JPS6316266A - 自己抗体測定用試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、自己免疫疾患診断のための自己抗体測定試薬
に関する。

自己免疫疾患は多彩な症状を呈する難治性の疾患として
知られておシ、その病因は未解明の部分が多い疾患であ
るが、臨床的には正常な自己の体成分と反応する抗体の
存在を検出することによって診断されている。したがっ
て自己免疫疾Ｎ診断のためＫはこの自己抗体の測定が極
めて重要である。

（従来の技術） このような自己免疫疾患としては慢性関節リクマ−？、
全音性エリテマトーデス（Ｓ　ＬＥ　）、シエーグレン
症候群、橋本病、パセドク病、混合性結合組織病（ＭＣ
ＴＤ）などが挙げられるが、これらの疾患で出現する自
己抗体としてはリフマチ因子、抗ＤＮＡ抗体、抗ＥＮＡ
抗体、杭抜タンパク抗体、抗サイログロブリン抗体など
が知られている。

従来、これらの自己抗体測定法としては螢光抗体法、ラ
テックス凝集反応、感作血球凝集反応、ラジオイムノア
ッセイ法、エンデイムイムノアッセイ法（Ｅ　ＩＡ法）
々どが知られており、これらの測定に用いる試薬として
は、たとえば牛血清アルブミン、ツイーン２０などを含
有する緩衝液が一般に用いられている。

これらの測定試薬では測定における妨害反応を除去する
ために種々の工夫が試みられている。−例を挙げると、
螢光抗体法、ＥＩＡ決では、自己抗体が反応する相手の
抗原を適当な支持体に結合させておき、被検血清を反応
させて、該血清中（存在する自己抗体を前記支持体に結
合させた後、螢光色素あるいは酵素を標識した抗と）ｒ
−グロブリンを反応させることにより自己抗体を検出す
る方法である。被検血清中の自己抗体あるいは標識ｒ−
グロブリンが前記支持体に対して非特異的に結合するの
を抑えるために、通常、前記のようにして抗ぶを結合さ
せた支持体をマスキング処理する方法が採られている。

このマスキング処理は、一般的には牛血清アルブミン、
ゼラチンなどを含む緩衝液に浸漬して一定時間、一定温
度で処理した後洗浄すること忙より行なわれる。

しかしながら、前記のようなマスキング処理をもってし
ても、時として不明の原因で非特異反応を呈する場合の
あることが知られている。具体的には、前記抗原を結合
させた支持体に自己抗体が陰性である被検血清を反応さ
せた場合、通常反応結果は陰性でなければならな、いが
、陽性を示すことがある。この原因は現在のところ不明
ではあるが一種の非特異反応と考えられる。また、この
現象は前記抗ぶを結合させた支持体を長期間保存した場
合にその出現頭皮が高くなることを本発明者らは経験し
ている。臨床検査用試薬としては当然のことながら、試
薬は長期間保存されねばならず、その目的のためには前
記の間■点の解決は極めて重要である。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、上記のような事実Ｋｌｉみ、非特異反応
を防止し、試薬を長期間保存しても、その反応性能に文
化のない試薬組成を検索し、カゼイン加水分解物を添加
することにより、上記目的が達成されることを見出し、
本発明を完成した。

（問題点を解決するための手段） すなわち本発明はカゼイン加水分解物を含有してなるこ
とを特徴とする自己抗体測定用試薬組成物である。

自己抗体測定用試薬組成物は、具体的には（１）対照標
準血清、（１）標識したにγ−グロブリン又は抗体感作
ラテックス粒子あるいは赤血球、０１Ｄ免疫反応用緩衝
液およびｌｖ）抗原を結合させた支持体を主体とするも
の、あるいは（１）対照標準血清、（１）抗原を感作し
たラテックス粒子あるｈは赤血球、（至）免疫反応用緩
衝液ダを主体とするものであって、カゼイン加水分解物
を添加する試薬としては、被検血清の希釈液１．洗浄液
１．爆織抗ヒ）ｒ−グロブリンの希釈液、抗原を結合ぎ
せた支持体のマスキング処理液などが挙げられる。特に
被、血清の希釈液又は抗原を結合させた支持体のマスキ
ング処理液に添加するのか有効である。

