CN112098654B - 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒及其制备方法，所述试剂盒中磁珠稀释液为：HEPES 0.04～0.06mol/L、蛋白9～11g/L、保护剂1～4g/L、蔗糖29～31g/L、S171.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L，pH7.0‑7.5；酶标稀释液为：MES 0.04～0.06mol/L、酪蛋白19～21g/L、蔗糖39～41g/L、分散剂1～5g/L、阻断剂0.05～0.15g/L、ZnCl20.13～0.14g/L、MgCl21～1.5g/L、Tween20 1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L、NaCl 8～9g/L，pH6.0‑6.5；稳定性高。

Description

一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
胃蛋白酶原是胃蛋白酶的无活性前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6和7被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。在胃部合成的PG大部分进入胃腔，在酸性胃液作用下活化成胃蛋白酶，只有少量PG(约1％)透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，因此血清PGI和PGII反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也会随之发生改变。胃液和血清PG水平与活组织病理变化结果在临床结果上体现一致，因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。胃底腺黏膜萎缩的过程中，分泌PGI的主细胞减少，幽门腺细胞增多，PGII的分泌量也会增多，从而造成PGI和PGII的比值降低。因此PGI和PGII的比值可以作为胃底腺黏膜萎缩的指征，检测血清胃蛋白酶原I与胃蛋白酶原II的含量以及PGI与PGII比值变化(PGR)对胃部疾病的诊断具有多方面的临床意义，在临床诊断中，PG项目的筛查需要PGI和PGII一起检测才具有临床学意义，在2019年的胃癌诊疗规范里面的有如下描述：血清胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)检测：我国胃癌筛查采用PGI浓度≤70ng/mL且PG I/PGII≤7.0作为胃癌高位人群标准，国外厂商的对比试剂采用日本学者的诊断结论：PGI浓度<70ng/mL且PG I/PGII<3.0作为诊断标准。因此在PG项目的发光试剂里，PGII单独检测的意义并不明显，它需要与PGI一起对患者进行诊断，此时，PGI和PGII的性能显得尤为重要。
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。其原理是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)，利用发光信号测量仪器测量光量子信号。在免疫检测分析中，使用化学发光技术，可以使检测范围达到6个数量级，而且灵敏度很高，加上标记物稳定，有效期长，使其受到越来越多的关注与应用。
现有技术中，PG项目的检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫层析法、免疫比浊法、化学发光免疫分析法(CLIA)等。酶联免疫吸附测定方法操作过程复杂，测定时间较长，影响因素多，且不适合急诊样本的检测；免疫层析法，测试时间短是其优势，但受制于材料因素等原因，精密度差是其最大缺点；免疫比浊法测定，抗原或抗体量过大时，可出现可溶性复合物，造成误差，易受脂血影响。化学发光免疫分析法虽具有反应时间短和灵敏底低等多项优点，但抗干扰等性能较低，且由于是液体试剂，稳定性方面及精密度受稀释液影响较大。
因此，如何制备一种稳定性高的检测试剂盒，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，可以提高PGI和PGII试剂的稳定性。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明的目的之一在于提供一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂M和试剂R；
所述试剂M为采用磁珠稀释液稀释包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒获得的工作液；其中，所述磁珠稀释液的配方为：
