CN117471110B - 一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于血型检测技术领域，具体涉及一种用于封闭抗原‑微球指示系统的封闭液及封闭方法。本发明提供的封闭液包括羊血清、乙醇胺、Tween‑20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和Tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的KLH、Casein、OVA或PVA中的一种或多种。该封闭液可以使微球标记红细胞血型抗原后形成的抗原‑微球指示系统的灵敏度和特异性都提高。
Description
技术领域
本发明属于血型检测技术领域，具体涉及一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法。
背景技术
免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。标记微球的种类有多种，包括聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、荧光微球等。常见的标记抗原或抗体的过程中，由于样品孔之间存在空隙，而抗原或抗体会被吸附在其中，进而产生较多非特异性的信号，从而影响实验的准确性。
目前使用微球（例如常见的荧光微球）来标记抗原或抗体的实验过程中，往往需要使用惰性分子将微球进行封闭，其目的是将微球表面的非特异位点堵住，避免微球与其他物质的非特异性结合。常见的惰性分子包括BSA，其工作浓度通常较高。例如，公开号为CN111077315A（公开日20200428），发明名称为“一种荧光微球与抗体的偶联方法”的中国专利公开一种含20%BSA的封闭液。该专利主要是通过控制抗体与荧光微球的添加量，以及控制荧光微腔的粒径等来提高偶联效率及偶联强度，而封闭液本身对于微球的特异性封闭效果并不理想。
公开号为CN116087501A（公开日20230509），发明名称为“微球封闭试剂和试剂盒”的中国专利公开了一种包含第一封闭液和第二封闭液的微球封闭试剂，该专利对封闭液的成分进行了优化。但专利需要额外引入动物IgG抗体来封闭微球表面的非特异性位点，因此成本较高；此外IgG抗体本身的保存条件要求也更高。
实际应用中对于好的封闭液的要求包括能够封闭微球上所有未结合的位点而不替换上面已经结合的靶蛋白，同时还要做到不结合靶蛋白的表位以及不与后续抗体或检测试剂发生交叉反应。但现有技术里仅依靠封闭液本身成分能够同时满足上述条件依然具有较大的技术难度，或者需要较高的工艺成本。因此，仍有必要提出新的方法策略，以缓解现有技术的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法，具体技术方案如下。
一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液，所述封闭液包括羊血清、乙醇胺、Tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和Tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的KLH（血蓝蛋白）、Casein（酪蛋白）、OVA（卵白蛋白）或PVA（聚乙烯醇）中的一种或多种。
进一步，所述封闭液包括1%-5%羊血清、0.5%-2%乙醇胺、0.01%-0.05% Tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和Tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的KLH（血蓝蛋白）、Casein（酪蛋白）、OVA（卵白蛋白）或PVA（聚乙烯醇）中的一种或多种。
进一步，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mM Tris缓冲液，以及0.3%-0.9% KLH（血蓝蛋白）、0.3%-0.9% Casein（酪蛋白）、0.3%-0.9% OVA（卵白蛋白）或0.3%-0.9% PVA（聚乙烯醇）中的一种或多种。
进一步，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mM Tris缓冲液，以及0.3%-0.9% KLH（血蓝蛋白）、0.3%-0.9% Casein（酪蛋白）、0.3%-0.9% OVA（卵白蛋白）或0.3%-0.9% PVA（聚乙烯醇）中的任意一种。
进一步，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mM Tris缓冲液，以及0.3%-0.9% KLH（血蓝蛋白）。
进一步，所述封闭液进一步包括2% 羊血清、1% 乙醇胺和0.01% Tween-20。
一种封闭抗原-微球指示系统的方法，包括以下步骤：
S01：将微球加入MES溶液中混匀；
S02：进一步加入NHS和EDC，旋转，使微球活化；
S03：在活化的微球体系（包括微球和溶液）中加入红细胞血型抗原，超声，旋转反应1-2h，使所述微球标记所述红细胞血型抗原形成抗原-微球指示系统；
S04：加入上述的封闭液与所述抗原-微球指示系统混合均匀后共孵育1-2h，所述封闭液对微球表面的非特异位点进行封闭；
S05：封闭结束后离心，分离出完成封闭的抗原-微球指示系统进行保存。
进一步，S04中加入的封闭液与抗原-微球指示系统的比例为1ml封闭液封闭10mg微球。
进一步，所述红细胞血型抗原包括A抗原和B抗原。
由上述方法封闭的抗原-微球指示系统在制备侧向免疫层析试剂盒、免疫渗滤试剂盒和/或免疫比浊试剂盒中的应用。
有益技术效果
1）本发明提供的封闭液可以有效的封闭微球表面上未与红细胞血型抗原结合的位点，从而阻断非特异反应，血型抗原除了和对应的抗体结合，不会和其它非特异性物质结合。从而使微球标记抗原后形成的抗原-微球指示系统的灵敏度和特异性都提高。本发明重点对封闭液中惰性封闭组合物的组成进行了筛选，采用比浊法检测封闭液的封闭效果。其中N值代表阴性孔的OD值；N值越小，说明血型抗原和抗体结合特异性越好；P/N越大，说明反应的灵敏度越高。本发明优选成分的封闭液封闭后的红细胞血型抗原-微球指示系统可以达到检测时N值小于0.3，P/N值大于5.0的效果，以此作为确定优选惰性封闭组合物组成的指标。