カゼイン加水分解物は、市販のカゼインまたは脱脂粉乳
などより取り出したミルクカゼインを塩酸加水分解して
得られる。たとえばカゼインに３〜５倍量の３０％塩酸
を加え、８０〜１００℃にて４０時間前後分解し、残渣
をＦ去して減圧濃縮により塩酸を除き、固形物を乾燥し
て磨砕すると得られる。カゼイン加水分解物の添加量は
０．０１から１０重量パーセント、好ましくは０．１か
ら２重量パーセントが好適である。また、カゼイン加水
分解物と共に、牛血清アルブミンなどの血清タンパク質
、ツイーン２０などの界面活性剤を添加してもよい。

特忙ツイーン２０との併用は前記非特異反応の防止に極
めて効果がある。また、カゼイン加水分解物を添加した
試薬は適当な防腐剤、たとえば窒化ナトリクムを０．０
０１から０．２パーセント添加しておけば長期間安定で
ある。

次に（１）対照標準血清、（１）酵素標識した抗ヒトイ
ムノグロブリン試薬又は抗ヒトイムノグロブリンを結合
させた赤血球試薬、（ＩＩ＋）免疫反応用緩衝液および
ｂ）抗原を結合させた支持体を主体とする自己抗体測定
用試薬組成物の場合について詳述する。

本発明では膠原病などの自己免疫疾患者く出現する自己
抗体が特異的に反応する抗原を用いる。

これらの抗ぶは極めて不安定であり、再現性の高い自己
抗体の測定には、安定化された固相抗原が必要とされて
いる。これらの抗原の具体的な例としては、ＥＮＡ抗原
、Ｓｍ抗厚、２木欽ＤＮＡ１１木欽ＤＮＡ　１クリシデ
イアルシリエのキネドブラストなどが挙げられ、これら
の抗原の安定化された固相試薬は抗ＥＮＡ抗体、抗ＤＮ
Ａ抗体などの自己抗体の測定に有用である。

以下の説明では、自己抗体に特異的に反応し得る抗原を
単に抗原と記す。

まず抗原を結合させる不溶性支持体としては、ポリスチ
レンチューブ、ポリスチレン球、シリコーン片、マイク
ロプレートなどが挙げられるが、本発明では特にマイク
ロプレートが好適である。

マイクロプレートをではポリスチレン製マイクロプレー
ト、ポリ塩化ビニール製マイクロプレートなどが挙げら
れる。

これらの不溶性支持体に抗原を結合させるＫは次のよう
にして実施する。まず、抗原を適当な溶媒、たとえば生
食水、リン酸緩衝液に５〜ｉ、　ｏ　ｏ　。

Ｊｌｆ／ｌｎｌ、好ましくは２０〜２００　ｔｔＰ／ｌ
ｎｌ　となるように溶解し、不溶性支持体と共に浸漬す
る。この時、不溶性支持体はポリーＬ−リジン、メチル
化牛血清アルブミンなどで前処理されていてもよい。こ
れらの前処理は、たとえば２木鎮ＤＮＡ抗原などでは該
抗原が結合し易くなる念め有用である。抗原を不溶性支
持体と共に浸漬する時間は、１時間から２０時間、好ま
しくは３時間から１６時間である。

時間が短かくても抗ぶが十分結合しないし、長過ぎても
かえって抗原が劣化する。このようにして浸漬した後、
抗原の溶液を除去し、生食水などで洗浄してＩｌψ抗原
結合不溶性支持体が得られる。

本発明では抗原を不溶性支持体と共に浸漬する際に、カ
ゼイン加水分解物を添加しても良いが、浸漬後抗原を除
去し洗浄した後をで実施する方が好適である。

また、本発明ではカゼイン加水分解物のほかに糖類、キ
レート剤、卵白アルブミン、ゼラチンおよびフィコール
からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物を
含む水溶液と牛血清アルブミンとの混合溶液にて前記不
溶性支持体を処理してもよい。

カゼイン加水分解物を含む水溶液にて前記不溶性支持体
を処理するＫＨｌこれらの水溶液の適当量を前記不溶性
支持体ＫＯ℃〜２５℃、好ましくは２℃〜８℃にて、欺
１０分〜−夜、好ましくは３０分〜１時間浸漬すること
（よシ達成される。このようＫして浸漬後、前記水溶液
を除去し、生食水などで洗浄する。得られた固相試薬は
、このままでも良いが、真空乾燥、凍結乾燥などにより
乾燥する方が好適である。このようＫして得られた固相
試薬は低温で保存すれば６ケ月から１年間は保存可能で
ある。

さら忙、このようＫして得られた固相試薬と酵素標識し
た抗ヒトイムノグロブリン試薬もしくは抗ヒトイムノグ
ロブリンを結合させた赤血球試薬と適当な緩衝液試薬を
セットすることによシ、膠原病などの自己免疫疾患に出
現する種々の自己抗体を測定するための試薬組成物が提
供される。このような試薬組成物は、測定を随時実施で
き、極めて簡便な自己抗体の測定を可能にする。

以下、酵素標識した抗ヒトイムノグログリンおよび抗ヒ
トイムノグロブリンを結合させた赤血球試薬の製造方法
およびそれらを用いた自己抗体の測定法について説明す
る。

まず、酵素標識した抗ヒトイムノグロブリンは公知方法
により容易に製造されるが市販品を用いても良い。ここ
で用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ７
オス７アターゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられ
る。これらの酵素に抗ヒトイムノグロブリンを標識する
にはたとえば酵素の糖類を過ヨウ素酸で酸化してアルデ
ヒド基を露出させ、抗ヒトイムノグロブリンのアミノ基
と結合させることにより容易に製造できる。ここで抗ヒ
トイムノグロブリンとしては、抗ヒトイムノグロブリン
Ｇ１抗ヒトイムノグロブリンＭ１抗ヒトイムノグロブリ
ンＡなどが挙げられる。

次に、抗ヒトイムノグロブリンを赤血球に結合させるに
は、ヒツジ、ニワトリ々どの赤血球をホルマリン固定し
、タンニン酸処理後洗浄し、抗ヒトイムノグロブリンを
加丸て室温で数時間接触させるこ七により実施される。

ζうして得られた抗ヒトイムノグロブリン感作赤血球は
適当な緩衝液に浮遊させて用いるが、必要ならば凍結乾
燥しても良い。

得られた酵素標識した抗ヒトイムノグロブリン試薬もし
くは抗ヒトイムノグロブリン感作赤血球を用いて自己抗
体を測定するには次のようにして行う。

まず、前記の抗ぶを結合させた固相試薬に、ＳＬＥ。

リフマチなどの膠原病患者の血清（カゼイン加水分解物
を含な希釈液（て希釈）を反応させ、血清中の自己抗体
を結合させる。しかる後、酵素標識した抗ヒトイムノグ
ロブリンもしくは抗ヒトイムノグロブリン感作赤血球を
反応させると、前記固相試薬上には、自己抗体の示（応
じて酵素標識抗ヒトイムノグロブリンもしくは抗ヒトイ
ムノグロブリン感作赤血球が結合する。これらの結合し
た酵素量もしくは赤血球量を、前者では酵素の基質を加
えて反応さす、生成した生成物の量を分光光度計（よシ
、後者では、肉眼くよシ測定もしくは判定することに↓
シ、患者血清中の自己抗体量を間接的に測定することが
できる。

カゼイン加水分解物を含有してなる試薬は上記した被血
清の希釈液、抗原を結合させた支持体のマスキング処理
液のほかに１洗浄液、標識抗ヒトｒ−グロブリンの希釈
液として使用してもよい。

（発明の効果） 本発明ではカゼイン加水分解物を含有してなる試薬を被
血清の希釈液、抗原を結合させた支持体のマスキング処
理液、洗浄液又は標識抗ヒ）ｒ−グロブリンの希釈液と
して使用すること（より、自己抗体測定における免疫反
応の非特異反応を防止し、試薬を長期呆存してもその反
応性能に変化のない試薬組成物を得ることができる。

