CN116256517A - 一种抗ngal单克隆抗体复合荧光微球复合物及其制备方法和ngal检测试剂盒 - Google Patents

一种抗ngal单克隆抗体复合荧光微球复合物及其制备方法和ngal检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及体外试剂检测技术领域，更具体地说，它涉及一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物及其制备方法和NGAL检测试剂盒。一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物由抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球上获得，所述复合荧光微球的粒径为200nm；所述复合荧光微球由碳量子点和稀土铕荧光微球制备而成，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的重量比为(0.4‑0.8):1；碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比为(0.04‑0.08):1。本申请的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物可用于制备NGAL检测试剂盒，其具有灵敏度高和稳定性好的优点。

Description

一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物及其制备方法和 NGAL检测试剂盒
技术领域
本申请涉及体外试剂检测技术领域，更具体地说，它涉及一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物及其制备方法和NGAL检测试剂盒。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，又称人脂质运载蛋白2(Ln2)或噬铁蛋白，是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员。因为NGAL可能参与不同的生理、病理过程，所以NGAL是急性肾损伤的标志物。早期诊断急性肾功能损伤(AKI)时，血、尿中的NGAL浓度通常会迅速升高，2h最为明显(比临界值升高几十至几百倍)，而血清肌酐(sCr)、尿酶等传统指标往往要在24～72h才后明显升高，因而NGAL可用于AKI的早期诊断。
目前，NGAL的检测方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting、胶乳增强免疫透射比浊法以及化学发光法。其中，因为胶乳增强免疫透射比浊法，对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题，与其他检测方法比较，该方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围，较大的实用价值。如公告号为CN102590524B的中国发明，公开中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其检测NGAL抗原的最低检测限为10.39ng/ml，线性范围为0～7000ng/ml，R＝0.9982。
但是，NGAL浓度在正常人尿液中低于10ng/ml，如此低的浓度下，对NGAL检测试剂盒的灵敏度提出了较高的要求。所以，上述公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒明显已经不满足灵敏度的检测要求。因此现在急需一种灵敏度更高的NGAL检测试剂盒。
发明内容
为了提高NGAL检测的灵敏度，本申请提供一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物及其制备方法和NGAL检测试剂盒。
第一方面，本申请提供一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，采用如下的技术方案：
一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，由抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球上获得，所述复合荧光微球的粒径为200nm；
所述复合荧光微球由碳量子点和稀土铕荧光微球制备而成，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的重量比为(0.4～0.8):1；
碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比为(0.04～0.08):1。
稀土铕是一种镧系稀土，其具有荧光寿命长、发射谱线窄、stokes位移大、背景干扰少、生物毒性小等特点。碳量子点是一种新型的荧光纳米材料，其具有水溶性好、低毒性、生物相同性好和光稳定性好等优点。
通过采用上述技术方案，本申请通过使用碳量子点与稀土铕荧光微球复配，通过促使碳量子点与稀土铕配位，并接种在稀土铕荧光微球，得到的复合荧光微球，荧光强度更强。因在特定的粒径下，碳量子点与稀土铕荧光微球的分级复配效果较优，所得复合荧光微球的结构较稳定均一，可促进碳量子点与稀土铕荧光微球中的稀土铕的能量转移效应的发生；再结合碳量子点与稀土铕荧光微球特定的重量比例，可在稀土铕荧光微球掺量较少的情况下，制得具有荧光强度较强的复合荧光微球。所以，碳量子点与稀土铕荧光微球在特定重量和粒径下，所得的复合荧光微球中，可使得碳量子点与稀土铕荧光微球中的稀土铕具有较强的能量转移效应，促使碳量子点将能量转移给稀土铕，提高稀土铕的荧光强度。
