CN102341707B - 检测试剂以及使用该检测试剂测定检测样品中的被测定物的方法 - Google Patents
检测试剂以及使用该检测试剂测定检测样品中的被测定物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的课题是:提供检测试剂以及使用该检测试剂测定检测样品中的被测定物的方法,该检测试剂是以悬浮有粒子的粒子悬浮液中的粒子的凝集作为指标的、检测样品中的被测定物的检测试剂,所述粒子是将被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的,该检测试剂在保存中不发生自身凝集,且测定时也几乎不发生非特异性凝集。所述课题的解决方法是:用于测定被测定物的检测试剂至少含有A液和B液,A液是具有30ms/cm以上电导率的缓冲液,B液是悬浮有粒子的粒子悬浮液,所述粒子是将被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的,并且B液具有6.5ms/cm以下的电导率。
Description
技术领域
本发明涉及检测样品中的被测定物的检测试剂以及使用该检测试剂测定该被测定物的方法,其中,该检测试剂以悬浮有粒子的粒子悬浮液中的粒子的凝集为指标,所述粒子是将被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的。
背景技术
下列方法作为免疫凝集法是公知的并且被广泛采用:将悬浮有粒子的粒子悬浮液作为检测试剂——所述粒子是将抗体、抗原担载于不溶性载体粒子上得到的,与检测样品反应,然后以粒子的凝集程度为指标,测定检测样品中的被测定物(抗原、抗体)。
有报道称,担载了抗体的不溶性载体在特定的环境下在NaCl浓度为一定浓度以下的低离子强度的液相中、或相反地在一定浓度以上的高离子强度的液相中分散。
在NaCl浓度为一定浓度以下的低离子强度、即,电导率低的溶剂中担载有悬浮蛋白质的不溶性载体在高效率获得分散性、灵敏度方面是优异的。但是,由于来自生物物质中的夹杂物质的离子的混入,可能发生非特异性凝集。
已知对于生物样品,对目标物质的免疫反应产生影响的妨碍物质存在于生物样品中。为了避免免疫反应的妨碍物质的影响,广泛采用使用试剂的方法,所述试剂应用各种添加物。例如,已知下列方法:其使用用于检测目标物质的反应液、以及作为第2试剂的缓冲液,可避免妨碍物质的影响的物质在所述第2试剂中共存。缓冲液大多采用具有与生理盐水接近的电导率(约15-20 mS/cm)的溶液。在采用在低电导率条件下担载悬浮抗体的不溶性载体的测定系统中,在测定时,仅将反应液与缓冲液混合就可能引发非特异性凝集。
在免疫凝集法等中,为了提高试剂的灵敏度,有时使用各种添加剂(例如:聚乙二醇、胍)。但是,使用添加剂则电导率增加,在测定时,仅将试剂液与缓冲液混合就可能发生非特异性凝集。
另一方面,使用在高电导率条件下担载悬浮蛋白质的不溶性载体时,如果是数小时以内的短时间,则不发生自身凝集。但是,在数天或数个月以上的长期保存中,可能发生自身凝集而无法保存。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2005-351643号公报
专利文献2:日本特许第3095541号
专利文献3:日本特开昭57-182168号公报
非专利文献
非专利文献1:J.Biomater.Sci.Polymer Edn,Vol.10,No.11,PP.1093-1105 (1999)。
发明内容
本发明的目标是提供检测试剂以及使用该试剂测定检测样品中被测定物的方法,所述检测试剂是以悬浮有粒子的粒子悬浮液中的粒子的凝集为指标的、检测样品中的被测定物的检测试剂,所述粒子是将被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的,所述检测试剂在保存中不发生自身凝集,并且在测定时也几乎不发生非特异性凝集。
本申请发明人进行了深入的研究,结果发现,通过将检测试剂制成分别含有粒子悬浮液和缓冲液的双液系统,同时使粒子悬浮液的电导率比特定值低、使缓冲液的电导率比作为常规检测试剂使用的缓冲液的电导率高且比特定值高、在测定操作开始之前即刻将缓冲液和粒子悬浮液混合并进行测定,在保存中不发生自身凝集,并且在测定时也能够抑制非特异性凝集,从而完成了本发明。
