CN106442964A - 用于蛋白质固相化的包被液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法。该方法包含以下步骤：将酸液加入至预设浓度的缓冲溶液中，调整缓冲溶液的pH；将非离子型表面活性剂按预设的体积百分数加入至pH调整后的缓冲溶液中，混合均匀后加入生物活性物质，再次混合均匀后静止即得用于蛋白质固相化的包被液。本发明的实施方式通过在溶液配方中加入非离子型表面活性剂，降低液体表面张力，消除因管材疏水性而导致管道内留存气泡和管道嘴尖部留存空腔的可能性，从根本上消除了因此产生的分装液体体积不精确的情况，从而提高了包被液的加液精度。另外，该方法工艺成本低廉、易于操作，涉及的物料均对环境无害。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法。
背景技术
体外诊断试剂作为医疗器械的一个分支，对于各组分的纯度、杂质种类均有非常严格的要求，为了避免在生产过程中对液体试剂的污染，以及避免不同产品或同一产品不同批次共用生产设备时可能产生的交叉污染，各液体分装设备与溶液试剂接触的部分均会进行钝化处理，或使用易于清洁的疏水性材料制作的零部件，但这两种方法均会导致因部件表面的高疏水性而在管路内形成气泡，同时在加液管道嘴尖部会形成一段不含液体的空腔。在以压力为驱动力的加液设备中，由于气泡在压力的作用下体积和位置不恒定，且管道嘴尖部的空腔体积不确定，均会对加液精度产生一定的误差。
举例来说：在酶联免疫法试剂所必须的微孔反应板制备的过程中，包被液需精确分装至每一微孔中，且每一微孔中分装的包被液体积不超过200微升(即1/5毫升)，且在此过程中分装体积的误差会导致最终产品检测性能的差异，进一步可能导致对临床样本检测结果的偏差和对临床医生诊断及处方的误导。该风险是在体外诊断试剂生产过程中需极力避免的问题。目前常见且有效的解决的办法是人为增大加液体积，以达到可以将误差忽略的目的。但该方法在提高生产成本的同时，也并不能解决小体积液体分装时面临的问题。
综上所述，提供一种加液精度高的包被液的制备方法是目前我们亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，使得包被液的加液精度大大提高，从而降低产品的批内差异。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，该方法包含以下步骤：将酸液加入至预设浓度的缓冲溶液中，调整缓冲溶液的pH；将非离子型表面活性剂按预设的体积百分数加入至pH调整后的缓冲溶液中，混合均匀后加入生物活性物质，再次混合均匀后静止即得用于蛋白质固相化的包被液。
本发明实施方式相对于现有技术而言，通过在溶液配方中加入非离子型表面活性剂，降低液体表面张力，消除因管材疏水性而导致管道内留存气泡和管道嘴尖部留存空腔的可能性，从根本上消除了因此产生的分装液体体积不精确的情况，从而提高了包被液的加液精度。另外，该方法工艺成本低廉、易于操作，涉及的物料均对环境无害。
另外，缓冲溶液的预设浓度为:10～50mM，缓冲液的浓度涉及到该溶液的缓冲能力，如果浓度过低，会导致缓冲能力不足，在生产过程中空气中的二氧化碳溶解在溶液中会引起明显的pH降低；如果浓度过高，则会导致调整pH的时候需加入更多的盐酸。
另外，缓冲溶液的pH调整至8.5～10.5。
另外，缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷(简称：Tris)缓冲溶液，Tris缓冲溶液的表面张力较小，可显著降低所配制溶液的表面张力。
另外，预设的体积百分数为：0.01～0.70％。
另外，预设的体积百分数为：0.02～0.50％，由于使用的非离子型表面活性剂均是粘稠液体，如果加入的体积过小，那么会在分装的过程中产生较大的偏差，从而导致生产过程中存在不可控的风险，如果加入的体积过大，非离子型表面活性剂会产生泡沫较多，进而造成加液体积的不准确。
另外，酸液为盐酸溶液，盐酸溶液氧化性较弱，能够为生物活性物质提供一个比较温和的反应环境。
另外，非离子型表面活性剂为以下之一或其组合：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚，上述非离子型表面活性剂即对生物活性物质本身结构不会产生影响，还能有效降低溶液的表面张力。
另外，生物活性物质为蛋白质。
另外，蛋白质为抗体或抗原。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，该方法包含以下步骤：将酸液加入至预设浓度的缓冲溶液中，调整缓冲溶液的pH；将非离子型表面活性剂按预设的体积百分数加入至pH调整后的缓冲溶液中，混合均匀后加入生物活性物质，再次混合均匀后静止即得用于蛋白质固相化的包被液。
具体地，在本实施方式中，缓冲溶液的预设浓度可以为:10～50mM，缓冲溶液的pH可以调整至8.5～10.5。
值得注意的是，在本实施方式中，缓冲溶液可以为三羟甲基氨基甲烷(简称：Tris)缓冲溶液，Tris缓冲溶液的表面张力较小，可显著降低所配制溶液的表面张力，但是本实施方式不应以此为限，本领域普通技术人员可以根据需要灵活选择缓冲溶液，只要该缓冲溶液的表面张力较小均在本发明的保护范围之内。