因此，抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球表面形成的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，具有较强的荧光强度，应用于NGAL检测试剂盒中时，当样品中的NGAL与抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物结合，并形成NGAL-抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，并层析至被另一抗NGAL单克隆抗体捕获时，因抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的荧光强度较强，可被荧光分析仪器检测出较强的荧光强度，从而提高了NGAL检测试剂盒检测NGAL的灵敏度。
同时，所得的复合荧光微球经检测的粒径为200nm，该复合荧光微球具有良好的比表面积和较多的有效基团，其对抗NGAL单克隆抗体的负载量较多，可进一步提高最终所得NGAL检测试剂盒检测NGAL的灵敏度。
特别是，稀土铕本身具有一定的生物毒性，在本申请复合荧光微球的制备过程中，碳量子点的加入，减少了稀土铕的使用量，提高了所得复合荧光微球以及的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物、NGAL试剂盒的安全性能。
优选的，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的重量比为(0.4～0.6):1。
优选的，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比为(0.05～0.08):1。
通过采用上述技术方案，通过进一步的优化碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径和重量，不仅提高所得复合荧光微球的荧光荧光强度，还能延长复合荧光微球荧光寿命。将复合荧光微球负载抗NGAL单克隆抗体后，应用于NGAL检测试剂盒中，可将其灵敏度提高至0.2ng/mL。
优选的，所述复合荧光微球的制备方法为：
A1：将碳量子点溶于水中，得到碳量子点水溶液；将稀土铕荧光微球溶于水中，得到稀土铕荧光微球水溶液；将碳量子点水溶液加入到稀土铕荧光微球水溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；
A2：将混合溶液在180～200℃，反应3～4h，自然冷却至25～30℃，使用截留分子量1000的透析膜进行20～22h的透析纯化后，通过冻干法即得复合荧光微球。
通过采用上述技术方案，在上述制备条件下的碳量子点与稀土铕荧光微球相容性较好，促使碳量子点表面活化，从而可促进稀土铕配位在碳量子点表面，形成碳点-铕的复合荧光微球。同时，因为碳量子点具有较好的光稳定性和抗外界环境影响的能力，将碳量子点配位在稀土铕表面后，不仅可提高所得复合荧光微球的光稳定性和抗外界环境影响的能力，提高所得抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的稳定性；还可加速碳量子点与稀土铕发生能量转移效应，提高所得复合荧光微球的荧光强度，也即提高抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的荧光强度。进一步的，在上述方法下制得的复合荧光微球，比表面积大，有效基团多，从而耦连抗NGAL单克隆抗体的负载量较大。所以，最终所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，用于制备NGAL检测试剂盒，具有较高的灵敏度和稳定性。
优选的，所述稀土铕荧光微球为羧基修饰的稀土铕荧光微球。
通过采用上述技术方案，羧基修饰的稀土铕荧光微球表面含有大量的羧基，有助于稀土铕与碳量子点的配位，提高形成碳点-铕的复合荧光微球的荧光强度和稳定性。
第二方面，本申请提供一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备方法，采用如下的技术方案：
一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1:将复合荧光微球加入pH值为5.8～7.2的活化缓冲液中，搅拌混合后，离心3～5次，去除上清液，得到清洗后的复合荧光微球；
S2：
S21：将清洗后的复合荧光微球加入到pH值为7.2～8.5的耦连缓冲液中，在50～65KHz超声30～40min后，得到超声后的复合荧光微球悬浊液；
S22：向复合荧光微球悬浊液中加入0.2～1.0mg/ml复合荧光微球悬浊液NHS和0.04～0.2mg/ml复合荧光微球悬浊液EDC，搅拌混合，离心3～5次，去除上清液，得到下层的复合荧光微球原液；
S23：将复合荧光微球原液加入到pH值为7.2～8.5的耦连缓冲液中，在50～65KHz超声30～40min后，加入抗NGAL单克隆抗体，搅拌混合后，离心3～5次，去除上清液，得到耦连后的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球；
S3：将耦连后的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球加入封闭缓冲液中，在50～65KHz超声30～40min后，得到封闭的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球；
所述抗NGAL单克隆抗体的加入量为1～5mg/mL复合荧光微球原液；
