CN116087501A - 微球封闭试剂和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种微球封闭试剂,用于封闭包被有能与待测人IgG抗体特异性结合的相应抗原的微球,微球封闭试剂包括第一封闭液和第二封闭液;第一封闭液包括蛋白封闭剂,蛋白封闭剂包括动物IgG抗体,动物IgG抗体不与微球上抗原特异性结合;第二封闭液包括氨基化合物。本申请创造性地将不与微球表面的抗原特异性结合的动物IgG抗体应用于微球封闭试剂的制备中,以在封闭微球步骤中,通过IgG抗体封闭微球表面的非特异性位点,避免微球混合导致的非特异性位点的暴露,进而避免了本底升高及假阳性的检测结果。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域,具体而言,涉及一种微球封闭试剂和免疫球蛋白检测试剂盒。
背景技术
液态芯片,又称悬浮阵列、流式荧光技术,通常用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究。液态芯片起源于流式细胞仪,流式细胞仪有区分不同大小和颜色微球的能力,用于不同类别微球群的分析,因而液态芯片是一种以微球为基础的多指标数据采集和分析平台。
液态芯片技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球(5.6μm)用荧光染色的方法进行编码,根据两种荧光染料的不同配比,将直径5.6μm的聚苯乙烯微球(Beads)染成不同的荧光色,可获得多达100种经荧光编码的微球。将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体,通过不同荧光编码的微球可实现对多种特定检测物的检测。
使用液态芯片检测靶分子时,先把针对不同检测物的荧光编码微球混合,再加入微量待检样本,在悬液中将靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合,在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。用LuminexTM分析软件进行分析,仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。由于分子杂交或免疫反应在悬浮溶液中进行,液态芯片检测速度极快,且可在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。
IgG是哺乳类动物抗体(又称免疫球蛋白,immunoglobulin,简称Ig)的种型之一。IgG抗体(immunoglobulin G)在免疫应答中起着激活补体,中和多种毒素的作用。IgG抗体持续时间长,是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。它们还能从乳腺分泌进入初乳,使新生儿第一时间得到抗体保护。IgG是四链单体,占血清Ig总量的75%,是血清和细胞外液中最主要的抗体成分。IgG自出生后三个月开始合成,三到五岁接近成人水平,主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生,血清半衰期较长,约20~23天,是再次体液免疫应答产生的主要抗体,其亲和力高,在体内广泛分布,具有重要的免疫效应,是机体抗感染的主力军。
目前,基于编码微球对检测样本中多个IgG抗体的联合检测中,通常需要将包被有不同抗原的多种编码微球混合到一个液相体系中,从而实现对一份样本中多个IgG抗体联合检测的目的。然而,在多个IgG抗体联合检测中发现,包被有不同抗原的多种编码微球混合后会导致检测背景升高或检测结果存在假阳性。
如何减少多个IgG抗体联合检测存在的背景升高或假阳性是提高其检测灵敏度和精确度的难点。
发明内容
为了解决上述问题,减少包被不同抗原的多种微球混合导致的检测背景升高或假阳性,本申请的第一目的在于提供一种微球封闭试剂,用于封闭包被有抗原的微球,抗原用于特异性结合待测人IgG抗体;
微球封闭试剂包括第一封闭液和第二封闭液;
第一封闭液包括蛋白封闭剂,蛋白封闭剂包括动物IgG抗体,动物IgG抗体不与抗原特异性结合;
第二封闭液包括氨基化合物。
