLIA法是一种较为先进的免疫学方法，具有反应时间短、灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好等优点，标记物稳定性好，在保证检测速度的前提下，也能达到检测高通量。根据目前胰岛素临床的应用情况，市场应用前景最好且诊断最可靠的方法学为CLIA法。

虽然目前中国市场上已有注册批准的胰岛素化学发光免疫分析法测定试剂盒，但多为进口试剂，成本较高，且试剂盒的制备方法和相关材料均作为保密资料，未被公开，不利于胰岛素检测在社区基层医院的推广。国产胰岛素试剂盒重复性较差，批间差异难控，且灵敏度较低，交叉反应率较高，临床应用前景较差。

因此，本领域急需一种具有检测灵敏度高、特异性好、重复性高等优点的人胰岛素检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法，利用所述人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒检测人胰岛素的灵敏度大幅提高。

本发明还有一目的是提供包括上述人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的人胰岛素检测试剂盒。

本发明再有一目的是提供利用本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒或人胰岛素检测试剂盒检测人胰岛素的方法。

在第一方面，本发明提供一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，所述人胰岛素单克隆抗体在与磁微粒交联之前，利用非离子表面活性剂进行前处理。

在优选的实施方式中，所述非离子表面活性剂是LF221(BASF公司)、或F68(Sigma公司)、或二者的组合。

在优选的实施方式中，所述非离子表面活性剂是LF221(BASF公司)和F68(Sigma公司)的组合。

在优选的实施方式中，所述人胰岛素单克隆抗体是罗氏公司的单克隆抗体(Roche，克隆号为BM1)。

在另一优选的实施方式中，所述前处理是将非离子表面活性剂与人胰岛素单克隆抗体进行温育；优选地，在2-8℃，温育30分钟。

在另一优选的实施方式中，进行前处理时，所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的浓度分别为1-3mg/ml、0.8-1.2wt％、0.8-1.2wt％，优选2mg/ml、1.0wt％、1.0wt％。

在另一优选的实施方式中，进行前处理时，人胰岛素抗体溶液与LF221溶液或F68溶液的体积比为(8-10):(0.8-1.2)；优选9:1的比例混合。

在另一优选的实施方式中，进行前处理时，所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的体积比为(6-10):(0.8-1.2):(0.8-1.2)；优选8:1:1。

在另一优选的实施方式中，所述磁微粒的主要成分是超顺磁性微粒，粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在第二方面，本发明提供一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)用非离子表面活性剂处理人胰岛素单克隆抗体；和

b)将步骤a)处理的人胰岛素单克隆抗体与磁微粒相交联。

在优选的实施方式中，步骤a)中的所述非离子表面活性剂是LF221(BASF公司)、或F68(Sigma)、或二者的组合。

在优选的实施方式中，所述非离子表面活性剂是LF221(BASF公司)和F68(Sigma)的组合。

在优选的实施方式中，所述人胰岛素单克隆抗体是罗氏公司的单克隆抗体(Roche，克隆号为BM1)。

在另一优选的实施方式中，所述前处理是将非离子表面活性剂与人胰岛素单克隆抗体进行温育；优选地，在2-8℃，温育30分钟。

在另一优选的实施方式中，进行前处理时，人胰岛素抗体溶液与LF221溶液或F68溶液的体积比为(8-10):(0.8-1.2)；优选9:1的比例混合。

在另一优选的实施方式中，进行前处理中，所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的浓度分别为1-3mg/ml、0.8-1.2wt％、0.8-1.2wt％，优选2mg/ml、1.0wt％、1.0wt％。

在另一优选的实施方式中，进行前处理时，所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的体积比为(6-10):(0.8-1.2):(0.8-1.2)；优选8:1:1。

在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第二方面所述的方法制备的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒在检测人胰岛素或制备人胰岛素检测试剂盒中的用途。

在第三方面，本发明提供一种人胰岛素检测试剂盒，所述试剂盒装有：本发明第一方面所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第二方面所述的方法制备的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒。

