PT599803E

PT599803E - Processo para a identificacao de anticorpos e antigenes

Info

Publication number: PT599803E
Application number: PT93890224T
Authority: PT
Inventors: Manfred Schinkinger; Markus Korger
Original assignee: Sanochemia Pharmazeutika Ag
Priority date: 1992-11-23
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 2000-07-31
Also published as: DE59309999D1; DK0599803T3; JPH06281652A; ATE191565T1; ES2056041T3; EP0599803A1; GR3033389T3; ES2056041T1; EP0599803B1; GR940300070T1

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS E ANTIGENES" A invenção refere-se a um processo para a identificação de um anticorpo contido numa amostra por meio de ligação do anticorpo a identificar a um antigene especifico para o anticorpo a identificar. A invenção refere-se ainda a um processo para a identificação de um antigene contido numa amostra por meio de ligação do antigene a identificar a um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal especifico para o antigene a identificar.

Na patente WO/06801 descreve-se um processo para a determinação qualitativa ou quantitativa de um analito numa amostra, no qual se utiliza um parceiro reaccional imobilizado sobre uma fase sólida. Nesse processo, o parceiro reaccional deve conter ouro como indicador, que se encontra na forma de partículas com um diâmetro médio inferior a 5 nm numa proporção estequeométrica de 1:1 em relação ao parceiro reaccional. A técnica de trabalho descrita na WO/06801 prevê que se misture o suporte com a amostra e se incube em seguida, só se adicionando depois uma substância que contenha o indicador. Propõe-se também que se empregue como indicador um complexo de partículas de ouro e proteínas. O processo de identificação de anticorpos de acordo com a invenção caracteriza-se por se misturar e incubar a amostra numa mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas, no qual se encontra imobilizado o antigene específico para o anticorpo a identificar, e um conjugado de pelo menos um fragmento Fc de proteína reactiva ao anticorpo e um indicador ligado a este fragmento, de modo a formar complexos do conjugado e dos anticorpos e a ligar estes complexos ao suporte, por se proceder à separação do suporte e se verificar a 1

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existência de complexos do conjugado e dos anticorpos a identificar ligados ao suporte.

No processo de acordo com a invenção coloca-se a amostra numa mistura reaccional que contém já o antigene imobilizado num suporte em forma de partículas e o conjugado de pelo menos uma proteína reactiva em relação ao anticorpo, ou seja ao seu fragmento Fc, e um indicador a ela ligado, no qual num só passo se formam por incubação os agregados a partir do complexo formado (a partir dos anticorpos contidos na amostra e do conjugado constituído pela proteína e pelo indicador, podendo existir uma razão estequeométrica maior do que 1:2, de preferência de 1:20 a 1.70) e do antigene imobilizado sobre o suporte em forma de partículas. A técnica de trabalho de acordo com a invenção tem a vantagem de os anticorpos a identificar também não tomarem parte na formação do complexo do conjugado e dos anticorpos contidos na amostra, de modo que estes complexos são maiores do que quando são constituídos apenas pelos anticorpos a identificar. Isto verifica-se em especial quando se mantém a proporção estequeométrica acima mencionada. O mecanismo de amplificação descrito de acordo com a invenção origina uma amplificação interna do sinal, de modo que a identificação é mais fácil de efectuar e mais reprodutível. Este efeito de amplificação ocorre no processo de acordo com a invenção também devido ao facto de, tanto a reacção entre o conjugado e o anticorpo ou os anticorpos como a ligação dos complexos formados contendo o anticorpo a identificar, ocorrerem simultaneamente e num único meio reaccional. O processo de acordo com a invenção é particularmente fácil de executar por esta razão e também porque não necessita de quaisquer reacções imunoquímicas adicionais para a detecçâo. É por isso possível, de acordo com a invenção, um passo de identificação muito simples, nomeadamente uma fácil separação (filtração) da mistura reaccional, em que os agregados são retidos na membrana utilizada para a filtração. Neste contexto pode também referir-se que, segundo a WO 89/06801, 2

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U κ tanto o suporte como os agregados mais pequenos atravessam a membrana, sendo a identificação mais dificultada. Uma vez que, pelo contrário, segundo a invenção, os anticorpos contidos na amostra mas não a identificar aumentam o tamanho dos complexos e assim dos agregados de complexo e suporte, torna-se não só mais fácil a separação, como também se pode verificar com maior segurança se ocorre uma reacção positiva (= formação no suporte dos complexos contendo o anticorpo a identificar).

Uma outra vantagem do processo de identificação de acordo com a invenção consiste no facto de ele ser executável num tempo muito curto e num único passo processual, uma vez que é possível uma reacção simultânea do conjugado e da amostra para formação do complexo e entre os complexos e os suportes com o antigene imobilizado para formação dos agregados. Pelo contrário, segundo o processo da WO 89/06801 trabalha-se em vários passos.

As misturas reaccionais utilizáveis para a identificação de anticorpos caracterizam-se, de acordo com a invenção, por a mistura reaccional conter, num meio líquido, em especial numa solução tampão, um suporte em forma de partículas, no qual se encontra imobilizado um antigene específico para o anticorpo a identificar, e um conjugado de pelo menos uma proteína reactiva ao fragmento Fc dos anticorpos e um indicador ligado e esse conjugado.

Estas misturas reaccionais podem preparar-se, de acordo com a invenção, revestindo-se as partículas de suporte, em especial partículas de látex, de preferência as de poliestireno, com um diâmetro médio preferencialmente de 1 μιη, num tampão de revestimento, de preferência alcalino, com pelo menos um antigene, suspendendo as partículas de suporte revestidas numa solução tampão, em especial numa solução tampão fisiológica, numa quantidade de 1% em relação à solução tampão e adicionando à suspensão assim obtida pelo menos um conjugado de pelo menos uma proteína reactiva em relação ao fragmento Fc dos anticorpos acoplada a um indicador. 0 processo de acordo com a invenção para a identificação de antigenes caracteriza-se por se incubar a 3

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ΐ amostra numa mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas, no qual se encontram imobilizados fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal específico para o antigene a identificar, e um conjugado constituído por pelo menos um fragmento Fc de uma proteína reactiva aos anticorpos e por um indicador a ela ligado, bem como pelo menos um anticorpo monoclonal específico para antigene a identificar, de modo a formar agregados do suporte em forma de partículas, do antigene a identificar e de complexos do conjugado e dos anticorpos, e se verificar a presença de agregados que contêm o antigene a identificar.