HEPES缓冲液0.04～0.06mol/L、蛋白9～11g/L、保护剂1～4g/L、蔗糖29～31g/L、S17(Rhodasur ON-870)1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L，pH 7.0-7.5；
所述试剂R为采用酶标稀释液稀释碱性磷酸酶标记的抗胃蛋白酶原I/II抗体获得的工作液；其中，所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0.04～0.06mol/L、酪蛋白19～21g/L、蔗糖39～41g/L、分散剂1～5g/L、阻断剂0.05～0.15g/L、ZnCl2 0.13～0.14g/L、MgCl2 1～1.5g/L、Tween 20 1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L、NaCl 8～9g/L，pH 6.0-6.5。
进一步地，所述蛋白包括BSA、酪蛋白、γ蛋白中的至少一种。
进一步地，所述保护剂包括明胶、果胶、海藻酸中的至少一种。
进一步地，所述分散剂为PVPK100、PEG 20000、PVA17-92中的至少一种。
进一步地，所述防腐剂包括ProClin 300、四环素、庆大霉素、叠氮钠中的一种。
进一步地，所述磁珠稀释液的配方为：
HEPES缓冲液0.05mol/L、BSA 10g/L、明胶1g/L、蔗糖30g/L、S17(Rhodasur ON-870)2g/L、ProClin 300 1g/L，pH 7.0-7.5。
进一步地，所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0.05mol/L、酪蛋白20g/L、蔗糖40g/L、PVPK1001g/L、阻断剂0.1g/L、ZnCl2 0.136g/L、MgCl2 1.015g/L、Tween 20 2g/L、ProClin 300 1g/L、NaCl 8.5g/L，pH6.0-6.5。
进一步地，所述包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒的制备方法为：
将磁珠微粒清洗重悬，获得磁微粒溶液；
使用EDC将所述磁微粒溶液活化，获得活化磁微粒溶液；
将所述活化磁微粒溶液包被胃蛋白酶原I/II抗体，获得包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒。
进一步地，所述获得磁微粒溶液包括：取磁珠微粒，用缓冲液清洗多次后，再用缓冲液重悬，获得浓度为1-4mg/ml的磁微粒溶液，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种。
进一步地，所述EDC与所述磁微粒的质量比为1:(90-110)；所述胃蛋白酶原I/II抗体与磁微粒质量比为1:(480-520)。
进一步地，所述碱性磷酸酶标记的抗胃蛋白酶原I/II抗体为采用碱性磷酸酶、胃蛋白酶原I/II抗体和戊二醛进行反应获得，具体包括：
将胃蛋白酶原I/II抗体溶解于PBS溶液中，获得浓度为0.5-2mg/ml的胃蛋白酶原I/II抗体溶液；
将所述胃蛋白酶原I/II抗体溶液中加入碱性磷酸酶，混匀后加入戊二醛，反应完全后透析除去未反应的戊二醛，获得抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物。
进一步地，所述碱性磷酸酶与所述抗胃蛋白酶原I/II抗体的质量比为(8-12):1；所述戊二醛的终浓度为0.1-0.4％。
本发明还提供了一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒的制备方法，采用所述的配方制得。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒及其制备方法，通过对磁珠稀释液的配方和酶标稀释液的配方进行研发：磁珠稀释液中，pH为7.0-7.5时，需要有一定量的蛋白保护但其稳定性还需要保护剂辅助，加入辅助类保护剂后，不管是其CV还是稳定性，都有了明显的提高。酶标稀释液中，经过研究发现偏酸的体系更利于酶标抗体的保存，且加入酪蛋白作为保护剂比BSA效果更好，但酪蛋白的性质决定其在酸性条件下不太稳定，加入对酪蛋白起保护作用的物质后，其热破和长期稳定性都符合要求，高分子保护酪蛋白的原理在于高分子在水中溶解时会形成网状结构，其独特的结构使得酪蛋白吸附，从而产生一定的静电排斥和位阻效应，相对应的阻止酪蛋白的团聚，从而对整个体系的稳定起到正面作用。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明的一种典型的实施方式，提供一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，所述试剂盒包括：试剂M和试剂R；
