WO2023145915A1 - 肺サーファクタントプロテインの免疫測定方法及び免疫測定試薬 - Google Patents

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WO2023145915A1
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latex particles
measurement
sample
concentration
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PCT/JP2023/002767
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真波 岩崎
智宏 ▲高▼畑
建午 藤村
万友美 吉田
智之 臼井
侑佳 石原
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積水メディカル株式会社
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    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method and measurement reagent for pulmonary surfactant protein.
  • it relates to an immunoassay method and an immunoassay reagent using latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody.
  • Lung surfactant is a liquid substance produced and secreted from type II pulmonary epithelial cells in the lung. Lung surfactant reduces the surface tension on the alveolar surface, making it easier for the alveoli to inflate, which aids in respiration and gas exchange.
  • Lung surfactant protein (hereinafter sometimes simply referred to as SP) is an apoprotein specific to pulmonary surfactant.
  • SPs include SP-A and SP-D, which are hydrophilic proteins that exhibit bioprotective action and bind to specific lipids, and SP-B and SP-C, which are highly hydrophobic and associate with phospholipids. It is Among these, SP-D is specific to the lung, and serum SP-D is known to reflect the presence of lung disease. Examples of pulmonary diseases that can be diagnosed by measuring serum SP-D include idiopathic interstitial pneumonia, collagen disease interstitial pneumonia, and alveolar proteinosis (Non-Patent Document 1).
  • SP-D immunoassay reagents include the SP-D kit "Yamasa” EIA II (Non-Patent Document 2) based on the enzyme immunoassay method (ELISA method) and the CL SP based on the chemiluminescence enzyme immunoassay method (CLEIA method).
  • ELISA method enzyme immunoassay method
  • CL SP chemiluminescence enzyme immunoassay method
  • -D "Yamasa” NX Non-Patent Document 3
  • the reagent for measurement by the ELISA method it takes as long as four and a half hours to react the SP-D in the sample with the antibody. A B/F separation step for separation is required, and the operation is complicated.
  • Non-Patent Document 2 when the kit of Non-Patent Document 2 is used, it is necessary to dilute the biological sample before measurement, and the operation is complicated. It should be noted that serum is the only type of specimen that can be measured with the kit of Non-Patent Document 2.
  • the reagent of Non-Patent Document 3 requires a dedicated instrument as a measuring instrument, and the measurable sample species is only serum.
  • An object of the present invention is to provide an immunoassay reagent and an immunoassay method that can measure SP-D in a biological sample more easily and in a shorter time.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, and found that a step of contacting a biological sample such as serum or plasma with latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody in a liquid phase. It was found that SP-D in a biological sample can be measured simply and in a short period of time by an immunoassay method including the above. Furthermore, by devising the composition of the reagent, the present inventors have found that the measurement can be performed accurately regardless of the type and storage history of the biological sample, leading to the completion of the present invention. That is, the present invention has the following configurations.
  • a method for immunoassay of pulmonary surfactant protein D (SP-D) in a biological sample comprising: The above measuring method, comprising the step of contacting the sample with latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody in a liquid phase.
  • the measurement method according to ⁇ 1> wherein the biological sample is serum or plasma.
  • the concentration of latex particles in the liquid phase is 0.01 to 0.10%.
  • ⁇ 5> The measurement method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the step of contacting the sample with anti-SP-D monoclonal antibody-supported latex particles includes the following steps. (1) a step of contacting the sample with a first reagent containing a buffer solution in a liquid phase; (2) a second reagent containing latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody after step (1); The step of adding into the liquid phase ⁇ 6>.
  • ⁇ 7> The measuring method according to ⁇ 6>, wherein the step of optically measuring is a step of measuring scattered light intensity, absorbance or transmitted light intensity with an optical instrument.
  • ⁇ 8> The measuring method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the pH in the liquid phase is 5.0 to 9.0.
  • ⁇ 9> The measuring method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the liquid phase contains a divalent metal.
  • the divalent metal is magnesium or calcium.
  • a reagent for measuring SP-D in a biological sample by immunoassay said reagent comprising latex particles carrying at least an anti-SP-D monoclonal antibody and a buffer solution.
  • ⁇ 12> The measurement reagent according to ⁇ 11>, wherein the biological sample is serum or plasma.
  • ⁇ 13> The measurement reagent according to ⁇ 11> or ⁇ 12>, wherein the latex particles have an average particle size of 90 nm to 450 nm.
  • ⁇ 14> The measurement reagent according to any one of ⁇ 11> to ⁇ 13>, wherein the concentration of latex particles in the liquid phase is 0.01 to 0.10%.
  • ⁇ 15> The measurement reagent according to any one of ⁇ 11> to ⁇ 14>, wherein the buffer has a pH of 5.0 to 9.0.
  • ⁇ 16> The measurement reagent according to any one of ⁇ 11> to ⁇ 15>, wherein the buffer contains a divalent metal.
  • ⁇ 17> The measurement reagent according to ⁇ 16>, wherein the divalent metal is magnesium or calcium.
  • a method for suppressing variation in measured values in an immunoassay method for SP-D in a biological sample A method for suppressing variation in the measurement value, comprising the step of contacting the sample with latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody in a liquid phase containing a divalent metal.
  • ⁇ 20> The method for suppressing variation in measured values according to ⁇ 18> or ⁇ 19>, wherein the latex particles have an average particle size of 90 nm to 450 nm.
  • a reagent kit for measuring SP-D in a biological sample by immunoassay comprising: (1) a first reagent containing a buffer; (2) a second reagent containing latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody;
  • the present invention it is possible to provide an immunoassay method and a measurement reagent for SP-D in a biological sample, which allows measurement results to be obtained more easily and in a shorter time.
  • FIG. 1 shows SP-D concentration-dependent sensitivity changes of the reagent of the present invention (Example 1-1). The correlation between the measured values of the reagent of the present invention and the ELISA reagent is shown (Example 3).
  • FIG. 4 shows SP-D concentration-dependent sensitivity changes when the buffer pH of the first reagent of the present invention is varied (Example 4). Correlation between serum specimen measurements and EDTA-2K plasma specimen measurements derived from the same donor using the reagent of the present invention is shown (Example 6). The correlation between serum sample values and heparin lithium plasma sample values derived from the same donor using the reagent of the present invention is shown (Example 7).
  • Measured values of serum samples derived from the same donor and measured values of EDTA-2K plasma samples are correlated with each other when the concentration of magnesium chloride in the reagent of the present invention is varied (Example 8).
  • the correlation between the serum specimen measurement value and the EDTA-2K plasma specimen measurement value derived from the same donor measured with the magnesium chloride added reagent and the magnesium chloride-free reagent of the present invention, or the serum specimen measurement value and heparin lithium Correlation with plasma sample measurements is shown (Example 9).
  • Fig. 10 shows the correlation between the measured values of the reagent of the present invention and the ELISA reagent (Example 10).
  • the present invention is an immunoassay method for pulmonary surfactant protein D (SP-D) in a biological sample, wherein the sample is brought into contact with latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody in a liquid phase. It is the said measuring method including the process of making.
  • the immunoassay method of the present invention uses an insoluble carrier such as latex particles on which an anti-SP-D monoclonal antibody against SP-D, which is an antigen, is immobilized to form an immune complex, and the latex associated with the formation of the immune complex. This is a method for measuring SP-D by detecting the degree of aggregation of particles, and is a so-called immunoagglutination method.
  • a method using latex as insoluble carrier particles is particularly called a latex immunoagglutination method (hereinafter sometimes simply referred to as LTIA).
  • LTIA latex immunoagglutination method
  • the present invention is a method of measuring SP-D by LTIA.
  • the ELISA method and CLEIA method known as conventional SP-D measurement methods are heterogeneous methods that require a washing step for B/F separation, whereas the LTIA method of the present invention is a homogeneous method that does not require B/F separation. Therefore, according to the method of measuring SP-D by LTIA of the present invention, the steps can be simplified and the measurement time can be shortened.
  • LTIA is the concentration of SP-D to be measured by optically or electrochemically observing the degree of agglutination caused by the binding of SP-D and anti-SP-D antibody-supported latex particles. can be measured.
  • optical observation methods include methods of measuring scattered light intensity, absorbance, or transmitted light intensity with an optical instrument (endpoint method, rate method, etc.).
  • the latex immunoagglutination method includes immunonephelometry (TIA), immunonephelometry (NIA), and other subdivided methods according to the detection method for measuring turbidity.
  • the measured values such as absorbance obtained by measuring the sample are compared with the measured values such as absorbance obtained by measuring the standard substance (sample containing SP-D with known concentration), and the amount contained in the sample is determined. Calculate the SP-D concentration (quantitative value).
  • the measurement of the absorbance of transmitted light, scattered light, or the like may be one-wavelength measurement or two-wavelength measurement (difference or ratio between two wavelengths).
  • the measurement wavelength is generally selected from 500 nm to 800 nm.
  • the measurement of SP-D in a sample according to the present invention may be performed manually or using a device such as a measuring device.
  • the measuring device may be a general-purpose automatic analyzer or a dedicated measuring device (dedicated machine).
  • the measurement according to the present invention is preferably carried out by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
  • the substance to be measured in the present invention is pulmonary surfactant protein D (SP-D).
  • Lung surfactant protein is an apoprotein specific for lung surfactant.
  • Known hydrophilic proteins are SP-A and SP-D, which exhibit biological defense action and bind to specific lipids, and SP-B and SP-C, which are highly hydrophobic and associate with phospholipids.
  • SP-D which is specific to the lung and known to reflect the presence of lung disease, is the object of measurement.
  • the sample in the present invention is not particularly limited as long as it is a biological sample that can contain SP-D.
  • Samples in the present invention are typically blood samples taken from humans or animals, such as whole blood, serum, plasma. Plasma samples in the present invention also include heparin plasma, EDTA plasma, and the like.
  • the biological sample in the present invention may be a fresh specimen within several hours after being collected from a human or animal, a specimen that has been refrigerated after collection, or a specimen that has been thawed after cryopreservation.
  • a biological sample in the present invention may be a sample that has been pretreated after being collected from a living body, or a sample that has been diluted with a buffer solution or the like after being collected from a living body.
  • the ability to measure SP-D in plasma by the LTIA method of the present invention is of great significance. For example, some plasma samples, such as heparin plasma, do not require waiting for the sample to clot, so the test time can be shortened compared to serum, which is convenient for emergency testing.
  • the ability to measure SP-D in both serum and plasma by the measurement method of the present invention contributes to improved usability. Furthermore, according to the measuring method of the present invention, accurate measurement can be performed without fluctuations in measured values even for samples that have been frozen and then thawed after sample collection.
  • Latex particles Anti-SP-D monoclonal antibody-supported antibody latex particles in the present invention are not particularly limited as long as they are latex particles generally used as immunoassay reagents. Latex particles can be obtained by polymerizing or copolymerizing various monomers. Examples of monomers herein include polymerizable monomers having a phenyl group, such as styrene, ⁇ -methylstyrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, 4-vinylbenzoic acid, divinylbenzene, and vinyltoluene.
  • monomers herein include polymerizable monomers having a phenyl group, such as styrene, ⁇ -methylstyrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, 4-vinylbenzoic acid, divinylbenzene, and vinyltolu
  • Polymerizable monomers having a phenyl group and sulfonate such as styrenesulfonate, divinylbenzenesulfonate, o-methylstyrenesulfonate, p-methylstyrenesulfonate, 1-vinylnaphthalene
  • Polymerizable unsaturated aromatics such as polymerizable monomers having a naphthyl group such as 2-vinylnaphthalene, ⁇ -naphthyl (meth)acrylate, and ⁇ -naphthyl (meth)acrylate, such as (meth)acrylic acid
  • Polymerizable unsaturated carboxylic acids such as itaconic acid, maleic acid, and fumaric acid, such as methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, n-butyl (meth)acrylate, and 2-(meth)acrylate
  • the average particle size of the latex on which the anti-SP-D monoclonal antibody is supported may be an average particle size that allows sensitivity differences to be obtained over the entire SP-D concentration range of 0 to 1000 ng/mL.
  • One type of latex particles may be used, or two or more types of latex particles having different average particle sizes may be used.
  • the average particle size of the latex particles is preferably 50 nm to 1000 nm, more preferably 90 nm to 500 nm, even more preferably 90 nm to 450 nm.
  • the average particle size of the latex particles is most preferably 224-375 nm.
  • the average particle size of the latex particles is less than 50 nm, the sensitivity in the low to medium concentration range may be lowered, resulting in lower measurement accuracy. Further, when the average particle diameter of the latex particles exceeds 1000 nm, the sensitivity in the low density range increases, while the so-called hook phenomenon occurs in the high density range, possibly resulting in a measured value lower than the actual density. In the examples described later, one type of latex particles was used to measure a wide range of SP-D concentrations. It can also be enlarged.
  • latex particles with a large sensitivity difference in the SP-D low concentration range eg, 0 to 200 ng/mL
  • latex particles with a large sensitivity difference in the SP-D medium to high concentration range eg, 200 to 1000 ng/mL
  • Two or more types of latex particles can also be used in combination, such as in combination.