本申请针对包被不同抗原的微球混合后导致的检测背景升高或检测结果存在假阳性的问题,创造性地通过将不与微球表面抗原特异性结合的动物IgG抗体应用于微球封闭试剂的制备中,以在蛋白封闭剂封闭微球步骤中,通过动物IgG抗体封闭微球表面的非特异性位点,实现了显著降低混合微球之间的非特异性结合,避免了微球检测多种人IgG抗体时出现的本底升高及假阳性的检测结果。
其中一个实施例中,微球封闭试剂满足以下特征(1)~(5)中的至少一个:
(1)动物IgG抗体选自鼠IgG抗体、兔IgG抗体、猴IgG抗体、绵羊IgG抗体、山羊IgG抗体和牛IgG抗体中的至少一种;
(2)第二封闭液中氨基化合物选自三羟甲基氨基甲烷、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸和乙醇胺中的至少一种;
(3)第一封闭液中的蛋白封闭剂还包括牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、鱼明胶、明胶和酪蛋白中的至少一种;
(4)第一封闭液和/或第二封闭液还包括缓冲试剂和防腐剂中的至少一种;
(5)第一封闭液还包括表面活性剂。
其中一个实施例中,微球封闭试剂满足以下特征(1)~(3)中的至少一个:
(1)表面活性剂选自Tetronic1307、吐温表面活性剂、Triton表面活性剂及Brij表面活性剂中的至少一种;
(2)缓冲试剂选自MES缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES非离子两性缓冲液和tris缓冲液中的任意一种,缓冲试剂的pH为5.0~10.0;
(3)防腐剂包括Proclin 300、硫柳汞钠、叠氮钠及牛莎抑菌剂中的至少一种。
其中一个实施例中,第一封闭液中的各组分满足以下特征(1)~(5)中的至少一个:
(1)第一封闭液中缓冲试剂的工作浓度为10mM~100mM;
(2)BSA质量分数是0.50%~10%;
(3)动物IgG抗体的质量分数为0.50%~10%;
(4)表面活性剂的质量分数0.05%~5%;
(5)第一封闭液中防腐剂的质量分数为0.10%~5%;
及/或
第二封闭液中的各组分满足以下特征(6)~(8)中的至少一个:
(6)第二封闭液中缓冲试剂的工作浓度为10mM~100mM;
(7)氨基化合物的质量分数为1%~10%;
(8)第二封闭液中防腐剂的质量分数为0.10%~5%。
本申请的第二目的在于提供动物IgG抗体在制备用于封闭包被有抗原的微球的微球封闭试剂中的用途,其中,抗原用于特异性结合待测人IgG抗体。
本申请的第三目的在于提供一种微球制备方法,包括采用上述微球封闭试剂,对包被有抗原的微球进行封闭处理,其中,抗原用于特异性结合待测人IgG抗体。
其中一个实施例中,对包被有抗原的微球进行封闭处理具体包括:
利用第一封闭液和第二封闭液分两步对包被有抗原的微球进行封闭处理。
本申请的第四目的面在于提供上述制备方法制备的微球。
本申请的第五目的在于提供一种检测人免疫球蛋白的试剂盒,试剂盒包括上述微球。
其中一个实施例中,试剂盒满足以下特征(1)~(2)中的至少一种:
(1)所述微球为荧光编码微球,所述试剂盒包括至少两种荧光编码微球,每种荧光编码微球上包被一种抗原;
(2)所述试剂盒还包括荧光染料标记的抗人IgG抗体。
本申请的第六目的在于提供一种人免疫球蛋白检测方法,采用上述试剂盒检测样本中的待测人IgG抗体。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本申请更广阔的方面。
传统的微球包被方法中,微球通过NHS和EDC活化后,在MES缓冲液中通过自身的羧基和抗原上的氨基进行偶联结合,得到包被有抗原或抗体的微球。包被有抗原或抗体的编码微球经过一步封闭或不经过封闭就直接混合后保存到含有一定浓度BSA的磷酸盐缓冲液中。
普通的封闭方法既没有对包被后微球进行充分地封闭,也没有封闭针对其他人IgG抗体或抗人IgG抗体可能与包被后微球结合的非特异性位点,而包被上不同抗原的混合微球的环境比单个类别抗原包被微球的环境更为复杂,部分微球上包被的抗原易受干扰,微球上的抗原结构受周围环境的影响发生结构变化或部分抗原脱落等,造成抗原包被的微球与后续加入的样本中其他人IgG抗体发生非特异性结合,或与反应液中抗人IgG抗体发生较强的非特异性结合,导致检测背景升高或检测结果存在假阳性,进而影响反应的灵敏度、精密度和准确度。
为了解决上述技术问题,本申请的第一方面提供了一种微球封闭试剂,用于封闭包被有抗原的微球,抗原能与待测人IgG抗体特异性结合,以用于检测样本中的待测人IgG抗体;
