CN101819207B - 一种纳米微球免疫比浊法检测α1-微球蛋白的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定血清中的α1-微球蛋白的试剂盒。所要解决的技术问题是提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。技术方案是：一种纳米微球免疫比浊法检测α1-微球蛋白的试剂盒，包括：a、试剂R₁：缓冲液、稳定剂、电解质、表面活性剂以及适量防腐剂；b、试剂R2：缓冲液、抗人α₁-MG抗体多克隆抗体和纳米微球、适量防腐剂；c、参考校准品：缓冲液、稳定剂、适量防腐剂以及根据浓度需要确定量的重组α1-微球蛋白纯品。

Description

一种纳米微球免疫比浊法检测α1-微球蛋白的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于测定血清成份的试剂盒，特别是测定血清中的α1-微球蛋白(α1-MG)的试剂盒，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。

背景技术

α_1--微球蛋白(α₁-MG)主要在肝脏和淋巴细胞组织中合成，广泛分布于体液及淋巴细胞膜表面的一种糖蛋白，分子质量27KD，在血液中α₁-微球蛋白有游离和与IgA结合等等种形式；正常情况下，血液中游离α₁-微球蛋白可自由通过肾小球滤过，并在近曲小管被重吸收，因此尿中含量极微。而结合IgA的α₁-微球蛋白则不能通过肾小球滤过。由于α₁-微球蛋白的产生量恒定，较少受肾外因素影响，因此测定α₁-微球蛋白浓度对肾功能损伤具有早期诊断意义。

已知测定α₁-微球蛋白(α₁-MG)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法(ELISA法)，这些方法存在着操作繁琐，需要特殊的设备，样本需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种α₁-微球蛋白检测试剂的改进，所提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。

本发明提供的技术方案是：

一种纳米微球免疫比浊法检测α1-微球蛋白的试剂盒，包括试剂R₁、试剂R₂以及参考校准品，其中：

a、试剂R₁：一种使样本中α₁-微球蛋白抗原位点充分暴露，有利于与抗α₁-微球蛋白抗体试剂充分结合的α₁-微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.1-4mmol/L表面活性剂以及适量防腐剂，其余为纯化水；

b、试剂R2：一种结合有抗人α1-微球蛋白抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L的缓冲液、重量比例0.1％-5％的抗人α₁-MG抗体多克隆抗体和纳米微球、并加入适量防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；

c、参考校准品：一种用来与样本比较，进行结果计算的α1-微球蛋白溶液，包括：100-200mmol/L pH7.0的缓冲液、171-180mmol/L的稳定剂、适量防腐剂以及根据浓度需要确定量的重组α1-微球蛋白纯品，其余为纯化水。

α₁-微球蛋白参考校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品；这里没有特别的限制，只要制得的α₁-MG参考校准品能与样本比较，能够测定样本中α₁-MG的含量即可。

所述α₁-微球蛋白试剂溶液中还加入反应促进剂PEG-6000，浓度为3-10mmol/L。

所述结合有抗人α1-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是：用缓冲液在室温下稀释重量比例为1∶1的抗人α₁-MG抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温振荡吸附2小时，加入含0.1％BSA的缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用缓冲液稀释至浓度为0.3％，并加入适当防腐剂。

抗人α₁-MG抗体多克隆抗体和纳米微球包括羊抗人α₁-MG抗体多克隆抗体或兔抗人α₁-MG抗体多克隆抗体或鼠抗人α₁-MG抗体多克隆抗体。

所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混合。

所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPSO。

所述防腐剂是广谱杀菌剂。

本发明检测试剂盒及标准所需主要原料是：

1、羊抗人α₁-MG抗体多克隆抗体或兔抗人α₁-MG抗体多克隆抗体或鼠抗人α₁-MG抗体多克隆抗体，可外购或由浙江伊利康生物技术研发中心按常规方法制备；该抗体仅与人α₁-微球蛋白反应，与其它抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试剂要求。