Uma vantagem considerável do processo de acordo com a invenção para a identificação de antigenes consiste no facto de tanto a reacção entre o conjugado, os anticorpos e o antigene ou os antigenes, como a ligação dos complexos aí formados contendo o antigene a identificar, ocorrerem simultaneamente e num único meio reacional. 0 processo de acordo com a invenção para a identificação de antigenes é por isso, entre outros, particularmente fácil de executar, uma vez que não necessita de quaisquer reacções imunoquímícas adicionais para a detecção do antigene.

Os processos de acordo com a invenção para a identificação de anticorpos e para a identificação de antigenes têm em comum o facto de os anticorpos contidos na amostra mas não a identificar aumentarem o tamanho dos complexos e assim o dos agregados de complexo e suporte, de modo que após a separação se pode verificar mais facilmente e com maior segurança se ocorreu uma reacção positiva (= ligação do complexo contendo o antigene ou o anticorpo a identificar ao suporte).

Os meios utilizáveis para a identificação de antigenes caracterizam-se, de acordo com a invenção, por o meio ser constituído por um componente I e um componente II, o componente I conter um suporte em forma de partículas revestido por fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo específico para o antigene a identificar e um conjugado, constituído por pelo menos um fragmento Fc de proteína reactiva ao anticorpo e por um 4

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ΐ indicador, ο componente II conter anticorpos monoclonais específicos para o antigene a identificar e, conforme o caso, moléculas IgG ou os respectivos fragmentos Fc não especificas em relação ao antigene a identificar.

Estes meios podem preparar-se de uma maneira simples·.

As formas de concretização preferenciais dos processos de identificação de acordo com a invenção, das misturas reaccionais e dos processos para a sua preparação são objectivo das reivindicações adiante apresentadas. 0 desenvolvimento do diagnóstico laboratorial clinico cresce rapidamente em todo o mundo e há por isso uma exigência crescente em sistemas de teste de alta sensibilidade, muito específicos e de rápida execução.

Ao contrário do diagnóstico de massas clínico-químico, o diagnóstico imunológico e serológico está principalmente orientado para trabalhar em séries mais pequenas e com o equipamento laboratorial mínimo possível. Resulta daqui uma tendência para testes rápidos e independentes de aparelhagem.

Actualmente, existem essencialmente disponíveis três sistemas básicos em diferentes variantes: 1. aglutinação de partículas 2. imunoconcentração 3. "radial partition immunoassay" (teste imunologico de partição radial) (RPIA)

Na aglutinação de partículas tornam-se as partículas revestidas com o antigene ou o anticorpo (na maior parte dos casos partículas de látex ou eritrócitos) numa aglutinação macroscópica visível por meio de uma reacção imunológica (aglutinação directa de partículas) ou impede-se a aglutinação (aglutinação de partículas indirecta ou de competição).

Estes sistemas de teste são rápidos e exigem apenas um equipamento laboratorial mínimo, mas são contudo muitas vezes pouco sensíveis e específicos e necessitam muitas vezes de uma certa experiência para o tratamento dos resultados. Além disso, são muitas vezes sensíveis a influências perturbadoras de componentes do soro (lípidos, factores reumáticos e análogos). 5 Γ

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Na imunoconcentração imobilizam-se os antigenes ou os anticorpos em zonas definidas de uma membrana e faz-se passar através dela a amostra e os reagentes de identificação de uma forma activa (sob vácuo) ou passiva (por efeito capilar) (ICON® da firma Ybritech, patentes US N° 4.727.109 e 4.632.901). Comeste arranjo da fase sólida acelera-se a cinética da interacção antigene-anticorpo por um factor de 10, de modo que se podem dispensar os passos de incubação dispendiosos em tempo. A detecção efectua-se como na técnica "Sandwich-ELISA" com anticorpos secundários marcados com enzimas e a visualização subsequente da reacção enzimática. Trata-se neste caso de um processo em vários passos, que dá resultados num espaço de 5 a 10 minutos, que são comparáveis em sensibilidade e em especificidade com os resultados obtidos por ELISA.

Os novos desenvolvimentos têm também a ver com a utilização de partículas de látex como suporte do antigene e a sua imobilização subsequente sobre diversas membranas em vez do método de revestimento directo das membranas. 0 "Radial Partition Immunoassy" conjuga os princípios da técnica imunológica em fase sólida e da cromatografia radial. No RIPA (radial partition enzyme immunoassay) incubam-se a amostra e o conjugado marcado sobre uma matriz sólida (membrana), que contém o antigene ou o anticorpo imobilizado. Após um determinado tempo de incubação (poucos minutos) separam-se os reagentes num passo de lavagem por meio de cromatografia radial. A mancha central contém então maioritariamente o antigene, o anticorpo ligado e o conjugado ligado. O conjugado não ligado e os componentes do soro ou da amostra difundem-se a partir da zona central da membrana. A detecção efectua-se utilizando conjugados marcados com enzimas por adição posterior de substrato e visualização da reacção enzimática.

Processos de identificação mais recentes, baseados neste principio, utilizam como conjugado anticorpos secundários marcados com ouro, prescindindo contudo da adição de substrato. As vantagens desta tecnologia estão na facilidade e rapidez da execução. Contudo, uma separação indefinida ou insuficiente dos 6

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u ^ ligandos conduz sempre em tais sistemas a problemas de especificidade ou a um maior número de reacções secundárias quando se utilizam sistemas acoplados a enzimas. Além disso, quando se utiliza a cromatografia radial diminui também a sensibilidade, uma vez que principalmente no instante da impregnação da membrana (aquando da aplicação da amostra) os reagentes podem difundir a partir da zona reaccional por efeito capilar ainda antes de ocorrer a reacção imunológica. Em especial no caso de amostras com baixo teor em reagentes (por exemplo soros de baixa concentração) este efeito pode causar problemas.