所述试剂M为采用磁珠稀释液稀释包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒获得的工作液；其中，所述磁珠稀释液的配方为：
HEPES缓冲液0.04～0.06mol/L、蛋白9～11g/L、保护剂1～4g/L、蔗糖29～31g/L、S17(Rhodasur ON-870)1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L，pH 7.0-7.5；
所述试剂R为采用酶标稀释液稀释碱性磷酸酶标记的抗胃蛋白酶原I/II抗体获得的工作液；其中，所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0.04～0.06mol/L、酪蛋白19～21g/L、蔗糖39～41g/L、分散剂1～5g/L、阻断剂0.05～0.15g/L、ZnCl2 0.13～0.14g/L、MgCl2 1～1.5g/L、Tween 20 1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L、NaCl 8～9g/L，pH 6.0-6.5。
本发明提供的一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，通过对磁珠稀释液的配方和酶标稀释液的配方进行研发：磁珠稀释液中，pH为7.0-7.5时，需要有一定量的蛋白保护但其稳定性还需要保护剂辅助，加入辅助类保护剂后，不管是其CV还是稳定性，都有了明显的提高。酶标稀释液中，经过研究发现偏酸的体系更利于酶标抗体的保存，且加入酪蛋白作为保护剂比BSA效果更好，但酪蛋白的性质决定其在酸性条件下不太稳定，加入对酪蛋白起保护作用的物质后，其热破和长期稳定性都符合要求，高分子保护酪蛋白的原理在于高分子在水中溶解时会形成网状结构，其独特的结构使得酪蛋白吸附，从而产生一定的静电排斥和位阻效应，相对应的阻止酪蛋白的团聚，从而对整个体系的稳定起到正面作用。
该实施方式中，
所述蛋白包括BSA、酪蛋白、γ蛋白中的至少一种。
所述保护剂包括明胶、果胶、海藻酸中的至少一种。
所述分散剂为PVPK100、PEG 20000、PVA17-92中的至少一种。
所述防腐剂包括ProClin 300、四环素、庆大霉素、叠氮钠中的一种。
作为优选的实施方式，所述磁珠稀释液的配方为：
HEPES缓冲液0.05mol/L、BSA 10g/L、明胶1g/L、蔗糖30g/L、S17(Rhodasur ON-870)2g/L、ProClin 300 1g/L。
作为优选的实施方式，所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0.05mol/L、酪蛋白20g/L、蔗糖40g/L、PVPK1001g/L、阻断剂0.1g/L、ZnCl2 0.136g/L、MgCl2 1.015g/L、Tween 20 2g/L、ProClin 300 1g/L、NaCl 8.5g/L。
作为优选的实施方式，所述包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒的制备方法为：
将磁珠微粒清洗重悬，获得磁微粒溶液；
使用EDC将所述磁微粒溶液活化，获得活化磁微粒溶液；
将所述活化磁微粒溶液包被胃蛋白酶原I/II抗体，获得包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒。
其中，所述获得磁微粒溶液包括：取磁珠微粒，用缓冲液清洗多次后，再用缓冲液重悬，获得浓度为1-4mg/ml获得磁微粒溶液，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种。
所述EDC与所述磁微粒的质量比为1:(90-110)，优选为1:100；当质量比增大，EDC使用量过多时，磁微粒活化率升高，活化的磁微粒浓度升高容易引起磁微粒发生聚沉；当质量比减小，磁微粒过多时，磁微粒活化率降低，导致抗体包被率降低。
所述胃蛋白酶原I/II抗体与磁微粒质量比为1:(480-520)，优选为1:500。当质量比增大，抗体量过多时，未包被在磁微粒上的抗体形成游离的抗体，容易降低M试剂长期稳定性；当质量比减小，磁微粒过多时，磁微粒之间容易发生非特异性吸附，继而增加测试系统背景值。
所述将所述活化磁微粒溶液包被胃蛋白酶原I/II抗体，具体包括：向活化磁微粒溶液中加入胃蛋白酶原I/II抗体，混匀后，加入封闭液进行封闭，混匀后磁分离移除上清液，获得包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒，再加入磁珠稀释液混匀获得包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒试剂M。