所述活化缓冲液为PB、Borax和MES中的任一种；
耦连缓冲液为PB、Borax和MES中的任一种
所述封闭型缓冲液为BSA、glycine、casein、flishskingelate、JeffamineD2000、PEG2000中的一种或多种。
进一步的，本申请中，仅以活化缓冲液和耦连缓冲液为PB，封闭型缓冲液为BSA举例，但并不影响其他类型的活化缓冲液、耦连缓冲液和封闭型缓冲液在本申请中的应用。
通过采用上述技术方案，通过同时使用EDC和NHS作为耦连剂，可将抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球上，提高所得抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物结构的稳定性。在抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球的过程中，EDC与抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物上的羧基形成一个O-异酰基脲结构，这一活化中间产物与抗NGAL单克隆抗体上的-NH2形成酰胺交联，再利用NHS形成更稳定的酯而增强了EDC交联产物的稳定性。同时，EDC和NHS并没有实际成为抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的一部分，而是转变成水溶性的脲衍生物，可以消除并被洗掉，对所得抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物并无影响，所以当所得抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物用于制备NGAL检测试剂盒时，可提高所得NGAL检测试剂盒的灵敏度。
优选的，所述抗NGAL单克隆抗体的加入量为3mg/mL复合荧光微球原液。
通过采用上述技术方案，在上述抗NGAL单克隆抗体的加入量下，复合荧光微球的耦连抗NGAL单克隆抗体的载量最高，保持所得抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物具有一定的重量，可减少抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物在制备过程中离心的损耗，提高所得抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物结构的稳定性和灵敏度。
第三方面，本申请提供一种NGAL检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种NGAL检测试剂盒，包括包被有抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的NGAL检测试剂卡。
优选的，所述最低检出限为0.5ng/mL，线性范围0～500ng/mL，相关系数R2＞0.99。
通过采用上述技术方案，所得的NGAL检测试剂盒，检测NGAL的最低检出限低至0.5ng/mL，而且在NGAL浓度为0～500ng/mL内具有良好的线性范围，相关系数R2高达0.99以上，由此表明，本申请所得的NGAL检测试剂盒，具有较高的NGAL检测的灵敏度。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请采用特定重量和粒径的碳量子点与稀土铕荧光微球复配，通过促使碳量子点与稀土铕配位，所得的复合荧光微球，不仅比表面积较大，可提高负载抗NGAL单克隆抗体的含量，还可促使碳量子点与稀土铕荧光微球中的稀土铕发生能量转移效应，加速碳量子点将能量转移给稀土铕，提高所得的复合荧光微球的荧光强度，将该复合荧光微球应用于NGAL检测试剂盒后，可提高NGAL检测试剂盒的检测灵敏度；
2、本申请中通过进一步优化碳量子点与稀土铕荧光微球的粒径和重量，可进一步促进碳量子点与稀土铕荧光微球中的稀土铕发生能量转移效应，将得到的复合荧光微球负载抗NGAL单克隆抗体后，应用于NGAL检测试剂盒中，可将其灵敏度提高至0.2ng/mL；
3、本申请在制备复合荧光微球的过程中，碳量子点与稀土铕荧光微球相容性较好，促使碳量子点表面活化，从而可促进稀土铕配位在碳量子点表面，形成碳点-铕的复合荧光微球，将得到的复合荧光微球负载抗NGAL单克隆抗体后，应用于NGAL检测试剂盒中，可提高其的灵敏度和稳定性。
附图说明
图1是本申请实施例NGAL检测试剂盒的整体结构示意图；
图2是本申请应用实施例1中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图3是本申请应用实施例2中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图4是本申请应用实施例3中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图5是本申请应用实施例4中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图6是本申请应用实施例5中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图7是本申请应用实施例6中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图8是本申请应用实施例7中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图9是本申请应用实施例8中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