即,本发明提供用于测定上述被测定物的检测试剂,该检测试剂至少含有A液和B液,A液是具有30 mS/cm以上电导率的缓冲液;B液是悬浮有粒子的粒子悬浮液并具有6.5 mS/cm以下的电导率,其中,所述粒子是将被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的。本发明还提供使用上述本发明的检测试剂测定检测样品中被测定物的方法,该方法包含将上述A液、上述B液和上述检测样品混合的步骤以及测定所得混合液中上述粒子的凝集程度的步骤,并且在测定操作开始之前即刻将至少上述A液与上述B液混合。
根据本发明,在试剂的保存中不发生自身凝集,另外在测定时也几乎不发生非特异性凝集,因此可以准确地测定检测样品中的被测定物。
附图说明
图1是表示使用自动测定装置实施本发明的方法时A液、B液和检测样品的混合方法的一个方案的图。
图2是表示在自动测定装置中使用Y字型管实施本发明的方法时A液、B液和检测样品的混合方法的又一方案的图。
图3是表示使用过滤管实施本发明的方法时A液、B液和检测样品的混合方法的另一方案的图。
图4表示由本发明的实施例制作的校准曲线。
具体实施方案
如上所述,本发明的试剂含有作为缓冲液的A液、和作为粒子悬浮液的B液。A液和B液是在分开的容器中容纳的个别液体,其在测定操作开始之前即刻混合。混合的方式在下文中陈述。
A液 (缓冲液)
作为缓冲液的A液中所含的缓冲剂可以是检测试剂中通常使用的公知的缓冲剂,例如可优选使用:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等氨基酸;柠檬酸、马来酸、戊二酸等的羧酸盐;磷酸钠、磷酸氢钠等磷酸盐;碳酸钙、碳酸镁等碳酸盐;Good's缓冲剂等,适宜使用Tris缓冲剂、Good's缓冲剂、磷酸系缓冲剂,但缓冲剂并不限于此。
A液的电导率为30 mS/cm以上,优选35 mS/cm以上。电导率的上限没有特别限定,通常、电导率为200 mS/cm以下,优选100 mS/cm以下。通过使A液的电导率为30 mS/cm以上,测定时的非特异性凝集得到显著抑制。作为以往在检测试剂中广泛使用的缓冲液,使用与生理盐水具有同程度电导率的缓冲液,即,电导率为15-20 mS/cm左右的缓冲液。因此,本发明中的一个特征是使用具有比通常高的电导率的缓冲液。电导率可按照使用广泛市售的电导率计的常规方法测定。电导率的测定在室温下进行。
通过调节上述缓冲剂的浓度和添加水溶性离子化合物,可将A液的电导率调节为任意值。可使用的优选的水溶性离子化合物例如可举出:钠、钾等碱金属和/或镁、钙等碱土类金属的氯化物、溴化物、碘化物、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、硫酸盐,明矾类等。其中,NaCl是简便和优选的。如果使用市售的电导率计,则可实时测定液体的电导率,因此,通过一边测定电导率一边添加水溶性离子化合物,可以容易地达到期望的电导率。
B液(粒子悬浮液)
如上所述,在B液中,被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的粒子以悬浮状态被包含。该悬浮粒子没有任何限定,可以是以往在检测试剂中使用的公知的粒子。
即,被测定物捕获物质是可与要测定的被测定物特异性结合的物质即可,其可以通过抗原抗体反应、配体-受体反应等特异性结合反应与被测定物结合。利用抗原抗体反应的方法是被称为免疫凝集法的公知的免疫测定法,被测定物为抗原时,担载与该抗原进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段(保持与抗原的结合性的Fab片段、F(ab')2片段等)。被测定物为抗体时,抗体也是抗原,因此,担载与该抗体进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段。另外,这些抗体可以是单克隆抗体,也可以是多克隆抗体。