所述抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物试剂R2为采用酶标稀释液稀释抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物；所述抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物为采用碱性磷酸酶、胃蛋白酶原I/II抗体和戊二醛进行反应获得，具体包括：
将胃蛋白酶原I/II抗体溶解于PBS溶液中，获得浓度为0.5-2mg/ml的胃蛋白酶原I/II抗体溶液；
将所述胃蛋白酶原I/II抗体溶液中加入碱性磷酸酶，混匀后加入戊二醛，反应完全后透析除去未反应的戊二醛，获得抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物；
所述碱性磷酸酶与所述抗胃蛋白酶原I/II抗体的质量比为(8-12):1，当质量比增大，碱性磷酸酶用量过多时，造成系统背景值升高，且高值样本光子值超出仪器测值上限，影响高值样本测试精密度；当质量比减小，抗体过多时，未标记的游离抗体与碱性磷酸酶-抗胃蛋白酶原I/II抗体复合物竞争抗原位点，降低了低端样本灵敏度。
所述戊二醛的终浓度为0.1-0.4％。戊二醛浓度过高可使非特异性反应增加，而浓度过低又影响灵敏度。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒进行详细说明。
本实施例的提供一种胃蛋白酶原I/II定量测定试剂盒，其包括校准品、质控品、抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物试剂R和包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒试剂M。
1、胃蛋白酶原I/II校准品、胃蛋白酶原I/II质控品的配制方法如下：
用校准品缓冲液溶解胃蛋白酶原I/II抗原，配置胃蛋白酶原I/II校准品和质控品，校准品包含已知浓度的胃蛋白酶原I/II，胃蛋白酶原I浓度在0-200ng/mL范围内，胃蛋白酶原II浓度在0-100ng/mL范围内。在具体实施方案中，校准品中胃蛋白酶原I浓度分别为0、2.0、20.0、70.0、150.0、200.0ng/mL，胃蛋白酶原II浓度分别为0、2.0、15.0、40.0、80.0、100.0ng/mL，质控品中胃蛋白酶原I浓度分别为2ng/mL、70ng/mL，胃蛋白酶原II浓度分别为2ng/mL、15ng/mL；其中，校准品缓冲液是通过在4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)缓冲液中加入0.5％-3％的山梨醇、0.5％-3％的海藻糖、0.5％-1％的牛血清白蛋白、150-300mmol/L氯化钠和0.03-0.1％ProClin 300，pH为6.0-8.0，搅拌溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；
2、抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物试剂R
用酶标抗体的缓冲液溶解胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物。其中，胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物是取10mg碱性磷酸酶溶于含有1mg抗胃蛋白酶原I/II抗体的1ml PBS(0.01mol/LpH7.0)中，待完全溶解后，添加4ml 1％戊二醛溶液，使戊二醛的最终浓度为0.2％，透析除去多余的戊二醛后，4℃保存。
其中，所述酶标稀释液的配方为：
MES 0.05mol/L、酪蛋白20g/L、蔗糖40g/L、PVPK1001g/L、阻断剂0.1g/L、Zncl20.136g/L、Mgcl2 1.015g/L、Tween 20 2g/L、ProClin 300 1g/L、Nacl 8.5g/L。
制备步骤如下：
准备好洁净容器，在800ml超纯水中加入依次加入以下物质：
缓冲盐选择MES加入，搅拌使其充分混匀；
加入Nacl，搅拌，使其充分混匀；
加入蔗糖，搅拌，使其充分混匀；
加入表活Tween 20，搅拌，使其充分混匀；
加入酶活剂Zncl2，搅拌，使其充分混匀；
加入酶活剂Mgcl2，搅拌，使其充分混匀；
加入PVPK100，搅拌，使其充分混匀；