（実施例） 次に実施例を用いて本発明を説明するが、もとよシ零発
男はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ （ＥＩＡ決によるＩＰＧクラスリクマチ因子測定試薬）
牛血清アルブミン０．５％、ツイーン２０１％、窒化ナ
トリクム０．１９６を含む０．０５Ｍリン酸緩衝緩衝水
（ｐＨ７，２）に々ゼイン加水分解物を１％になるよう
に溶解し、被検血清の希釈液を調製した。従来法による
対照としては、上記組成の内力ゼイン加水分解物を含ま
ない液を用いる。

ｌユ 加熱変肩りサギＩ％を抗ぶとして結合させたマイクロプ
レートに１　ＩＰＧククスリクマチ因子陰性の被検血清
を前記本発明方法および従来法による希釈液にてそれぞ
れ１００倍に希釈し、１００μＩ　宛添加し、室温で１
時間反応させ洗浄し−た。次に、ペルオキシダーゼ見識
抗ヒト１ｙＧ　（Ｃａｐｐｅ１社ｍりを１００μＩ宛添
加し、室温で１時間反応させ洗浄した。さらにＯ−フェ
ニレンジアミン０．３％、過酸化水素０．０２％からな
る基質液を１００μｅ８添加し、室温で３０分度応させ
た後、２Ｎ硫酸１００μ！陰性血清２０例の測定結果を
第１表に示した。第１表に示すように、従来法では、２
０例の内３例陽性と判定されたが、本発明方法では２０
例すべて陰性であった。

第１表 実施例２ 加熱変性クサイＩｆＰＧを抗原として結合させたマイク
ロプレートを４℃で３ケ月保存して用めた以外は実施例
１と同様に陰性血清２０例を測定した。

測定結果は第２表に示した。第２表に示すように、従来
法では２０例の内隅性を示す検体が７例と増加している
のに対して本発明方法ではすべて陰性であった。

第２表 実施例３ （受身混合凝集反応法によるＩｙＧクラスリクマチ因子
の測定）加熱変性ウサギＩｙＧを抗原として結合させた
マイクロプレーＨζ、実施例１と同様に調製した本発明
方法および従来法による希釈液を用いて１００倍に希釈
した被検血清を１００μσ宛添加し、室温で２時間反応
させ、ンイーン２００．０５％を含む生食水で況浄した
。次に抗ヒ）ＩｙＧｆｆｉ作赤血球（バイオチック株式
会社製）浮遊液を５０μＩＮＫ加し、室温で５時間反応
させた後肉眼で判定した。判定方法は赤血球が沈降して
赤い点く見える場合を陰性、赤血球が沈降せず、赤い輪
の拡がシとして見える場合を陽性とした。被検血清とし
て陰性血清２０例を用いて実施した結果を第３表に示し
た。

＄３表に示すように、従来法では２例に陽性が認められ
たのに対して本発明方法ではすべて陰性であった。

４！１３表 実施例４ 加熱変性ウサギＩｙＧを抗原として結合させたマイクロ
プレートを４℃で３ケ月保存して用いた以外は実施例３
と同様に行った。判定結果は、従来法では陽性例が３例
と実施例３に比して増加したのに対し、本発明方法では
すべて陰性であった。

上記実施例に示されるように、カゼイン加水分解物を含
む試薬を被血清の希釈液として用いるこ七によシ、非特
異反応が除去され、試薬を長期間保存しても、再現性の
良い自己抗体測定が可能となった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）カゼイン加水分解物を含有してなることを特徴と
   する自己抗体測定用試薬組成物。
2. （２）（ｉ）対照標準血清、（ｉｉ）標識したにγ−グ
   ロブリン又は抗体感作ラテックス粒子あるいは赤血球（
   ｉｉｉ）免疫反応用緩衝液および（ｉｖ）抗原を結合さ
   せた支持体を主体とすることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の自己抗体測定用試薬組成物。
3. （３）（ｉ）対照標準血清、（ｉｉ）抗原を感作したラ
   テックス粒子あるいは赤血球、（ｉｉｉ）免疫反応用緩
   衝液を主体とすることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の自己抗原測定用試薬組成物。