在另一优选的实施方式中，所述人胰岛素检测试剂盒还装有：酶标记的人胰岛素单克隆抗体；胰岛素定标品；化学发光底物；和，洗涤液。

在另一优选的实施方式中，所述酶标记的人胰岛素单克隆抗体中的酶是碱性磷酸酶。

在另一优选的实施方式中，所述化学发光底物的主要成分为1,2-二氧杂环丁烷衍生物，为酶促化学发光底物。

在另一优选的实施方式中，所述1,2-二氧杂环丁烷衍生物为AMPPD(3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)、CDP-star。

在另一优选的实施方式中，所述的磁微粒试剂的主要成分是超顺磁性微粒，其粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在第四方面，本发明提供一种检测人胰岛素的方法，所述方法包括利用本发明第一方面所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第二方面所述的方法制备的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或本发明第三方面所述的人胰岛素检测试剂盒检测样品中的人胰岛素。

在第五方面，本发明提供制备人胰岛素检测试剂盒的方法，所述的方法包括：

将根据本发明第二方面所述的方法制备人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒；酶标记的人胰岛素单克隆抗体；胰岛素定标品；化学发光底物；和洗涤液制成人胰岛素检测试剂盒。

在另一优选的实施方式中，所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的制备，是将活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基的磁微粒通过共价交联的方式与人胰岛素单克隆抗体中的裸露氨基交联反应，并通过含有0.5～2％的BSA溶液洗涤和封闭，最终贮存于含有0.1～1％的BSA溶液中，2～8℃保存备用。

在另一优选的实施方式中，所述的磁微粒试剂稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体的制备方法为戊二醛偶联法，具体操作为：将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，室温静置过夜，生理盐水透析后，加入胰岛素单克隆抗体，50mMpH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜，加入甘氨酸，室温反应2小时，等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃2小时，4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mMpH7.40磷酸缓冲液中，对其透析过夜，加入等体积甘油，置于-20℃保存。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体的稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、5～15％甘油、0.05～0.5％吐温-20、0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，所述的胰岛素定标品的浓度分别为5～20μIU/mL和50～150μIU/mL。

在另一优选的实施方式中，所述的胰岛素定标品的稀释液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，10～50％牛血清，0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，所述的洗涤液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了用或不用非离子表面活性剂前处理人胰岛素抗体，对于检测人胰岛素的灵敏度的影响。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在人胰岛素单克隆抗体与磁微粒交联之前，利用非离子表面活性剂对人胰岛素单克隆抗体前处理能够显著提高最终所得人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒在检测人胰岛素时的灵敏度。在此基础上完成了本发明。

本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法

基于以上出乎意料的发现，本发明首先提供一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，所述人胰岛素单克隆抗体，例如罗氏公司的单克隆抗体(Roche，克隆号为BM1)在与磁微粒交联之前，利用非离子表面活性剂进行前处理。

相应地，本发明还提供了上文所述人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)用非离子表面活性剂处理人胰岛素单克隆抗体；和

b)将步骤a)处理的人胰岛素单克隆抗体与磁微粒相交联。

本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒可以用于检测人胰岛素或制备人胰岛素检测试剂盒，从而显著提高检测人胰岛素时的灵敏度。

本文所用的术语“非离子表面活性剂”具有与本领域普通技术人员通常理解的含义，即，在水溶液中不产生离子的表面活性剂。非离子表面活性剂溶于水时不发生解离，其分子中的亲油基团与离子型表面活性剂的亲油基团大致相同，其亲水基团主要是由具有一定数量的含氧基团(如羟基和聚氧乙烯链)构成。

在具体的实施方式中，本发明所用的非离子表面活性剂是LF221(BASF公司)、或F68(Sigma公司)、或二者的组合。在优选的实施方式中，本发明所用的非离子表面活性剂是LF221(BASF公司)和F68(Sigma公司)的组合。

在本发明中，所述前处理是将非离子表面活性剂与人胰岛素单克隆抗体进行温育。在优选的实施方式中，在2-8℃，将非离子表面活性剂与人胰岛素单克隆抗体温育30分钟。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以合理确定上述前处理中，人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂各自合适的浓度以及相互的比例。