图10是本申请应用实施例9中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图11是本申请应用实施例10中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图12是本申请应用实施例11中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图13是本申请应用对比例1中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图14是本申请应用对比例2中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图15是本申请应用对比例3中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图16是本申请应用对比例4中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线；
图17是本申请应用对比例5中荧光强度比值T/C与抗原浓度的标准曲线。
附图标记：1、PVC底板；2、结合垫；3、检测线；4、质控线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请的各实施例中所用的原料，除下述特殊说明之外，其他均为市售：
抗NGAL单克隆抗体，型号为FAP-KC001,纯度大于或等于95％，采购自探生；
稀土铕荧光微球，为稀土铕荧光羧基微球，型号为BM100-010-EU，采购自上海宇涛国际贸易有限公司；
稀土铕荧光微球，为羧基与磺酸基修饰的稀土铕荧光微球，粒径为100～200nm，采购自上海宇涛国际贸易有限公司；
碳量子点，型号为QDC620，粒径为3～9nm，采购自昆道生物；
羊抗鼠IgG，型号为FAB-S003，采购自探生；
冻干机，型号为LGI-10N，采购自亚星科技。
原料的制备例
制备例1
一种复合荧光微球，其制备步骤如下：
A1：将1g稀土铕荧光微球和0.4g碳量子点依次加入14g去离子水中，在25℃、3000r/min的条件下，搅拌混合10min，得到混合溶液；
A2：将混合溶液转移至反应釜中，在170℃下，反应2.5h后，自然冷却至25℃，然后再使用截留分子量1000的透析膜进行19h的透析纯化，纯化后的混合溶液通过冻干机冻干24h后，即得复合荧光微球。
其中，碳量子点的粒径为4nm；
稀土铕荧光微球为羧基与磺酸基修饰的稀土铕荧光微球，粒径为100nm；
经检测，所得复合荧光微球的粒径为200nm。
制备例2
一种复合荧光微球，其制备步骤如下：
A1：将0.4g碳量子点溶于4g去离子水中，得到碳量子点的水溶液；将1g稀土铕荧光微球溶于10g去离子水中，得到稀土铕荧光微球的水溶液；将碳量子点的水溶液加入稀土铕荧光微球的水溶液中，在25℃、3000r/min的条件下，搅拌混合10min，得到混合溶液；
A2：将混合溶液转移至反应釜中，在180～200℃(本实施例为180℃)，反应3～4h(本实施例为3.5h)后，自然冷却至25℃，然后再使用截留分子量1000的透析膜进行20～22h(本实施例为21h)的透析纯化，纯化后的混合溶液通过冻干机冻干24h后，即得复合荧光微球。
其中，碳量子点的粒径为4nm；
稀土铕荧光微球为羧基与磺酸基修饰的稀土铕荧光微球，粒径为100nm；
经检测，所得复合荧光微球的粒径为200nm。
制备例3～5
一种复合荧光微球，与制备例2的不同之处在于，除其制备步骤A1中，碳量子点的重量不同外，其他均与制备例1相同。碳量子点的重量如下表所示。
Figure BDA0003386781470000071
制备例6～8
一种复合荧光微球，与制备例3的不同之处在于，除碳量子点的粒径不同外，其他均与制备例3相同。碳量子点的粒径如下表所示。
Figure BDA0003386781470000072
Figure BDA0003386781470000081
制备例9
一种复合荧光微球，与制备例7的不同之处在于，除稀土铕荧光微球为羧基修饰的稀土铕荧光微球外，其他均与制备例1相同。
实施例
实施例1
一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，由抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球上获得，其制备步骤如下：
S1:将1g复合荧光微球加入9mL、pH值为5.8～7.2(本实施例pH值为6.5)的活化缓冲液中，在25℃、2000r/min的条件下搅拌混合1h后，在转速3000r/min下，离心4次，每次离心1min,去除上清液，得到清洗后的复合荧光微球。
S2：将S1所得的清洗后的复合荧光微球加入到30mL、pH值为7.2～8.5(本实施例pH值为7.9)的耦连缓冲液中，在50KHz超声30min后，得到超声后的复合荧光微球悬浊液；
向复合荧光微球悬浊液加入0.2～1.0mg/ml复合荧光微球悬浊液的NHS(本实施例为0.6mg/ml复合荧光微球悬浊液)和0.04～0.2mg/ml复合荧光微球悬浊液的EDC(本实施例为0.1mg/ml复合荧光微球悬浊液)，在25℃、2000r/min的条件下，搅拌混合1h后，再在转速15000r/min下，离心4次，每次离心1min,去除上清液，得到下层的复合荧光微球原液；
将复合荧光微球原液加入到30mL、pH值为7.2～8.5(本实施例pH值为7.9)的耦连缓冲液中，在50～65KHz(本实施例为50KHz)超声30～40min(本实施例为30min)后，加入1mg/mL复合荧光微球原液抗NGAL单克隆抗体，在25℃、2000r/min的条件下,搅拌混合3h，然后在转速15000r/min下，离心4次，每次离心1min,去除上清液，得到耦连后的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球；
