JP6919499B2 - 不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段 - Google Patents
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Description
本発明の免疫測定試薬における劣化防止成分であるω−アミノカルボン酸(1)における炭素原子数nは2−6の整数、具体的には、2、3、4、5、又は、6である。
本発明の劣化防止方法における、感作又は未感作の不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中における、上記のω−アミノカルボン酸(1)の共存は、免疫測定試薬を作成する工程のいずれかの段階で、ω−アミノカルボン酸(1)を所定の濃度になるように、試薬中に添加することにより行うことができる。このω−アミノカルボン酸(1)の添加は、不溶性担体粒子の添加に先行していても、その後であってもよい。
<第1試薬(未感作ラテックス分散液)の調製>
10mmol/mL HEPESを含む緩衝液に、(1)未添加(比較例)、(2)トレハロース二水和物(比較例:林原社製)、(3)グリセリン(比較例:和光純薬工業社製)、(4)グリシン(比較例:和光純薬工業社製)、(5)β−アラニン(n=2:東京化成工業社製)、(6)4−アミノ酪酸(n=3:東京化成工業社製)、(7)5−アミノ吉草酸(n=4:東京化成工業社製)、(8)6−アミノヘキサン酸(n=5:和光純薬工業社製)、又は、(9)7−アミノヘプタン酸(n=6:東京化成工業社製)を、それぞれ[0.3%、1%、3%](上記(2)、(3))、又は、[0.1%、0.3%、1%、3%、10%](上記(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9))溶解させ、それぞれの系に未感作ポリスチレンラテックス粒子(平均粒子径0.12μm:藤倉化成社製)を、0.1%となるように添加し、水酸化ナトリウム水溶液でpHが7.9になるように、未感作ラテックス分散液37種類を調製した。
上記の第1試薬に対してそれぞれ0−10回(詳しくは、0,1,3,6,10回)凍結・融解を繰り返し、当該凍結・融解回数による各試料のラテックス粒子の水中平均粒子径を計測した。凍結・融解は、試薬を−30℃のフリーザーに3時間以上入れて凍結を行い、その後25℃程度の室温に放置し、完全に液状になるまで融解を行った。この凍結・融解の過程を凍結・融解の「1回」とした。また、水中平均粒子径は、濃厚系粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子社製)を用いて測定した。結果を図1に示す。
10mmol/mL HEPESを含む緩衝液に、塩化ナトリウムを20g/Lとなるように添加し、0.2%Tween−20を添加し、pHを7.0に調製した。この緩衝液適量に対して、抗ヒトHbA1cマウスモノクローナル抗体(藤倉化成社製)を0.05mg/mL、抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体(和光純薬工業社製)を0.2mg/mLとなるように添加し、さらにヒドロキシプロピルセルロースを1%添加して、抗体希釈液を調製した。
上記の第1試薬に対してそれぞれ0−10回凍結・融解を、上記と同じ要領で繰り返し、凍結・融解回数による各試料の検量線を作成・確認した。検量線は、HbA1c値が0%、4.2%、8.5%、12.0%、16.4%に調製された精製ヒトHbA1cを検体として用いて、検体量6μL、第1試薬を150μL混合し、37℃で5分間反応させた後、第2試薬を50μL添加して、5分間の吸光度変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置7180を用い、主波長660nm、副波長800nmの2ポイントエンド法で行った。結果を図2(図2−1、2−2、2−3、2−4A、2−4B、2−5A、2−5B、2−6A、2−6B、2−7A、2−7B、2−8A、2−8B、2−9A、2−9B)に示す。
<第3試薬(検体希釈液)の調製>
50mMグリシンを含む緩衝液に、0.15mol/mLとなるように塩化ナトリウムを添加し、水酸化ナトリウム水溶液でpHを9.0となるように、検体希釈液を調製した。
50mMホウ酸緩衝液20mLに、抗ヒトLp(a)ヤギポリクローナル抗体(トリナバイオリアクティブス社製)を100mg添加して、さらに未感作ポリスチレンラテックス粒子(平均粒子径0.12μm:藤倉化成社製)の10%ラテックス分散液を12.5mL混合し、超音波装置VCX750(SONIC&MATERIALS INC.)を用いて、氷冷下で超音波処理を1分間行った。その後、室温で30分間撹拌した後、5%BSA水溶液を7mL添加し、50℃で30分間攪拌した。その後、20000Gで20分間遠心し、上澄みを除いた後、10mmol/mL HEPESに、(1)未添加(比較例)、(2)グリシン(比較例:和光純薬工業社製)、(3)β−アラニン(n=2:東京化成工業社製)、(4)4−アミノ酪酸(n=3:東京化成工業社製)、(5)5−アミノ吉草酸(n=4:東京化成工業社製)、(6)6−アミノヘキサン酸(n=5:和光純薬工業社製)、又は、(7)7−アミノヘプタン酸(n=6:東京化成工業社製)を、それぞれ0.1%、0.3%、3%、10%溶解させ((6)は、0.1%、0.3%、1%、3%、10%)、それぞれの系に上記感作ポリスチレンラテックス粒子(平均粒子径0.12μm:藤倉化成社製)を、0.3%となるように添加し、抗体感作ラテックス分散液26種類を調製した。
第4試薬を、それぞれ0−10回、上記の要領で凍結・融解を行い、凍結・融解回数による各試料の検量線を確認した。検量線は、Lp(a)値が0mg/dL、15mg/dL、30mg/dL、60mg/dL、100mg/dLに調製された、精製Lp(a)を検体として用いて、当該検体量2.1μLに対して第3試薬を210μL混合し、37℃で5分間反応させた後、これに第4試薬を70μL添加して、5分間における吸光度の変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置7180を用い、主波長600nmの2ポイントエンド法で行った。結果を図3(図3−1、3−2A、3−2B、3−3A、3−3B、3−4A、3−4B、3−5A、3−5B、3−6A、3−6B、3−7A、3−7B、3−8A、3−8B)に示す。
<第5試薬(抗体感作金コロイド分散液)の調製>
金コロイド分散液(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)350mLに、500mMHEPES(pH7)を7mL混合し、さらに抗ヒトCRPヤギポリクローナル抗体(ADVY社製)を2.1mg添加し、室温で1時間撹拌した。その後、0.1%BSA水溶液を38.5mL添加し、室温で30分間攪拌した。その後、20000Gで20分間遠心し、上澄みを除いた後、10mmol/mL HEPESに、0.3%、1%、3% 6−アミノヘキサン酸を添加した緩衝液をそれぞれ42mL添加して抗体感作金コロイド分散液を調製した。
第4試薬を、それぞれ0−10回、上記の要領で凍結・融解を行い、凍結・融解回数による各試料の検量線を確認した。検量線は、CRP値が0mg/dL、0.02mg/dL、0.05mg/dL、0.09mg/dL、0.19mg/dL、0.38mg/dL、0.75mg/dLに調製された、精製CRPを検体として用いて、当該検体量2.1μLに対して第3試薬を140μL混合し、37℃で5分間反応させた後、これに第5試薬を140μL添加して、5分間における吸光度の変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置7180を用い、主波長600nmの2ポイントエンド法で行った。
Claims (6)
- 凝集法による免疫測定試薬である、請求項1に記載の免疫測定試薬。
- 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子又は金コロイド粒子である、請求項1又は2に記載の免疫測定試薬。
- 免疫測定試薬は、凝集法による免疫測定試薬である、請求項4に記載の劣化防止方法。
- 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子又は金コロイド粒子である、請求項4又は5に記載の劣化防止方法。
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