例如，在具体的实施方式中，前处理中所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的浓度分别为1-3mg/ml、0.8-1.2wt％、0.8-1.2wt％。在优选的实施方式中，所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的浓度分别为12mg/ml、1.0wt％、1.0wt％。

在一优选例中，进行前处理时，人胰岛素抗体溶液与LF221溶液或F68溶液的体积比为(8-10):(0.8-1.2)；优选9:1的比例混合。

在另一具体的实施方式中，前处理中所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的体积比为(6-10):(0.8-1.2):(0.8-1.2)。在优选的实施方式中，所述人胰岛素单克隆抗体溶液与非离子表面活性剂LF221溶液和F68溶液的体积比为8:1:1。

同样，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以合理确定所用的磁微粒。例如，在具体的实施方式中，磁微粒的主要成分是超顺磁性微粒，粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在具体的实施方式中，所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的制备，是将活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基的磁微粒通过共价交联的方式与人胰岛素单克隆抗体中的裸露氨基交联反应，并通过含有0.5～2％的BSA溶液洗涤和封闭，最终贮存于含有0.1～1％的BSA溶液中，2～8℃保存备用。

本发明的人胰岛素检测试剂盒

基于本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，本发明进一步提供了一种人胰岛素检测试剂盒，所述试剂盒装有本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以确定所述人胰岛素检测试剂盒中的其它组分，例如，在具体的实施方式中，本发明的人胰岛素检测试剂盒还可装有：酶标记的人胰岛素单克隆抗体；胰岛素定标品；化学发光底物；和洗涤液。

在优选的实施方式中，所述酶标记的人胰岛素单克隆抗体中的酶是碱性磷酸酶。

相应地，本发明的人胰岛素检测试剂盒中的所述化学发光底物的主要成分可以为1,2-二氧杂环丁烷衍生物，为酶促化学发光底物。在优选的实施方式中，所述1,2-二氧杂环丁烷衍生物为AMPPD(3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)、CDP-star。而本发明的人胰岛素检测试剂盒中的磁微粒试剂的主要成分可以是超顺磁性微粒，其粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

本发明的人胰岛素检测试剂盒可如下所示进行制备，包括：

将本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒；酶标记的人胰岛素单克隆抗体；胰岛素定标品；化学发光底物；和洗涤液制成人胰岛素检测试剂盒。

在具体的实施方式中，所述的磁微粒试剂稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、0.05～0.2％ProClin-300。

在具体的实施方式中，碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体的制备方法为戊二醛偶联法，具体为：将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，室温静置过夜，生理盐水透析后，加入胰岛素单克隆抗体，50mMpH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜，加入甘氨酸，室温反应2小时，等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃2小时，4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mMpH7.40磷酸缓冲液中，对其透析过夜，加入等体积甘油，置于-20℃保存。

在具体的实施方式中，碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体的稀释液的配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mMNaCl、0.5～2％BSA、5～15％甘油、0.05～0.5％吐温-20、0.05～0.2％ProClin-300；所述的胰岛素定标品的浓度分别为5～20μIU/mL和50～150μIU/mL；所述的胰岛素定标品的稀释液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，10～50％牛血清，0.05～0.2％ProClin-300；所述的洗涤液配方为：10～100mMpH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mMNaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

本发明的人胰岛素的检测方法

在本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒以及包含其的人胰岛素检测试剂盒的基础上，本发明还提供一种检测人胰岛素的方法，所述方法利用本发明的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或本发明的人胰岛素检测试剂盒检测样品中的人胰岛素。

本发明的优点

1)包含本发明人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的试剂盒的检测灵敏度高，目前市场上的胰岛素试剂盒的最低检测限一般高于1μIU/mL，相比之下，包含本发明人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的试剂盒的最低检测限能达到0.2μIU/mL；