另外，预设的体积百分数为：0.01～0.70％。更具体地，预设的体积百分数可以为：0.02～0.50％。
值得一提的是，酸液可以为盐酸溶液，当然也可以是其他酸液。
另外，非离子型表面活性剂为以下之一或其组合：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(简称：Tween-20)、聚乙二醇辛基苯基醚(简称：Triton X-100)，上述非离子型表面活性剂即对生物活性物质本身结构不会产生影响，还能有效降低溶液的表面张力。
在实际制备过程中，生物活性物质可以优选蛋白质，具体地，蛋白质可以为抗体或抗原。
举例来说，该方法具体包含以下步骤：使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)配制成为终浓度为10mM的Tris缓冲溶液，使用稀盐酸溶液调整pH至8.5，按体积百分数为0.02％加入Tween-20，混合均匀后加入包被用的抗原，再次混匀后静置至液体中不含气泡即得用于蛋白质固相化的包被液。
下面通过实验来检测不同缓冲液配制得到的包被液的表面张力，具体的是使用毛细管上升法测量相关溶液表面张力，计算公式为：σ＝[(ρ1-ρg)ghr]/(2cosθ)
式中：σ—液体表面张力；ρ1—液体密度；ρg—空气密度；g—重力加速度；h—液柱高度；r—毛细管直径。
待测三种液体(溶液1：纯化水；溶液2：当缓冲液为碳酸缓冲液时配制的包被液；溶液3：按照本发明实施方式制备得到的包被液)的密度均为1000kg/m3；空气密度约为1.293kg/m3；重力加速度g为9.8m/s；使用的毛细管直径为0.7mm；由于使用的毛细管被完全浸润，因此认为θ近似于0，cosθ＝1。
使用实验室自制装置测量溶液1爬高21.67mm(三次测量分别为21mm、22mm、22mm，取均值)，经公式计算的表面张力为7.42x 10-2(N/m)，与文献记载纯化水表面张力接近，据此认为该装置可用于测量液体表面张力。
使用自制装置测量得常规方法的溶液2爬高22mm(三次测量分别21mm、22mm、23mm，取均值)，计算得表面张力为7.54x 10-2(N/m)。
使用自制装置测量得溶液3爬高3.67mm(三次测量分别为3.5mm、4.5mm、3.0mm)，计算得表面张力为1.26x 10-2(N/m)。
对比上述三种液体的的液体表面张力，由此结果可见，本发明实施方式的方法配制的溶液其表面张力较常规方法有大幅度下降。
另外，在本实施方式中，为了验证本发明实施方式配制的液体分装精度，下面通过实验来验证，具体实验过程如下：
首先准备2组溶液，第一组溶液是常规方法配制的包被液，第二组溶液是本发明实施方式制备得到的包被液。
使用称重法测量微孔反应板中加液质量，按照1000kg/m3的密度计算得体积，对加样体积进行统计，计算离散系数，并据此比较液体分装精度。比较试验使用可拆卸微孔反应板，整块微孔反应板可拆为12条，每条有8个微孔。在液体分装前对每一条微孔反应板进行标记并称重记录，在每一微孔中加入120微升第一组包被液或第二组包被液，分装液体后对每一条微孔反应板进行称重测量，扣除分装前空板的重量后，对液体净重体积进行汇总统计。
值得注意的是，实验过程使用全自动加样设备对两种缓冲液均连续分装10块微孔反应板，因此每种缓冲液均可得120个测量数据，第一组包被液、第二组包被液数据及计算结果如表1、表2所示：
表1(单位：毫升)：
上述数据计算得平均值为870.43(毫升)，离散系数(CV％)为18.01％。表2(单位：毫升)：
| 870 | 1045 | 816 | 888 | 950 | 964 |
| 833 | 933 | 1045 | 869 | 885 | 895 |
| 920 | 799 | 887 | 904 | 986 | 838 |
| 1033 | 841 | 831 | 950 | 858 | 900 |
| 845 | 827 | 842 | 784 | 908 | 833 |
| 883 | 965 | 1014 | 1022 | 1014 | 935 |
| 1036 | 829 | 1035 | 892 | 869 | 981 |
| 900 | 987 | 913 | 996 | 937 | 927 |
| 979 | 892 | 806 | 1032 | 1027 | 983 |
| 1037 | 985 | 910 | 1034 | 1048 | 830 |
| 814 | 879 | 928 | 777 | 785 | 786 |
| 915 | 827 | 1023 | 1026 | 1033 | 875 |
| 937 | 1000 | 845 | 798 | 784 | 920 |
| 967 | 1032 | 1032 | 1013 | 804 | 973 |
| 983 | 908 | 909 | 774 | 964 | 793 |
| 774 | 772 | 1016 | 1043 | 930 | 876 |
| 881 | 945 | 869 | 820 | 933 | 1041 |
| 845 | 909 | 929 | 981 | 953 | 910 |