S3：将耦连后的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球加入封闭缓冲液中，在50～65KHz(本实施例为50KHz)超声30～40min(本实施例为30min)后，得到封闭的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球；
其中，活化缓冲液为PB；
耦连缓冲液为PB；
封闭型缓冲液为BSA；
复合荧光微球为制备例1制备。
实施例2～9
一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，与实施例1的不同之处在于，除复合荧光微球采用制备例2～9所得的复合荧光微球外，其他均与实施例1相同。
实施例10～11
一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，与实施例9的不同之处在于，除抗NGAL单克隆抗体的加入量不同外，其他均与实施例9相同。抗NGAL单克隆抗体的加入量如下表所示。
Figure BDA0003386781470000091
应用实施例
应用实施例1～11
一种NGAL检测试剂盒，包括NGAL检测试剂卡、样本稀释液和IC卡。
参照图1，NGAL检测试剂卡包括PVC底板1和依次设置在PVC底板上的样品垫、结合垫2、NC膜和吸收垫，NC膜上有检测线(T线)3和质控线(C线)4。T线包被有抗NGAL单克隆抗体，C线包被有羊抗鼠IgG。结合垫包被有实施例1～11制得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物。
样品稀释液为0.1M的PB缓冲液；IC卡中拷贝有使用本试剂盒检测过程的相关参数、操作步骤等信息。
本检测试剂盒的使用仪器为广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS3000B干式荧光免疫分析仪。
灵敏度检测
标准工作溶液的配制：将NGAL抗原采用5％小牛血清的PBS缓冲液(0.02M，pH7.4)配制成系列浓度(0；0.2ng/mL；0.5ng/mL；1ng/mL；5ng/mL；10ng/mL；50ng/mL；100ng/mL；500ng/mL)，用移液枪取80μL加入结合垫中，5分钟后，采用广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS3000B干式荧光免疫分析仪检测T线和C线的荧光强度，每次检测三次，检测结果取平均值，然后计算T线和C线的荧光强度比值T/C，并记入下表中。
Figure BDA0003386781470000101
通过分析上表数据可知，应用实施例1～5所得的NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原的灵敏度均可达0.5ng/mL，应用实施例6～11所得的NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原的灵敏度均可达0.2ng/mL。
根据荧光强度比值T/C与抗原浓度绘制标准曲线，结果如图2～图12所示。
参照图2，应用实施例1中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.0115x+14.001，R2＝0.9986，线性范围为0～500ng/mL。
参照图3，应用实施例2中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.0311x+14.116，R2＝0.9988，线性范围为0～500ng/mL。
参照图4，应用实施例3中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.0683x+14.929，R2＝0.9987，线性范围为0～500ng/mL。
参照图5，应用实施例4中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.0954x+15.611，R2＝0.9986，线性范围为0～500ng/mL。
参照图6，应用实施例5中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1095x+17.014，R2＝0.9987，线性范围为0～500ng/mL。
参照图7，应用实施例6中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1212x+18.479，R2＝0.9988，线性范围为0～500ng/mL。
参照图8，应用实施例7中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1138x+19.547，R2＝0.9989，线性范围为0～500ng/mL。
参照图9，应用实施例8中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1472x+20.475，R2＝0.9987，线性范围为0～500ng/mL。
参照图10，应用实施例9中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1525x+22.129，R2＝0.9987，线性范围为0～500ng/mL。
参照图11，应用实施例10中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1731x+23.217，R2＝0.9987，线性范围为0～500ng/mL。