2)本发明的试剂盒特异性强；胆红素、血红蛋白、乳糜颗粒、类风湿因子(RF)、抗核抗体(ANA)、人抗鼠抗体(HAMA)对胰岛素测定结果均无明显干扰；而人胰岛素原(Proinsulin)、C肽(C-Peptide)、类胰岛素生长因子I(IGF-I)、人生长激素(hGH)和胰高血糖素对胰岛素测定结果均无明显干扰；

3)本发明的试剂盒药物干扰小；对于目前市面上最常见的且临床使用最普遍的4种类胰岛素药物，即，诺和锐、优泌乐、来得时、诺和平，目前市场上主流商品化的胰岛素试剂盒都有着不同程度的干扰，交叉反应率达到3.6％-143％，相比之下，本发明的试剂盒检测300mIU/l浓度以下的诺和锐、优泌乐、来得时、诺和平几乎无明显干扰。

4)本发明的试剂盒测定结果稳定性好；碱性磷酸酶更稳定、测定结果的重复性更好，1,2-二氧杂环丁烷衍生物具有较长的发光时间，发光信号可稳定超过20分钟以上；信号强度高，便于光电倍增管检测；抗干扰能力强，不易污染。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料

本发明实施例中所用的材料和试剂，包括人胰岛素单克隆抗体均是市售可得的。

本发明实施例中用作校准品的胰岛素购自Sigma公司，由科华公司自行稀释到相应浓度；血清样品来自上海长征医院临床检验科。

方法

1.胰岛素磁微粒试剂的制备

胰岛素磁微粒试剂稀释液配方：

将胰岛素磁微粒单克隆抗体交联物用磁微粒稀释液稀释至0.2～0.6mg/mL，室温充分混匀至少30分钟，制得胰岛素磁微粒试剂。

2.碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体的制备

1)将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，使得碱性磷酸酶的浓度为10mg/mL；

2)室温静置过夜；

3)用生理盐水(体积比大于1:200)透析至少4小时；

4)取出透析后的碱性磷酸酶，按照质量1:1的比例加入胰岛素单克隆抗体，充分混匀；

5)50mMpH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜；

6)取出透析液，按照体积比1:1000加入1M甘氨酸溶液，混匀，终止反应2小时；

7)等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃保存2小时；

8)4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mMpH7.40磷酸缓冲液中；

9)50mMpH7.40磷酸缓冲液中透析过夜；

10)取出透析液加入等体积的甘油，制得碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体，置于-20℃保存。

3.胰岛素酶试剂的制备

胰岛素酶试剂稀释液配方：

将碱性磷酸酶标记胰岛素单克隆抗体用酶稀释液稀释至1:1000～1:5000，室温充分混匀至少30分钟，制得胰岛素酶试剂。

4.胰岛素定标品的制备

胰岛素定标品稀释液配方：

将重组人胰岛素抗原用胰岛素定标品稀释液分别稀释至10μIU/mL和100μIU/mL，室温充分混匀至少30分钟，制得胰岛素定标品。通过多次对校准品和定标品同时测定，建立胰岛素试剂盒主曲线，并对胰岛素定标品进行赋值，即为胰岛素定标品的制备。

5.洗涤液的制备

洗涤液配方：

按配方配制洗涤液，室温充分混匀至少30分钟，制得洗涤液。

6.人胰岛素的检测方法

1)加入30μl血清样本、50μl磁微粒试剂、50μl酶试剂；

2)37℃反应15分钟；

3)磁吸后去上清液，加入300μl洗涤液；

4)重复步骤3)2次；

5)磁吸后去上清液，加入300μl化学发光底物；

6)37℃下反应10分钟；

7)光电倍增管(PMT)读取相对发光单位(RLU)，自动计算浓度值。

实施例1.人胰岛素单克隆抗体的前处理

1)将人胰岛素抗体(BM1,Roche)用10mMpH7.40PBS溶液稀释至2mg/ml；

2)将非离子表面活性剂LF221和F68，用纯化水分别稀释至1％(质量百分比浓度)；

3)将人胰岛素抗体与1％LF221或1％F68按照体积比9:1的比例混合；或将人胰岛素抗体与1％LF221、1％F68，按照体积比8:1:1的比例混合，2～8℃下混匀30分钟；