微球封闭试剂包括第一封闭液和第二封闭液;
第一封闭液包括蛋白封闭剂,蛋白封闭剂包括动物IgG抗体;
第二封闭液包括氨基化合物。
本申请中,术语“封闭试剂”是指封闭微球所有的未结合位点而不替换微球表面上的抗原/抗体、不结合抗原/抗体的特异性位点、也不与检测试剂有交叉反应的试剂。
本申请中,待测人IgG抗体是指人体内针对特定抗原产生的特异性IgG抗体,特定抗原可以是Sm、组蛋白、核小体、SS-A、JO-1、RNP、M2、CENP-B、Scl-70及SSB等抗原中的任意一种。
本申请中,动物IgG抗体是指非人的动物IgG抗体,对其种属没有特别限定。本申请的动物IgG抗体来源于健康动物血清/血浆,可通过商业化途径购买。
本申请针对包被不同抗原的多种微球混合后互相干扰,导致微球检测多种人IgG抗体时出现的的背景升高或检测结果存在假阳性的问题,创造性地将不与微球表面的抗原特异性结合的动物IgG抗体应用于微球封闭试剂的制备中,在封闭微球步骤中加入动物IgG抗体,通过动物IgG抗体封闭微球表面可能与样本中其他非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体结合的非特异性位点,降低了微球检测多种人IgG抗体时出现的本底,同时减少了假阳性检测结果;封闭抗原包被后的免疫微球可能受其他免疫微球影响而暴露的非特异性位点,实现了显著降低混合微球带来的干扰,从而也有效降低本底进而减少了因微球混合带来的样本的假阳性检测结果;同时动物IgG抗体与氨基化合物这样的小分子封闭剂组合使用提高信噪比,降低低值区间的变异系数,进一步提高了待测人IgG抗体检测精确度。
一些实施方案中,蛋白封闭剂还包括牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、鱼明胶、明胶和酪蛋白中的至少一种。示例性地,牛血清白蛋白BSA可以更好的保护微球上抗原/抗体的原有构象,避免微球上的抗原/抗体受到微球周围环境的影响,BSA可以提高低端信号的信噪比。酪蛋白对酸敏感,在中性和碱性条件下带有负电性,能够吸附于微球表面带正电荷的非特异性位点。
本申请通过研究发现,在联合检测多种人IgG抗体时,包被不同抗原的微球混合导致的本底升高以及假阳性检测结果的问题,常规的蛋白封闭剂和小分子封闭剂组合使用也无法解决混合微球带来的上述问题,因而在对微球进行封闭时,本申请在常规的蛋白封闭试剂的基础上加入动物IgG抗体,提前封闭微球可能受其他微球影响而暴露的非特异性位点,进而显著降低后续检测时加入的非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体和微球之间的非特异性结合,从而降低本底,同时还减少假阳性结果。
一些实施方案中,当利用微球检测多种人IgG抗体时,蛋白封闭剂包括的动物IgG抗体选自鼠IgG抗体、兔IgG抗体、猴IgG抗体、绵羊IgG抗体、山羊IgG抗体和牛IgG抗体中的至少一种,与人IgG抗体结构类似的其他哺乳动物IgG抗体,可以提前将微球表面与人IgG抗体结合的非特异性位点封闭,避免包被有抗原的免疫微球与其他免疫微球混合后暴露与非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体结合的非特异性位点,阻隔了后续非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体与包被有抗原的免疫微球的非特异性结合,从而降低了本底,减少了假阳性检测结果。需要说明的是,相比于其他蛋白封闭剂,动物IgG抗体和人IgG抗体在结构上更为相似,因而对于微球表面原本存在的非特异性位点,以及微球与其他微球混合后暴露的非特异性位点,可能均具有更好的封闭效果,从而实现了降低微球混合后的本底和减少假阳性的效果。
一些实施方案中,氨基化合物选自三羟甲基氨基甲烷、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸和乙醇胺中的至少一种,可以对蛋白封闭剂无法封闭完全的非特异性位点进一步进行封闭,从而提高微球封闭效果。本申请使用的氨基化合物作为小分子封闭剂与蛋白封闭剂组合使用,能够在不影响高值的变异系数的情况下,减小低值检测结果的变异系数。
一些实施方案中,第一封闭液还包括缓冲试剂、表面活性剂和防腐剂中的至少一种,其中,缓冲试剂用于维持封闭反应过程中反应体系的稳定性,表面活性剂同时和BSA使用,在封闭时会起到清洗非特异性结合或结合不牢固的蛋白的作用,防腐剂用于防止封闭过程中微生物的繁殖对检测结果带来的影响。
一些具体实施方案中,第一封闭液中的缓冲试剂选自MES缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES非离子两性缓冲液和tris缓冲液中的任意一种,缓冲试剂的pH值范围为5.0~10.0,以维持封闭反应过程中pH的稳定性,保护微球上抗原/抗体的原有构象,维持蛋白封闭剂的稳定性,提高蛋白封闭剂的封闭效果。
一些具体实施方案中,第一封闭液中的表面活性剂为非离子表面活性剂,具体地,表面活性剂选自Tetronic1307、吐温表面活性剂、Triton表面活性剂及Brij表面活性剂中的至少一种,非离子表面活性剂能够用于吸附到包被后的微球表面未完全封闭掉的位点上,从而提高了免疫微球表面的空间位阻,进一步降低其他蛋白的非特异性吸附。具体地,吐温表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60及吐温80中的至少一种;Triton表面活性剂选自Triton X-100、Triton X-114及Triton X-405中的至少一种;Brij表面活性剂选自Brij35、Brij76、Brij72、Brij58、Brij52及Brij30中的至少一种。
一些具体实施方案中,第一封闭液中的防腐剂包括Proclin 300、硫柳汞钠、叠氮钠及牛莎抑菌剂中的至少一种,从而抑制微生物繁殖,防止微生物对微球抗原效价的影响。其中,牛莎抑菌剂选自牛莎PC-150、牛莎BND-10和牛莎GML-2中的至少一种。
一些实施方案中,第一封闭液中的缓冲试剂的工作浓度为10mM~100mM,进一步,缓冲试剂的工作浓度为10mM~50mM;BSA质量分数是0.50%~10%,进一步,BSA质量分数是0.50%~5%;IgG的质量分数为0.50%~10%,进一步,IgG质量分数是0.50%~5%;表面活性剂的质量分数0.05%~5%,进一步,表面活性剂的质量分数0.05%~2%;防腐剂的质量分数为0.10%~5%,进一步,防腐剂的质量分数0.05%~2%。
一些实施方案中,第二封闭液还包括缓冲试剂和防腐剂中的至少一种,缓冲试剂用于维持封闭反应过程中反应体系的稳定性,防腐剂用于防止封闭过程中微生物的繁殖对检测结果带来的影响。
一些具体实施方案中,第二封闭液中的缓冲试剂选自MES缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES非离子两性缓冲液和tris缓冲液中的任意一种,缓冲试剂的pH值范围为5.0~10.0,以维持反应过程中pH的稳定性,保护微球上抗原/抗体的原有构象,保证氨基化合物的稳定性和封闭效果。
一些具体实施方案中,第二封闭液中的防腐剂包括Proclin 300、硫柳汞钠、叠氮钠及牛莎抑菌剂中的至少一种,从而抑制微生物繁殖,防止微生物对微球抗原效价的影响。
一些具体实施方案中,第二封闭液中的缓冲试剂的工作浓度为10mM~100mM,进一步,缓冲试剂的工作浓度为10mM~50mM;小分子封闭剂的质量分数为1%~10%,进一步,小分子封闭剂的质量分数为1%~5%;防腐剂的质量分数为0.10%~5%,防腐剂的质量分数0.05%~2%。
本申请的第二方面提供了非人IgG在制备如上述微球封闭试剂中的用途,一方面,通过动物IgG抗体封闭微球表面原本可能与非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体的非特异性位点,降低本底并减少假阳性检测结果;另一方面,通过动物IgG抗体封闭微球可能受其他微球影响而暴露非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体的非特异性位点,显著降低混合微球带来的非特异性结合,也有效降低本底并减少样本的假阳性检测结果;进一步,动物IgG抗体同时与作为小分子封闭剂的氨基化合物组合使用提高信噪比,降低低值区间的变异系数,进一步提高了待测人IgG抗体检测精确度。
本申请的第三方面提供了一种微球制备方法,包括采用上述微球封闭试剂对包被有抗原的微球进行封闭处理,抗原特异性结合待测人IgG抗体。本申请的微球封闭试剂封闭的微球在与其他微球混合时,能够避免不同微球混合出现的本底升高和假阳性问题,提高人IgG抗体检测的灵敏度和精确度。
为了达到更好的封闭效果,对包被有抗原的微球进行封闭处理时,利用第一封闭液和第二封闭液分两步对包被有抗原的微球进行封闭处理。
因此,本申请的第四方面提供了一种采用上述制备方法制备的微球。
一些实施方案中,微球为荧光编码微球。进而用于制备基于液态芯片的多联检产品。
本申请中,术语“荧光编码微球”一般是指利用荧光的发射波长以及强度进行编码得到的荧光微球。荧光编码微球具有优良的比表面积,提供了更加灵敏的检测,同时荧光编码微球具有编码以及解码过程简单,编码容量大以及可大批量制备等优势。荧光编码微球的编码元件包括半导体的量子点、有机荧光染料以及上转换纳米颗粒等主要编码元件。
半导体的量子点的发射光谱窄,荧光稳定性好,较宽的的激发光谱可以实现多种量子点的单一波长激发。有机荧光染料价格低廉、种类较多,适用于多种编码方法以及多种材质的微球,不同批次间的荧光均一性较好。上转换纳米颗粒利用近红外发激光,可以避免生物分子背景荧光的干扰,另外可以避免不同发射波长间的共振能量转移现象。
荧光编码微球的生化检测主要利用两种方式,一种为悬浮芯片技术,另外一种方式基于微流控的技术或者微井阵列的方式。
为了实现基于液态芯片的多重免疫检测,本申请的第五方面提供了一种人免疫球蛋白检测试剂盒,试剂盒包括采用上述制备方法制备的微球,以实现对多种人IgG抗体的检测。
一些具体实施方案中,试剂盒包括不同荧光编码微球,不同荧光编码微球具有不同编码且每种荧光微球表面共价包被一种抗原,不同抗原可特异性结合不同的人IgG抗体,从而实现对多种人IgG抗体的检测。
相应的,本申请的第六方面提供了一种非疾病诊断目的免疫球蛋白检测方法,采用上述试剂盒检测样本中的待测人IgG抗体,以实现对多种人IgG抗体的检测。
在检测时,样本中待测人IgG抗体交联到编码微球表面上的特定抗原,加入荧光染料标记的抗人IgG抗体即标记抗体,最终形成微球(结合特定抗原)-特异性人IgG抗体-荧光染料标记的抗人IgG抗体复合物。
进一步,采用适用仪器对复合物进行检测时,两束激光聚焦于编码微球上,一束判定微球的荧光编码,确定人IgG抗体的种类;另一束测定微球上报告分子即标记抗体上标记物的荧光强度,即为荧光素的荧光值,该荧光值与样本中相应的分析物浓度成正比,通过仪器计算得到最终结果,从而实现对不同的人IgG抗体的联合检测,并提高多联检测的准确度。
一些具体实施方案中,标记抗体标记的荧光染料为藻红蛋白。
一些具体实施方案中,待测样本包括血液样本。具体地,待测样本来自于人。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述,但本申请不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料,试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例提供了一种微球封闭试剂,封闭试剂主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.05%的吐温20、0.50%BSA、0.50%山羊IgG、0.50%的甘氨酸和0.10%Proclin 300。
实施例2
本实施例提供了一种微球封闭试剂,封闭试剂主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的甘氨酸、0.50%的乙醇胺、0.50%BSA、0.50%的山羊IgG、0.05%的吐温20 和0.10%Proclin 300。
实施例3
本实施例提供了一种微球封闭试剂,包括第一封闭液和第二封闭液,第一封闭液和第二封闭液用于分两步对微球进行封闭。
第一封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的BSA、0.50%的山羊IgG抗体、0.05%的吐温20和0.10%Proclin 300。第二封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量百分数计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的甘氨酸、0.50%的乙醇胺和0.10%Proclin 300。
实施例4
本实施例提供了一种微球封闭试剂,包括第一封闭液和第二封闭液,第一封闭液和第二封闭液用于分两步对微球进行封闭。
第一封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:50mM的MES、10%的酪蛋白、5%的绵羊IgG、Triton X-100和5%Proclin 300。第二封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量百分数计算,具体组成:10mM的HEPES、10%的甘氨酸、5%的乙醇胺和2.5%Proclin 300。
实施例5
本实施例提供了一种微球封闭试剂,包括第一封闭液和第二封闭液,第一封闭液和第二封闭液用于分两步对微球进行封闭。
第一封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:50mM的tris、5%的明胶、10%的兔IgG抗体、2%的吐温80和5%硫柳汞。第二封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量百分数计算,具体组成:100mM的MES、5%的赖氨酸、5%的甘氨酸和2.5%Proclin 300。
实施例6
本实施例提供了一种微球封闭试剂,包括第一封闭液和第二封闭液,第一封闭液和第二封闭液用于分两步对微球进行封闭。
第一封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:50mM的PBS、2.5%的胎牛血清白蛋白、10%的鼠IgG抗体、5%的Tetronic1307和5%叠氮钠。第二封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量百分数计算,具体组成:100mM的tris、5%的甘氨酸、10%的精氨酸和2.5%Proclin 300。
对比例1
本实施例提供了一种微球封闭试剂。封闭试剂主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.05%的吐温20、0.50%的甘氨酸和0.10%Proclin 300。
对比例2
本实施例提供了一种微球封闭试剂,封闭试剂主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的BSA、0.05%的吐温20和0.10%Proclin 300。
对比例3
本实施例提供了一种微球封闭试剂,封闭试剂主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的甘氨酸、0.50%的BSA、0.05%的吐温20和0.10%Proclin 300。
对比例4
本对比例提供了一种微球封闭试剂,包括第一封闭液和第二封闭液,第一封闭液和第二封闭液用于分两步对微球进行封闭。
第一封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量体积百分数(W/V)计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的BSA、0.05%的吐温20和0.10%Proclin 300。第二封闭液主要由如下原材料组成,浓度以摩尔浓度或质量百分数计算,具体组成:10mM的PBS、0.50%的甘氨酸、0.50%的乙醇胺和0.10%Proclin 300。
实施例7
本实验例提供了一种微球的制备方法,包括
(1)微球标记:取1mg的4μm-8μm荧光编码微球加入10mM MES缓冲溶液中,洗涤后加入过量(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化。磁分离去掉多余试剂,加入200μg的Sm抗原25℃旋转反应2小时进行抗原偶联反应,结束后磁分离去掉未反应试剂,加入封闭试剂得到Sm包被的免疫微球悬液进行下一步封闭。
(2)微球封闭:将抗原偶联的荧光编码微球重新悬浮分散于1.5mL的实施例1~6和对比例1~4微球封闭试剂中。具体地,所用微球封闭试剂的组分如表1所示,按照下列配方配置微球封闭试剂。一步法封闭是在室温25℃下将微球加入第一封闭试剂旋转反应2h。二步法封闭是在室温25℃下将微球加入第一封闭试剂旋转反应1h后换液到第二封闭液中再旋转反应1h。
表1
(3)微球保存:封闭结束后,磁分离去除多余的封闭试剂,将微球重新悬浮分散于200mL微球保存液中,所用保存液成分为10mM PBS+0.10%BSA+0.05%吐温20+0.10%Proclin 300。
(4)测试:取制备好的微球分别测试0、15、30、80、200、300、400、500、600、800、1000、1500、2000、2500AU/mL14个浓度,每个浓度重复测试3次取均值,经过四参数拟合得到标准曲线。