参照图12，应用实施例11中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝1.1909x+24.504，R2＝0.9987，线性范围为0～500ng/mL。
综上所述，本申请应用实施例1～11所得的NGAL检测试剂盒，检测NGAL抗原的灵敏度高，且在NGAL抗原浓度为0～500ng/mL的浓度范围内，线型关系良好，相关系数R2均可达0.99以上。
稳定性检测
将NGAL抗原采用5％小牛血清的PBS缓冲液(0.02M，pH7.4)配制成1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL三种浓度的待测样品，用移液枪取80μL加入结合垫中，5分钟后，采用广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS3000B干式荧光免疫分析仪检测T线的荧光强度，每次检测10次，根据10次检测结果计算平均偏差CV％值，并记入下表中。
Figure BDA0003386781470000121
通过分析上表数据可知，当以1ng/mL的NGAL抗原作为测试样品时，连续检测10次，应用实施例1～11的检测试剂盒检测结果CV％值仅为3.98～4.55％；当以10ng/mL的NGAL抗原作为测试样品时，连续检测10次，应用实施例1～11的检测试剂盒检测结果CV％值仅为3.30～4.13％；当以100ng/mL的NGAL抗原作为测试样品时，连续检测10次，应用实施例1～11的检测试剂盒检测结果CV％值仅为3.10～4.02％。
由此表明了，本申请应用实施例1～11所得的NGAL检测试剂盒检测的稳定性高。
对比例
对比例1
一种抗NGAL单克隆抗体荧光微球复合物，与实施例1的不同之处在于，除复合荧光微球为羧基与磺酸基修饰的稀土铕荧光微球，粒径为200nm，型号为EU300-10，采购自上海宇涛国际贸易有限公司外，其他均与实施例1相同。
对比例2
一种抗NGAL单克隆抗体荧光微球复合物，与实施例1的不同之处在于，除复合荧光微球的制备步骤中，碳量子点和稀土铕荧光微球的重量不同外，其他均与实施例1相同。复合荧光微球的制备步骤如下：
A1：将1g稀土铕荧光微球和0.3g碳量子点依次加入13g去离子水中，在25℃、3000r/min的条件下，搅拌混合10min，得到混合溶液；
A2：将混合溶液转移至反应釜中，在170℃下，反应2.5h后，自然冷却至25℃，然后再使用截留分子量1000的透析膜进行19h的透析纯化，纯化后的混合溶液通过冻干机冻干24h后，即得复合荧光微球。
其中，碳量子点的粒径为4nm；
稀土铕荧光微球为羧基与磺酸基共同修饰的稀土铕荧光微球，粒径为100nm；
经检测，所得复合荧光微球的粒径为200nm。
对比例3
一种抗NGAL单克隆抗体荧光微球复合物，与实施例1的不同之处在于，除复合荧光微球的制备过程中，碳量子点和稀土铕荧光微球的重量不同外，其他均与实施例1相同。复合荧光微球的制备步骤如下：
A1：将1g稀土铕荧光微球和0.9g碳量子点依次加入19g去离子水中，在25℃、3000r/min的条件下，搅拌混合10min，得到混合溶液；
A2：将混合溶液转移至反应釜中，在170℃下，反应2.5h后，自然冷却至25℃，然后再使用截留分子量1000的透析膜进行19h的透析纯化，纯化后的混合溶液通过冻干机冻干24h后，即得复合荧光微球。
其中，碳量子点的粒径为4nm；
稀土铕荧光微球为羧基与磺酸基共同修饰的稀土铕荧光微球，粒径为100nm；
经检测，所得复合荧光微球的粒径为200nm。
对比例4
一种抗NGAL单克隆抗体荧光微球复合物，与实施例1的不同之处在于，除复合荧光微球的制备过程中，除碳量子点的粒径为3mm，稀土铕荧光微球的粒径为100mm外，其他均与实施例1相同。
对比例5
一种抗NGAL单克隆抗体荧光微球复合物，与实施例1的不同之处在于，除复合荧光微球的制备过程中，除碳量子点的粒径为9mm，稀土铕荧光微球的粒径为100mm外其他均与实施例1相同。
上述对比例2-5中，碳量子点和稀土铕荧光微球的重量和粒径如下表所示。
Figure BDA0003386781470000141
应用对比例1～5
一种NGAL检测试剂盒，与应用实施例1的不同之处在于，除结合垫依次采用对比例1～5制得的抗NGAL单克隆抗体荧光微球复合物替代实施例1制得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物外，其他均与应用实施例1相同。
灵敏度检测
标准工作溶液的配制：将NGAL抗原采用5％小牛血清的PBS缓冲液(0.02M，pH7.4)配制成系列浓度(0；0.2ng/mL；0.5ng/mL；1ng/mL；5ng/mL；10ng/mL；50ng/mL；100ng/mL；500ng/mL)，用移液枪取80μL加入结合垫中，5分钟后，采用广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS3000B干式荧光免疫分析仪检测T线和C线的荧光强度，每次检测三次，检测结果取平均值，然后计算T线和C线的荧光强度比值T/C，并记入下表中。
Figure BDA0003386781470000142
Figure BDA0003386781470000151
通过分析上表数据可知，应用对比例1所得的NGAL检测试剂盒，在NGAL抗原浓度为0～5ng/mL时，检测所得的荧光强度比值T/C变动幅度较小。所以，应用对比例1所得的NGAL检测试剂盒，其最低检出量为10ng/mL，并且远远高于本申请应用实施例1所得的NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原的最低检出量0.5ng/mL。由此表明，本申请应用例1～11采用实施例1～11所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，最终所得的NGAL检测试剂盒，相对于市售的NGAL检测试剂盒，具有较低的最低检测量，也即本申请所得NGAL检测试剂盒，具有较高的灵敏度。