  • two types of anti-SP-D monoclonal antibodies having different recognition sites which will be described later, can be combined with two types of latex particles having different average particle sizes.
  • the average particle size of latex particles can be analyzed by laser diffraction/scattering method (LS method), Coulter principle, dynamic light scattering photon correlation method, electron microscope, or the like.
  • the critical coagulation concentration of latex particles is the maximum salt concentration at which the latex does not coagulate when the salt concentration in the latex particle suspension is increased.
  • Salt is added stepwise to the latex particles not carrying the antibody, the salt concentration at which complete self-aggregation is achieved is determined, and the salt concentration that is one step lower than that concentration is defined as the critical aggregation concentration.
  • the critical aggregation concentration can be calculated by the method described below.
  • Aqueous sodium phosphate solutions pH 7.4 were prepared in which the concentration was varied by 10 mM in the range of 10 to 400 mM, and latex particles were added to the aqueous sodium phosphate solutions of each concentration to a final concentration of 1% (W/V). Add quantity and stir.
  • the concentration of the sodium phosphate aqueous solution one step lower than the concentration at which the latex particles completely self-aggregate is defined as the critical aggregation concentration (maximum non-aggregation concentration).
  • the critical aggregation concentration (sodium phosphate aqueous solution concentration) of the latex particles in the present invention is preferably 10 mM to 500 mM, more preferably 10 mM to 400 mM, still more preferably 60 mM to 390 mM.
  • Latex particles with a critical agglutination concentration of less than 10 mM are difficult to keep dispersed, and latex particles with a critical agglutination concentration of 500 mM or more repel each other, resulting in agglutination of latex particles via an antigen-antibody reaction in LTIA. may be suppressed.
  • the critical aggregation concentration of latex particles can be adjusted by appropriately changing the weight ratio of raw materials.
  • styrene latex particles are prepared by combining a predetermined amount of a polymerizable monomer having a phenyl group such as styrene and a predetermined amount of a polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate such as sodium styrene sulfonate. It is obtained by copolymerization in an aqueous medium, and the critical aggregation concentration can be adjusted by changing the mixing ratio of styrene and sodium styrenesulfonate. As a combination of the range of the average particle size of the latex particles and the critical aggregation concentration, the particle size and the critical aggregation concentration can be arbitrarily combined.
  • latex particles having an average particle size of 50 nm to 1000 nm and a critical aggregation concentration of 10 mM to 500 mM are preferred, and a latex having an average particle size of 90 nm to 500 nm and a critical aggregation concentration of 10 mM to 400 mM. Particles are more preferred, and latex particles having an average particle size of 90 nm to 450 nm and a critical aggregation concentration of 60 mM to 390 mM are even more preferred.
  • the material and particle size can be appropriately selected in order to obtain desired performance such as sensitivity improvement, and it is also possible to use a combination of different materials and particle sizes. can.
  • the concentration of the latex particles in the measurement solution (liquid phase) in the measurement method of the present invention can be appropriately set according to the desired sensitivity and performance.
  • the measurement solution (liquid phase) is a mixture of a biological sample such as serum or plasma and a reagent containing latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody. indicates the solution to be measured.
  • the concentration of latex particles in the measurement solution is, for example, 0.01 to 0.10% by weight. More specifically, when polystyrene latex particles having an average particle size of 90 to 450 nm are used, the concentration of the latex particles in the measurement solution is 0.01 to 0.10% by weight, preferably 0.01 to 0.01%.
  • the concentration of latex particles in the measurement solution can also be defined from the absorbance value of the latex particles.
  • the absorbance of latex particles can be calculated by subtracting the absorbance of a liquid having the same composition but not containing latex particles from the absorbance of a liquid containing latex particles. In the case of absorbance at 600 nm, the absorbance value of the latex particles contained in the measurement solution is 0.1 to 4.0 Abs. is preferred. Furthermore, when polystyrene latex particles with an average particle size of 90 to 450 nm are used, the absorbance of the latex particles contained in the measurement solution is 0.1 to 4.0 Abs. , preferably 0.3 to 3.0 Abs. , more preferably 0.5 to 2.5 Abs. , more preferably 0.75 to 2.0 Abs. can be
  • Monoclonal antibodies against SP-D can be supported on latex particles, which are insoluble carrier particles, by known methods such as physical adsorption (hydrophobic bonding), chemical bonding, or a combination thereof.
  • a physical adsorption method is employed, antibodies can be supported on latex particles by a known method. For example, a method of mixing and contacting a monoclonal antibody against SP-D and latex particles in a solution such as a buffer, or a method of contacting latex particles with a monoclonal antibody against SP-D dissolved in a buffer or the like.
  • Antibodies can be supported on latex particles by, for example.
  • an antibody against SP-D and an amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group, hydroxyl group, or the like contained in the latex particles may be treated with a bivalent cross-linking reagent such as glutaraldehyde, carbodiimide, imidoester, or maleimide, respectively.
  • a bivalent cross-linking reagent such as glutaraldehyde, carbodiimide, imidoester, or maleimide
  • the anti-SP-D monoclonal antibody supported on the latex particles may be at least one type, and two or more types of monoclonal antibodies having different recognition sites (a first monoclonal antibody and a second monoclonal antibody) may be used. monoclonal antibodies) may also be used. When two or more types of antibodies are used, the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody may be supported on separate latexes, or multiple types of antibodies may be supported on the same latex. good. When there is one type of anti-SP-D monoclonal antibody, one type of latex particles may be used, or two or more types with different sizes may be used.
  • the average particle size of each latex particle should be the large particle size latex particle (for example, 300 to 500 nm) that exhibits sensitivity in the low concentration range and the measurable concentration range. It is preferable to combine latex particles having a particle size (for example, 50 to 300 nm) smaller than the particle size that can expand the (measurement range). The combination of the average particle sizes of the latex particles and the amount ratio of the latex particles having different average particle sizes in the measurement solution can be appropriately adjusted.
  • Proteins such as bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin, ovalbumin or a salt thereof may be added to the surface of the latex particles if it is necessary to treat the latex particles to suppress spontaneous agglutination or non-specific reactions.
  • Blocking treatment (masking treatment) of the latex particles may be performed by a known method such as contacting and coating with a surfactant, skim milk powder, or the like.
  • Anti-SP-D monoclonal antibodies in the present invention can be obtained by methods well known to those skilled in the art. That is, it can be easily produced by dissolving human SP-D as an antigen in a solvent such as phosphate buffer or physiological saline and administering this solution to an animal for immunization. Immunization may be performed using an emulsion after adding an appropriate adjuvant to the solution as necessary.
  • Adjuvants include widely used adjuvants such as water-in-oil emulsions, water-in-oil-in-water emulsions, oil-in-water emulsions, liposomes, and aluminum hydroxide gels, as well as proteins and peptide substances derived from biological components. good too.
  • Freund's incomplete adjuvant or Freund's complete adjuvant can be preferably used.
  • the administration route, dosage, and administration time of the adjuvant are not particularly limited, but are preferably selected appropriately so as to enhance the desired immune response in the animal immunized with the antigen.
  • the type of animal used for immunization is also not particularly limited, but mammals are preferable. For example, mice, rats, cows, rabbits, goats, sheep, etc. can be used, and mice can be used more preferably.
  • Immunization of animals may be performed according to a general technique. For example, immunization can be performed by subcutaneously, intracutaneously, intravenously, or intraperitoneally injecting an antigen solution, preferably a mixture with an adjuvant, into an animal. . Since the immune response generally differs depending on the type and strain of the animal to be immunized, it is desirable to appropriately set the immunization schedule according to the animal used. It is preferable to repeat the antigen administration several times after the initial immunization.
  • hybridomas can be produced by extracting antibody-producing spleen cells or lymph node cells from the immunized animal and fusing them with myeloma cells that have high proliferative potential.
  • Cells with high antibody-producing ability are preferably used for cell fusion, and myeloma cells are preferably compatible with the animal from which the antibody-producing cells to be fused are derived.
  • Cell fusion can be performed according to methods known in the art, and for example, a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, a method using electric current, or the like can be employed.
  • the resulting hybridomas can be grown according to known methods, and the desired hybridomas can be selected while confirming the properties of the antibodies to be produced.
  • Hybridoma cloning can be performed by known methods such as the limiting dilution method and the soft agar method.
  • hybridomas that produce anti-SP-D monoclonal antibodies can be selected by ELISA, RIA, Biacore, or the like. Specifically, a monoclonal antibody in the culture supernatant is reacted with immobilized human SP-D, and then reacted with a labeled anti-IgG antibody by an antigen-immobilized ELISA method.
  • Hybridomas can be selected that produce monoclonal antibodies with the desired properties.
  • the method of mass culture is not particularly limited, for example, a method of culturing a hybridoma in an appropriate medium to produce a monoclonal antibody in the medium, or a method of injecting a hybridoma into the peritoneal cavity of a mammal to proliferate and inject the hybridoma into ascites.
  • a method of producing an antibody and the like can be mentioned.
  • Purification of monoclonal antibodies can be performed by appropriately combining, for example, anion exchange chromatography, affinity chromatography, ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation and the like.
  • anti-SP-D antibodies obtained through the process of immunizing animals as described above, but also antibodies obtained using gene recombination techniques and chimeric antibodies can be used.
  • anti-SP-D monoclonal antibody a whole antibody molecule may be used, or a functional fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity may be used.
  • Functional fragments of antibodies include, for example, F(ab') 2 and Fab', and these functional fragments are prepared by digesting the antibody obtained as described above with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.). It can be produced by treating with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.). It can be produced by treating with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.). It can be produced by treating with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.). It can be produced by treating with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc
  • the reaction solution (liquid phase) in which the sample and the anti-SP-D monoclonal antibody-supported latex particles are brought into contact preferably contains a divalent metal (atom).
  • a divalent metal atom
  • the present inventors have found that the coexistence of a divalent metal in the reaction solution in which an antigen-antibody reaction occurs results in equivalent measurement values when the biological sample is plasma and when serum is used.
  • the difference between the measured value when using a sample obtained by thawing cryopreserved plasma and the measured value when using unfrozen plasma as a sample causes the coexistence of divalent metals in the reaction solution.
  • measured values equivalent to serum were obtained.
  • the form in which the divalent metal is provided in the present invention includes the form of a divalent metal compound such as a divalent metal salt or a divalent metal complex.
  • divalent metal salts are preferably used because of ease of handling.
  • the constituent atoms of the divalent metal are not particularly limited, examples thereof include alkaline earth metal atoms such as magnesium and calcium, iron, zinc, and the like.
  • magnesium or calcium is preferable, and magnesium is particularly preferable.
  • Chlorides, sulfates, and the like can be used as divalent metal salts, and chlorides are preferably used.
  • divalent metal complexes include monodentate ligands, bidentate ligands, amine ligands, imine ligands, phosphine ligands, amino acids, sugars, nucleic acids, ethylenediaminetetraacetic acid, crown ethers, and the like.
  • a complex formed by coordination bonding of a ligand of and a divalent metal can be used.
  • the divalent metal may be present in the reaction solution (liquid phase) in which the antigen-antibody reaction is performed.
  • a divalent metal is preferably added to at least the first reagent.
  • the divalent metal may be contained in the pretreatment liquid.
  • the concentration of the divalent metal in the reaction solution is preferably 0.5 mM or more and 500 mM or less. If the concentration of the divalent metal in the reaction solution is less than 0.5 mM, the effect of suppressing fluctuations in measured values is poor, and if it exceeds 500 mM, the antigen-antibody reaction may be inhibited.
  • the concentration of the divalent metal in the reaction solution is more preferably 5 mM or more and 50 mM or less.
  • the concentration of the divalent metal in the reagent may also be set so as to be the above concentration in the reaction solution in which the antigen-antibody reaction is performed.
  • Examples of contacting a biological sample containing SP-D with latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody in a liquid phase typically include the following (1) to (3). aspects.
  • aspects can be selected as appropriate.
  • the measuring reagent of the present invention is a liquid reagent for measuring SP-D in a blood sample by immunoagglutination, and contains latex particles carrying at least one type of anti-SP-D monoclonal antibody. Typically, it consists of two or more reagents, at least one of which contains anti-SP-D monoclonal antibody-loaded latex particles and the other reagent contains a buffer solution.
  • the measurement reagent of the present invention is preferably a two-reagent type measurement reagent consisting of a first reagent and a second reagent.
  • the first reagent of the two-reagent type measurement reagent is a reagent containing a buffer solution for diluting a biological sample containing SP-D
  • the second reagent is an anti-SP-D monoclonal antibody-supported reagent.
  • the buffer solution contained in the measurement reagent of the present invention contains a buffering agent having a buffering action.
  • Buffers such as acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, phthalic acid, glutaric acid, maleic acid, glycine and salts thereof, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, good buffers such as HEPES;
  • the concentration of the buffering agent in the reagent should be within a concentration range in which the insoluble carrier particles in the reagent do not spontaneously agglutinate and the desired antigen-antibody reaction takes place. is 50 mM or more, more preferably 75 mM or more.