加入ProClin 300，搅拌，使其充分混匀，使用1M NaOH或1M HCl将溶液PH调整至6.0-6.5左右；
在上述溶液中加入酪蛋白，搅拌，使其充分混匀；
加入阻断剂，搅拌，使其充分混匀；
待上述所加物质全部溶解混匀后，使用1M NaOH或1M HCl将溶液PH调整至6.0-6.5，然后使用超纯水将溶液定容至1L体积，最后得到PGI和PGII的酶标稀释液。
3、包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒试剂M
(1)包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒的制备：
①清洗：取适量磁珠微粒，用0.1mol/L MES缓冲液清洗3次，再用0.1mol/L MES缓冲液重悬磁珠微粒，使其浓度为2mg/ml；
②活化：取现配EDC溶液，按EDC与磁微粒质量比1:100的比例向重悬好的磁微粒中加入EDC溶液，涡旋混匀后，室温水平混匀20min；
③包被：按胃蛋白酶原I/II抗体与磁微粒质量比为1:500的包被比例，向活化好的磁微粒中加入需包被的胃蛋白酶原I/II抗体，涡旋混匀后，室温水平混匀12h；
④封闭：向上述磁微粒中加入5％BSA溶液，室温水平混匀2h；
⑤保存：磁分离移除上清液，加入磁珠保存液中混匀。
(2)磁珠稀释液的配方为：
HEPES 0.05mol/L、BSA 10g/L、明胶1g/L、蔗糖30g/L、S17(Rhodasur ON-870)2g/L、ProClin 300 1g/L。
制备步骤如下：
准备好洁净容器，在800ml超纯水中加入依次加入以下物质：
缓冲体系选择HEPES加入，搅拌使其充分混匀；
加入明胶，加热搅拌，使其充分混匀；
加入蔗糖，搅拌，使其充分混匀；
加入表面活性剂S17，搅拌，使其充分混匀；
加入ProClin 300，搅拌，使其充分混匀，使用1M NaOH或1M HCl将溶液PH调整至7.0-7.5左右；
在上述溶液中加入蛋白物质BSA，搅拌，使其充分混匀；
待上述所加物质全部溶解混匀后，使用1M NaOH或1M HCl将溶液PH调整至7.0-7.5，然后使用超纯水将溶液定容至1L体积，最后得到PGI和PGII的磁珠稀释液。
(3)采用所述磁珠稀释液稀释包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒获得试剂M。
所述化学发光免疫试剂盒的检测方法如下：
①将碱性磷酸酶标记的抗体稀释后混合得到酶结合物工作液(即R试剂)，碱性磷酸酶标记的抗体与稀释液的体积比为1:500～1:5000；以磁珠缓冲液将本发明得到的免疫磁微粒稀释成磁微粒偶联抗体工作液(即M试剂)，免疫磁微粒与稀释液的体积比为1:50～1:100；
②将所述酶结合物工作液(即R试剂)、磁微粒偶联抗体溶液(即M试剂)和发光底物在室温下平衡至少30min，将平衡好的试剂加载至全自动化学发光仪；
③在反应容器中加入20μL校准品或经过分离的待测血清(或血浆)、50μL磁微粒偶联抗体溶液，50μl酶结合物工作液，混匀后37℃反应15min形成磁微粒偶联抗体-抗原-酶标记物抗体复合物，进行磁性分离，弃去上层未反应的液体，得到下层的复合物，洗涤复合物后混匀，置于磁性分离器中分离，弃去洗涤液，重复洗涤3次，以去除未结合的反应物；
④向步骤③中的复合物中加入200μL发光底物液，混匀孵育5min，放入化学发光检测仓，检测发光强度值；根据发光强度值与待测抗原的浓度的比例关系计算得到待测血清或血浆中的待测抗原的浓度值。
实施例2
在实施例1的基础上，将磁珠稀释液中的明胶换成海藻酸，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例3
在实施例1的基础上，将磁珠稀释液中的明胶换成果胶，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例4
在实施例1的基础上，将磁珠稀释液中的BSA换成酪蛋白，其它组分和工艺与实施例1相同
实施例5
在实施例1的基础上，将磁珠稀释液中的明胶浓度增加至4g/L，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例6
本实施例的磁珠稀释液的配方为：HEPES缓冲液0.04mol/L、BSA9g/L、明胶2g/L、蔗糖29g/L、S17(Rhodasur ON-870)1.5g/L、ProClin 300 0.5g/L，pH 7.0-7.5。
其余均同实施例1。
实施例7
本实施例的磁珠稀释液的配方为：HEPES缓冲液0.06mol/L、BSA 11g/L、明胶4g/L、蔗糖31g/L、S17(Rhodasur ON-870)2.5g/L、ProClin 300 1.5g/L，pH 7.0-7.5。其余均同实施例1。
实施例8