Os processos de acordo com a invenção para a identificação de anticorpos e de antigenes distinguem-se por reunirem num só passo todos os reagentes necessários para a reacção e por através do passo subsequente simples de separação (por exemplo filtração através de uma membrana) , permitirem uma identificação de anticorpos ou de antigenes visível opticamente e de alta sensibilidade. 0 passo decisivo da invenção na identificação de anticorpos está na utilização de uma proteína reactiva Fc -conjugada com vários indicadores como ouro, pigmentos, FITC, partículas plásticas coloridas, etc., como por exemplo conjugado de proteína A - ouro, conjugado de proteína G - ouro, conjugado de anti-anticorpo - ouro, proteína A -fluorocromo, por exemplo conjugado de FITC, conjugado de proteína A+G - látex colorido, conjugado de látex colorido - factor complementar, etc. - para a detecção da ligação antigene - anticorpo sobre as partículas de látex que servem como suporte. A proteína A e a proteína G são por exemplo proteínas relativamente pequenas, que se ligam especificamente ao fragmento Fc de moléculas de IgG. 0 anticorpo, após a ligação à proteína A ou à proteína G também não é influenciado no que respeita à sua capacidade de ligação ao antigene, de modo que é possível uma incubação simultânea de ambos os reagentes em fase líquida. Além disso, utilizando por exemplo proteína A abrangem-se também anticorpos IgM específicos, o que em muitos casos leva a um muito considerável aumento da sensibilidade. 7

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Além disso, é de importância fundamental para o processo de identificação de anticorpos a incubação simultânea de reagentes detectores e da amostra a analisar, uma vez que nestes sistemas também se utilizam moléculas de IgG não especificas para a amplificação do sinal. Dado que a uma única partícula de ouro se encontram ligadas até 70 moléculas de proteína A ou de proteína G, estas podem ligar-se até 140 moléculas de IgG que por sua vez se podem ligar de novo a outras moléculas de proteína A ou G ligadas a partículas de ouro. Os complexos assim formados podem, mesmo quando apenas uma única molécula de IgG do complexo é um anticorpo específico, ligar-se especificamente às partículas de látex sobre as quais se encontra imobilizado o antigene, sendo em seguida retidos pela membrana. O sinal é assim amplificado várias vezes devido à acção dos anticorpos não específicos para o antigene.

Todas as reacções imunológicas (ligação antigene-anticorpo e detecção) de acordo com a invenção ocorrem simultaneamente e, muitas vezes, num intervalo de apenas 60 segundos. No passo de separação que se segue (filtração) efectua-se então depois a separação completa dos reagentes em excesso. As reacções não específicas eliminam-se num único passo de lavagem a seguir à filtração. Este resultado é imediatamente observável, isto é sem adição de substrato, e não necessita também da interrupção de qualquer reacção enzimática. Através dos passos reaccionais, em pequeno número e fáceis de executar, eliminam-se além disso fontes de erro durante a execução do teste. A utilização de partículas de látex como suporte do antigene em fase líquida possibilita uma aceleração óptima da cinética da reacção antigene-anticorpo, uma vez que devido à suspensão das partículas de látex se podem evitar limitações do processo condicionadas pela difusão. Esta reacção é ainda acelerada pela sedimentação das partículas de látex causada pela gravitação durante a incubação, de modo que não é necessário um movimento permanente (agitação) da mistura de teste. A execução do teste é extremamente simples e consiste simplesmente numa solução de amostra a analisar (por 8 Γ

exemplo uma diluição de soro), adição desta à mistura reaccional, transferência da mistura reaccional para o dispositivo de filtração e, antes ou depois de efectuada a filtração, adição de cinco gotas de solução de lavagem (para remover os reagentes em excesso). A solução de lavagem pode também ser adicionada logo imediatamente antes da filtração, de modo que o resultado seja obtido logo após a filtração. Não é necessária uma preparação dos reagentes. 0 tempo necessário para a identificação completa é, no máximo, de 3 minutos. A identificação é adequada tanto para a execução de testes individuais como também para determinações em série, uma vez que é facilmente possível uma automatização utilizando os processos ELISA correntes. Dado que a intensidade da reacção colorimétrica é proporcional ao teor em anticorpos da amostra numa larga gama, é também possível, utilizando "scanners Dot", uma determinação semi-quantitativa ou quantitativa. 0 processo de identificação de antigenes de acordo com a invenção possui a vantagem de se fazerem reagir num só passo todos os reagentes necessários e de, por meio da separação simples subsequente (por exemplo filtração através de uma membrana) permitir uma identificação de antigenes de alta sensibilidade facilmente visível a olho nu.

Uma característica deste processo para a identificação de antigenes consiste na utilização de uma proteína reactiva Fc, conjugada com vários indicadores como ouro, pigmentos, fluorocromos, partículas plásticas coradas etc., como por exemplo conjugado de proteína A - ouro, conjugado de proteína G - ouro, conjugado anti-anticorpo - ouro, proteína A -FITC, conjugado de proteína A+G - látex corado, factores complementares, etc., para a detecção da ligação antigene Fab ou F(ab)2 -fragmento sobre as partículas de látex. A proteína A e a proteína G são por exemplo proteínas relativamente pequenas que se ligam especificamente ao fragmento Fc de moléculas IgG. 0 anticorpo também não é influenciado, após a ligação à proteína A ou à proteína G, na sua capacidade de ligação a antigenes, de modo que é possível uma incubação simultânea de ambos os reagentes em fase líquida. 9

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Além disso, é de importância fundamental para o processo de identificação de antigenes a incubação simultânea de reagentes detectores e da amostra a analisar, dado que na invenção se utilizam também moléculas IgG não específicas para amplificação do sinal. Dado que a uma única partícula de ouro se encontram ligadas até 70 moléculas de proteína A ou de proteína G, estas podem ligar-se até 140 moléculas de IgG que por sua vez

se podem ligar de novo a outras moléculas de proteína A ou G ligadas a partículas de ouro. Os complexos assim formados podem, mesmo quando apenas um único anticorpo do complexo é um anticorpo específico, ligar-se especificamente às partículas de látex, sendo em seguida retidos pela membrana. O sinal é assim amplificado várias vezes devido à incorporação dos anticorpos não específicos para o antigene.