  • the pH of the reaction solution (liquid phase) of the measurement method of the present invention and the pH of the buffer solution of the measurement reagent of the present invention may be any pH at which an antigen-antibody reaction can occur, preferably pH 5.0 to 9.0. More preferably pH 5.0 to 8.5, and even more preferably pH 5.0 to 8.0.
  • the measurement reagent of the present invention contain a salt other than the divalent metal salt described above.
  • a salt other than the divalent metal salt As for the kind of salt, an inorganic salt is desirable, and examples of the inorganic salt include sodium chloride and the like.
  • the concentration of the salt other than the divalent metal salt in the measurement reagent may be within a concentration range in which the insoluble carrier particles in the reagent do not spontaneously aggregate and the desired antigen-antibody reaction occurs. More than 100 mM is sufficient, preferably 100 mM or more, more preferably 200 mM or more, and still more preferably 300 mM or more.
  • the concentration of latex particles in the second reagent in the present invention can be appropriately set according to desired sensitivity and performance. Moreover, it can be appropriately set according to the mixing ratio of the first reagent and the second reagent.
  • the concentration of latex particles in the second reagent can be, for example, 0.01-0.10% by weight.
  • concentration of the latex particles is defined by the absorbance at 600 nm
  • the preferred absorbance value of the latex particles contained in the second reagent is 0.4 to 16.0 Abs. is.
  • the absorbance value at 600 nm of the latex particles contained in the second reagent is 0.4 to 16.0 Abs. , preferably 1.0 to 12.0 Abs. , more preferably 2.0 to 10.0 Abs. , more preferably 3.0 to 8.0 Abs. It is preferable to set such that
  • the concentration range (measurement range) of SP-D measurable with the measurement reagent of the present invention may be about 10 to 1500 ng/mL, preferably 15 to 1000 ng/mL, when SP-D is measured as a diagnostic marker. mL.
  • the reagent kit of the present invention is a reagent kit for measuring SP-D in a biological sample by an immunoassay method, characterized by containing at least the following elements (1) and (2).
  • a first reagent containing a buffer (2) a second reagent containing latex particles carrying an anti-SP-D monoclonal antibody;
  • a standard reagent or control which is a composition comprising, may also be included.
  • the reagent kit of the present invention may contain a sample pretreatment reagent for pretreating the sample.
  • the sample pretreatment reagent may be included in the first reagent containing the buffer in (1), or may be included in the reagent kit as a separate reagent from (1) and (2).
  • the reagent kit of the present invention can include an instruction manual, sample collection tools (collection pipette, syringe, cotton swab, filtration filter, etc.), sample diluent, and sample extract.
  • the measurement reagent of the present invention may contain macromolecules such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, and phospholipid polymers as components that enhance aggregation formation of insoluble carrier particles.
  • the measuring reagent of the present invention contains components commonly used in preparing immunoassay reagents, such as proteins, amino acids, sugars, surfactants, reducing substances and chaotropic substances, as components for controlling the formation of agglutination. may contain.
  • Example 1 Construction of an SP-D measurement reagent based on the LTIA method: Evaluation of latex particles Varying the physical properties of latex particles (particle size, critical agglutination concentration) to cover the SP-D concentration distribution in human serum It was examined whether an SP-D concentration-dependent change in absorbance was observed within the concentration range of 0 to 1000 ng/mL.
  • LTIA reagent (1) first reagent 100 mM MES-NaOH (pH 6.0) 500 mM NaCl 0.5% BSA sensitizer
  • Example 1-1 The following anti-human SP-D monoclonal antibody-sensitized latex particle solution was treated with 5 mM MOPS-NaOH (pH 7.0) so that the absorbance at a wavelength of 600 nm was 6.0 Abs. It was used as the second reagent by diluting so that
  • Anti-human SP-D monoclonal antibody-sensitized latex particle solution A 1% polystyrene latex solution (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) having an average particle size of 317 nm and a critical aggregation concentration of 280 mM (10 mM MOPS buffer) was added with an equal amount of 10 mM MOPS buffer. An anti-human SP-D monoclonal antibody solution diluted to 0.35 mg/mL with liquid was added and stirred at 4° C. for 2 hours. Then, an equal volume of 0.5% BSA solution (10 mM MOPS buffer solution) was added and stirred at 4° C.
  • an anti-human SP-D monoclonal antibody-sensitized latex solution The anti-human SP-D monoclonal antibody was obtained by a method well known to those skilled in the art using human SP-D (manufactured by GenScript) as an antigen.
  • Example 1-2 Average particle size 109 nm, critical aggregation concentration 390 mM
  • Example 1-3 Average particle size 229 nm, critical aggregation concentration 60 mM
  • Example 1-4 Average particle size 224 nm, critical aggregation concentration 250 mM
  • Example 1-5 Average particle size 332 nm, critical aggregation concentration 60 mM
  • Example 1-6 Average particle size 375 nm, critical aggregation concentration 60 mM
  • Example 1-7 Average particle size 379 nm, critical aggregation concentration 260 mM
  • Example 1-8 Average particle size 432 nm, critical aggregation concentration 260 mM
  • test Samples Physiological saline (sample A) and four arbitrary human serum samples (samples BE) were used as samples.
  • the SP-D concentration in each sample was separately measured using the SP-D kit "Yamasa” EIA II (Yamasa Soy Sauce Co., Ltd., certified external diagnostic reagent (hereinafter referred to as certified reagent)).
  • the measurement method followed the package insert of the reagent.
  • the SP-D concentration of each sample measured by the measurement method was as follows.
  • Specimen A physiological saline (0 ng/mL)
  • Specimen B 56.4 ng/mL
  • Specimen C 208.0 ng/mL
  • Specimen D 609.4 ng/mL
  • Specimen E 1000ng/mL
  • the first reagent and the second reagent of each example were combined, and the SP-D concentration in each sample was measured using a Hitachi automatic analyzer. Specifically, 120 ⁇ L of the first reagent was added to 5 ⁇ L of each sample and heated at 37° C. for 5 minutes. After that, 40 ⁇ L of the second reagent was added and stirred. Subsequently, absorbance changes for 5 minutes were measured at a dominant wavelength of 570 nm and a secondary wavelength of 800 nm. Henceforth, the measurement with the LTIA reagent was performed by the above method unless otherwise specified. 4. Evaluation Method A standard curve was prepared by plotting the SP-D concentration in the sample and the amount of change in measured absorbance (mAbs.).
  • Example 1-1 The results of Example 1-1 are shown in FIG. An SP-D concentration-dependent increase in absorbance was observed in the SP-D concentration range of 0 to 1000 ng/mL. Furthermore, in all of Examples 1-2 to 1-8, SP-D concentration-dependent increases in absorbance were observed at 0 to 1000 ng/mL (not shown). As described above, a calibration curve for the measurement reagent using latex particles with an average particle size of 109 nm to 432 nm and a critical aggregation concentration of 60 mM to 390 mM was obtained. The SP-D concentration in the sample can be quantified based on the calibration curve created in this test.
  • Example 2 Measurement of Serum Specimens A comparative study was conducted between the SP-D values measured in serum by the following LTIA reagent and the SP-D values measured by the certified reagents.
  • Example 2-1 Second reagent of Example 1-1
  • Example 2-2 Second reagent of Example 1-2
  • Example 2-3 Second reagent of Example 1-3
  • Example 2-4 Second reagent of Example 1-4
  • Example 2-5 Second reagent of Example 1-5
  • Example 2-6 Second reagent of Example 1-6
  • Example 2-7 Example 1- Second Reagent of 7
  • Example 2-8 Second Reagent of Example 1-8
  • Test Samples Four random human serum specimens were used as samples. The SP-D concentration of each sample was separately measured using a certified reagent. The SP-D concentration of each sample measured by the kit was as follows. Specimen (1): 127.6 ng/mL Specimen (2): 178.2 ng/mL Specimen (3): 409.0 ng/mL Specimen (4): 804.1 ng/mL
  • LTIA reagent (1) first reagent 100 mM MES-NaOH (pH 6.0) 500 mM NaCl 0.5% BSA sensitizer
  • LTIA reagent 1-1 1.
  • Example 4-1 (1) First reagent 100 mM MES-NaOH (pH 5.0) 500 mM NaCl 0.5% BSA sensitizer
  • Example 4-2 to 4-5 The procedure was carried out in the same manner as in Example 4-1, except that the buffer solution of the first reagent was changed as follows.
  • Example 4-2 100 mM MES-NaOH (pH 6.0)
  • Example 4-3 100 mM MES-NaOH (pH 7.0)
  • Example 4-4 100 mM HEPES-NaOH (pH 8.0)
  • Example 4-5 100 mM Tris-HCl (pH 9.0)
  • Comparative Example 1 100 mM CAPS-NaOH (pH 10.0)
  • Test Samples The same samples (specimens A, B, C, D and E) as in Example 1 were measured.
  • Example 5 Measurement of serum specimen The adequacy of the SP-D measurement value in serum when the pH of the first reagent of the LTIA reagent was changed was examined in comparison with the measurement value by the certified reagent.
  • Example 5-1 First Reagent of Example 4-1
  • Example 5-2 First Reagent of Example 4-2
  • Example 5-3 First Reagent of Example 4-3
  • Example 5-4 First reagent of Example 4-4
  • Example 5-5 First reagent of Example 4-5
  • Evaluation method Calculate the SP-D concentration in each sample from the change in absorbance measured with each LTIA reagent using the calibration curve of each reagent prepared in Example 4, and compare it with the SP-D concentration measured with the certified reagent. A ratio (%) was calculated.
  • Example 6 Correlation evaluation between serum specimen measurement values and plasma specimen measurement values derived from the same donor-1 EDTA plasma LTIA reagent was used to measure the correlation between serum specimens and plasma specimens derived from the same donor as samples. evaluated. Correlation with the addition of divalent metals to the LTIA reagent was also evaluated.
  • LTIA reagent 1-1 Example 6-1 (measurement by LTIA method: no addition of divalent metal) (1) First reagent 100 mM MES-NaOH (pH 6.0) 500 mM NaCl 0.5% BSA sensitizer
  • Example 6-2 (measurement by LTIA method: addition of 10 mM calcium chloride) The procedure was the same as in Example 6-1, except that calcium chloride was added to the first reagent as a divalent metal to a final concentration of 10 mM.
  • Example 6-3 (measurement by LTIA method: addition of 10 mM magnesium chloride) The procedure is the same as in Example 6-1, except that magnesium chloride was added to the first reagent as a divalent metal to a final concentration of 10 mM.
  • Test Samples The following specimens were used as samples. (1) Specimens A, B, C, D, and E described in Example 1 (hereinafter referred to as calibrators) (2) Serum specimens from 19 healthy donors (3) EDTA-2K plasma specimens simultaneously collected from 19 donors from whom the above serum was collected
  • Example 6-2 Under the condition that calcium chloride was added to the first reagent as a divalent metal (Example 6-2), the correlation coefficient between the SP-D measurement value of the serum specimen and the SP-D measurement value of the plasma specimen was 0.997, the slope of the regression line was 1.00, and the correlation was improved compared to Example 6-1. Furthermore, even in the low concentration range, the correlation coefficient was 0.970, and the correlation convergence was remarkably improved compared to Example 6-1 (unadded condition).
  • Example 6-3 Under the condition of adding magnesium chloride as a divalent metal (Example 6-3), the correlation coefficient between the SP-D measurement value of the serum sample and the SP-D measurement value of the plasma sample was 0.994, and the regression line was The slope was 0.94, which improved the correlation compared to Example 6-1. Also, the correlation coefficient in the low concentration region was 0.969, which significantly improved the correlation convergence compared to Example 6-1.
  • Example 7 Correlation evaluation between serum specimen measurement values and plasma specimen measurement values derived from the same donor-2 Heparin lithium plasma In Example 6, EDTA-2 plasma was used as plasma to evaluate the correlation with serum measurement values However, similar evaluation was performed using heparin lithium plasma as the plasma. 19 specimens collected from the same subjects as in Example 6 were used as samples.
  • Example 7-1 (measurement by LTIA method: no addition of divalent metal) Using the reagent used in Example 6-1, the SP-D concentration in the sample was measured.
  • Example 7-2 (measurement by LTIA method: addition of 10 mM calcium chloride) Measurement was performed using the reagents used in Example 6-2.
  • Example 7-3 (measurement by LTIA method: addition of 10 mM magnesium chloride) Measurement was performed using the reagents used in Example 6-3.
  • Test Samples The following specimens were used as samples. (1) Serum samples from the same 19 healthy donors as in Example 6 (2) EDTA-2K plasma simultaneously collected from the 19 donors from whom the above serum was collected
  • Example 7-1 Under conditions where no divalent metal was added to the first reagent (Example 7-1), the correlation coefficient between serum and plasma was 0.994, and the slope of the regression line was 1.03 (three decimal places were rounded off, The same applies below), and the correlation between both samples was good. Under the condition of adding calcium chloride (Example 7-2), the correlation coefficient was 0.994 and the slope of the regression line was 1.03, indicating good correlation. Under the conditions in which magnesium chloride was added (Example 7-3), the correlation coefficient was 0.997 and the slope of the regression line was 0.99, indicating good correlation.