2、纳米微球，市场上有许多商品化的纳米微球可供选择，包括美国Sigma公司、德国默克公司、日本UNF公司；可选择多种直径的纳米微球，本发明采用了直径为80～120nm的微球，相应的试剂检测主波长为600nm。

3、重组α₁-微球蛋白纯品(外购，或由浙江伊利康生物技术研发中心制备)，用于制备本试剂所需参考校准品。

其余生化原料均可外购。

试剂R2中纳米微球与抗人α1-微球蛋白抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备，优选物理吸附法。

所述参考校准品中添加的重组人α1-微球蛋白纯品，采用人血清或动物血清或其它类似血清基质的液体。

本发明的检测原理是：利用抗原抗体反应，试剂R1作为样本稀释液加入，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入试剂R2(抗人α₁-MG抗体的纳米微球溶液)；α₁-MG抗体的纳米微球与样本中相应的α₁-MG抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的α₁-MG含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知浓度的α₁-MG参考校准品进行比较，则可计算出样本中α₁---MG的含量。

本发明提供的试剂操作简单、样本不用预稀释，采用重组人α₁-微球蛋白纯品的人血清或其它类似血清基质的α₁-微球蛋白参考校准品与样本比较，进行结果计算。本试剂为液体双试剂，具有特异性好，灵敏度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，可用于检测体液中α₁-微球蛋白的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。

附图说明

图1是用实施例1进行检测所得α₁-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的α₁-MG测得值的相互关系示意图。

图2是用实施例2进行检测所得α₁-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的α₁-MG测得值的相互关系示意图。

图3是用实施例3进行检测所得α₁-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的α₁-MG测得值的相互关系示意图。

具体实施方式

α₁-MG检测试剂的制备实施例：

实施例一

1、α₁-MG溶液(试剂R₁)

三羟甲基氨基甲烷(缓冲液)            50mmol/L

吐温-20(表面活性剂)                 0.5mmol/L

NaCL(电解质)                        100mmol/L

PEG-6000(反应促进剂)                4mmol/L

广谱杀菌剂(防腐剂)                  3mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)            5mmol/L

其余为纯化水

2、抗人α₁-MG抗体溶液(试剂R₂)

用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.0)在室温下稀释羊抗人α1-MG抗体多克隆抗体和150nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1)，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1％BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3％，并加入防腐剂；获得α1-微球蛋白检测试剂盒试剂(R₂)。

3、血清型α₁-MG溶液(参考校准品)

CAPSO     (缓冲液)                100mmol/L

广谱杀菌剂(防腐剂)                2mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)          2mmol/L

牛血清白蛋白    (稳定剂)          3mmol/L

氯化钠          (稳定剂)          166mmol/L

其余为纯化水

按照需要的α₁-MG参考校准品浓度将相应的重组α₁-微球蛋白纯品90mg/L加入上述缓冲液中，制备得90mg/L浓度的α₁-微球蛋白参考校准品。

采用本实施例试剂进行具体检测，所得α₁-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的α₁-MG测得值进行比较(参见图1，并进行回归分析)，相关性r＝0.9999(y＝0.9795X+0.3093)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。

实施例二

1、α₁-MG溶液(试剂R₁)

三羟甲基氨基甲烷(缓冲液)            100mmol/L

吐温-20(表面活性剂)                 4mmol/L

NaCL(电解质)                        60mmol/L

PEG-6000(反应促进剂)                8mmol/L

广谱杀菌剂(防腐剂)                  0.1mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)            0.5mmol/L

其余为纯化水

2、抗人α₁-MG抗体溶液(试剂R₂)

用150mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人α₁-MG抗体多克隆抗体和50nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1)，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1％BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为4％，并加入适当的本领域技术人员已知的防腐剂。获得α₁-微球蛋白检测试剂盒试剂2(R₂)。

3、血清型α₁-MG溶液(参考校准品)