Todas as reacções imunológicas (ligação antigene-fragmento Fab ou F(ab)2 e detecção) de acordo com a invenção ocorrem simultaneamente e, muitas vezes, num intervalo de apenas 60 segundos. No passo de separação que se segue (filtração) efectua-se a separação completa dos reagentes em excesso. As reacções não específicas eliminam-se num único passo de lavagem a seguir à separação (filtração). Este resultado é imediatamente observável, isto é sem adição de substrato, e não necessita também da interrupção de qualquer reacção enzimática. Através dos passos reaccionais, em pequeno número e fáceis de executar, eliminam-se além disso fontes de erro durante a execução do processo de acordo com a invenção. A utilização de partículas de látex como suporte do fragmento Fab ou F(ab)2 em fase líquida possibilita uma aceleração óptima da cinética da reacção antigene-anticorpo, uma vez que devido à suspensão das partículas de látex se podem evitar limitações do processo condicionadas pela difusão. Esta reacção é ainda acelerada pela sedimentação das partículas de látex causada pela gravitação durante a incubação, de modo que não é necessário um movimento permanente (agitação) da mistura de teste. A execução do teste de identificação de antigenes é extremamente simples e consiste simplesmente numa solução de 10 p L-Zj ^-Ç* amostra a analisar (por exemplo uma diluição de soro), adição desta a um dos componentes do meio e adição subsequente do segundo componente, transferência da mistura reaccional para o dispositivo de filtração e, após efectuada a filtração, adição de cinco gotas de solução de lavagem (para remover os reagentes em excesso) . A solução de lavagem pode também ser adicionada antes da filtração. Não é necessária uma preparação dos reagentes. 0 tempo necessário para a identificação completa é, no máximo, de 3 minutos. 0 processo é adequado tanto para a execução de testes individuais como também para determinações em série, uma vez que é facilmente possível uma automatização utilizando os processos ELISA correntes.

Legendas das ilustrações anexas:

Fig. 1: representação do processo de acordo com a invenção para a identificação de anticorpos,

Fig. 2: representação do processo de acordo com a invenção para a identificação de antigenes,

Fig. 3: representação esquemática e exemplificativa da preparação de fragmentos Fab e F(ab)2· 0 processo de acordo com a invenção é adequado para todos os tipos de identificação em que ocorrem reacções antigene-anticorpo como parte essencial do sistema, como por exemplo todas as identificações serológicas de infecções causadas por virus ou bactérias em seres vivos (tanto humanos como animais) que induzam a formação de anticorpos específicos.

Em seguida apresentam-se exemplos para a preparação da mistura reaccional de acordo com a invenção e para o processo de acordo com a invenção para a identificação de anticorpos.

Exemplo 1: a) Revestem-se partículas de látex (poliestireno) , lavadas, uniformes, com um diâmetro médio de 1 fim, em tampão de revestimento alcalino, no qual se encontram dissolvidos 11 Γ

antigenes de membrana recombinantes (gp41-HIV-l) em concentrações entre 200 e 800 μg/ml bem como antigene de revestimento (p24-HIV-l) em concentrações entre 50 e 200 μg/ml, e lavam-se em seguida. Saturam-se as posições de ligação livres das proteínas com uma mistura de proteínas de suporte e detergentes. Em seguida lavam-se novamente as partículas revestidas e ressuspendem-se numa solução tampão fisiológica. Para a preparação da mistura reaccional pronta adiciona-se a esta suspensão conjugado de proteína A - ouro e/ou conjugado de proteína G - ouro (em ambos os casos partículas de ouro de 20 nm acopladas à proteína, A525 = 4, 0) na proporção de 16:1. Esta mistura reaccional constitui o componente de teste central e pode guardar-se em condições estáveis em qualquer quantidade de 2 a 8°C. b) Para a execução do teste dilui-se soro do paciente, conforme a aplicação, entre 1:10 e 1:50. Misturam-se 40 μΐ da diluição adequada com 160 μΐ de mistura reaccional e incuba-se durante 2 a 5 minutos. c) Em seguida transfere-se esta suspensão de b) para uma membrana de acetato de celulose ou de nylon, sob a qual se encontra uma almofada absorvente ou vácuo. A separação da fase líquida da fase sólida ocorre espontaneamente. d) Efectua-se uma lavagem posterior com 5 gotas de tampão detergente (ou adiciona-se uma solução de lavagem igual à mistura reaccional). Um círculo corado de vermelho mais ou menos intenso, conforme o teor em anticorpos específicos da amostra, mostra a positividade ao HIV-1 do soro. No caso de reacções negativas a membrana permanece branca.

Em todos os exemplos a seguir apresentados os passos essenciais do processo descrito no exemplo 1 permanecem iguais. Por esta razão, descrevem-se principalmente as alterações.

Exemplo 2: 12

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Como antigene utilizam-se os antigenes recombinantes gp 36 HIV-2 e p 2 6 HIV-2 para o revestimento das partículas de látex. Uma reacção corada mostra a positividade do soro ao HIV-2.

Exemplo 3:

Para o revestimento das partículas de látex utiliza-se uma mistura de antigenes recombinantes HIV-1 e HIV-2. Uma reacção corada mostra a positividade do soro ao HIV-1 ou ao HIV-2.

Exemplo 4:

Para o revestimento das partículas de látex utiliza-se antigene de membrana de entamoeba histolytica. Uma reacção corada mostra uma infecção com o bacilo da diarreia de amoeba.

Exemplo 5:

Para o revestimento do látex utiliza-se uma preparação de antigenes de vírus de herpes de vaca IBR/IPV. Como reagente detector utiliza-se exclusivamente proteína G - ouro. Para o teste emprega-se soro, plasma ou leite de vaca. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção por IBR/IPV na vaca analisada.

Exemplo 6:

Para o revestimento do látex utiliza-se uma preparação de antigenes de vírus de leucemia felina. Para a investigação utiliza-se soro ou plasma de gato. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção pelo FeLV no gato analisado.