4)将处理后的胰岛素抗体置于10mMpH7.40PBS溶液中，37℃透析4-8小时；

5)取出透析液，胰岛素抗体2～8℃待用。

实施例2.人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的制备

1)取10mg活性功能基团为羧基的1.0μm磁微粒，用50mMpH6.0的MES缓冲液洗涤2次；

2)磁吸后去上清液，加入0.5mL的50mMpH6.0的MES缓冲液混匀，再加入0.5mL25mg/mL碳二亚胺(EDC)溶液，充分混匀；

3)室温反应30分钟；

4)磁吸后去上清液，用50mMpH6.0的MES缓冲液洗涤2次；

5)加入实施例1所得的0.05mg胰岛素单克隆抗体，再用50mMpH6.0的MES缓冲液定容至1mL，充分混匀；

6)37℃反应过夜；

7)用含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，1％BSA溶液洗涤2次。

8)加入2mL含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，1％BSA溶液，充分混匀。

9)37℃封闭过夜；

10)用含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％BSA溶液洗涤2次；

11)加入2mL含有50mMpH7.8Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％BSA溶液，充分混匀；

12)2～8℃保存，制得人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒。

实施例3.人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的灵敏度检测

利用实施例2所得的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，如材料与方法所述进行灵敏度检测(碱性磷酸酶标记的人胰岛素单克隆抗体为BM1)，结果如下表所示：

从上表可以看出，使用1％LF221或者1％F68处理单独处理人胰岛素抗体，灵敏度(S/N值)分别提高2.3倍和2.7倍，而同时使用1％LF221和1％F68处理胰岛素抗体，灵敏度(S/N值)提高4.2倍。综上所述，以下实施例中选择1％LF221+1％F68共同对胰岛素抗体作预处理。

实施例4.胰岛素抗体筛选

从不同供应商挑选了3对胰岛素单克隆抗体，分别为BM1和ST3抗体对(Roche)、HUI-018和OXI-005抗体对(Dako)、10-I30B和10-I30C抗体对(Fitzgerald)。按照磁微粒交联和酶标记给定的工艺分别交联磁微粒抗体交联物和酶标记抗体。将磁微粒抗体交联物按照0.4mg/ml的浓度配制成磁微粒试剂，酶标记抗体按照2μg/ml的浓度配制成酶试剂，比较校准品的反应强度、信噪比(S/N值)、反应线性相关系数r、质控品(Bio-rad)测值、样本比对结果(结果如下表所示)。

从上表可以看出，3种不同来源的抗体对，反应强度明显不同，其中Roche抗体对的反应强度、S/N值、校准曲线相关系数r均最高，Dako次之，两者Biorad测定结果均能满足质控要求。而Fitzgerald抗体对整体反应强度偏低，基本不能满足试剂盒预期性能。样本比对结果可知，Roche抗体的样本比对相关性最佳，Dako次之，Fitzgerald结果最差。

根据以上结果，在以下实施例中选择Roche抗体作为包被抗体(BM1)和标记抗体(ST3)。

实施例5.本发明所述的试剂盒分析性能

1)最低检测限：本试剂盒的最低检测限不高于0.2μIU/mL。

测定空白样本20次，计算20次测定结果均值(M)和标准差(SD)，M+2SD对应的浓度即为试剂盒的最低检测限。

2)准确度：本试剂盒的回收率在85％～115％之间。

3)重复性：本试剂盒的相对变异系数(CV)≤8％。

4)线性范围：本试剂盒的线性范围为0.2～300μIU/mL。

将接近线性范围上限的高值样本进行系列稀释，计算实测值与理论稀释度之间的线性相关系数r，结果应大于或等于0.99。

5)批间差：本试剂盒批间的相对变异系数(CV)≤15％。

6)分析特异性：

测定以下一定浓度的干扰物质，测定结果基本无交叉反应。

7)药物干扰：

测定4种临床中常用的类胰岛素药物，不同浓度下的药物干扰结果见下表。

8)稳定性：本试剂盒2～8℃保存12个月，试剂盒分析性能仍稳定。

实施例6.本发明所述的试剂盒与现有进口试剂盒的临床比对结果

委托上海中医药大学附属龙华医院和上海长征医院从门诊和住院病人中收集共223例临床血清样本，同时对本发明所述的试剂盒与现有的进口胰岛素检测试剂盒(Roche公司，货号12017547)进行检测，通过Medcalc统计软件进行相关性及一致性分析。