应用对比例2～3所得的NGAL检测试剂盒，在NGAL抗原浓度为0～0.5ng/mL时，检测所得的荧光强度比值T/C变动幅度较小。所以，应用对比例2～3所得的NGAL检测试剂盒，其最低检出量为1ng/mL，远远小于本申请应用实施例1所得的NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原的最低检出量0.5ng/mL。由此表明，本申请应用例1采用实施例1所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，最终所得的NGAL检测试剂盒，具有较低的最低检测量，也即本申请所得NGAL检测试剂盒，具有较高的灵敏度。分析其原因可能是，在抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备过程中，其复合荧光微球由碳量子点和稀土铕荧光微球按重量比(0.4～0.8):1制备时，所得复合荧光微球中发生了碳量子点到铕离子的荧光能量转移，使得碳量子点的能量转移给了铕离子，导致铕离子的荧光强度增强，所以提高了所得NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原的灵敏度。
应用对比例4～5所得的NGAL检测试剂盒，在NGAL抗原浓度为0～0.5ng/mL时，检测所得的荧光强度比值T/C变动幅度较小。所以，应用对比例4～5所得的NGAL检测试剂盒，其最低检出量为1ng/mL，远远小于本申请应用实施例1所得的NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原的最低检出量0.5ng/mL。由此表明，本申请应用例1采用实施例1所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，最终所得的NGAL检测试剂盒，具有较低的最低检测量，也即本申请所得NGAL检测试剂盒，具有较高的灵敏度。分析其原因可能是，在复合荧光微球的制备过程中，当碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比为(0.04～0.08):1时，所得复合荧光微球的结构较稳定，有利于提高复合荧光微球与抗体的交联物的结构的稳定性，使得所得NGAL检测试剂盒检测NGAL抗原时，具有较高灵敏度的同时，还具有较高的稳定性。
根据荧光强度比值T/C与抗原浓度绘制标准曲线，结果如图2～图12所示。
参照图13，应用对比例1中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝0.9586x+12.329，R2＝0.9985，线性范围为0～500ng/mL。
参照图14，应用对比例2中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝0.953x+1.713，R2＝0.9989，线性范围为0～500ng/mL。
参照图15，应用对比例3中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝0.9492x+14.549，R2＝0.9982，线性范围为0～500ng/mL。
参照图16，应用对比例4中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝0.9601x+14.123，R2＝0.9981，线性范围为0～500ng/mL。
参照图17，应用对比例5中，检测NGAL抗原的标准曲线方程为y＝0.9658x+13.962，R2＝0.9988，线性范围为0～500ng/mL。
稳定性检测
将NGAL抗原采用5％小牛血清的PBS缓冲液(0.02M，pH7.4)配制成50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL三种浓度的待测样品，用移液枪取80μL加入结合垫中，5分钟后，采用广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS3000B干式荧光免疫分析仪检测T线的荧光强度，每次检测10次，根据10次检测结果计算平均偏差CV％值，并记入下表中。
Figure BDA0003386781470000161
通过分析上表数据可知，当以50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL三种浓度的NGAL抗原作为测试样品时，连续检测10次，应用对比例1的检测试剂盒检测结果CV％值均远远大于本申请应用实施例1的CV％值。由此表明，本申请应用例1～11采用实施例1～11所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，最终所得的NGAL检测试剂盒，相对于市售的NGAL检测试剂盒，具有良好的稳定性。
通过分析上表数据可知，当以50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL三种浓度的NGAL抗原作为测试样品时，连续检测10次，应用对比例2～3的检测试剂盒检测结果CV％值均远远大于本申请应用实施例1的CV％值。由此表明，在抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备过程中，当复合荧光微球由碳量子点和稀土铕荧光微球按重量比(0.4～0.8):1制备时，所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，用于制备NGAL检测试剂盒，所得的NGAL检测试剂盒具有较高的稳定性。