Exemplo 7:

Para o revestimento do látex utiliza-se uma preparação de antigenes do vírus Parvo de porco. Para a investigação utílizam- 13

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se soro ou plasma de porco. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção por vírus Parvo no porco analisado.

Exemplo 8:

Para o revestimento do látex utiliza-se uma preparação de antigenes Salmonella polorum. Para a investigação utilizam-se soro ou plasma de galinha. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção por salmonelas na galinha analisada.

Exemplo 9:

Para o revestimento do látex utiliza-se uma preparação de antigenes de Salmonella typhii. Para a investigação utilizam-se soro ou plasma de galinha. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção por Salmonella typhii.

Exemplo 10:

Para o revestimento do látex utiliza-se antigene de vírus de hepatite B recombinante (HBV). Para a investigação utilizam-se soro ou plasma humanos. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção por HBV.

Exemplo 11:

Para o revestimento do látex utiliza-se uma preparação de antigenes de vírus Epstein Barr (EBV). Para a investigação utilizam-se soro ou plasma humanos. Uma reacção corada mostra a existência de uma infecção por EBV.

Exemplo 12:

Para o revestimento do látex utiliza-se antigene de membrana recombinante do vírus Maedi Visna (MW) . Para a investigação utilizam-se soro ou plasma de carneiro. Uma reacção corada 14

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L-Ci )=^*> mostra a existência de uma infecção por MW no carneiro analisado.

No processo e no sistema de teste para a identificação de antigenes imobilizam-se sobre as partículas de látex fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal (anticorpo 1) especifico para o antigene a detectar (ver Fig. 2). Adicionalmente, coloca-se na mistura reaccional um outro anticorpo monoclonal que se distingue do anticorpo imobilizado na sua especificidade epitópica.

Na identificação de antigenes todos os passos reaccionais ocorrem simultaneamente no espaço de, por exemplo, 60 segundos. A detecção efectua-se utilizando conjugados de proteína - ouro, proteína - látex corado ou proteína partículas coradas, reactivos a Fc (como por exemplo proteína A - ouro, proteína G - ouro, proteína A - látex corado). Quando se utilizam amostras de antigene contendo IgG (soro, plasma) empregam-se moléculas IgG não específicas para amplificação do sinal. Amostras de antigene não contendo ou contendo apenas pequenas quantidades de IgG (urina) podem também tirar partido do mecanismo de amplificação de acordo com a invenção pela adição de fragmentos Fc ou de IgG purificado à mistura reaccional.

Os fragmentos Fc, Fab ou F(ab)2 de imunoglobulinas podem obter-se por cisão de IgG com papaína (Fc e Fab) ou com pepsina (Fc e F(ab)2) seguida de separação cromatográfica dos fragmentos (Fig. 3).

Para a preparação da mistura reaccional deve ter-se em atenção que esta é constituída por dois componentes, dos quais um é misturado com a amostra imediatamente antes da utilização, sendo a mistura assim obtida misturada com o outro componente. Idealmente, um componente (componente I) consiste em partículas de látex revestidas com fragmentos Fab com o reagente detector (por exemplo proteína A - ouro) numa solução tampão fisiológica; o outro componente (componente II) é constituído pelo anticorpo monoclonal específico para o antigene e (se for caso disso) por moléculas IgG não específicas ou respectivos 15

t fragmentos Fc também numa solução tampão fisiológica. As moléculas IgG não especificas ou os respectivos fragmentos Fc só se empregam quando o processo para a identificação de antigenes se aplica a liquidos (amostras) não contendo IgG. A execução do teste (identificação) efectua-se então como se segue: A uma diluição da solução de antigene a determinar adiciona-se em primeiro lugar o componente II e aumenta-se imediatamente a seguir com o componente I. Os passos seguintes são a incubação, a separação (filtração) e o tratamento dos resultados.

Por meio de um ajuste adequado de cada um dos componentes do teste pode obter-se uma combinação cuja utilização constitua uma correlação (linear) entre a intensidade do sinal e o teor em antigenes de uma amostra. Utilizando sistemas de tratamento de dados adequados ("scanners" Dot) consegue-se ao mesmo tempo a determinação de amostras padrão de antigenes de concentração conhecida e uma determinação quantitativa de antigenes.

Em pormenor, para a identificação de antigenes utilizando o processo de acordo com a invenção, pode proceder-se por exemplo do seguinte modo: 1.) Preparação do componente I do sistema reaccional: A partir de anticorpos (anticorpo 1) monoclonais, específicos para o antigene a determinar, preparam-se fragmentos Fab por cisão com papaína ou fragmentos F(ab)2 por cisão com pepsina (Fig. 3). Com os fragmentos Fab ou F(ab)2 assim obtidos revestem-se suportes, por exemplo partículas de látex (de poliestireno) com um diâmetro de 1 μπχ.

Além disso, prepara-se um conjugado de proteína reactiva Fc (proteína A) e de um indicador (por exemplo partículas de ouro, FITC ou látex corado) (por exemplo conjugado de proteína A - ouro, proteína G - ouro, proteína A - látex corado). 0 suporte revestido e o conjugado colocam-se numa solução tampão, em especial numa solução tampão fisiológica, e 16 u

V t Γ conserva-se armazenado o componente I assim preparado para a determinação. 2.) Preparação do componente II do sistema reaccional:

Colocam-se também numa solução tampão fisiológica anticorpos monoclonais (anticorpo 2) específicos para o antigene a detectar e moléculas IgG (anticorpos) não especificas para o antigene a detectar, ou os respectivos fragmentos Fc.

Introduzem-se no componente II moléculas IgG não especificas ou os respectivos fragmentos Fc quando se investiga uma amostra pobre em IgG ou isenta de IgG (por exemplo urina) , mas não se introduzem quando se investiga uma amostra de antigene contendo IgG (soro, plasma). 17 Γ L· t 3.) Execução do processo de identificação:

Imediatamente antes da identificação mistura-se ao componente II a solução de antigenes diluída com uma solução tampão, em especial com uma solução tampão fisiológica (amostra que contém sempre o antigene a identificar). Utiliza-se um componente II com moléculas IgG (anticorpos) não especificas ou os respectivos fragmentos Fc quando na amostra contendo o antigene ou os antigenes (por exemplo urina) não se encontram ou se encontra contida uma pequena quantidade de moléculas IgG.