进一步,进行灵敏度和精密度的测试,考察微球封闭试剂的不同成分及不同封闭方式对检测试剂灵敏度、精密度和特异性的影响,具体测试方案如下:
灵敏度测试:取抗Sm IgG抗体浓度分别为0AU/mL和25AU/mL的两个样本,各重复测试3次取平均值,计算测试读取荧光信号的信噪比;
精密度测试:取抗Sm IgG抗体浓度分别为130AU/mL和630AU/mL的两个样本,各重复测试10次,分别计算精密度。
本实施例灵敏度和精密度检测结果如下:
A.灵敏度:各实验组测试的荧光信号读取结果如表2所示:
表2
结果表明:添加BSA、酪蛋白及明胶等蛋白质,以及山羊IgG、绵羊IgG、鼠IgG及兔IgG等非人动物IgG作为蛋白封闭剂可以提高低端信号的信噪比,可能原因是以上蛋白质可以更好的保护微球上抗原/抗体的原有构象,动物IgG能够更好的封闭微球表面的多种非特异性位点,从而提高了免疫结合反应效率,最终实现灵敏度的改善。相较于对比例3的封闭试剂,对比例1中单一的甘氨酸小分子封闭剂的引入未能明显改善非特异性吸附带来的背景信号,对比例4采用BSA、甘氨酸及乙醇胺的两步封闭可以提高低值信噪比,而实施例3-6与对比例4相比,添加动物IgG后的两步封闭能够在不影响低值区分度和检测灵敏度的前提下实现背景信号的显著降低。
B.精密度:(1)130AU/mL测试结果如表3所示;(2)630AU/mL测试结果如表4所示。
表3
表4
结果表明:相比于对比例2单独使用BSA作为蛋白封闭剂而言,对比例1中使用单一的甘氨酸作为小分子封闭剂可以改善高值重复性,减小高值测试结果的变异系数,但是单一使用甘氨酸会使低值测试结果的变异系数增大,对比例3组合使用BSA蛋白封闭剂和甘氨酸小分子封闭剂一步封闭,能够在保持高值变异系数的同时降低低值测试的变异系数。相比于对比例3使用一步法封闭,对比例4采用2步法封闭能够进一步降低高值测试结果的变异系数和低值测试结果的变异系数。
结合低、高值精密度测试结果考虑,发现相比于对比例3组合使用BSA蛋白封闭剂和甘氨酸小分子封闭剂一步封闭,在实施例1中通过BSA、山羊IgG和甘氨酸的组合封闭方式可同时改善高值和低值检测的变异系数;相比于实施例1中封闭试剂的一步封闭方式而言,实施例2采用BSA、山羊IgG、乙醇胺和甘氨酸一步封闭的方式也可同时改善高值和低值检测的变异系数;而相比于实施例2的一步封闭方式而言,实施例3采用BSA、山羊IgG、乙醇胺和甘氨酸的两步封闭法可以更好的改善高低值的精密度,同时还可以提高低值区分度,显著降低非特异性吸附;实施例4-6采用不同的蛋白保护剂、动物IgG及小分子物质可达到与实施例3同样的效果,故实施例3-6的微球封闭试剂可使得微球在灵敏度、精密度和特异性上都有更好的检测效果。
实施例8
本实施例提供了一种微球的制备方法,包括:
(1)微球标记:取3个不同编码的5-6μm荧光编码微球各1mg加入10mM MES缓冲溶液中,洗涤后加入过量(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化。磁分离去掉多余试剂,分别加入50μg的Sm、SS-A及SSB抗原25℃旋转反应2小时进行抗原偶联反应,结束后磁分离去掉未反应试剂,加入封闭试剂得到Sm、SS-A及SSB包被的3个免疫微球悬液进行下一步封闭。
(2)微球封闭:将不同抗原偶联的荧光编码微球分别重新悬浮分散于1.5mL实施例3和对比例4中的第一封闭液中,室温25℃旋转反应120分钟。所用封闭试剂和封闭方式如表5所示,按照下列配方配置封闭试剂并分成2步进行微球封闭。
(3)微球保存:封闭结束后,磁分离去除多余的封闭试剂,将Sm、SS-A及SSB包被微球分别重新悬浮分散于200mL微球保存液中,所用保存液成分为10mM PBS+0.10%BSA+0.05%吐温20+0.10%Proclin 300。
(4)测试:取制备好的微球分别测试0、15、30、80、200、300、400、500、600、800、1000AU/mL11个浓度,每个浓度重复测试3次取均值,经过四参数拟合得到标准曲线。将Sm、SS-A及SSB包被微球进行混合,混合后测试各自的本底及阴性样本浓度值,考察添加山羊IgG是否对混合微球的本底和阴性样本检测结果的影响,检测结果如表5所示。
表5