2）本发明采用的惰性封闭组合物中的惰性分子（KLH、Casein、OVA或PVA）均为低浓度，最高浓度为不大于0.9%。进一步复配其他的溶剂成分，实现了对微球的有效封堵，且不与反应体系中其他试剂成分发生交叉反应，特别是当用于封闭微球标记的人工合成的血型抗原-蛋白偶联物指示系统时，低浓度的惰性封闭组合物不会干扰偶联的蛋白成分和干扰检测结果，且不会替换微球表面标记的靶蛋白。相较于现有技术中常用的高浓度单一惰性分子（如，20% BSA），本发明的低浓度封闭液对蛋白的作用更加稳定。
3）本发明创新性的使用了KLH作为惰性封闭组合物中的核心成分，其封闭效果最优。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为A1抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图2为A2抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图3为A3抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图4为A4抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图5为B1抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图6为B2抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图7为B3抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图；
图8为B4抗原标记过程中不同惰性封闭成分的封闭效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述的红细胞血型抗原包括A抗原和B抗原。其中，A抗原包括A1、A2、A3和A4型；B抗原包括B1、B2、B3和B4型。化学式如下。
（化学式A1）。
（化学式A2）。
（化学式A3）。
（化学式A4）。
（化学式B1）。
（化学式B2）。
（化学式B3）。
（化学式B4）。
实施例1
本实施例提供一种抗原-微球指示系统的封闭方法。
S01：将荧光微球超声1分钟，取25μL微球加入0.5ml MES（4-吗啉乙磺酸）溶液（0.05M，pH6.1）混匀。
S02：进一步加入30mg/mL的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）10μL和50mg/mL的EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）10μL，混匀后，旋转活化30分钟。
S03：进一步超声1分钟，13000rpm离心15分钟，弃上清，加入1ml MES继续超声；然后加入0.1mg红细胞血型抗原，混匀后反应1-2分钟，超声30s，旋转反应2小时，使所述微球标记所述红细胞血型抗原形成抗原-微球指示系统。
S04：加入25μL本发明提供的封闭液，混合均匀后使所述封闭液对所述抗原-微球指示系统作用2h，以封闭微球表面的非特异位点。
S05：封闭结束后离心，分离出完成封闭的抗原-微球指示系统进行保存。如果暂时不使用，可放入保存液中保存。
用于保存完成封闭的抗原-微球指示系统的保存液包括：1.2114g Tris，0.5gBSA，0.2g PVP，2mL 20% Tween-20，2mL 20% T-X100，3g甘氨酸，5mL羊血清，0.25g酪蛋白，100mL水。
本实施例可选的提供另一种抗原-微球指示系统的封闭方法。
1）微球的洗涤和活化
S01.取出100μL微球(10%浓度w/v)放入低蛋白吸附的微量离心管中。
S02.加入1mL活化/偶联缓冲液（50mM MES(Sigma-Aldrich M8250)pH6.0）并充分混匀。
S03.对于不同粒径的微球选择合适的离心条件离心。
0.2 μm-17000 rpm 9 分钟、0.3μm -14000 rpm 7分钟、0.4 μm -12000 rpm 7分钟、0.5μm - 12000 rpm 5 分钟。
S04.去除上清。
S05.重复步骤2-4两次，在洗涤后和偶联之前充分重悬微球非常重要。反复吹打效果很好，如有需要，也可用探入式超声。
S06.在最后一轮洗涤后，将微球重悬于1mL活化/偶联缓冲液中，并务必确保微球呈单分散态。
S07.活化试剂即配即用。
S08.制备200mM EDC溶液：在室温条件下向干净的离心管中加入19.2mM EDC和500μL的Mill-Q超纯水。
S09.制备200mM Sulfo-NHS：向干净的离心管中加入21.7mgSulfo-NHS和500μL活化/偶联缓冲液。
S10.向1mL洗涤后的微球（见上述步骤S06）中快速加入24μL 200mM EDC以及240μL200mM Sulfo-NHS。
S11.室温涡旋震荡后用转盘式混合器混合孵育30分钟。
S12.离心使微球沉降。
S13.去除上清。
S14.加入1mL活化/偶联缓冲液洗涤微球并充分混匀。
S15.在合适的条件下离心使微球沉降。
S16.重复步骤S13-S15两次。
S17.将微球重悬于700μL活化/偶联缓冲液中，微球在抗体偶联前应保持单分散态，这一点非常重要。如有必要可使用超声。
2）微球和血型抗原偶联
S01.在活化/偶联缓冲液中加入红细胞血型抗原。
S02.根据1g微球包被60mg抗原的包被比例，将300μL抗原(2mg/mL)加入700μL微球中，充分混匀至终体积1mL。
S03.室温下用转盘式混合器混合悬液2.5小时。
S04.在通风橱内向1mL1%的微球悬液中加入30μL的乙醇胺。涡旋震荡后用转盘式混合器混和30分钟终止微球反应，在合适的条件下离心使微球沉降，去除上清 (或根据后续实验需要保留上清液，通过BCA实验分析蛋白含量)。
S05.将微球重悬于1mL本发明提供的封闭液。超声后在室温下通过转盘式混合器混和至少2小时。或者，可选的，微球在室温下混合过夜。
S06.在合适的条件下离心使微球沉降。
S07去除上清。
S08.加入1mL本发明提供的封闭液，通过移液器反复吹打重悬微球。如有必要也可超声。
S09.在合适的条件下离心使微球沉降。
S10.重复步骤S07-S10两次或更多。
S11.在最后洗涤步骤去除上清液，加入1mL本发明提供的封闭液。此时微球浓度为1%w/v。
S12.通过移液器反复吹打或是超声重悬微球 (通过显微镜镜检来确保微球是否处于单分散态)。
S13.使用前悬液应置于4℃保存，并在5日内使用。
本发明提供的封闭液配方如下所示。
本发明优选：