Quando uma amostra contendo IgG (por exemplo plasma, soro) é submetida ao processo de identificação dilui-se esta com solução tampão (solução tampão fisiológica), mistura-se a solução de antigenes a determinar num componente II à qual não se adicionaram moléculas IgG (anticorpos) não específicas ou os respectivos fragmentos Fc. À mistura assim obtida adiciona-se o componente I. A mistura reaccional assim obtida incuba-se durante 2 a 5 minutos, ou durante 30 a 120 segundos, em especial durante 2 minutos ou 60 segundos, a uma temperatura de 19 a 30°C. Na reacção formam-se complexos do conjugado e dos anticorpos (anticorpo 2 ou molécula IgG) contidos no componente II ou na amostra contendo os anticorpos. Os complexos reagem com o antigene através do anticorpo 2 neles contido específico em relação ao antigene a identificar. O antigene a identificar liga-se por sua vez aos fragmentos Fab ou F(ab)2 (do anticorpo 1) com os quais se encontra revestido o suporte. Formam-se assim agregados de suporte, antigene a determinar e complexos de conjugado e anticorpos 2.

Após a incubação filtra-se através de uma membrana (por exemplo uma membrana de nylon ou uma membrana de acetato de celulose), passando pela membrana os complexos sem antigenes agregados e os complexos com antigenes agregados não a identificar, enquanto que ficam retidos na membrana os agregados acima descritos contendo os antigenes a identificar. 18 A seguir ao passo de filtração lava-se com uma solução tampão de detergente, ou adiciona-se imediatamente a solução de lavagem à mistura reaccional. 0 sinal formado a partir dos agregados retidos sobre a membrana (coloração, vermelha quando se utilizam partículas de ouro como indicador) serve como sinal para a presença de um antigene a identificar, isto é, de um para o qual o fragmento Fab ou F(ab)2 imobilizado sobre o suporte é específico.

Por meio de combinações seleccionadas do componente I e do componente II consegue-se uma correlação entre a intensidade do sinal e o teor em antigenes da amostra. É assim possível uma determinação quantitativa dos antigenes por meio de sistemas de tratamento de dados ("scanners" Dot) e da determinação simultânea de amostras de antigenes de concentração conhecida.

Exemplos de processos de identificação de antigenes:

Exemplo 13:

Determinação de hCG em urina ou soro utilizando dois anticorpos monoclonais anti-hCG para a verificação da gravidez ou para o diagnóstico tumoral.

Exemplo 14:

Determinação de antigenes p24 de HIV-1 utilizando dois anticorpos monoclonais anti-p24 para a identificação de antigenes de HIV.

Exemplo 15:

Determinação de antigenes de hepatite B no soro ou no plasma utilizando dois anticorpos monoclonais anti-hepatite B.

Exemplo 16:

Determinação de PMSG utilizando dois anticorpos monoclonais anti-PMSG para a determinação da gestação de burras.

Exemplo 17: Γ

Determinação de micotoxinas (aflatoxina, zearalenonas, ·..) em alimentos ou rações utilizando em cada caso dois anticorpos v monoclonais específicos.

Exemplo 18:

Determinação de diversos marcadores tumorais (por exemplo a-fetopropteína) utilizando dois anticorpos monoclonais específicos.

Em resumo, a invenção pode apresentar-se por exemplo como se segue:

Para a identificação de um anticorpo contido numa amostra coloca-se a amostra numa mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas no qual se encontra imobilizado um antigene específico para o anticorpo a identificar, como por exemplo antigenes de vírus nativos ou recombinantes, antigenes de bactérias nativos ou recombinantes, antigenes de fungos nativos ou recombinantes ou outros antigenes nativos ou recombinantes específicos de células, e um conjugado de pelo menos uma proteína reactiva ao fragmento Fc de anticorpos e de um indicador a ela ligado. Procede-se em seguida à incubação para formar complexos do conjugado e dos anticorpos e ligar ao mesmo tempo estes complexos ao suporte. Em seguida separam-se o suporte e os agregados de suporte e de pelo menos um complexo que contém o anticorpo a identificar da mistura reaccional líquida e dos complexos que contêm exclusivamente anticorpos não a identificar, e verifica-se, sem reacção imunológica adicional, a presença de complexos de conjugado e do anticorpo a identificar ligados ao suporte.

Um antigene contido numa amostra pode identificar-se por ligação do antigene a identificar a um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal específico para o antigene a identificar. Para tal incuba-se a amostra numa mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas, no qual se encontra imobilizado um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal específico para o antigene a identificar, e um conjugado constituído por pelo menos uma proteína reactiva ao 20 fragmento Fc de anticorpos e por um indicador a ela ligado, bem como pelo menos um anticorpo monoclonal específico para o antigene a identificar. Formam-se assim agregados do suporte em forma de partículas, do antigene a identificar e de complexos constituídos pelo conjugado e pelos anticorpos. Filtra-se a mistura reaccional e verifica-se sobre o filtro a presença (reacção corada) de agregados contendo o antigene a identificar.

Um meio para a identificação de um antigene contido numa amostra, adequado para aplicação na execução do processo, é constituído por um componente I e um componente II. 0 componente I contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo específico para o antigene a identificar, e um conjugado constituído por pelo menos um fragmento Fc de uma proteína reactiva aos anticorpos e por um indicador. 0 componente II contém anticorpos monoclonais específicos para o antigene a identificar e, conforme o caso, moléculas IgG ou os respectivos fragmentos Fc não específicos para o antigene a identificar.