| 1018 | 872 | 890 | 802 | 829 | 927 |
| 1039 | 852 | 814 | 949 | 998 | 954 |
上述数据计算得平均值为916.27(毫升)，离散系数(CV％)为8.89％。
通过上述实验数据，不难发现，按照每孔分装120微升，8孔理论分装
量应为960微升。与传统方法相比较，本发明实施方式中的方法配制所得溶
液在相同的分装体系下，分装准确性和精确性均有一定程度提高。
与现有技术相比，本实施方式中，通过对在配方中加入非离子型表面活性剂，降低液体表面张力，消除因管材疏水性而导致管道内留存气泡和管道嘴尖部留存空腔的可能性，从根本上消除了因此产生的分装液体体积不精确的情况，从而提高了包被液的加液精度。另外，该方法工艺成本低廉、易于操作，涉及的物料均对环境无害。
本发明的第二实施方式涉及一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，第二实施方式与第一实施方式大致相同，只是对其中各反应物的反应参数进行了调整，该方法包含以下步骤：使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)配制成为终浓度为50mM的Tris缓冲溶液，使用稀盐酸溶液调整pH至10.5，按体积百分数为0.5％加入Tween-20，混合均匀后加入包被用的抗体，再次混匀后静置至液体中不含气泡即得用于蛋白质固相化的包被液。
本发明的第三实施方式涉及一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，第三实施方式与第一实施方式大致相同，只是对其中各反应物的反应参数进行了调整，该方法包含以下步骤：使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)配制成为终浓度为50mM的Tris缓冲溶液，使用稀盐酸溶液调整pH至10.5，按体积百分数为0.5％加入Triton X-100，混合均匀后加入包被用的抗体，再次混匀后静置至液体中不含气泡即得用于蛋白质固相化的包被液。
本发明的第四实施方式涉及一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，第四实施方式与第一实施方式大致相同，只是对其中各反应物的反应参数进行了调整，该方法包含以下步骤：使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)配制成为终浓度为30mM的Tris缓冲溶液，使用稀盐酸溶液调整pH至9，按体积百分数为0.7％加入Triton X-100，混合均匀后加入包被用的抗体，再次混匀后静置至液体中不含气泡即得用于蛋白质固相化的包被液。
本发明的第五实施方式涉及一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，第五实施方式与第一实施方式大致相同，只是对其中各反应物的反应参数进行了调整，该方法包含以下步骤：使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)配制成为终浓度为20mM的Tris缓冲溶液，使用稀盐酸溶液调整pH至10，按体积百分数为0.01％加入Tween-20，混合均匀后加入包被用的抗原，再次混匀后静置至液体中不含气泡即得用于蛋白质固相化的包被液。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
将酸液加入至预设浓度的缓冲溶液中，调整所述缓冲溶液的pH；
将非离子型表面活性剂按预设的体积百分数加入至pH调整后的所述缓冲溶液中，混合均匀后加入生物活性物质，再次混合均匀后静止即得用于蛋白质固相化的包被液。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的预设浓度为:10～50mM。
3.根据权利要求1所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH调整至8.5～10.5。
4.根据权利要求1所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述预设的体积百分数为：0.01～0.70％。
6.根据权利要求5所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述预设的体积百分数为：0.02～0.50％。
7.根据权利要求1所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述酸液为盐酸溶液。
8.根据权利要求1所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为以下之一或其组合：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述生物活性物质为蛋白质。
10.根据权利要求9所述的用于蛋白质固相化的包被液制备方法，其特征在于，所述蛋白质为抗体或抗原。
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