通过分析上表数据可知，当以50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL三种浓度的NGAL抗原作为测试样品时，连续检测10次，应用对比例5～5的检测试剂盒检测结果CV％值均远远大于本申请应用实施例1的CV％值。由此表明，在抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备过程中，当复合荧光微球由碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比按(0.04～0.08):1制备时，所得的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，用于制备NGAL检测试剂盒，所得的NGAL检测试剂盒具有较高的稳定性。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，其特征在于，由抗NGAL单克隆抗体负载到复合荧光微球上获得，所述复合荧光微球的粒径为200nm；
所述复合荧光微球由碳量子点和稀土铕荧光微球制备而成，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的重量比为(0.4～0.8):1；
碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比为(0.04～0.08):1。
2.根据权利要求1所述的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，其特征在于，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的重量比为(0.4～0.6):1。
3.根据权利要求1所述的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，其特征在于，所述碳量子点和稀土铕荧光微球的粒径比为(0.05～0.08):1。
4.根据权利要求1所述的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，其特征在于，所述复合荧光微球的制备方法为：
A1：将碳量子点溶于水中，得到碳量子点水溶液；将稀土铕荧光微球溶于水中，得到稀土铕荧光微球水溶液；将碳量子点水溶液加入到稀土铕荧光微球水溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；
A2：将混合溶液在180～200℃，反应3～4h，自然冷却至25～30℃，使用截留分子量1000的透析膜进行20～22h的透析纯化后，通过冻干法即得复合荧光微球。
5.根据权利要求4所述的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物，其特征在于，所述稀土铕荧光微球为羧基修饰的稀土铕荧光微球。
6.权利要求1～5任一所述抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:将复合荧光微球加入pH值为5.8～7.2的活化缓冲液中，搅拌混合后，离心3～5次，去除上清液，得到清洗后的复合荧光微球；
S2：
S21：将清洗后的复合荧光微球加入到pH值为7.2～8.5的耦连缓冲液中，在50～65 KHz超声30～40 min后，得到超声后的复合荧光微球悬浊液；
S22：向复合荧光微球悬浊液中加入0.2～1.0mg/ml复合荧光微球悬浊液 NHS和0.04～0.2mg/ml复合荧光微球悬浊液 EDC，搅拌混合，离心3～5次，去除上清液，得到下层的复合荧光微球原液；
S23：将复合荧光微球原液加入到pH值为7.2～8.5的耦连缓冲液中，在50～65 KHz超声30～40 min后，加入抗NGAL单克隆抗体，搅拌混合后，离心3～5次，去除上清液，得到耦连后的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球；
S3封闭：将耦连后的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球加入封闭缓冲液中，在50～65KHz超声30～40 min后，得到封闭的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球；
所述抗NGAL单克隆抗体的加入量为1～5mg/mL复合荧光微球原液；
所述活化缓冲液为PB、Borax和MES中的任一种；
耦连缓冲液为PB、Borax和MES中的任一种；
所述封闭型缓冲液为BSA、glycine、casein、flish skin gelate、Jeffamine D2000、PEG2000中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的制备方法，其特征在于，所述抗NGAL单克隆抗体的加入量为3mg/mL复合荧光微球原液。
8.一种NGAL检测试剂盒，其特征在于，包括包被有权利要求1～5任一所述的抗NGAL单克隆抗体复合荧光微球复合物的NGAL检测试剂卡。
9.根据权利要求8所述的NGAL检测试剂盒，其特征在于，所述最低检出限为0.5ng/mL，线性范围0～500ng/mL，相关系数R2＞0.99。
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