Lisboa, 06 de Abril de 2000

0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

Γ

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a identificação de um anticorpo contido numa amostra por ligação do anticorpo a identificar a um antigene especifico para o anticorpo a identificar, caracterizado por se colocar e incubar a amostra numa mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas, no qual se encontra imobilizado o antigene específico para o anticorpo a identificar, e um conjugado de pelo menos um fragmento Fc de proteína reactiva ao anticorpo e um indicador a ele ligado, de modo a formar complexos do conjugado e dos anticorpos e a ligar estes complexos ao suporte, por se proceder em seguida à separação do suporte e se verificar a existência de complexos do conjugado e do anticorpo a identificar ligados ao suporte.
2. Processo para a identificação de um antigene contido numa amostra por ligação do antigene a identificar a um fragmento Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal específico para o antigene a identificar, caracterizado por se incubar a amostra numa mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas, no qual se encontram imobilizados fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal específico para o antigene a identificar, e um conjugado constituído por pelo menos um fragmento Fc de uma proteína reactiva aos anticorpos e por um indicador a ela ligado, bem como pelo menos um anticorpo monoclonal específico para antigene a identificar, que se distingue do anticorpo imobilizado na sua epitopoespecificidade, de modo a formar agregados do suporte em forma de partículas, do antigene a identificar e de complexos do conjugado e dos anticorpos, e se verificar a presença de agregados que contêm o antigene a identificar. 1 u V Γ
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se utilizar como suporte partículas de látex, em especial de poliestireno.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se utilizarem partículas de látex com um diâmetro médio de 1 μιη.
5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se utilizar como indicador ouro, pigmentos, FITC, partículas plásticas coradas.
6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém como conjugado, conjugado de proteína A - ouro, conjugado de proteína G - ouro, conjugado de anti-anticorpo - ouro, conjugado de proteína reactiva a Fc - fluorocromo ou conjugado de proteína A+G - látex corado.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional constituída por conjugado de proteína A - ouro e/ou conjugado de proteína G - ouro, e por as partículas de ouro apresentarem um diâmetro médio de 20 nm.
8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém os parceiros reaccionais numa solução tampão, em especial numa solução tampão fisiológica.
9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por se separar o suporte por filtração.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se separar o suporte por filtração utilizando uma membrana, em especial uma membrana de acetato de celulose. 2 f u t
11. Processo de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado por se promover a filtração por aplicação de vácuo ou por colocação de uma almofada absorvente sob o filtro, em especial sob a membrana.
12. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por, após a adição da amostra à mistura reaccional, se incubar durante 2 a 5 minutos, de preferência durante 2 minutos, a uma temperatura de 19 a 30°C.
13. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por se lavar o suporte separado, adicionando o liquido de lavagem à mistura reaccional de preferência logo antes ou durante a separação do suporte.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se efectuar a lavagem com a ajuda de uma solução tampão detergente.
15. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar um suporte no qual se encontra imobilizado um antigene de virus nativo ou recombinante.
16. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar um suporte no qual se encontra imobilizado um antigene de bactéria nativo ou recombinante.
17. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar um suporte no qual se encontra imobilizado um antigene de fungo nativo ou recombinante.
18. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar um suporte no qual se encontra imobilizado um antigene especifico de uma célula nativo ou recombinante. 3 V

L-Cj ^^
19. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar um suporte no qual se encontra imobilizado um antigene recombinante especifico de uma célula.
20. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com antigene de membrana recombinante (gp41-HIV-l) e com antigene de revestimento recombinante (p24-HIV-l).
21. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com antigene recombinante gp 36 HIV-2 e p 26 HIV-2.
22. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma mistura de antigenes recombinantes de HIV-1 e HIV-2.
23. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com antigenes de membrana de Entamoeba histolytica.
24. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma preparação de antigenes de vírus de herpes de vaca IBR/IPV, e que contém como conjugado, conjugado de proteína G - ouro. 4 V
25. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma preparação de antigenes do vírus de leucemia felina.
Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma preparação de antigenes do vírus Parvo de porcos.
27. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma preparação de antigenes de Salmonella pulorum.
28. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma preparação de antigenes de Salmonella typhii.
29. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com antigene de vírus de hepatite B recombinante (HBV).
30. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com uma preparação de antigenes do vírus Epstein Barr (EBV). 5 Γ L-Cj t
31. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com antigenes recombinantes de Borrelia Burgdorfrei SSP.
32. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado por se utilizar uma mistura reaccional que contém um suporte em forma de partículas que se encontra revestido com um antigene de membrana recombinante do vírus Maedi Visna (MW) .
33. Mistura reaccional para a identificação de um anticorpo contido numa amostra, em especial para aplicação na execução do processo de acordo com as reivindicações 1 e 3 a 32, caracterizada por a mistura reaccional conter num meio líquido, em especial numa solução tampão, um suporte em forma de partículas no qual se encontra imobilizado um antigene específico para o anticorpo a identificar, e um conjugado de pelo menos uma proteína reactiva ao fragmento Fc de anticorpos e de um indicador.
34. Mistura reaccional de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por o suporte ser constituído por partículas de látex.
35. Mistura reaccional de acordo com a reivindicação 34, caracterizada por as partículas de látex serem de poliestireno.
36. Mistura reaccional de acordo com a reivindicação 35, caracterizada por as partículas de látex possuírem um diâmetro médio de 1 μη.
37. Mistura reaccional de acordo com uma das reivindicações 33 a 36, caracterizada por o indicador ser ouro, pigmento, FITC ou partículas plásticas coloridas. 6 Γ u
38. Mistura reaccional de acordo com uma das reivindicações 33 a 37, caracterizada- por a mistura reaccional conter como conjugado, conjugado de proteína A - ouro, conjugado de proteína G - ouro, conjugado de anti-anticorpo - ouro, conjugado de proteína A - fluorocromo ou conjugado de proteína A+G - látex colorido.
39. Mistura reaccional de acordo com uma das reivindicações 33 a 38, caracterizada por a mistura reaccional conter o conjugado e o suporte em forma de partículas numa solução tampão fisiológica como meio líquido.
40. Mistura reaccional de acordo com uma das reivindicações 33 a 39, caracterizada por o suporte em forma de partículas se encontrar revestido com pelo menos um dos antigenes a seguir mencionados: antigene de vírus nativo ou recombinante, antigene de bactéria nativo ou recombinante, antigene de fungo nativo ou recombinante, antigene específico de células nativo ou recombinante.
41. Mistura reaccional de acordo com uma das reivindicações 33 a 40, caracterizada por o suporte em forma de partículas se encontrar revestido com pelo menos um dos antigenes a seguir mencionados: antigene de membrana recombinante (gp41-HIV-l), antigene de revestimento recombinante (p24 HIV-1), antigene recombinante gp 36 HIV-2 e p 26 HIV-2, mistura de antigenes recombinantes de HIV-1 e HIV-2, antigene de membrana de Entamoeba histolytica, preparação de antigenes de vírus de herpes de vaca IBR/IPV, preparação de antigenes de vírus de leucemia felina, preparação de antigenes de vírus Parvo, preparação de antigenes de Salmonella pulorum, preparação de antigenes de Salmonella typhii, antigene recombinante de vírus de hepatite B, 7 r antigene recombinante de Borrelia Burgdorferi SSP, preparação de antigenes de vírus de Espstein Barr (EBV) ou antigene de membrana de vírus de Maedi Visna (MW) .
42. Mistura reaccional de acordo com uma das reivindicações 33 a 41, caracterizada por a mistura reaccional conter como conjugado, conjugado de proteína A -ouro e/ou conjugado de proteína G - ouro, apresentando as partículas de ouro um diâmetro médio de 20 nm.
43. Processo para a preparação de uma mistura reaccional, de acordo com uma das reivindicações 33 a 42, caracterizado por se revestirem as partículas de suporte, em especial partículas de látex, de preferência de poliestireno, com um diâmetro médio preferencial de 1 μιη, num tampão de revestimento, de preferência alcalino, com pelo menos um antigene, se suspenderem as partículas de suporte revestidas numa solução tampão, em especial numa solução tampão fisiológica, numa quantidade de 1% em relação à solução tampão, e se misturar à suspensão assim obtida pelo menos um conjugado de pelo menos uma proteína reactiva ao fragmento Fc de anticorpos acoplado a um indicador.
44. Processo de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por se saturarem as posições de ligação livres de proteínas do material de suporte com uma mistura de proteínas de suporte e detergentes.
45. Processo de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado por se misturar uma parte de conjugado a cada dezasseis partes da suspensão que contém as partículas de suporte revestidas.
46. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 14, caracterizado por se formar a mistura reaccional a partir de dois componentes, em que o componente I contém o suporte revestido e o conjugado e o componente II contém anticorpos monoclonais específicos para o antigene, se adicionar a 8 t V