被测定物为抗原时,被测定物例如可举出:CRP (C-反应蛋白)、前列腺特异抗原、铁蛋白、β-2微球蛋白、肌红蛋白、巨蛋白、足萼蛋白运铁蛋白、白蛋白、肌酸酐等蛋白标志物,各种肿瘤标志物,LDL、HDL、TG等脂蛋白,甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、RS病毒(RSV)、鼻病毒(rhinovirus)、轮状病毒(rotavirus)、诺如病毒(norovirus)、腺病毒(adenovirus)、星状病毒(astrovirus)、HAV、HBs、HCV、HIV、EBV等病毒抗原,沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、溶血性链球菌(hemolytic streptococcus)、百日咳菌(bordetella pertussis)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)、钩端螺旋体(leptospira)、梅毒螺旋体(treponema palidum)、弓形虫(toxoplasma gondii)、包柔氏螺旋体(borrelia)、军团菌属菌(legionella)、炭疽杆菌(anthrax bacillus)、MRSA等细菌抗原,细菌等生产的毒素,支原体(mycoplasma)脂质抗原,人绒毛膜促性腺激素等肽激素、类固醇激素等类固醇,肾上腺素或吗啡等生理活性胺类,维生素B类等维生素类,前列腺素类,四环素等抗生素,农药、环境激素等,但并不限于这些。优选的例子可举出:CRP、前列腺特异抗原、铁蛋白和β-2微球蛋白等抗原。
被测定物为抗体时,被测定物可举出:与上述蛋白质标志物、各种肿瘤标志物、脂蛋白、病毒抗原、细菌抗原、细菌等产生的毒素、肽激素、类固醇、生理活性胺类、维生素类、抗生素、农药、环境激素等抗原特异性反应的抗体等。
被测定物为抗原时,可以使与被测定物结合的被测定物捕获物质为抗体,使载体粒子敏化。被测定物为抗体时,可以使与被测定物结合的被测定物捕获物质为载体粒子中的抗原而敏化。被测定物为配体时,可以使与被测定物结合的被测定物捕获物质为受体,使载体粒子敏化,被测定物为受体时,可以使与被测定物结合的被测定物捕获物质为载体粒子中的配体。
不溶性载体也可以是以往在检测试剂中使用的公知的载体,例如可举出聚乙烯、聚苯乙烯等树脂胶乳,氧化铝,二氧化硅,胶体金,磁性粒子等粒子。在这些不溶性载体中,适合使用胶乳粒子、特别是聚苯乙烯胶乳粒子。
B液中的悬浮粒子浓度根据所使用的被测定物捕获物质的种类、被测定物的种类、检测样品中被测定物的预测浓度等适当设定,通常,粒子浓度为0.01-0.5%左右。
B液的电导率为6.5 mS/cm以下,优选5 mS/cm以下。B液的电导率为6.5 mS/cm以下时,可防止保存中粒子的自身凝集,另外,几乎不发生测定时的非特异性凝集。电导率的下限没有特别限定,通常电导率为0.1 mS/cm以上。6.5 mS/cm以下的电导率通过使用例如水、醇(例如乙醇等)、糖液(例如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等)等作为B液的溶剂来实现。在实现上述电导率的范围内,B液内也可添加氯化钠、缓冲剂。
本发明的检测试剂中可以结合作为添加剂的下列物质:用于检出检测对象物质的显色试剂、反应性试剂,胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶等酶,表面活性剂,用于抗体稳定化、抑制非特异性反应的蛋白质等,用于调节比重的糖类、甘油等。这些添加剂可以添加在A液或B液中,也可以在测定时作为与A液、B液分开的试剂(进一步地,另外的液体)添加。
测定方法
使用上述本发明的检测试剂的本发明的测定方法包含以下步骤:将A液、B液和检测样品混合的步骤,以及测定所得混合液中上述粒子的凝集程度的步骤。