  • the correlation coefficient in the low concentration range was 0.956 under the condition that no divalent metal was added to the first reagent (Example 7-1), and 0.956 under the condition of adding calcium chloride (Example 7-2). 944, and 0.989 under the condition of adding magnesium chloride (Example 7-3), and the correlation convergence was further improved under the condition of adding magnesium chloride (Example 7-3).
  • Example 8 Evaluation of divalent metal concentration to improve the correlation between measured values of serum samples and plasma samples derived from the same donor Correlations between SP-D measurements and plasma specimen SP-D measurements were evaluated.
  • LTIA reagent 1-1 Reference Example 1 (measurement by LTIA method: no divalent metal added) Using a first reagent and a second reagent based on the principle of LTIA described below, the SP-D concentration in the sample was measured with a Hitachi automatic analyzer.
  • Example 8-1 (measurement by LTIA method: addition of 10 mM magnesium chloride) Measurement was performed in the same manner as in Reference Example 1, except that magnesium chloride was added to the first reagent shown in Reference Example 1 so that the final concentration was 10 mM.
  • Example 8-2 (measurement by LTIA method: addition of 25 mM magnesium chloride) Measurement was performed in the same manner as in Reference Example 1, except that magnesium chloride was added to the first reagent shown in Reference Example 1 so that the final concentration was 25 mM.
  • Example 8-3 (measurement by LTIA method: addition of 50 mM magnesium chloride) Measurement was performed in the same manner as in Reference Example 1 except that magnesium chloride was added to the first reagent shown in Reference Example 1 so that the final concentration was 50 mM.
  • Test sample Serum specimens from 15 healthy donors (2) EDTA-2K plasma simultaneously collected from 15 donors from whom the above serum was collected
  • FIG. 6 shows the correlation between the SP-D measurement value of the serum sample and the SP-D measurement value of the plasma sample.
  • the SP-D measurement value of the serum specimen and the SP-D measurement value of the EDTA-2K plasma specimen The correlation coefficient was 0.988 or 0.990, respectively, and the correlation was improved compared to the case of adding 10 mM of magnesium chloride.
  • the correlation coefficient can be further improved by adjusting the divalent metal concentration.
  • Example 9 Suppression of fluctuations in measured values due to freezing and thawing of samples Whether or not fluctuations in LTIA measured values due to freezing and thawing of samples can be suppressed by adding a divalent metal to the reaction solution was examined. gone.
  • Reference example 2 (1) First reagent 100 mM MES-NaOH (pH 6.0) 500 mM NaCl 0.5% BSA sensitizer
  • Example 9 (measurement by LTIA method: addition of 25 mM magnesium chloride) Measurement was performed in the same manner as in Reference Example 2, except that magnesium chloride was added to the first reagent shown in Reference Example 2 so that the final concentration was 25 mM.
  • Test Samples The following specimens were used as samples. (1) Serum specimens from 30 healthy donors (2) EDTA-2K plasma specimens simultaneously collected from the 30 donors from whom the above serum was collected (3) Heparin lithium plasma specimens simultaneously collected from the 30 donors from whom the above serum was collected The collected serum and plasma specimens were aliquoted and stored in tubes. Specimens described as “non-frozen” are specimens that have been refrigerated after subdivided and have not been frozen and thawed. Specimens described as "freeze-thawed once" are specimens that have been re-thawed after being subdivided and stored frozen at -70°C or below.
  • FIG. 7 shows the correlation between the SP-D measurement value of the serum sample and the SP-D measurement value of the plasma sample.
  • (a) to (d) show the results when the reagent of Reference Example 2 was used, and (e) and (f) show the results when the reagent of Example 9 was used.
  • Example 9 When the reagent of Example 9 was used In contrast to the results of Reference Example 2 above, under the condition that magnesium chloride was added to the first reagent at a final concentration of 25 mM, as shown in Example 8-2, unfrozen serum Correlations between analyte measurements and plasma analyte measurements were good. In addition, under these conditions, when the correlation between the serum specimen measured value and the plasma specimen measured value obtained by freezing and thawing once was evaluated (Example 9), the slope of the regression line was 0.930 and the intercept was 3.45 ng. /mL, and the correlation coefficient was 0.998, indicating a very good correlation between these specimen measurements (FIG. 7(e)).
  • LTIA reagent (1) first reagent 100 mM MES-NaOH (pH 6.0) 500 mM NaCl 0.5% BSA 25 mM magnesium chloride sensitizer
  • the present invention it is possible to provide an immunoassay method and a measurement reagent for SP-D in a biological sample, which allows measurement results to be obtained more easily and in a shorter time. Since the immunoassay method and assay reagent of the present invention can be applied to a versatile fully automated analyzer, it is possible to rapidly assay a large amount of specimens.

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Abstract

本発明は、生体由来試料中のＳＰ－Ｄをより簡便に、より短時間で測定できる免疫測定試薬及び免疫測定方法を提供することを課題とする。　液相中で、血清や血漿などの生体由来試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、免疫測定方法により、簡便かつ短時間で、生体由来試料中のＳＰ－Ｄを測定できることを見出した。さらには、液相中に二価金属を共存させることにより生体由来試料の種類や保存歴を問わず正確に測定できることを見出した。

Description

肺サーファクタントプロテインの免疫測定方法及び免疫測定試薬
　本発明は、肺サーファクタントプロテインの免疫測定方法及び測定試薬に関する。特に、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を用いる免疫測定方法及び免疫測定試薬に関する。
　肺サーファクタントは、肺のII型肺上皮細胞より産生・分泌される液状の物質である。肺サーファクタントは、肺胞表面の表面張力を弱めることで肺胞を膨らみやすくし、呼吸やガス交換を助ける働きをする。
　肺サーファクタントプロテイン（以下、単にＳＰと称することがある）は、肺サーファクタントに特異的なアポタンパク質である。ＳＰとしては、親水性タンパク質で、生体防御作用を示し、特異的な脂質と結合するＳＰ－Ａ、ＳＰ－Ｄと、疎水性が強く、リン脂質と会合するＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃが知られている。この中でもＳＰ－Ｄは肺に特異的であり、血清中ＳＰ－Ｄが肺疾患の存在を反映することが知られている。血清中のＳＰ－Ｄの測定により診断可能な肺疾患としては、例えば突発性間質性肺炎、膠原病性間質性肺炎、肺胞蛋白症などが挙げられる（非特許文献１）。
　現在、ＳＰ－Ｄの免疫測定試薬としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によるＳＰ－Ｄキット「ヤマサ」ＥＩＡ　II（非特許文献２）や化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）によるＣＬ　ＳＰ－Ｄ「ヤマサ」ＮＸ（非特許文献３）などが知られている。しかし、ＥＬＩＳＡ法による前記測定試薬では、抗体と試料中のＳＰ－Ｄを反応させるために４時間半もの時間を要することに加え、抗体とＳＰ－Ｄとの免疫複合体を未反応画分と分離するＢ／Ｆ分離工程が必要であり操作が煩雑である。また、非特許文献２のキットを用いる場合、生体試料を希釈してから測定に供する必要があり操作が煩雑である。なお、非特許文献２のキットで測定可能な検体種は血清のみである。
　非特許文献３の試薬では、測定機器として、専用の機器が必要であり、測定可能な検体種も血清のみである。
臨床化学　３２：２１６－２２６、２００３ ＳＰ－Ｄキット「ヤマサ」ＥＩＡ　II　添付文書 ＣＬ　ＳＰ－Ｄ「ヤマサ」ＮＸ添付文書
　本発明は、生体由来試料中のＳＰ－Ｄをより簡便に、より短時間で測定できる免疫測定試薬及び免疫測定方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、液相中で、血清や血漿などの生体由来試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、免疫測定方法により、簡便かつ短時間で、生体由来試料中のＳＰ－Ｄを測定できることを見出した。さらには、試薬組成を工夫することにより生体由来試料の種類や保存歴を問わず正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
生体由来試料中の肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰ－Ｄ）の免疫測定方法であって、
液相中で、当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、前記測定方法。
＜２＞
生体由来試料が血清又は血漿である＜１＞に記載の測定方法。
＜３＞
ラテックス粒子が平均粒子径９０ｎｍ～４５０ｎｍのラテックス粒子である＜１＞又は＜２＞に記載の測定方法。
＜４＞
液相中のラテックス粒子の濃度が０．０１～０．１０％である＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の測定方法。
＜５＞
当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程が以下の工程を含む＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載の測定方法。
（１）液相中で、当該試料と緩衝液を含む第１試薬とを接触させる工程
（２）工程（１）の後に、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む第２試薬を液相中に添加する工程
＜６＞
さらに、試料中のＳＰ－Ｄと抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子の複合体の凝集度合いを光学的に測定する工程を含む＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載の測定方法。
＜７＞