在实施例1的基础上，将酶标稀释液中的PVP K100换成PEG 20000，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例9
在实施例1的基础上，将酶标稀释液中的PVP K100换成PEG 20000，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例10
在实施例1的基础上，将酶标稀释液中的PVP K100换成PVA17-92，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例11
在实施例1的基础上，将酶标稀释液中的PVPK100的浓度增加至5g/L，其它组分和工艺与实施例1相同。
实施例12
所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0.04mol/L、酪蛋白19g/L、蔗糖39g/L、PVP K1002g/L、阻断剂0.05g/L、ZnCl2 0.13g/L、MgCl2 1g/L、Tween 20 1.5g/L、ProClin 300 0.5g/L、NaCl 8g/L，pH 6.0-6.5。
其余均同实施例1。
实施例13
所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0.06mol/L、酪蛋白21g/L、蔗糖41g/L、PVP K1005g/L、阻断剂0.15g/L、ZnCl2 0.14g/L、MgCl2 1.5g/L、Tween 20 2.5g/L、ProClin 300 1.5g/L、NaCl 9g/L，pH6.0-6.5。
其余均同实施例1。
对比例1
在酶标液配方不变的情况下，将磁珠稀释液换成如下配方：Tris 4.58g/L、BSA10g/L、Nacl 6.81g/L、Tween 20 0.96g/L、ProClin 300 0.2ml/L、pH＝8.0±0.05。
对比例2
在酶标液配方不变的情况下，将磁珠稀释液换成如下配方：Na2HPO4·12H2O2.68g/L、NaH2PO4·2H2O 0.39g/L、NaCl 8.5g/L、酪蛋白10g/L、ProClin 300 1ml/L、pH＝7.3±0.1。
对比例3
在实施例1的基础上，去掉磁稀液中的明胶、蔗糖，其他组分和工艺与实施例1相同。
对比例4
在实施例1的基础上，将酶标稀释液中的酪蛋白换成BSA，其他组分和工艺与实施例1相同。
对比例5
在实施例1的基础上，将酶标稀释液中的酪蛋白质去掉，其他组分和工艺与实施例1相同。
对比例6
在实施例1的基础上，将将酶标稀释液中的PVPK100去掉，其他组分和工艺与实施例1相同。
对比例7
在实施例1的基础上，将酶稀液的pH调整至6.6-7.5，其他组分和工艺与实施例1相同。
对比例8
在实施例1的基础上，将酶稀液的pH调整至5.0-5.9，其他组分和工艺与实施例1相同。
对比例9
在磁稀液配方不变的情况下，将酶标稀稀液换成如下配方：Tris 6.06g/L、BSA3.0g/L、Nacl 13.0g/L、Zncl2 0.05g/L、Mgcl2 0.05g/L、ProClin 300 0.2ml/L、pH＝7.4±0.05。
试验例1
对各实施例和各对比例进行性能评价，具体评价方法如下：
(1)精密度：重复测定同一样本10次，计算CV(％)，CV≤3％算满足要求；结果如表1-表2所示。
(2)准确度：测企业校准品，计算测定平均值与标示值的偏差，≤5％算满足要求，低值算相对偏差在±0.5ng/ml以内；结果如表1-表2所示。
(3)稳定性：将试剂在37度放置7天，再评价以上指标：精密度、准确度；结果如表1-表2所示。
表1：PGI和PGII磁稀液热破后的精密度与准确度
由以上数据可以看出，对比例1、2和3的CV和准确度都不符合要求，而实施例1到7无论是CV还是准确度都满足要求。
表2：PGI和PGII酶稀液热破后的稳定性与准确度
/>
由以上数据可以看出，对比例中的pH不在6.0-6.5范围内的稳定性和准确度都较差，不符合要求，且将酪蛋白换成BSA，PG试剂的稳定性变差，这说明在PG酪稀中，酪蛋白的效果明显优于BSA，将PVP K100去掉后，其稳定性明显变差。只有实施例的稳定性符合要求。
(4)长期稳定性：将试剂放置在4度冰箱，按照第0周、第1周、第1、2、5、8、12月进行长期稳定性检测，只对准确度进行测试。
表3：PGI试剂长期试剂的稳定性-测试结果
表4：PGI试剂长期试剂的稳定性-测试偏差
表5：PGII试剂长期试剂的稳定性-测试结果
/>
表6：PGII试剂长期试剂的稳定性-测试偏差
/>
由以上数据可以看出，选择稳定性较好的磁稀和酶稀进行长期实验，其稳定性达标；选择稳定性稍差一些的对比例，其长期稳定性会随着时间的加长而变差。