检测样品只要是可能含有上述的被测定物抗原、抗体等的检测样品即可,没有任何限定。但是,推测测定时的非特异性凝集是由来自检测样品中的夹杂物质的离子的混入导致的,因此,本发明在应用于由人体或动物、优选由人体采集的检测样品时最发挥威力。这种检测样品例如可举出:血液、血清、尿液、脑脊髄液、汗液、淋巴液、唾液、胃液等液体,粪便、毛发、角质、指/趾甲等,适合使用血液、血清、血浆、尿液、脑脊髄液或粪便,特别适合使用来自血液的血液、血清或血浆。
对于A液、B液、检测样品的混合,只要可将它们三者(检测试剂含有另外的添加剂时,进一步包含该添加剂)混合即可,其顺序没有限定,可举出将三者同时混合的方法、将A液与B液混合后混合检测样品的方法、将A液与检测样品混合后混合B液的方法等。使用自动测定装置的凝集法也广泛采用,本发明中也可优选使用市售的自动测定装置。使用自动测定装置时的A液、B液、检测样品的混合方案可举出例如图1-图2所示的方案。在图1的方法中,先添加下面的液体,然后添加上面的液体。图2所示的方法是使用Y字形管的方法,其中使A液和B液合流混合,然后将该混合液与检测样品混合。图3所示的方法是使用过滤管的混合方法,其中将A液加入到管内,将检测样品加入到过滤器内,将A液、检测样品混合过滤,滴加到B液中。优选在混合后搅拌。
至少A液与B液的混合在测定操作开始之前即刻进行。这里,“测定操作”是测定混合液中粒子的凝集程度的操作,通常是吸光度或浊度的测定。“之前即刻”是测定操作开始前10分钟以内、优选5分钟以内。通过将A液和B液在测定操作开始之前即刻混合,本发明的效果得以实现,即,防止保存时的自身凝集、防止测定时的非特异性凝集。另外,混合时各液的温度优选为进行反应的温度,通常为室温-37℃。
与以往同样,混合后,通常使反应进行1分钟-1小时左右、优选3分钟-15分钟左右。与以往同样,凝集程度通常通过光学方法测定,优选通过测定吸光度或浊度进行。对各种已知浓度的标准样品进行测定,将浓度与测定值(吸光度等)的关系绘图,制作校准曲线,通过将针对检测样品得到的测定值代入校准曲线,可以测定检测样品中的被测定物。“测定”以包含检出、定量、半定量中任一种的含义使用。
检测试剂试剂盒
使用上述本发明的检测试剂的本发明的检测试剂试剂盒含有A液、B液和容器等检测所必须的试剂和部件。
以下,基于实施例更具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。
实施例
实施例1-3、比较例1-5
如下所示,测定粒子悬浮液(B液)的自身凝集的差异,所述粒子悬浮液(B液)含有担载了悬浮蛋白质的不溶性载体粒子。另外,将生理盐水作为空白检测物,评价在改变缓冲液(A液)的电导率的反应条件下非特异性凝集的差异。另外,通过CRP的测定评价灵敏度的差异。
使用材料
A液:在含100 mM Tris的缓冲液中一边监控电导率一边添加氯化钠,得到规定的电导率。电导率为8 mS/cm(氯化钠浓度50 mM,比较例1、5)、16 mS/cm (氯化钠浓度150 mM,比较例2)、35 mS/cm (氯化钠浓度400 mM,实施例1)、75 mS/cm (氯化钠浓度1000 mM,实施例2,比较例3、4)、200 mS/cm (氯化钠浓度5000 mM,实施例3)。
B液:在将担载了0.25 mg/mL市售抗CRP抗体的平均粒径220 nm的0.1%聚苯乙烯胶乳分散于水中而成的反应液中添加氯化钠,得到规定的电导率。电导率为5 mS/cm (氯化钠:50 mM,实施例1-3,比较例1、2)、15 mS/cm (氯化钠:150 mM,比较例3)、78 mS/cm (氯化钠:1000 mM,比较例4、5)。
方法
测定上述B液的初期吸光度和1个月后的吸光度,确认自身凝集的有无。
使用生理盐水作为空白检测样品,将上述A液与B液混合得到的试剂用自动分析装置测定,确认试剂的非特异性凝集。即,在日立7180型(商品名)自动分析装置上,在2.4 μL生理盐水中添加120 μL上述的A液,将该混合液在37℃下搅拌混合,然后放置5分钟,然后添加120 μL上述B液,进一步在37℃下搅拌混合。以570 nm的吸光度变化量来测定约5分钟的凝集反应。