光学的に測定する工程が、散乱光強度、吸光度又は透過光強度を光学機器で測定する工程である＜６＞に記載の測定方法。
＜８＞
液相中のｐＨが５．０～９．０である＜１＞～＜７＞のいずれか１に記載の測定方法。
＜９＞
液相中に二価金属が含まれている＜１＞～＜８＞のいずれか１に記載の測定方法。
＜１０＞
二価金属がマグネシウム又はカルシウムである＜９＞に記載の測定方法。
＜１１＞
生体由来試料中のＳＰ－Ｄを免疫測定法により測定するための試薬であって、少なくとも抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子及び緩衝液を含む前記試薬。
＜１２＞
生体由来試料が血清又は血漿である＜１１＞に記載の測定試薬。
＜１３＞
ラテックス粒子が平均粒子径９０ｎｍ～４５０ｎｍのラテックス粒子である＜１１＞又は＜１２＞に記載の測定試薬。
＜１４＞
液相中のラテックス粒子の濃度が０．０１～０．１０％である＜１１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の測定試薬。
＜１５＞緩衝液のｐＨが５．０～９．０である＜１１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の測定試薬。
＜１６＞
緩衝液中に二価金属が含まれている＜１１＞～＜１５＞のいずれか１に記載の測定試薬。
＜１７＞
二価金属がマグネシウム又はカルシウムである＜１６＞に記載の測定試薬。
＜１８＞
生体由来試料中のＳＰ－Ｄの免疫測定方法における測定値の変動抑制方法であって、
二価金属を含む液相中で、当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、前記測定値の変動抑制方法。
＜１９＞
生体由来試料が血漿である＜１８＞に記載の測定値の変動抑制方法。
＜２０＞
ラテックス粒子が平均粒子径９０ｎｍ～４５０ｎｍのラテックス粒子である＜１８＞又は＜１９＞に記載の測定値の変動抑制方法。
＜２１＞
液相中のラテックス粒子の濃度が０．０１～０．１０％である＜１８＞～＜２０＞のいずれか１に記載の測定値の変動抑制方法。
＜２２＞
二価金属がマグネシウム又はカルシウムである１８～２１のいずれか１に記載の測定値の変動抑制方法。
＜２３＞
生体由来試料中のＳＰ－Ｄを免疫測定法により測定するための試薬キットであって、以下を含む試薬キット。
（１）緩衝液を含む第１試薬
（２）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子含む第２試薬
　本発明によれば、より簡便に、より短時間で測定結果が得られる生体由来試料中のＳＰ－Ｄの免疫測定方法及び測定試薬を提供することができる。
本発明試薬の、ＳＰ－Ｄ濃度依存的な感度変化を示す（実施例１－１）。 本発明試薬と、ＥＬＩＳＡ試薬の測定値の相関性を示す（実施例３）。 本発明の第一試薬の緩衝液ｐＨを変動した際のＳＰ－Ｄ濃度依存的な感度変化を示す（実施例４）。 本発明試薬により同一ドナー由来の血清検体測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体測定値との相関性を示す（実施例６）。 本発明試薬により同一ドナー由来の血清検体測定値とヘパリンリチウム血漿検体測定値との相関性を示す（実施例７）。 本発明試薬の塩化マグネシウムの濃度を変動した際の、同一ドナー由来の血清検体測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体測定値検体測定値との相関性を示す（実施例８）。 保存状態の異なる試料について、本発明の塩化マグネシウム添加試薬と未添加試薬により測定した同一ドナー由来の血清検体測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体測定値との相関性、又は血清検体測定値とヘパリンリチウム血漿検体測定値との相関性を示す（実施例９）。 本発明試薬とＥＬＩＳＡ試薬の測定値の相関性を示す（実施例１０）。
（免疫測定方法）
　本発明は、生体由来試料中の肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰ－Ｄ）の免疫測定方法であって、液相中で、当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、前記測定方法である。
　本発明の免疫測定方法は、抗原であるＳＰ－Ｄに対する抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子などの不溶性担体を用いて、免疫複合体を形成し、免疫複合体の形成に伴うラテックス粒子の凝集度合を検出することによりＳＰ－Ｄを測定する方法であり、いわゆる免疫凝集法と呼ばれる方法である。また、不溶性担体粒子としてラテックスを利用する方法を特にラテックス免疫凝集法（以下単にＬＴＩＡということがある）という。したがって、本発明は、ＳＰ－ＤをＬＴＩＡにより測定する方法である。
　ここで、従来のＳＰ－Ｄの測定方法として知られているＥＬＩＳＡ法及びＣＬＥＩＡ法は、Ｂ／Ｆ分離のための洗浄工程を必要とするヘテロジーニアス法であるのに対して、本発明のＬＴＩＡはＢ／Ｆ分離を必要としないホモジーニアス法である。したがって、本発明のＳＰ－ＤをＬＴＩＡにより測定する方法によれば、工程の簡略化と測定時間の短時間化を図ることができる。
　ＬＴＩＡは、ＳＰ－Ｄと抗ＳＰ－Ｄ抗体が担持されたラテックス粒子とが結合することにより生じた凝集の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより測定対象であるＳＰ－Ｄの濃度を測定できる。光学的に観察する方法としては、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を光学機器で測定する方法（エンドポイント法、レート法等）が挙げられる。本発明において、ラテックス免疫凝集法は、濁りを測定する検出方法に応じて免疫比濁法（ＴＩＡ）、免疫比ろう法（ＮＩＡ）と細分化される方法等を含む。試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（濃度が既知のＳＰ－Ｄを含む試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたＳＰ－Ｄの濃度（定量値）を算出する。なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。測定波長は、５００ｎｍから８００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
  本発明による試料中のＳＰ－Ｄの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。また、本発明による測定は、２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより実施することが好ましい。
（測定対象物質）
  本発明における測定対象物質は、肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰ－Ｄ）である。
　肺サーファクタントプロテインは、肺サーファクタントに特異的なアポタンパク質である。親水性タンパク質で、生体防御作用を示し、特異脂質と結合するＳＰ－Ａ、ＳＰ－Ｄと、疎水性が強く、リン脂質と会合するＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃが知られている。本発明では、肺に特異的であり、肺疾患の存在を反映することが知られているＳＰ－Ｄを測定対象とする。
（生体由来試料）
　本発明における試料は、ＳＰ－Ｄを含みうる生体由来の試料であれば特に限定はされない。本発明における試料は、典型的にはヒト又は動物から採取された血液試料であり、例えば全血、血清、血漿である。本発明における血漿試料には、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿なども含まれる。本発明における生体由来試料は、ヒト又は動物から採取されてから数時間以内の新鮮な検体でもよいし、採取後、冷蔵保存された検体、凍結保存後融解された検体でもよい。本発明における生体試料は、生体から採取した後に前処理された試料であってもよいし、生体から採取した後に緩衝液などで希釈された試料であってもよい。
　従来のＳＰ－Ｄ免疫測定試薬は、適用検体種が血清のみであったことから、本発明のＬＴＩＡ法により血漿中のＳＰ－Ｄを測定することができるようになった意義は大きい。例えば、へパリン血漿等の一部の血漿試料は、試料が凝結するのを待つ必要がないため、血清よりも検査時間が短縮でき、緊急検査において都合がよい。本発明の測定方法により、血清、血漿の双方においてＳＰ－Ｄを測定可能となったことは、ユーザービリティー向上に貢献する。さらに、本発明の測定方法によれば、試料採取後に凍結保存した後、融解した試料においても測定値の変動なく、正確な測定ができるようになる。
（ラテックス粒子）
　本発明において抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持された抗体ラテックス粒子としては、免疫測定試薬として一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されない。ラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン等のフェニル基を有する重合性単量体、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩等のフェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α－ナフチル、（メタ）アクリル酸β－ナフチル等のナフチル基を有する重合性単量体などの重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸等の重合性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸－ｎ－ブチル、（メタ）アクリル酸－２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール－ジ－（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル等の重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール－（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ－ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル等の不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類等を挙げることができる。これらのモノマーは、要求される表面特性、比重等によって適宜選択され、１種を単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
　本発明において抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックスの平均粒子径は、ＳＰ－Ｄの濃度０～１０００ｎｇ／ｍＬの範囲全域で感度差を得られる平均粒子径であればよい。１種類のラテックス粒子を用いてもよいし、平均粒子径が異なる２種類以上のラテックス粒子を用いてもよい。ラテックス粒子の平均粒子径は、好ましくは５０ｎｍ～１０００ｎｍ、より好ましくは９０ｎｍ～５００ｎｍ、よりいっそう好ましくは９０ｎｍ～４５０ｎｍである。ラテックス粒子の平均粒子径は、２２４～３７５ｎｍが最も好ましい。ラテックス粒子の平均粒子径が５０ｎｍ未満の場合、低濃度域から中濃度域の感度が低下し測定精度が下がる可能性がある。また、ラテックス粒子の平均粒子径が１０００ｎｍを超えると低濃度域の感度は上昇する一方で高濃度域ではいわゆるフック現象が発生し実濃度より低い測定値が得られる可能性がある。後述する実施例においては、１種類のラテックス粒子を用いて広範囲の濃度のＳＰ－Ｄの測定を実現したが、大小２種類以上の平均粒子径のラテックス粒子を用いてさらに測定可能な濃度範囲を拡大することもできる。例えば、ＳＰ－Ｄ低濃度域（例えば０～２００ｎｇ／ｍＬ）で感度差が大きいラテックス粒子と、ＳＰ－Ｄ中濃度～高濃度域（例えば２００～１０００ｎｇ／ｍＬ）で感度差が大きいラテックス粒子を組み合わせるなど、２種類以上のラテックス粒子を組み合わせて使用することもできる。さらには、後述する認識部位の異なる２種類の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を２種類の平均粒子径の異なるラテックス粒子と組み合わせることもできる。
　ラテックス粒子の平均粒子径は、レーザー回析・散乱法（ＬＳ法）、コールター原理、動的光散乱光子相関法、電子顕微鏡などで解析することができる。
　ラテックス粒子の臨界凝集濃度とは、ラテックス粒子懸濁液中の塩濃度を増大させていった場合に、ラテックスが凝集しない最大の塩濃度のことである。抗体を担持していないラテックス粒子に段階的に塩を加え、完全に自己凝集する塩濃度を求め、その濃度の１段階薄い塩濃度を臨界凝集濃度とする。例えば以下に記載の方法で臨界凝集濃度を算出することができる。１０～４００ｍＭの範囲で１０ｍＭごとに濃度を変動させたリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）を準備し、各濃度のリン酸ナトリウム水溶液に、ラテックス粒子を最終濃度１％（Ｗ／Ｖ）になる量を投入して攪拌する。１分間経過後に目視でラテックス粒子が自己凝集しているか否か確認する。ラテックス粒子が完全に自己凝集する濃度より１段階薄いリン酸ナトリウム水溶液濃度を臨界凝集濃度（最大非凝集濃度）とする。
　本発明におけるラテックス粒子の臨界凝集濃度（リン酸ナトリウム水溶液濃度）は、好ましくは１０ｍＭ～５００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ～４００ｍＭ、さらに好ましくは６０ｍＭ～３９０ｍＭである。臨界凝集濃度が１０ｍＭ未満のラテックス粒子では、ラテックス粒子の分散を保つことが難しく、臨界凝集濃度が５００ｍＭ以上のラテックス粒子では、粒子同士の反発により、ＬＴＩＡにおける抗原抗体反応を介したラテックス粒子の凝集が抑制される可能性がある。
　ラテックス粒子の臨界凝集濃度は、原料の重量比を適宜変更することにより調整することができる。例えば、スチレンラテックス粒子は、スチレンなどのフェニル基を有する重合性単量体の所定量と、所定量のスチレンスルホン酸ナトリウムなどのフェニル基とスルホン酸塩とを有する重合性単量体とを、水系媒体中で共重合させることにより得られるが、スチレンとスチレンスルホン酸ナトリウムの混合比を変更することで臨界凝集濃度を調整することができる。
　ラテックス粒子の平均粒子径と臨界凝集濃度の範囲の組み合わせとしては、前記の粒子径と臨界凝集濃度を任意で組み合わせることができる。すなわち、平均粒子径が５０ｎｍ～１０００ｎｍであり、かつ、臨界凝集濃度が１０ｍＭ～５００ｍＭであるラテックス粒子が好ましく、平均粒子径が９０ｎｍ～５００ｎｍであり、かつ、臨界凝集濃度が１０ｍＭ～４００ｍＭであるラテックス粒子がより好ましく、平均粒子径が９０ｎｍ～４５０ｎｍであり、かつ、臨界凝集濃度は６０ｍＭ～３９０ｍＭであるラテックス粒子がよりいっそう好ましい。
　本発明の測定方法で使用されるラテックス粒子は、感度向上等の所望の性能を得るため、材質や粒子径を適宜選択することができ、材質や粒子径が異なるものを組み合わせて使用することもできる。
（ラテックス粒子の濃度）
　本発明の測定方法における測定溶液中(液相中)のラテックス粒子の濃度は所望の感度や性能に応じて適宜設定することができる。測定溶液(液相)とは、血清や血漿などの生体由来試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む試薬とを混合した溶液であり、ＬＴＩＡにおいて抗原抗体反応による吸光度変化を測定する対象の溶液を示す。測定溶液中のラテックス粒子の濃度は、例えば、０．０１～０．１０重量％である。より具体的には、平均粒子径９０～４５０ｎｍのポリスチレンラテックス粒子を用いる場合には、測定溶液中のラテックス粒子の濃度は、０．０１～０．１０重量％、好ましくは０．０１～０．０９重量％、より好ましくは０．０２～０．０８重量％、さらに好ましくは０．０２～０．０７重量％とすることができる。測定溶液中のラテックス粒子の濃度は、ラテックス粒子の吸光度値より規定することもできる。ラテックス粒子の吸光度は、ラテックス粒子を含む液体の吸光度から、ラテックス粒子を含まない同一組成の液体の吸光度を差し引くことで算出できる。６００ｎｍにおける吸光度の場合、測定溶液中に含まれるラテックス粒子の吸光度値は０．１～４．０Ａｂｓ．が好ましい。さらに平均粒子径９０～４５０ｎｍのポリスチレンラテックス粒子を用いる場合には、測定溶液中に含まれるラテックス粒子の吸光度は０．１～４．０Ａｂｓ．、好ましくは０．３～３．０Ａｂｓ．、より好ましくは０．５～２．５Ａｂｓ．、さらに好ましくは０．７５～２．０Ａｂｓ．とすることができる。
（抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子）
　ＳＰ－Ｄに対するモノクローナル抗体は、物理的吸着（疎水結合）法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により不溶性担体粒子であるラテックス粒子に担持させることができる。