综上可知，磁珠稀释液的配方中HEPES缓冲液0.04～0.06mol/L、蛋白9～11g/L、保护剂1～4g/L、蔗糖29～31g/L、S17(Rhodasur ON-870)1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L，pH 7.0-7.5各组分协同作用，缺一不可，且含量在本发明的范围内才能提高稳定性；
酶标稀释液的配方中MES缓冲液0.04～0.06mol/L、酪蛋白19～21g/L、蔗糖39～41g/L、分散剂1～5g/L、阻断剂0.05～0.15g/L、ZnCl2 0.13～0.14g/L、MgCl2 1～1.5g/L、Tween 20 1.5～2.5g/L、防腐剂0.5～1.5g/L、NaCl 8～9g/L，pH 6.0-6.5各组分协同作用，缺一不可，且含量在本发明的范围内才能提高稳定性。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂M和试剂R；
所述试剂M为采用磁珠稀释液稀释包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒获得的工作液；其中，所述磁珠稀释液的配方为：
HEPES缓冲液0.04～0.06mol/L、BSA9～11g/L、明胶1～4g/L、蔗糖29～31g/L、S171.5～2.5g/L、ProClin3000.5～1.5g/L，pH 7.0～7.5；
所述试剂R为采用酶标稀释液稀释碱性磷酸酶标记的抗胃蛋白酶原I/II抗体获得的工作液；其中，所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0 .04～0.06mol/L、酪蛋白19～21g/L、蔗糖39～41g/L、PVPK1001～5g/L、阻断剂0.05～0.15g/L、ZnCl20.13～0.14g/L、MgCl21～1.5g/L、Tween201.5～2.5g/L、ProClin3000.5～1.5g/L、NaCl8～9g/L，pH 6.0～6.5；
所述包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒，胃蛋白酶原I/II抗体与磁微粒质量比为1:(480-520)；
所述碱性磷酸酶标记的抗胃蛋白酶原I/II抗体，碱性磷酸酶与抗胃蛋白酶原I/II抗体的质量比为(8-12):1。
2.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，其特征在于，所述磁珠稀释液的配方为：
HEPES缓冲液0 .05mol/L、BSA 10g/L、明胶1g/L、蔗糖30g/L、S17(RhodasurON-870)2g/L、ProClin300 1g/L，pH 7.0-7.5。
3.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，其特征在于，所述酶标稀释液的配方为：
MES缓冲液0 .05mol/L、酪蛋白20g/L、蔗糖40g/L、PVP K100 1g/L、阻断剂0.1g/L、ZnCl20.136g/L、MgCl21.015g/L、Tween20 2g/L、ProClin300 1g/L、NaCl 8.5g/L，pH 6.0-6.5。
4.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，其特征在于，所述包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒的制备方法为：
将磁珠微粒清洗重悬，获得磁微粒溶液；
使用EDC将所述磁微粒溶液活化，获得活化磁微粒溶液；
将所述活化磁微粒溶液包被胃蛋白酶原I/II抗体，获得包被抗胃蛋白酶原I/II抗体的磁微粒。
5.根据权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的抗胃蛋白酶原I/II抗体为采用碱性磷酸酶、胃蛋白酶原I/II抗体和戊二醛进行反应获得，具体包括：
将胃蛋白酶原I/II抗体溶解于PBS溶液中，获得浓度为0.5-2mg/ml的胃蛋白酶原I/II抗体溶液；
将所述胃蛋白酶原I/II抗体溶液中加入碱性磷酸酶，混匀后加入戊二醛，反应完全后透析除去未反应的戊二醛，获得抗胃蛋白酶原I/II抗体-碱性磷酸酶标记物。
6.一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒的制备方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述的配方制得。
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