CRP测定使用含有0.05 mg/dL CRP的溶液作为检测样品,通过自动分析装置对将上述A液与B液混合得到的试剂进行测定,确认吸光度变化量。即,在日立7180型(商品名)自动分析装置中,在2.4 μL 0.05 mg/dL的CRP溶液中添加120 μL上述A液,将该混合液在37℃下搅拌混合,然后放置5分钟,然后添加120 μL上述B液,进一步在37℃下搅拌混合。以570 nm的吸光度变化量来测定约5分钟的凝集反应。
评价方法
对于自身凝集,在保存前后分别计算0.1%聚苯乙烯胶乳粒子分散液的吸光度、和B液的吸光度之差,按照以下的判定基准评价各电导率下的自身凝集。
判定基准
以0.1%聚苯乙烯胶乳粒子分散液的吸光度为基准,
○:差为15%以下
×:差超过15%
关于测定时的非特异性凝集,按照以下的判定基准,评价自动分析装置中生理盐水测定时的吸光度变化量。
判定基准
○:吸光度变化量ΔAbs的10000倍为20以下
×:吸光度变化量ΔAbs的10000倍超过20
CRP测定
关于CRP的测定,计算作为空白的生理盐水和0.05 mg/dL CRP溶液测定时的吸光度变化量之差,对灵敏度进行比较。
电导率的测定
A液和B液的电导率的测定使用东亚电波工业(株式)会社制造的电导率计CM-60G型进行。
(电极:CT-57101B,温度:25℃)
结果
结果如下述表1所示。
[表1]
如表1所示,在B液的电导率比本发明所规定的范围高的比较例3-5中,保存1个月后发生自身凝集(比较例3中,混合后即刻起发生自身凝集)。另外,在A液的电导率比本发明所规定的范围低的比较例1和2中,测定生理盐水时吸光度也发生变化,即,发生了非特异性凝集。
接着,对于不发生非特异性凝集的实施例1-3和比较例3-5,对其0.05 mg/dL CRP溶液测定时的吸光度变化量进行比较。实施例1-3显示比比较例3-5高的吸光度变化量。另外,在实施例2和比较例5中,A液与B液的电导率大致相反地设定,其最终的电导率大致相同。但是,如本发明的规定,将电导率设定成B液比A液低的实施例2显示更高的吸光度。
因此,至少含有具本发明所规定的电导率的缓冲液A液和B液的检测试剂以及测定方法可以防止B液的胶乳粒子的自身凝集,并且保存性优异。另外,可防止非特异性凝集且可实现高灵敏度的测定。
实施例3
校准曲线制作
使用上述实施例2的试剂,使用含有各种浓度的CRP的标准溶液,与上述同样地进行测定,进行校准。所得吸光度变化量与CRP浓度的关系如图4所示。
如图4所示,可知吸光度依赖于CRP浓度变化,使用该试剂,可以进行CRP的定量。
实施例4
血清检测物的测定
使用上述实施例2的试剂,对于血清检测物,与上述同样地进行CRP的测定。反复进行20次测定,探讨其再现性。结果如表2所示。
[表2]
如表2所示,由本发明的方法得到的、对实际的血清检测物的测定结果再现性极高。
Claims (8)
1.检测试剂,所述检测试剂用于测定被测定物并且至少含有A液和B液,所述A液是具有30 mS/cm以上和200 mS/cm以下电导率的缓冲液,所述B液是悬浮有粒子的粒子悬浮液且具有6.5 mS/cm以下的电导率,其中,所述粒子是将被测定物捕获物质担载于不溶性载体粒子上得到的。
2.权利要求1的检测试剂,其中,所述被测定物捕获物质是抗体或其抗原结合片段、或者抗原。
3.权利要求1或2的检测试剂,其中,所述不溶性载体粒子是胶乳粒子。
4.权利要求3的检测试剂,其中,所述胶乳粒子是聚苯乙烯胶乳粒子。
5.检测样品中的被测定物的测定方法,所述方法使用权利要求1-4中任一项的检测试剂,所述方法包含将所述A液、所述B液和所述检测样品混合的步骤以及测定所得混合液中所述粒子的凝集程度的步骤,并且在测定操作开始之前即刻将至少所述A液与所述B液混合,其中,所述A液与所述B液以不发生非特异性凝集的量混合,所述测定操作是测定混合液中粒子的凝集程度的操作,所述之前即刻是测定操作开始前10分钟以内。
6.权利要求5的测定方法,其中,所述检测样品是尿液、脑脊髄液或粪便。
7.权利要求5的测定方法,其中,所述检测样品是血液、血清或血浆。
8.检测试剂试剂盒,所述检测试剂试剂盒至少含有权利要求1-4中任一项的检测试剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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