　物理的吸着法を採用する場合は、公知の方法によりラテックス粒子へ抗体を担持させることができる。例えば、ＳＰ－Ｄに対するモノクローナル抗体と、ラテックス粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させる方法、又は、緩衝液等に溶解したＳＰ－Ｄに対するモノクローナル抗体を、ラテックス粒子に接触させる方法等によりラテックス粒子へ抗体を担持させることができる。
　化学的結合法を採用する場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従ってラテックス粒子へ抗体を担持させることができる。例えば、ＳＰ－Ｄに対する抗体と、ラテックス粒子とに含まれるアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等を、それぞれ、二価性の架橋試薬のグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等と反応させることにより、ラテックス粒子へ抗体を担持させることができる。
　本発明の免疫測定方法において、ラテックス粒子に担持された抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、少なくとも１種類であればよく、認識部位の異なる２種類以上のモノクローナル抗体（第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体）を用いてもよい。２種類以上の抗体を用いる場合には、第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体がそれぞれ別のラテックスに担持されていてもよいし、同一のラテックスに複数種類の抗体が担持されていてもよい。
　抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が１種類である場合において、ラテックス粒子は１種類であってもよく、大きさの異なる２種類以上であってもよい。
　大きさの異なる２種類のラテックス粒子を用いる場合、それぞれのラテックス粒子の平均粒子径は、低濃度域で感度を発揮する大きな粒子径のラテックス粒子（例えば、３００～５００ｎｍ）と測定可能な濃度範囲（測定レンジ）を拡大可能な前記の粒子径よりも小さな粒子径のラテックス粒子（例えば５０～３００ｎｍ）を組み合わせることが好ましい。ラテックス粒子の平均粒子径の組合せや、平均粒子径の異なるラテックス粒子の測定溶液中における量比は、適宜調整することができる。
  ラテックス粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ラテックス粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させる等、公知の方法によりラテックス粒子のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
（抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体）
　本発明において抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって取得することができる。すなわち、抗原としてヒトＳＰ－Ｄをリン酸緩衝液や生理食塩液などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することによりに容易に製造できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
　免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができ、より好ましくはマウスを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
　モノクローナル抗体を得る場合、引き続き以下の操作が行われるが、それに限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８８））に記載の方法に準じて行うことができる。
　最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有するミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、またミエローマ細胞は、融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
　抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングについて説明する。ハイブリドーマのスクリーニングは、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮して実施することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｂｉａｃｏｒｅ法等により、ヒトＳＰ－Ｄに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。具体的には、培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化したヒトＳＰ－Ｄと反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、ヒトＳＰ－Ｄに対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
　選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有する抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の精製は、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
　本発明において、前記のように動物への免疫工程を経て得られた抗ＳＰ－Ｄ抗体だけではなく、遺伝子組換え技術を使用して得られる抗体や、キメラ抗体を用いることもできる。また、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体としては、抗体分子全体を用いてもよいし、抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を用いてもよい。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらの機能性断片は前記のようにして得た抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
（二価金属）
　本発明の免疫測定方法において、試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とが接触する反応液(液相)が二価金属（原子）を含んでいることが好ましい。本発明者らは、抗原抗体反応が生じる反応液に二価金属を共存させることにより、生体由来試料が血漿の場合と血清の場合との測定値が同等になることを見出した。特に、凍結保存された血漿を融解したものを試料とする場合の測定値と、未凍結の血漿を試料とする場合の測定値との間の差異が、二価金属を反応液中に共存させることにより抑制され、凍結融解した血漿を試料とした場合においても血清と同等の測定値が得られた。このように本発明によれば、ＳＰ－ＤのＬＴＩＡによる測定において、試料の種類や試料の保存状態を問わずに正確なＳＰ－Ｄの測定が可能となる。したがって、自動分析装置による連続した測定において、試料の種類や状態によって試薬や測定条件を変更することなく測定することができるため効率的である。
　本発明において二価金属の提供される形態としては、二価金属塩や二価金属錯体などの二価金属化合物の形態が挙げられる。このうちでも取り扱い易さなどから二価金属塩が好ましく用いられる。
　二価金属の構成原子としては特に限定されないが、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属原子や、鉄、亜鉛等が挙げられる。二価金属の構成原子としては、マグネシウム又はカルシウムが好ましく、マグネシウムが特に好ましい。
　二価金属塩としては、塩化物、硫酸塩、などを用いることができ、塩化物を用いることが好ましい。二価金属錯体としては例えば、単座配位子、２座配位子、アミン系配位子、イミン系配位子、ホスフィン系配位子、アミノ酸、糖、核酸、エチレンジアミン四酢酸、クラウンエーテルなどの配位子と二価金属が配位結合して形成される錯体を用いることができる。
　本発明において二価金属は、抗原抗体反応が行われる反応液中(液相中)に存在すればよい。したがって、試薬構成の第１試薬又は第２試薬のいずれか、若しくは両方に添加されていてもよいし、反応液に別途添加してもよい。二価金属は少なくとも第１試薬に添加されていることが好ましい。また、二価金属は、前処理液に含まれていてもよい。
　本発明において、反応液中の二価金属の濃度は、０．５ｍＭ以上５００ｍＭ以下が好ましい。反応液中の二価金属の濃度が０．５ｍＭ未満では測定値の変動抑制効果に乏しく、５００ｍＭより高い濃度では、抗原抗体反応が阻害される可能性がある。反応液中の二価金属の濃度は、より好ましくは５ｍＭ以上５０ｍＭ以下である。
　試薬における二価金属の濃度も抗原抗体反応が行われる反応液中で前記の濃度となるように設定すればよい。
（接触）
　液相中で、ＳＰ－Ｄを含む生体由来試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる態様としては、典型的には、以下の（１）～（３）の態様が挙げられる。
（１）試料と緩衝液を混合した後、当該混合液に抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を混合する態様、
（２）試料、緩衝液、及び、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を同時に混合する態様、
（３）緩衝液と抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を混合した後、当該混合液に試料を混合する態様
　また、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子が、第１の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子と第２の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子との２種類である場合には、それぞれのラテックス粒子を同時又は逐次に混合する態様を適宜選択することができる。
（測定試薬）
　本発明の測定試薬は、血液試料中のＳＰ－Ｄを免疫凝集法により測定するための液状の試薬であって、少なくとも１種類の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む。典型的には、２つ以上の試薬により構成され、そのうち少なくとも１つの試薬は抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含み、他の試薬は緩衝液を含む。　本発明の測定試薬は、第一試薬と第二試薬とからなる２試薬型の測定試薬が好ましい。例えば、２試薬型の測定試薬の第一試薬は、ＳＰ－Ｄを含む生体由来試料を希釈するための緩衝液を含む試薬であり、第二試薬は、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む試液である。
　本発明の測定試薬に含まれる緩衝液には、緩衝作用を有する緩衝剤が含まれており、緩衝剤としては、一般的に使用されるものであればよく、例えばトリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、グルタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩などの緩衝剤や、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝剤などが挙げられる。
　試薬中の緩衝剤の濃度は、試薬中の不溶性担体粒子の自然凝集が起こらず、かつ、所望の抗原抗体反応が行われる濃度範囲であればよく、反応溶液中において３０ｍＭ以上あればよく、好ましくは５０ｍＭ以上、さらに好ましくは７５ｍＭ以上である。
　本発明の測定方法の反応液(液相)のｐＨ及び本発明の測定試薬の緩衝液のｐＨとしては、抗原抗体反応が生じうるｐＨであればよく、好ましくはｐＨ５．０～９．０、さらに好ましくはｐＨ５．０～８．５、よりいっそう好ましくはｐＨ５．０～８．０である。
　本発明の測定試薬は、前記の二価金属の塩以外にさらに別の塩を含むことが望ましい場合がある。塩の種類としては、無機塩が望ましく、無機塩としては塩化ナトリウム等を挙げることができる。
　測定試薬中の二価金属塩以外の塩の濃度は、試薬中の不溶性担体粒子の自然凝集が起こらず、かつ、所望の抗原抗体反応が行われる濃度範囲であればよく、反応液中において５０ｍＭ以上あればよく、好ましくは１００ｍＭ以上、さらに好ましくは２００ｍＭ以上、よりいっそう好ましくは３００ｍＭ以上である。
　本発明における第二試薬中のラテックス粒子の濃度は所望の感度や性能に応じて適宜設定することができる。また、第一試薬と第二試薬の混合比に応じて、適宜設定することができる。第二試薬中のラテックス粒子の濃度は、例えば、０．０１～０．１０重量％であることができる。ラテックス粒子の濃度を６００ｎｍにおける吸光度で規定する場合、第二試薬中に含まれるラテックス粒子の好ましい吸光度値は０．４～１６．０Ａｂｓ．である。平均粒子径９０～４５０ｎｍのポリスチレンラテックスを用いる場合には、第二試薬中に含まれるラテックス粒子の６００ｎｍにおける吸光度値は０．４～１６．０Ａｂｓ．、好ましくは１．０～１２．０Ａｂｓ．、より好ましくは２．０～１０．０Ａｂｓ．、さらに好ましくは３．０～８．０Ａｂｓ．となるように設定することが好ましい。
　本発明の測定試薬で測定可能なＳＰ－Ｄの濃度範囲（測定レンジ）は、ＳＰ－Ｄを診断用マーカーとして測定する場合、１０～１５００ｎｇ／ｍＬ程度であればよく、望ましくは１５～１０００ｎｇ／ｍＬである。
(試薬キット)
　本発明の試薬キットは、少なくとも下記（１）及び（２）の要素を含むことを特徴とする生体由来試料中のＳＰ－Ｄを免疫測定法により測定するための試薬キットである。
（１）緩衝液を含む第１試薬
（２）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子含む第２試薬
　本発明の試薬キットは、上記測定試薬の他に、既知濃度のＳＰ－Ｄを含む組成物である標準試薬又はコントロールを含んでいてもよい。
　また、本発明の試薬キットは試料を前処理するための試料前処理試薬を含んでいてもよい。試料前処理試薬は（１）の緩衝液を含む第一試薬に含まれていてもよいし、（１）、（２）とは別の試薬として試薬キットに含まれていてもよい。
　さらに、本発明の試薬キットは、使用説明書、試料採取用具（採取ピペット、シリンジ、綿棒、ろ過フィルターなど）、試料希釈液、試料抽出液を含むことができる。
（その他の試薬成分）
　本発明の測定試薬は、不溶性担体粒子の凝集形成を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでもよい。また、本発明の測定試薬は、凝集の形成をコントロールする成分として、タンパク質、アミノ酸、糖類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質などの免疫測定試薬を調製する上で汎用される成分を含んでもよい。
［実施例１］ＬＴＩＡ法に基づくＳＰ－Ｄ測定試薬の構築：ラテックス粒子の評価
　ラテックス粒子の物理的性質（粒子径、臨界凝集濃度）を変動し、ヒト血清中のＳＰ－Ｄ濃度分布を網羅する濃度範囲である０～１０００ｎｇ／ｍＬの間で、ＳＰ－Ｄ濃度依存的な吸光度変化が認められるか検討した。
１．ＬＴＩＡ試薬
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ６．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
　増感剤
（２）第二試薬
（２－１）実施例１－１
　下記の抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス粒子溶液を５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）で波長６００ｎｍの吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように希釈して第二試薬とした。
（ｉ）抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス粒子溶液
　平均粒子径３１７ｎｍ、臨界凝集濃度２８０ｍＭの１％ポリスチレンラテックス溶液（積水メディカル社製）（１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液）に、等量の１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液で０．３５ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体溶液を添加して４℃、２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡ液（１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液）を添加して４℃、１時間攪拌し、抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス溶液を作製した。なお、抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、ヒトＳＰ－Ｄ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）を抗原として使用し、当業者周知の方法にて取得した。