u amostra de antigene ao componente II, e se adicionar o componente I à mistura assim obtida.
47. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 14 e 46, caracterizado por, na análise de uma amostra que não contenha ou contenha apenas uma pequena quantidade de moléculas IgG, como por exemplo urina, se utilizar um componente II que contém, para além dos anticorpos monoclonais específicos do antigene, moléculas IgG não específicas ou os respectivos fragmentos Fc.
48. Processo de acordo com as reivindicações 46 ou 47, caracterizado por se utilizarem os componentes I e II na forma de soluções num tampão, em especial num tampão fisiológico.
49. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 14 e 46 a 48, caracterizado por, para a identificação de hCG na urina ou no soro, se utilizar um suporte em forma de partículas revestido com fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-hCG.
50. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 14 e 46 a 48, caracterizado por, para a identificação do antigene p24 do HIV-1, se utilizar um suporte revestido com fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-p24.
51. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 14 e 46 a 48, caracterizado por, para a identificação do antigene da hepatite B no soro ou no plasma, se utilizar um suporte revestido com fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-hepatite B.
52. Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 14 e 46 a 48, caracterizado por, para a identificação de PMSG, se utilizar um suporte revestido com fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo monoclonal anti-PMSG. 9 V

I—^ ...
53. Meio para a identificação de um antigene contido numa amostra, em especial para aplicação na execução do processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 4 e 46 a 52, caracterizado por o meio ser constituído por um componente I e um componente II, por o componente I conter um suporte em forma de partículas revestido com fragmentos Fab ou F(ab)2 de um anticorpo específico para o antigene a identificar, e um conjugado constituído por pelo menos uma proteína reactiva ao fragmento Fc de anticorpos e um indicador, e por o componente II conter anticorpos monoclonais específicos para o antigene a determinar, que se distinguem na sua epitopoespecificidade do anticorpo imobilizado e, conforme o caso, moléculas IgG não específicas para o antigene a identificar ou os respectivos fragmentos Fc.
54. Meio de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por o suporte ser constituído por partículas de látex, em especial de poliestireno.
55. Meio de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por as partículas de látex possuírem um diâmetro médio de 1 μιη.
56. Meio de acordo com uma das reivindicações 53 a 55, caracterizado por o indicador ser ouro, pigmento, FITC ou partículas plásticas coradas.
57. Meio de acordo com uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado por o indicador serem partículas de ouro com um diâmetro médio de 20 nm.
58. Meio de acordo com uma das reivindicações 53 a 57, caracterizado por o componente I conter como conjugado, conter como conjugado, conjugado de proteína A - ouro, conjugado de proteína G - ouro, conjugado de anti-anticorpo - ouro, conjugado de proteína A - fluorocromo ou conjugado de proteína A+G - látex colorido. 10
59. Meio de acordo com uma das reivindicações 53 a 58, caracterizado por os componentes I e II serem soluções num tampão, em especial num tampão fisiológico.
60. Meio de acordo com uma das reivindicações 53 a 59, caracterizado por o suporte em forma de partículas estar revestido com pelo menos um fragmento Fab ou F(ab)2 dos anticorpos a seguir mencionados: anticorpos monoclonais específicos de antigenes virais, anticorpos monoclonais específicos de antigenes bacterianos, anticorpos monoclonais específicos de antigenes celulares e extracelulares, anticorpos monoclonais anti-hCG, anticorpos monoclonais anti-p24, anticorpos anti-hepatite B, anticorpos monoclonais anti-PMSG, anticorpos monoclonais específicos de micotoxinas, anticorpos monoclonais específicos de marcadores tumorais, anticorpos monoclonais específicos de hormonas humanas ou animais. Lisboa, 06 de Abril de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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