CAPSO(缓冲液)                   100mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)        3mmol/L

牛血清白蛋白(稳定剂)            3mmol/L

氯化钠(稳定剂)                  166mmol/L

广谱杀菌剂(防腐剂)              5mmol/L

其余为纯化水

按照需要的α₁-MG参考校准品浓度将相应的重组α₁-微球蛋白纯品80mg/L加入上述缓冲液中，制备得80mg/L浓度的α₁-微球蛋白参考校准品。

采用本实施例试剂进行具体检测，所得α₁-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的α₁-MG测得值进行比较(参见图2，并进行经回归分析)，相关性r＝0.9992(y＝1.0106X-0.4244)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。

实施例三

1、α₁-MG溶液(试剂R₁)

三羟甲基氨基甲烷(缓冲液)        200mmol/L

吐温-20(表面活性剂)             2mmol/L

NaCL(电解质)                    200mmol/L

PEG-6000(反应促进剂)            5mmol/L

广谱杀菌剂(防腐剂)              3mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)        2mmol/L

其余为纯化水

2、抗人α₁-MG抗体溶液(试剂R₂)

用200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4)在室温下稀释羊抗人α1-MG抗体多克隆抗体和100nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为1∶1)，将两者混匀后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1％BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为2％，并加入适当的本领域技术人员已知的防腐剂。获得α₁-微球蛋白检测试剂盒试剂2(R₂)。

3、血清型α₁-MG溶液(参考校准品)

CAPSO           (缓冲液)        200mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)        0.5mmol/L

牛血清白蛋白    (稳定剂)        5mmol/L

氯化钠          (稳定剂)        166mmol/L

广谱杀菌剂      (防腐剂)        2mmol/L

其余为纯化水

按照需要的α1-MG参考校准品浓度将相应的重组α1-微球蛋白纯品100mg/L加入上述缓冲液中，制备得100mg/L浓度的α1-微球蛋白参考校准品。

采用本实施例试剂进行具体检测，所得α₁-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的α₁-MG测得值进行比较(参见图3，并进行回归分析)；相关性r＝0.9994(y＝1.0017X-0.1985)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。

本发明的测定条件及步骤：

结果的计算：

$\mathrm{\α}1-\mathrm{MG}(\mathrm{mg}/L)=\mathrm{CS}\×\frac{{\mathrm{\ΔA}}_T}{{\mathrm{\ΔA}}_S}(\mathrm{mg}/L)$

式中：

ΔAT待测样品平均每分钟吸光度变化值

ΔAS校准液平均每分钟吸光度变化值

CS校准液中α1-MG的浓度

尚需补充的是：本文中凡未特别标明的比例均为重量比。

Claims (2)

1.一种纳米微球免疫比浊法检测α₁-微球蛋白的试剂盒，包括试剂R₁、试剂R₂以及参考校准品，其中：

a、试剂R₁：一种使样本中α₁-微球蛋白抗原位点充分暴露，有利于与抗α₁-微球蛋白抗体试剂充分结合的α₁-微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、0.5-5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、50-200mmol/L NaCL、0.1-4mmol/L吐温-20、3-10mmol/L PEG-6000以及适量广谱杀菌剂，其余为纯化水；

b、试剂R₂：一种结合有抗人α₁-微球蛋白抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的抗人α₁-微球蛋白抗体多克隆抗体和纳米微球，并加入适量防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；

c、参考校准品：一种用来与样本比较，进行结果计算的α₁-微球蛋白溶液，包括：100-200mmol/L pH 7.0的CAPSO、171-180mmol/L的稳定剂、适量广谱杀菌剂以及根据浓度需要确定量的重组α₁-微球蛋白纯品，其余为纯化水；所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混合。

2.权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测α₁-微球蛋白的试剂盒，其中的结合有抗人α₁-微球蛋白抗体的纳米微球溶液制备方法是：用三羟甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1：1的抗人α₁-微球蛋白抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温振荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入防腐剂。

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