（ｉｉ）ラテックス粒子の物理的性質
（ａ）ラテックス粒子の粒子径の測定方法
　レーザー回析・散乱法粒度分布装置ＬＳ１３３２０（ベックマンコールター社製）でラテックス粒子径を解析した。
（ｂ）ラテックス粒子の臨界凝集濃度の測定方法
　リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）を１０～４００ｍＭの範囲で１０ｍＭごとに準備し、各濃度のリン酸ナトリウム水溶液に、ラテックス粒子を終濃度１％（ｗ／ｖ）になるように投入して攪拌した。１分間経過後にラテックスが自己凝集しているか否かを目視で確認し、完全に自己凝集する濃度の１段階薄いリン酸ナトリウム水溶液濃度を臨界凝集濃度とした。
（２－２）実施例１－２～１－８
　実施例１－１のラテックス粒子（平均粒子径３１７ｎｍ、臨界凝集濃度２８０ｍＭ）を以下のように変更した以外は同様にＬＴＩＡ試薬を調製した。
実施例１－２：平均粒子径１０９ｎｍ、臨界凝集濃度３９０ｍＭ
実施例１－３：平均粒子径２２９ｎｍ、臨界凝集濃度６０ｍＭ
実施例１－４：平均粒子径２２４ｎｍ、臨界凝集濃度２５０ｍＭ
実施例１－５：平均粒子径３３２ｎｍ、臨界凝集濃度６０ｍＭ
実施例１－６：平均粒子径３７５ｎｍ、臨界凝集濃度６０ｍＭ
実施例１－７：平均粒子径３７９ｎｍ、臨界凝集濃度２６０ｍＭ
実施例１－８：平均粒子径４３２ｎｍ、臨界凝集濃度２６０ｍＭ
２．被検試料
　生理食塩液（検体A）、及び任意のヒト血清４検体（検体B～E）を試料として用いた。
　なお、それぞれの試料中のＳＰ－Ｄ濃度を、別途ＳＰ－Ｄキット「ヤマサ」ＥＩＡ　II（ヤマサ醤油株式会社、既認証体外用診断薬（以下、既認証試薬とする））を用いて測定した。測定方法は試薬の添付文書に従った。当該測定方法による各試料のＳＰ－Ｄ濃度は以下の通りであった。　
　検体A：生理食塩液（０ｎｇ／ｍＬ）
　検体B：５６．４ｎｇ／ｍＬ
　検体C：２０８．０ｎｇ／ｍＬ
　検体D：６０９．４ｎｇ／ｍＬ
　検体E：１０００ｎｇ／ｍＬ
３．測定方法
　第一試薬と各実施例の第二試薬とをそれぞれ組み合わせ、日立自動分析装置を用いて、各試料中のＳＰ－Ｄ濃度を測定した。具体的には、各試料５μＬに第一試薬を１２０μＬずつ加えて、３７℃、５分間加熱した。その後、第二試薬を４０μＬずつ添加して攪拌した。続いて、５分間の吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。以降、ＬＴＩＡ試薬による測定は、別途記載がない限り上記の方法で実施した。
４．評価方法
　試料中のＳＰ－Ｄ濃度と、測定された吸光度の変化量（ｍＡｂｓ．）をプロットし、検量線を作成した。
５．評価結果
　実施例１－１の結果を図１に示した。ＳＰ－Ｄ濃度範囲０～１０００ｎｇ／ｍＬで、ＳＰ－Ｄ濃度依存的な吸光度上昇を認めた。さらに、実施例１－２～１－８のいずれも、０～１０００ｎｇ／ｍＬで、ＳＰ－Ｄ濃度依存的な吸光度上昇を認めた(図示せず)。
　以上より、平均粒子径は１０９ｎｍ～４３２ｎｍ、臨界凝集濃度は６０ｍＭ～３９０ｍＭのラテックス粒子を用いた測定試薬の検量線が得られた。本試験で作成した検量線をもとに試料中のＳＰ－Ｄ濃度を定量することができる。
［実施例２］血清検体の測定
　下記のＬＴＩＡ試薬による血清中のＳＰ－Ｄ測定値と、既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値との比較検討を行った。
１．ＬＴＩＡ試薬
　本実施例における試薬は、実施例１の第一試薬、及び以下に示す実施例１の第二試薬を用いた。
実施例２－１：実施例１－１の第二試薬
実施例２－２：実施例１－２の第二試薬
実施例２－３：実施例１－３の第二試薬
実施例２－４：実施例１－４の第二試薬
実施例２－５：実施例１－５の第二試薬
実施例２－６：実施例１－６の第二試薬
実施例２－７：実施例１－７の第二試薬
実施例２－８：実施例１－８の第二試薬
２．被検試料
　任意のヒト血清４検体を試料として用いた。
　なお、各試料のＳＰ－Ｄ濃度を、別途既認証試薬を用いて測定した。当該キットにより測定した各試料のＳＰ－Ｄ濃度は以下の通りであった。
　検体（１）：１２７．６ｎｇ／ｍＬ
　検体（２）：１７８．２ｎｇ／ｍＬ
　検体（３）：４０９．０ｎｇ／ｍＬ
　検体（４）：８０４．１ｎｇ／ｍＬ
３．評価方法
　実施例１で作成した検量線を用いて各試料のＳＰ－Ｄ濃度を算出し、既認証試薬で測定したＳＰ－Ｄ濃度との相対比（％）を算出した。
４．測定結果及び考察
　結果を表１に示した。
　本結果によれば、ＳＰ－Ｄ濃度の異なるヒト血清４検体において、実施例２－１～２－８のＬＴＩＡ試薬を用いた測定値で、既認証試薬による測定値の相対比が８０－１２０％となったことから、各測定試薬により既認証試薬と同等に血清試料中のＳＰ－Ｄ濃度を定量できることが分かった。
　以上より、平均粒子径が１００ｎｍ～４３２ｎｍ、臨界凝集濃度が６０ｍＭ～３９０ｍＭであるラテックス粒子を用いたいずれの試薬においても、試料中のＳＰ－Ｄ濃度を正確に測定可能であった。
　さらに、ラテックス粒子の平均粒径が２２４～３７５ｎｍである場合、既認証試薬による測定値の相対比が８５－１１５％となったことから、よりいっそう既認証試薬と同等に血清試料中のＳＰ－Ｄ濃度を定量できることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例３］試薬の既認証試薬に対する相関性評価
　下記のＬＴＩＡ試薬によるＳＰ－Ｄ測定値と、既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値との相関性を評価した。
１．ＬＴＩＡ試薬
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ６．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
増感剤
（２）第二試薬
　抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス（実施例１－１）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ７．０）
２．被検試料
　任意のヒト血清１９検体を試料として用いた。
　なお、各試料のＳＰ－Ｄ濃度を、別途既認証試薬を用いて測定した。
３．ＬＴＩＡ試薬と既認証試薬の測定値の相関性評価方法
　まず、実施例１－１で作成した検量線を用いて、各ＬＴＩＡ試薬で測定した吸光度変化から各試料中のＳＰ－Ｄ濃度を算出した。次に、既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値を横軸、ＬＴＩＡ試薬のＳＰ－Ｄ測定値を縦軸として散布図を作成した。さらに、統計学的手法によって算出した相関係数と回帰直線の傾きを比較して、本発明のＬＴＩＡ試薬によるＳＰ－Ｄ測定値と既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値の相関性を評価した。結果を図２に示す。
４．評価結果
　ＬＴＩＡ試薬によるＳＰ－Ｄ測定値と既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値との回帰直線の傾きは、１．０３３で、測定方法の違いによる測定値の著しい差は認められなかった。さらに、相関係数は０．９９７であり、両測定方法は高い相関性を示した。
　以上の結果より、ＳＰ－Ｄ測定用ＬＴＩＡ試薬は、多数の実検体についても既認証試薬と同等の測定値を示すことが確認された。
［実施例４］第一試薬のｐＨ変動による影響の評価
　ＬＴＩＡ試薬の第一試薬の緩衝液の種類及びｐＨを変動させ、ＳＰ－Ｄ濃度依存的な吸光度変化を検討した。
１．ＬＴＩＡ試薬
１－１．実施例４－１
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ５．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
　増感剤
（２）第二試薬
　抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス（実施例１－１）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ７．０）
１－２．実施例４－２～４－５
　実施例４－１の第一試薬の緩衝液を以下のように変更した以外は同様に行った。
実施例４－２：１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）
実施例４－３：１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
実施例４－４：１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）
実施例４－５：１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
比較例１：１００ｍＭ　ＣＡＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）
２．被検試料
　実施例１と同一の試料（検体A、B、C、D、E）を測定した。
３．評価方法
　実施例１と同一の方法で評価した。
４．評価結果
　結果を図３に示した。実施例４－１～４－５いずれのＬＴＩＡ試薬を用いた場合でも、ＳＰ－Ｄ濃度０～１０００ｎｇ／ｍＬにおいて、ＳＰ－Ｄ濃度依存的な吸光度上昇を認めた。以上より、第一試薬のｐＨは５．０～９．０において、本試験で作成した検量線をもとに試料中のＳＰ－Ｄ濃度を定量できることが分かった。なお、比較例１（ｐＨ１０）では吸光度上昇が認められなかった。
［実施例５］血清検体の測定
　ＬＴＩＡ試薬の第一試薬のｐＨを変動させた際の、血清中のＳＰ－Ｄ測定値の妥当性について、既認証試薬による測定値と対比し検討した。
１．ＬＴＩＡ試薬
　試薬は、以下に示す実施例４の第一試薬、及び実施例１－１の第二試薬を用いた。
実施例５－１：実施例４－１の第一試薬
実施例５－２：実施例４－２の第一試薬
実施例５－３：実施例４－３の第一試薬
実施例５－４：実施例４－４の第一試薬
実施例５－５：実施例４－５の第一試薬
２．被検試料
　任意のヒト血清３検体を試料として用いた。それぞれの試料を既認証試薬を用いて測定した。既認証試薬で測定した各試料のＳＰ－Ｄ濃度は以下の通りであった。
　検体（５）：１５５．１　ｎｇ／ｍＬ
　検体（６）：４４１．４　ｎｇ／ｍＬ
　検体（７）：８８２．０　ｎｇ／ｍＬ
３．評価方法
　実施例４で作成した各試薬の検量線を用いて各ＬＴＩＡ試薬により測定した吸光度変化から各試料中のＳＰ－Ｄ濃度を算出し、既認証試薬で測定したＳＰ－Ｄ濃度との相対比（％）を算出した。
４．測定結果及び考察
　結果を表２に示した。
　本結果によれば、ＳＰ－Ｄ濃度の異なるヒト血清３検体において、実施例５－１～５－５の測定値で、既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値の相対比が８０～１２０％となったことから、既認証試薬と同等に血清試料中のＳＰ－Ｄ濃度を定量できることが分かった。
　以上より、第一試薬のｐＨが５．０～９．０の範囲である場合、いずれのＬＴＩＡ試薬においても、試料中のＳＰ－Ｄ濃度を正確に測定可能であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例６］同一ドナー由来の血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性評価－１　ＥＤＴＡ血漿
　ＬＴＩＡ試薬で試料として同一ドナー由来の血清検体と血漿検体とを測定した場合の相関性を評価した。また、ＬＴＩＡ試薬に二価金属を添加した場合の相関性も評価した。
１．ＬＴＩＡ試薬
１－１．実施例６－１（ＬＴＩＡ法による測定：二価金属の添加なし）
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ６．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
　増感剤
（２）第二試薬
　抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス（実施例１－１と同じ。）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ７．０）
１－２．実施例６－２（ＬＴＩＡ法による測定：１０ｍＭ　塩化カルシウム添加）
　第一試薬に、二価金属として塩化カルシウムを終濃度１０ｍＭとなるよう添加したこと以外は実施例６－１と同様である。
１－３．実施例６－３（ＬＴＩＡ法による測定：１０ｍＭ　塩化マグネシウム添加）
　第一試薬に、二価金属として塩化マグネシウムを終濃度１０ｍＭとなるよう添加したこと以外は実施例６－１と同様である。
２．被検試料
　以下に示す検体を試料として用いた。
（１）実施例１記載の検体A、B、C、D、E（以降、キャリブレーターと記載する）
（２）健常人ドナー１９名の血清検体
（３）上記血清を採取した１９名から同時に採取したＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体
３．評価方法
　まず、キャリブレーターを測定し、各試薬の検量線を作成した。得られた検量線を用いて、各試料を測定し、濃度を求めた。次に、血清中ＳＰ－Ｄ濃度を横軸、血漿中ＳＰ－Ｄ濃度を縦軸として散布図（図４）を作成した。さらに、統計学的手法によって算出した相関係数と回帰直線の傾きを図中に示す。（ａ）は実施例６－１、（ｃ）は実施例６－２、（ｅ）は実施例６－３の結果を示す。また、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）は、（ａ）、（ｃ）、（ｅ）のＳＰ－Ｄ濃度０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲を拡大して示した図である。
４．評価結果
　第一試薬に二価金属を添加していない条件（実施例６－１）では、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と血漿検体のＳＰ－Ｄとの相関係数が０．９７６、回帰直線の傾きが０．８９となり、血漿検体を測定した場合においても、血清とほぼ同等のＳＰ－Ｄ測定値が得られた。しかし、ＳＰ－Ｄ濃度８０ｎｇ／ｍＬ以下（低濃度域、図４（ｂ））ではやや測定値のばらつきが認められた。
　一方で、二価金属として塩化カルシウムを第一試薬に添加した条件（実施例６－２）では、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関係数が、０．９９７、回帰直線の傾きが１．００となり、実施例６－１と比較して相関性が向上した。さらに、低濃度域においても、相関係数は０．９７０となり、実施例６－１（未添加条件）と比較して相関収束性が著しく向上した。
　また、二価金属として塩化マグネシウム添加した条件（実施例６－３）では、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関係数が０．９９４、回帰直線の傾きが０．９４となり、実施例６－１と比較して相関性が向上した。また、低濃度域の相関係数は０．９６９となり、実施例６－１と比較して相関収束性が著しく向上した。
［実施例７］同一ドナー由来の血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性評価－２　ヘパリンリチウム血漿
　実施例６では血漿としてＥＤＴＡ－２血漿を用いて血清測定値との相関性を評価したが、血漿としてヘパリンリチウム血漿を用いて同様の評価を行った。試料は、実施例６と同一の被験者から採取した１９検体を使用した。
１．ＬＴＩＡ試薬
１－１．実施例７－１（ＬＴＩＡ法による測定：二価金属の添加なし）
　実施例６－１で使用した試薬を用いて試料中のＳＰ－Ｄ濃度の測定を行った。
１―２．実施例７－２（ＬＴＩＡ法による測定：１０ｍＭ　塩化カルシウム添加）
　実施例６－２で使用した試薬を用いて測定を行った。
１－３．実施例７－３（ＬＴＩＡ法による測定：１０ｍＭ　塩化マグネシウム添加）
　実施例６－３で使用した試薬を用いて測定を行った。
２．被検試料
　以下に示す検体を試料として用いた。
（１）実施例６と同一の健常人ドナー１９名の血清検体
（２）上記血清を採取した１９名から同時に採取したＥＤＴＡ－２Ｋ血漿
３．評価方法
　実施例６で作成した検量線を用いて、実施例６と同様に評価した。血清測定値に対する血漿測定値の相関性を図５に示した。（ａ）は実施例７－１、（ｃ）は実施例７－２、（ｅ）は実施例７－３の結果を示す。また、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）は、（ａ）、（ｃ）、（ｅ）のＳＰ－Ｄ濃度０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲を拡大して示した図である。
４．評価結果
　血清検体のＳＰ－Ｄ測定値とヘパリンリチウム血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関も、実施例６の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性と同様の傾向を示した。