2%羊血清，1%乙醇胺，0.01% Tween-20；50mM Tris（pH8.0），0.3% -0.9% KLH（血蓝蛋白），0.02%甘油。
可选的替代配方1：
2%羊血清，1%乙醇胺，0.01% Tween-20；50mM Tris（pH8.0），0.3%-0.9% Casein（酪蛋白）。
可选的替代配方2：
2%羊血清，1%乙醇胺，0.01% Tween-20；50mM Tris（pH8.0），0.3%-0.9% OVA（卵白蛋白），0.02%甘油。
可选的替代配方3：
2%羊血清，1%乙醇胺，0.01% Tween-20；50mM Tris（pH8.0），0.3%-0.9% PVA（聚乙烯醇），0.02%甘油。
实施例2
本实施例提供由实施例1封闭得到的红细胞血型抗原-微球指示系统在检测抗体中的结果
本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μL乳胶微球，共标记0.1mg 抗原）；试剂R1（1g BSA，0.24g Tris，0.1g PC300，5g PEG6000，100mL水，pH8.5）。
本实验的上样方式如下：用R1稀释A、B抗体标准品（品牌Millipore）100倍，得到体积为200μL的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂R2（将上述乳胶微球用TBS稀释100倍）200μL，共得到400μL的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。见图1-图8（纵坐标为抗体稀释倍数；其中图5-图8中纵坐标数字后面的单位为×1000；例如，“2”代表“2000”）。
结果解读：如果封闭液效果好，红细胞血型抗原和对应抗体完全结合而不和其它非特异性物质结合，从而得到P值大，N值小，P/N值大的结果。
表1 封闭液对A1抗原的效果验证
表2封闭液对A2抗原的效果验证
表3封闭液对A3抗原的效果验证
表4 封闭液对A4抗原的效果验证
表5封闭液对B1抗原的效果验证
表6封闭液对B2抗原的效果验证
表7封闭液对B3抗原的效果验证
表8封闭液对B4抗原的效果验证
其中，P值代表阳性孔的OD值；N值代表阴性孔的OD值。
实施例3
本实施例验证由实施例1提供的封闭液对人工合成血型抗原-微球指示系统的影响。
封闭液成分：2%羊血清，1%乙醇胺，0.01% Tween-20；50mM Tris（pH8.0），0.9% KLH（血蓝蛋白），0.02%甘油。
封闭方法：参照实施例1。
本实验采用的主要实验试剂包括：乳胶微球（125μL乳胶微球，共标记0.1mg 抗原）；试剂R1（1g BSA，0.24g Tris，0.1g PC300，5g PEG6000，100mL水，pH8.5）。
本实验的上样方式如下：用R1稀释A、B抗体标准品（品牌Millipore）100倍，得到体积为200μL的稀释后抗体标准品，然后再加入试剂R2（将上述乳胶微球用TBS稀释100倍）200μL，共得到400μL的待检测样品。在本实验中，检测波长为340nm。
表9 封闭液封闭的人工合成血型抗原A-微球指示系统检测结果
表10 封闭液封闭的人工合成血型抗原B-微球指示系统检测结果
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结果显示：人工合成血型抗原A-微球指示系统能特异性的结合A抗体，人工合成血型抗原B-微球指示系统能特异性的结合B抗体，特异性和灵敏度都比较高，说明封闭液里的低浓度的惰性封闭组合物成分不会干扰人工合成血型抗原上偶联的蛋白。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (6)
1.一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括羊血清、乙醇胺、Tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mM Tris缓冲液，以及0.3%-0.9% KLH。
2.如权利要求1所述的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括1%-5%羊血清、0.5%-2%乙醇胺和0.01%-0.05% Tween-20。
3.如权利要求1所述的封闭液，其特征在于，所述封闭液进一步包括2% 羊血清、1% 乙醇胺和0.01% Tween-20。
4.一种封闭抗原-微球指示系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01：将微球加入MES溶液中混匀；
S02：进一步加入NHS和EDC，旋转，使微球活化；
S03：在活化的微球体系中加入红细胞血型抗原，超声，旋转反应1-2h，使所述微球标记所述红细胞血型抗原形成抗原-微球指示系统；
S04：加入权利要求1-3任一项所述的封闭液与所述抗原-微球指示系统混合均匀后共孵育1-2h，加入的封闭液与抗原-微球指示系统的比例为1ml封闭液封闭10mg微球，所述封闭液对微球表面的非特异位点进行封闭；
S05：封闭结束后离心，分离出完成封闭的抗原-微球指示系统进行保存。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述红细胞血型抗原包括A抗原和B抗原。
6.权利要求4或5所述的方法封闭的抗原-微球指示系统在制备侧向免疫层析试剂盒、免疫渗滤试剂盒和/或免疫比浊试剂盒中的应用。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063335A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Statens Serum Institut | MONOCLONAL DES-LYS58-β2-MICROGLOBULIN ANTIBODIES FOR MEASUREMENT AND MANAGEMENT OF HEMODIALYSIS COMPLICATIONS |
| WO2011057200A1 (en) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Pharmasan Labs, Inc. | Preparing hapten-specific antibodies and their application for immunodiagnostics and research |
| CN111551730A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-08-18 | 上海艾瑞德生物科技有限公司 | 荧光微球封闭液及应用该封闭液的试剂盒 |
| CN114166812A (zh) * | 2022-02-08 | 2022-03-11 | 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 | 一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用 |
| CN114397464A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-04-26 | 天津德祥生物技术有限公司 | 一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用 |
| CN114509562A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-17 | 上海艾瑞德生物科技有限公司 | 一种抗体偶联的微球复合物的封闭剂、保存剂及其应用 |
| CN115656494A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-01-31 | 济南诺磐生物科技有限公司 | 一种蓝色微球偶联抗体的方法及应用 |
| CN116068207A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-05-05 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 |
| CN116087501A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-05-09 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 微球封闭试剂和试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111751544B (zh) * | 2019-03-28 | 2023-06-09 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种用于检测可溶性生长激素表达基因2蛋白的试剂盒 |
-
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Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063335A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Statens Serum Institut | MONOCLONAL DES-LYS58-β2-MICROGLOBULIN ANTIBODIES FOR MEASUREMENT AND MANAGEMENT OF HEMODIALYSIS COMPLICATIONS |
| WO2011057200A1 (en) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Pharmasan Labs, Inc. | Preparing hapten-specific antibodies and their application for immunodiagnostics and research |
| CN111551730A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-08-18 | 上海艾瑞德生物科技有限公司 | 荧光微球封闭液及应用该封闭液的试剂盒 |
| CN114166812A (zh) * | 2022-02-08 | 2022-03-11 | 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 | 一种羧基荧光微球表面活化方法及其应用 |
| CN114509562A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-17 | 上海艾瑞德生物科技有限公司 | 一种抗体偶联的微球复合物的封闭剂、保存剂及其应用 |
| CN114397464A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-04-26 | 天津德祥生物技术有限公司 | 一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用 |
| CN115656494A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-01-31 | 济南诺磐生物科技有限公司 | 一种蓝色微球偶联抗体的方法及应用 |
| CN116087501A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-05-09 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 微球封闭试剂和试剂盒 |
| CN116068207A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-05-05 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Immune response of cattle immunized with a conjugate of the glycolipid glucose monomycolate and protein;Thi Kim Anh Nguyen等;《Vererinary Immunology and Immunopathology》;20110815;第142卷;全文 * |
| 明胶及酪蛋白作为封闭剂及保存稳定剂在免疫磁球制备中的应用;许迪莘;代凤英;杨寅;邓奕;杜庆庆;陈旭;张远;杜美红;;《食品安全质量检测学报》;20151225(第12期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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