结果表明:将实施例3-6和对比例4的检测结果进行对比发现,同样是采用蛋白封闭剂和小分子封闭剂对微球进行两步封闭,未添加动物IgG的微球封闭试剂封闭微球后,混合微球本底全部升高,而且阴性样本的结果也升高,造成很多假阳结果的产生;而添加动物IgG后可以显著降低非特异性结合,本底和阴性样本检测结果全部恢复正常,可能是因为微球混合后与非特异性人IgG抗体或抗人IgG抗体结合的非特异性位点暴露出来,如果没有对这些位点进行提前封闭,就会造成非特异性结合的产生,用动物IgG提前封闭掉这部分位点则不会再产生这样的非特异性结合,避免了本底升高及假阳性的检测结果。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种微球封闭试剂,其特征在于,用于封闭包被有抗原的微球,所述抗原用于特异性结合待测人IgG抗体;
所述微球封闭试剂包括第一封闭液和第二封闭液;
所述第一封闭液包括蛋白封闭剂,所述蛋白封闭剂包括动物IgG抗体;
所述第二封闭液包括氨基化合物。
2.根据权利要求1所述的微球封闭试剂,其特征在于,所述微球封闭试剂满足以下特征(1)~(5)中的至少一个:
(1)所述动物IgG抗体选自鼠IgG抗体、兔IgG抗体、猴IgG抗体、绵羊IgG抗体、山羊IgG抗体和牛IgG抗体中的至少一种;
(2)所述第二封闭液中氨基化合物选自三羟甲基氨基甲烷、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸和乙醇胺中的至少一种;
(3)所述第一封闭液中的蛋白封闭剂还包括牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、鱼明胶、明胶和酪蛋白中的至少一种;
(4)所述第一封闭液和/或所述第二封闭液还包括缓冲试剂和防腐剂中的至少一种;
(5)所述第第一封闭液还包括表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的封闭试剂,其特征在于,所述微球封闭试剂满足以下特征(1)~(3)中的至少一个:
(1)所述表面活性剂选自Tetronic1307、吐温表面活性剂、Triton表面活性剂及Brij表面活性剂中的至少一种;
(2)所述缓冲试剂选自MES缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES非离子两性缓冲液和tris缓冲液中的任意一种,所述缓冲试剂的pH为5.0~10.0;
(3)所述防腐剂包括Proclin 300、硫柳汞钠、叠氮钠及牛莎抑菌剂中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的封闭试剂,其特征在于,所述第一封闭液中的各组分满足以下特征(1)~(5)中的至少一个:
(1)所述第一封闭液中缓冲试剂的工作浓度为10mM~100mM;
(2)所述BSA质量分数是0.50%~10%;
(3)所述动物IgG抗体的质量分数为0.50%~10%;
(4)所述表面活性剂的质量分数0.05%~5%;
(5)所述第一封闭液中防腐剂的质量分数为0.10%~5%;
及/或
所述第二封闭液中的各组分满足以下特征(6)~(8)中的至少一个:
(6)所述第二封闭液中缓冲试剂的工作浓度为10mM~100mM;
(7)所述氨基化合物的质量分数为1%~10%;
(8)第二封闭液中防腐剂的质量分数为0.10%~5%。
5.动物IgG抗体在制备用于封闭包被有抗原的微球的微球封闭试剂中的用途,其中,所述抗原用于特异性结合待测人IgG抗体。
6.一种微球制备方法,其特征在于,包括采用权利要求1~4任一项所述的微球封闭试剂,对包被有抗原的微球进行封闭处理,其中,所述抗原用于特异性结合待测人IgG抗体。
7.根据权利要求6所述的制备方法制备的微球。
8.一种检测人免疫球蛋白的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求7所述的微球。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒满足以下特征(1)~(2)中的至少一种:
(1)所述微球为荧光编码微球,所述试剂盒包括至少两种荧光编码微球,每种荧光编码微球上包被一种抗原;
(2)所述试剂盒还包括荧光染料标记的抗人IgG抗体。
10.一种人免疫球蛋白检测方法,其特征在于,采用权利要求8或9所述的试剂盒检测样本中的待测人IgG抗体。
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