　第一試薬に二価金属を添加していない条件（実施例７－１）では、血清と血漿の相関係数が０．９９４、回帰直線の傾きが１．０３（小数点以下３位は四捨五入、以下同じ）となり、両検体間の相関性は良好であった。
　塩化カルシウムを添加した条件（実施例７－２）では、相関係数が０．９９４、回帰直線の傾きが１．０３となり相関性は良好であった。
　塩化マグネシウムを添加した条件では（実施例７－３）、相関係数が０．９９７、回帰直線の傾きが０．９９となり、相関性は良好であった。
　なお、低濃度域の相関係数は、第一試薬に二価金属を添加していない条件（実施例７－１）で０．９５６、塩化カルシウム添加条件（実施例７－２）で０．９４４、塩化マグネシウム添加条件（実施例７－３）で０．９８９となり、塩化マグネシウム添加条件（実施例７－３）でよりいっそう相関収束性が向上した。
５．まとめ
　実施例６及び実施例７の結果より、測定系に二価金属として塩化カルシウム又は塩化マグネシウムを共存させることによって、血漿の種類を問わず、血清検体と血漿検体の測定値の相関性が向上した。
［実施例８］同一ドナー由来の血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性を向上させる二価金属濃度の評価
第一試薬中の二価金属の濃度を変動させた時の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を評価した。
１．ＬＴＩＡ試薬
１－１．参考例１（ＬＴＩＡ法による測定：二価金属添加なし）
　下記のＬＴＩＡを原理とする第一試薬と第二試薬を用い、日立自動分析装置により試料中のＳＰ－Ｄ濃度を測定した。
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ６．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
　増感剤
（２）第二試薬
　抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス（実施例１－１と同じ。）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
１－２．実施例８－１（ＬＴＩＡ法による測定：１０ｍＭ塩化マグネシウム添加）
　参考例１で示した第一試薬に塩化マグネシウムを終濃度１０ｍＭとなるよう添加したほかは参考例１と同一の方法で測定を行った。
１－３．実施例８－２（ＬＴＩＡ法による測定：２５ｍＭ塩化マグネシウム添加）
　参考例１で示した第一試薬に、塩化マグネシウムを終濃度２５ｍＭとなるよう添加したほかは参考例１と同一の方法で測定を行った。
１－４．実施例８－３（ＬＴＩＡ法による測定：５０ｍＭ塩化マグネシウム添加）
　参考例１で示した第一試薬に、塩化マグネシウムを終濃度５０ｍＭとなるよう添加したほかは参考例１と同一の方法で測定を行った。
２．被検試料
（１）健常人ドナー１５名の血清検体
（２）上記血清を採取した１５名から同時に採取したＥＤＴＡ－２Ｋ血漿
３．評価方法
　まず、キャリブレーターを測定し、各試薬の検量線を作成した。作成した検量線を用いて、各検体を測定し、濃度を求めた。次に、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値に対する血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を図６に示した。
４．評価結果
　塩化マグネシウムを添加していない条件（参考例１）で測定した際の、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値に対するＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関係数は０．９２３であった。これに対して、１０ｍＭ塩化マグネシウムを添加した場合（実施例８－１）、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関係数は０．９５３であり、参考例１より向上した。さらに、塩化マグネシウムを２５ｍＭ（実施例８－２）、又は５０ｍＭ（実施例８－３）添加した場合、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関係数はそれぞれ０．９８８又は０．９９０であり、塩化マグネシウムを１０ｍＭ添加した場合と比較して相関性が向上した。
　このようにＳＰ－ＤのＬＴＩＡ測定方法において、二価金属を反応液に共存させることにより、共存させない場合に比べ血清検体と血漿検体とのＳＰ－Ｄ測定値の相関性が向上することがわかった。また、二価金属濃度を調整することでさらに当該相関係数を向上できることがわかった。
［実施例９］試料の凍結融解による測定値の変動の抑制について
　反応液に二価金属を添加することによって、試料の凍結融解によるＬＴＩＡ測定値の変動を抑制することができるかどうかの検討を行った。
１．ＬＴＩＡ試薬
　下記のＬＴＩＡを原理とする第一試薬と第二試薬を用い、日立自動分析装置により試料中のＳＰ－Ｄ濃度を測定した。
１－１．参考例２
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ６．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
　増感剤
（２）第二試薬
　抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス（実施例１－１）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ７．０）
１－２．実施例９（ＬＴＩＡ法による測定：２５ｍＭ塩化マグネシウム添加）
　参考例２で示した第１試薬に塩化マグネシウムを終濃度２５ｍＭとなるよう添加したほかは参考例２と同一の方法で測定を行った。
２．被検試料
　以下に示す検体を試料として用いた。
（１）健常人ドナー３０名の血清検体
（２）上記血清を採取した３０名から同時に採取したＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体
（３）上記血清を採取した３０名から同時に採取したヘパリンリチウム血漿検体
　なお、採血した血清及び血漿検体はチューブに小分けして保存した。「未凍結」と記載した検体は、小分け後に冷蔵保管した検体であり、凍結保存及び融解をしていない検体である。「凍結融解１回」と記載した検体は、小分け後に－７０℃以下で凍結保存した後に再融解した検体である。
３．評価方法
　まず、キャリブレーターを測定し、各試薬の検量線を作成した。得られた検量線を用いて、各検体を測定し、濃度を求めた。次に、血清検体のＳＰ－Ｄ測定値に対する血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を図７に示した。（ａ）～（ｄ）は参考例２の試薬を用いた場合の結果を、（ｅ）及び（ｆ）は実施例９の試薬を用いた場合の結果を示す。
（ａ）は未凍結の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と未凍結のＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を示す。（ｂ）は、未凍結の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値とヘパリンリチウム血漿の検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を示す。
（ｃ）、（ｅ）は凍結融解1回の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と凍結融解1回のＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を示す。
（ｄ）、（ｆ）は凍結融解1回の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と凍結融解1回のヘパリンリチウム血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関性を示す。
４．評価結果
４－１．試料：ＥＤＴＡ－２Ｋ血漿
（１）参考例２の試薬を用いた場合
　未凍結の血清検体のＳＰ－Ｄ測定値に対するＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値の相関性を評価したところ、回帰直線の傾きが０．９２２、切片が２．９７ｎｇ／ｍＬ、相関係数が０．９９８と、相関性は良好であった（図７（ａ））。しかし、凍結融解を１回行った血清検体のＳＰ－Ｄ測定値と血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との相関を評価したところ、傾き０．８４６、切片１１．００ｎｇ／ｍＬ、相関係数は０．９９５であり（図７（ｃ））、凍結融解によって血清検体のＳＰ－Ｄ測定値とＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体のＳＰ－Ｄ測定値との回帰直線の傾きが低下した。なお、血清検体、ＥＤＴＡ－２Ｋ血漿検体それぞれにおいて、凍結保存前後の測定値を比較したところ、凍結融解に伴う血清検体の測定値変動は生じていなかったため、血漿検体の測定値が変動していることがわかった。
（２）実施例９の試薬を用いた場合
　上記参考例２の結果に対し、第一試薬に塩化マグネシウムを終濃度２５ｍＭ添加した条件では、実施例８－２に示した通り、未凍結の血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性は良好であった。また、本条件で、凍結融解を１回行った血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性を評価したところ（実施例９）、回帰直線の傾きが０．９３０、切片が３．４５ｎｇ／ｍＬ、相関係数が０．９９８と、これらの検体測定値間の相関性は極めて良好であった（図７（ｅ））。
　以上より、採取した試料を凍結保存しておき、再度融解して測定する場合、第一試薬に塩化マグネシウムを添加すると、添加していない条件と比較して血清検体と血漿検体との測定値の相関性が向上することがわかった。
４－２．試料：ヘパリンリチウム血漿
　ヘパリンリチウム血漿でも同様に評価した。塩化マグネシウムを添加していない試薬（参考例２）であっても、未凍結の血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性は回帰直線の傾きが１．０３、切片が１．０７ｎｇ／ｍＬ、相関係数が０．９９８と極めて良好であった（図７（ｂ））。しかし、凍結融解を１回おこなった場合、回帰直線の傾きが０．９６５、切片が６．９３ｎｇ／ｍＬ、相関係数が０．９９３と、血清検体測定値と血漿検体測定値との回帰直線の傾きがやや低下した（図７（ｄ））。これに対して、第一試薬に塩化マグネシウムを終濃度２５ｍＭとなるよう添加した場合（実施例９）、回帰直線の傾きが１．０１、切片が２．１９ｎｇ／ｍＬ、相関係数が０．９９７と、血清検体測定値と血漿検体測定値との相関性は極めて良好であった（図７（ｆ））。
［実施例１０］ＬＴＩＡ試薬の既認証試薬に対する相関性評価
　ＬＴＩＡ試薬を用いて、既認証試薬に対する相関性を評価した。
１．ＬＴＩＡ試薬
（１）第一試薬
　１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ６．０）
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ
　０．５％　ＢＳＡ
　２５ｍＭ　塩化マグネシウム
　増感剤
（２）第二試薬
　抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス（実施例１－１）
　５ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ　（ｐＨ７．０）
２．被検試料
　任意のヒト血清５７検体を試料として用いた。
　なお、各試料のＳＰ－Ｄ濃度を、別途既認証試薬を用いて測定した。
３．評価方法
　まず、キャリブレーターを測定し、検量線を作成した。得られた検量線を用いて、各検体を測定し、濃度を求めた。次に、既認証試薬のＳＰ－Ｄ測定値を横軸、ＬＴＩＡ試薬のＳＰ－Ｄ測定値を縦軸として散布図を作成した。さらに、統計学的手法によって算出した相関係数と回帰直線の傾きを比較して、ＬＴＩＡ試薬によるＳＰ－Ｄ測定値と既認証試薬によるＳＰ－Ｄ測定値の相関性を評価した。結果を図８に示した。
４．評価結果
　第一試薬に二価金属を添加したＬＴＩＡ試薬と既認証試薬の測定値から算出した回帰直線の傾きは、０．９７５で、測定方法の違いによる測定値の著しい差は認められなかった。さらに、相関係数は０．９９０であり、両測定方法は高い相関性を示した。
　以上の結果より、多数の実検体を用いた試験においてもＳＰ－Ｄ測定用ＬＴＩＡ試薬は、従来の既認証試薬と同等の測定値を示すことが確認された。
５．まとめ
　以上の結果から、測定系に二価金属を共存させることによって、ＥＤＴＡ－２Ｋ及びヘパリンリチウム血漿の凍結融解によるＳＰ－Ｄ測定値変動が低減したことは驚くべき結果であった。この方法により、ＳＰ－Ｄ測定可能な血液検体の保存方法の選択肢が増え、臨床での利便性が向上した。
　本発明によれば、より簡便に、より短時間で測定結果が得られる生体由来試料中のＳＰ－Ｄの免疫測定方法及び測定試薬を提供することができる。本発明の免疫測定方法及び測定試薬は、汎用性のある全自動分析装置にも適用することができるため、迅速に大量の検体を測定することが可能となる。

Claims (23)

  1. 生体由来試料中の肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰ－Ｄ）の免疫測定方法であって、
    液相中で、当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、前記測定方法。
  2. 生体由来試料が血清又は血漿である請求項１に記載の測定方法。
  3. ラテックス粒子が平均粒子径９０ｎｍ～４５０ｎｍのラテックス粒子である請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. 液相中のラテックス粒子の濃度が０．０１～０．１０％である請求項１又は２に記載の測定方法。
  5. 当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程が以下の工程を含む請求項１又は２に記載の測定方法。
    （１）液相中で、当該試料と緩衝液を含む第１試薬とを接触させる工程
    （２）工程（１）の後に、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む第２試薬を液相中に添加する工程
  6. さらに、試料中のＳＰ－Ｄと抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子の複合体の凝集度合いを光学的に測定する工程を含む請求項１又は２に記載の測定方法。
  7. 光学的に測定する工程が散乱光強度、吸光度又は透過光強度を光学機器で測定する工程である請求項６に記載の測定方法。
  8. 液相中のｐＨが５．０～９．０である、請求項１又は２に記載の測定方法。
  9. 液相中に二価金属が含まれている請求項１又は２に記載の測定方法。
  10. 二価金属がマグネシウム又はカルシウムである請求項９に記載の測定方法。
  11. 生体由来試料中のＳＰ－Ｄを免疫測定法により測定するための試薬であって、少なくとも抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子及び緩衝液を含む前記試薬。
  12. 生体由来試料が血清又は血漿である請求項１１に記載の測定試薬。
  13. ラテックス粒子が平均粒子径９０ｎｍ～４５０ｎｍのラテックス粒子である請求項１１又は１２に記載の測定試薬。
  14. 液相中のラテックス粒子の濃度が０．０１～０．１０％である請求項１１又は１２に記載の測定試薬。
  15. 緩衝液のｐＨが５．０～９．０である請求項１１又は１２に記載の測定試薬。
  16. 緩衝液中に二価金属が含まれている請求項１１又は１２に記載の測定試薬。
  17. 二価金属がマグネシウム又はカルシウムである請求項１６に記載の測定試薬。
  18. 生体由来試料中のＳＰ－Ｄの免疫測定方法における測定値の変動抑制方法であって、
    二価金属を含む液相中で、当該試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子とを接触させる工程を含む、前記測定値の変動抑制方法。
  19. 生体由来試料が血漿である請求項１８に記載の測定値の変動抑制方法。
  20. ラテックス粒子が平均粒子径９０ｎｍ～４５０ｎｍのラテックス粒子である請求項１８又は１９に記載の測定値の変動抑制方法。
  21. 液相中のラテックス粒子の濃度が０．０１～０．１０％である請求項１８又は１９に記載の測定値の変動抑制方法。
  22. 二価金属がマグネシウム又はカルシウムである請求項１８又は１９に記載の測定値の変動抑制方法。
  23. 生体由来試料中のＳＰ－Ｄを免疫測定法により測定するための試薬キットであって、以下を含む試薬キット。
    （１）緩衝液を含む第１試薬
    （２）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子含む第２試薬
     
     
     
     
      
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