1)相关性分析

以现有进口试剂A的临床测定结果为X轴，本发明所述的试剂盒的临床测定结果为Y轴，绘制散点图，进行相关性分析，其相关性方程为：y＝0.9541x+0.177(P<0.001)；相关性系数：r＝0.9917，两者的测定结果相关性良好。

2)一致性分析

采用Bland-Altman统计学方法对两组测定结果进行分析，以每个样本的测定结果的比值作为纵坐标，两者的测定结果的均值作为横坐标作图。计算所有比值的平均值(A)及标准差(SD)，并根据公式A±1.96SD得到95％的一致性界限范围。本次临床试验中A＝0.95，SD＝0.116，因此95％的一致性界限范围为：0.72-1.18。上述结果显示，97.76％(218/223)的测定结果在上述范围内，两者测定结果在统计学上有着一致性。

3)总结：

现有的Roche公司的胰岛素检测试剂盒是目前临床上用于胰岛素测定市场份额最高的产品，其试剂盒的临床性能已被临床广泛接受。本发明所述的试剂盒在临床试验比对中，与进口试剂A的结果相关性及一致性高度吻合，能满足目前市场上对胰岛素测定的需求，且生产成本远低于该试剂盒。

对比例1.阳离子型表面活性剂预处理人胰岛素单克隆抗体

发明人利用411(Stepan公司)或T-77(Rhodia公司)重复实施例1-3，发现利用以上阳离子型表面活性剂对人胰岛素作预处理使得灵敏度降低40％左右。

结论：利用阳离子型表面活性剂未取得与利用非离子型表面活性剂相当的效果。

对比例2.阴离子型表面活性剂预处理人胰岛素单克隆抗体

发明人利用Triton^TMH-66(Dow公司)重复实施例1-3，发现利用以上阴离子型表面活性剂对人胰岛素作预处理使得灵敏度降低20％左右。

结论：利用阴离子型表面活性剂也未取得与利用非离子型表面活性剂相当的效果。

对比例3.两性离子表面活性剂预处理人胰岛素单克隆抗体

发明人利用两性离子表面活性剂1307(BASF公司)重复实施例1-3，发现利用两性离子表面活性剂对人胰岛素作预处理对灵敏度并未产生显著影响。

结论：利用两性离子表面活性剂并未取得与利用非离子型表面活性剂相当的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，其特征在于，所述人胰岛素单克隆抗体在与磁微粒交联之前，利用非离子表面活性剂进行前处理；所述非离子表面活性剂是BASF公司的LF221、或Sigma公司的F68、或二者的组合。

2.如权利要求1所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，其特征在于，所述非离子表面活性剂是BASF公司的LF221和Sigma公司的F68的组合。

3.如权利要求1或2所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，其特征在于，所述人胰岛素单克隆抗体是罗氏公司的单克隆抗体，克隆号为BM1。

4.一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)用非离子表面活性剂处理人胰岛素单克隆抗体；和

b)将步骤a)处理的人胰岛素单克隆抗体与磁微粒相交联；

步骤a)中的所述非离子表面活性剂是BASF公司的LF221、或Sigma公司的F68、或二者的组合。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂是BASF公司的LF221和Sigma公司的F68的组合。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述人胰岛素单克隆抗体是罗氏公司的单克隆抗体，克隆号为BM1。

7.权利要求1-3中任一项所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或权利要求4-6中任一项所述的方法制备的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒在制备人胰岛素检测试剂盒中的用途。

8.一种人胰岛素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒装有：权利要求1-3中任一项所述的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒，或权利要求4-6中任一项所述的方法制备的人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒。