JP2000146973A - Ｉｖ型コラーゲンの免疫測定法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 迅速、簡便で、かつ、正確にＩＶ型コラーゲ
ンの定量を行うことができ、全自動分析装置に適用可能
なラテックス試薬を用いたＩＶ型コラーゲンの免疫測定
法、及び、該免疫測定法を行うための測定用試薬を提供
する。 【解決手段】 検体中のＩＶ型コラーゲン量を、抗ヒト
ＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体が固定化されたラ
テックス粒子を含んでなるラテックス試薬の凝集反応を
利用して定量するＩＶ型コラーゲンの免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＩＶ型コラーゲン
をラテックス凝集により定量する方法及びその試薬に関
する。

【０００２】

【従来の技術】血中のヒトＩＶ型コラーゲンの定量は、
肝疾患、特に、肝腺維化、肝癌、消化器肝転移癌等の診
断等に有用であるため、従来よりさまざまな方法が提案
されている。ロード（Ｒｈｏｄｅ）ら著、ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーシ
ョン（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）９巻、
４５１〜４５９頁、１９７９年；ホージュマン（Ｈｏｇ
ｅｍａｎｎ）ら著、クリニカル・ケミカル・アクタ（Ｃ
ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ）１４４巻、１〜１０頁、
１９８４年；シュパン（Ｓｈｕｐｐａｎ）ら著、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）７８巻、２４４〜２
４８頁、１９８６年には、血中ヒトＩＩＩ型プロコラー
ゲンＮ末端ペプチド、ヒトＩＶ型コラーゲンＮ末端ペプ
チド７Ｓドメイン、及び、ヒトＩＶ型コラーゲンＣ末端
ペプチドＮＣ１ドメインの各ポリクローナル抗体を用い
て放射性免疫学的測定を行った報告がなされている。

【０００３】しかしながら、これらの定量方法は、いず
れも、ヒト胎盤からのＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに
関するポリクローナル抗体又はヒト胎盤からのヒトＩＶ
型コラーゲンＮＣ１ドメインに関するポリクローナル抗
体を用いたものであり、その定量精度は極めて正確性に
欠け、従って、これらの定量方法によって得られる定量
結果は、肝疾患の診断等に用いるにしても、充分なもの
ではなかった。

【０００４】このような問題点を解決するために、本発
明者らは、ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンに対す
るモノクローナル抗体を用い、１段階サンドイッチ法に
基づく酵素免疫学的定量法により、少量の試料で、良好
な精度で迅速に測定しうるヒトＩＶ型コラーゲンペプチ
ドの定量法を提案した〔小幡ら著、クリニカル・ケミカ
ル・アクタ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ）１８１
巻、２９３〜３０４頁、１９８９年〕。

【０００５】しかしながら、このような酵素免疫学的定
量法は、上述した放射性免疫学的測定と比較して、臨床
的な正確性には優れているものの、更に簡便で迅速な方
法が求められていた。

【０００６】そこで、従来より免疫化学的凝集反応や凝
集阻止反応に用いられているラテックスを抗体試薬とし
て用いることが考えられている。通常、エンザイムイム
ノアッセイ（ＥＩＡ法）やラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ法）、ラテックス凝集法等の免疫反応を利用した検出
方法では、同一の抗原又は同一の抗体を用いれば、感度
等は検出手段によって異なる場合もあるが、その特異性
については同等の性能が期待される。

【０００７】しかしながら、コラーゲンを測定するため
にラテックス試薬を検出手段として使用したものはな
く、また、文献的な報告も見られていないため、ラテッ
クスを用いて試薬を開発するには大きな技術的障害が伴
うことは避けられない。

【０００８】また、近年、免疫学的診断薬の分野におい
て、対象物質を鋭敏かつ選択的に検出するための材料と
して、モノクローナル抗体が汎用されているが、これ
は、従来より使用されているポリクローナル抗体とは異
なり、鋭敏性、特異性が期待されるものの、モノクロー
ナル抗体は、反応部位が単一なため、ラテックス粒子の
ような固相担体と結合させる場合には、多くの技術的検
討を要するとされている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、迅速、簡便で、かつ、正確にＩＶ型コラーゲンの定
量を行うことができ、全自動分析装置に適用可能なラテ
ックス試薬を用いたＩＶ型コラーゲンの免疫測定法、及
び、該免疫測定法を行うための測定用試薬を提供するこ
とを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、ヒト検体中のＩＶ型コラーゲンの定量に際し
て、ＩＶ型コラーゲンに対して特異的に反応するモノク
ローナル抗体を固定化させたラテックス粒子を検体中の
ＩＶ型コラーゲンと反応させた場合、ラテックス粒子が
抗原抗体反応により特異的に凝集することを見いだし、
本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、検体中のＩＶ型コラ
ーゲン量を、モノクローナル抗体が固定化されたラテッ
クス粒子を含んでなるラテックス試薬の凝集反応を利用
して定量するＩＶ型コラーゲンの免疫測定法である。以
下に本発明を詳述する。

【００１２】本発明で使用される検体は、ＩＶ型コラー
ゲン量を定量する必要のあるものであれば特に限定され
ず、例えば、ヒト血液、血清、血漿、組織液、尿、唾
液、汗等が挙げられる。上記ＩＶ型コラーゲンは、後述
するラテックス試薬と反応が可能となるように、７Ｓド
メインと分子中央三重らせんドメインとを有してなるも
のが好ましい。上記検体は、必要に応じて、希釈して用
いてもよい。

【００１３】本発明で使用されるモノクローナル抗体
は、抗原としてヒト組織から得られたＩＶ型コラーゲ
ン、遺伝子組み換え技術により得られたリコンビナント
抗原、更にはペプチド合成法によって得られたペプチド
又は改変ペプチドを用いて、細胞融合技術分野におい
て、例えば、岩崎辰夫ら著、「単クローン抗体・ハイブ
リドーマとＥＬＩＳＡ」（講談社刊）に記載されている
方法等、それ自体公知の手法を適宜選択し、また、これ
らの手法を組み合わせることにより、モノクローナル抗
体産生融合細胞株を形成させた後、該細胞株を利用して
モノクローナル抗体を産生させ、取得することができ
る。

【００１４】本発明において、上記モノクローナル抗体
としては、更に、上述のようにして得られたモノクロー
ナル抗体含有物を硫安分画後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ及びプロテインＡアフィニティカラムにより精製し
たＩｇＧ画分が用いられる。なお、本明細書中、上記モ
ノクローナル抗体は、これらの抗体における特異的結合
部分Ｆ（ａｂ′）２、又は、Ｆａｂ′そのものを使用す
る態様も含むものである。

【００１５】上記モノクローナル抗体は、一般に、担体
と結合させた場合、抗原認識部位である反応部位の構造
や配置が大きく変化し、活性部位がラテックス同士の凝
集に適さない位置に配置する可能性があり、また、反応
部位が単一であるので、抗原に対する特異性が失われる
おそれがある。このため、本発明においては、上記モノ
クローナル抗体として、後述するラテックス粒子に固定
化された後も、ＩＶ型コラーゲンとの結合能を失わない
ものが好ましく、このような特性を有するものであれ
ば、上記モノクローナル抗体のサブクラス等は特に限定
されない。なお、上記モノクローナル抗体のＩＶ型コラ
ーゲンとの結合能は、ＩＶ型コラーゲンを用いた中和
法、ＥＬＩＳＡ法等で適宜測定することができる。

【００１６】上記ラテックス粒子に固定化された後もＩ
Ｖ型コラーゲンとの結合能を失わないモノクローナル抗
体は、スクリーニング等によって選別することにより得
ることができる。上記スクリーニングの方法としては特
に限定されず、例えば、ＳＲＩＤ法、ＥＬＩＳＡ法等の
通常のＥＩＡ法やＲＩＡ法で用いられている手法を用い
ることができる。

【００１７】本発明において、上記モノクローナル抗体
としては、２種類の抗ヒトＩＶ型コラーゲン抗体を使用
することが好ましく、特に、ペプシン可溶化ＩＶ型コラ
ーゲン及びＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインのいずれとも
反応する抗体と、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンと反
応し、かつ、ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインと反応しな
いモノクローナル抗体を組み合わせて用いることが好ま
しい。なかでも、後述する実施例１で得られたクローン
ナンバー４Ｈ１２（以下、「クローン４Ｈ１２」とす
る）及びクローンナンバー１Ｄ６（以下、「クローン１
Ｄ６」とする）を使用することが好ましい。

【００１８】本発明において、上記モノクローナル抗体
は、ラテックス粒子に固定化されて用いられる。上記ラ
テックス粒子としては特に限定されず、例えば、従来よ
り免疫化学的凝集反応及び凝集阻止反応において一般的
に用いられている微粒子の担体等を使用することができ
る。

【００１９】上記微粒子の担体としては、工業的に大量
生産が可能な有機系微粒子が好ましいが、これらに限定
されるものではない。上記工業的に大量生産が可能な有
機系微粒子としては特に限定されず、例えば、スチレ
ン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アク
リル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モ
ノマーの単一重合体又は共重合体；スチレン−ブタジエ
ン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合
体等のブタジエン系共重合体等の微粒子；官能基として
カルボキシル基、第１級アミノ基、カルボアミノ基（−
ＣＯＮＨ₂ ）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、
基体が有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子等が挙
げられる。なかでも、抗体の吸着性に優れ、かつ、生物
学的活性を長期間安定に保持することができる等の理由
から、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。

【００２０】上記ラテックス粒子の平均粒径は特に限定
されず、固定化されたモノクローナル抗体と測定対象と
なる抗原物質との抗原抗体反応により惹起される凝集反
応の結果生じる凝集塊が、肉眼又は光学的に検出するの
に充分な大きさを呈するものであればよい。より好まし
くは、０．０１〜１．０μｍであり、更に好ましくは、
０．０５〜０．５００μｍである。

【００２１】上記ラテックス粒子の表面にモノクローナ
ル抗体を固定化させる手法としては特に限定されず、公
知の方法を使用することができる。例えば、ラテックス
粒子表面にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる方
法、官能基を有するラテックス粒子表面に、既知の方法
である化学結合法や共有結合法により感作させる方法等
が挙げられる。

【００２２】また、数種のマウス抗ヒトＩＶ型コラーゲ
ン抗体を固定化する場合には、例えば、抗体１種類ずつ
を別々にラテックス粒子に固定化させて、数種のモノク
ローナル抗体固定化ラテックスを調製した後、混合して
もよく、数種のモノクローナル抗体を予め混合してお
き、一度にラテックス粒子に固定化させてもよい。

【００２３】上記数種のモノクローナル抗体が固定化さ
れたラテックス粒子を混合する場合、混合割合は特に限
定されるものではなく、使用されるラテックス粒子の粒
径、モノクローナル抗体の量、必要とされる感度等に応
じて、適宜選択される。

【００２４】上記ラテックス粒子の表面に固定化される
モノクローナル抗体の量は、特に限定されるものではな
い。本発明においては、抗原抗体反応が行われ、検出す
るに足るラテックスの凝集を惹起することができる量で
あり、かつ、過剰のモノクローナル抗体により、抗体自
身を介した非特異凝集反応や血中の共存物質との非特異
凝集反応が起こらない程度であればよい。

【００２５】上記数種のマウス抗ヒトＩＶ型コラーゲン
抗体を固定化する場合においては、各モノクローナル抗
体の固定化量は、同量であってもよく、各モノクローナ
ル抗体の示す活性、非特異反応の程度に応じて、製造ロ
ットごとに適宜選択すればよい。好ましくは、ラテック
ス粒子１ｇ当たり、各々５〜５０ｍｇであるが、必ずし
もこの範囲内に限定されるものではない。

【００２６】本発明において、上記モノクローナル抗体
が固定化されたラテックス粒子は、緩衝液に懸濁してラ
テックス試薬として使用される。上記緩衝液としては特
に限定されず、例えば、りん酸系、グリシン系等の緩衝
液；グッドの緩衝液等の一般に生化学的実験に用いられ
る緩衝液等が挙げられる。好ましくは、トリス（ヒドロ
キシ）アミノメタン及びスルホン酸基を有する緩衝剤か
らなるグッドの緩衝液である。上記トリス（ヒドロキ
シ）アミノメタン及びスルホン酸基を有する緩衝剤とし
ては、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ
Ｏ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノプロパンスルホン
酸（ＴＥＳ）が好ましい。

【００２７】上記緩衝液のｐＨは、５．０〜９．０が好
ましい。５．０未満であっても、９．０を超えても、モ
ノクローナル抗体とＩＶ型コラーゲンとの反応が充分に
起こらない。より好ましくは、７．０〜８．５である。

【００２８】本発明において、上記ラテックス試薬に
は、安定化、感度向上のために、ウシ血清アルブミン
（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、以下、
「ＢＳＡ」という）、カゼイン、カザミノ酸等の抗原抗
体反応に特異的な活性を示さない添加物を添加してもよ
い。

【００２９】また、上記ラテックス試薬には、上記ラテ
ックス粒子に固定化されているものと同じ動物種又は他
の動物種から得られたグロブリン、これらの生成物等を
添加してもよい。上記グロブリン等は、ラテックス粒子
に固定化して使用される。上記グロブリン等を上記ラテ
ックス粒子に固定化する方法としては、上記モノクロー
ナル抗体をラテックス粒子に固定化する方法と同じ方法
であってもよく、異なる方法を用いてもよい。

【００３０】本発明においては、上記ＩＶ型コラーゲン
を含む検体と、上記モノクローナル抗体が固定化された
ラテックス粒子を含んでなるラテックス試薬とを混合す
ることにより、上記検体中のＩＶ型コラーゲン量を定量
する。上記モノクローナル抗体が固定化されたラテック
ス粒子と上記ＩＶ型コラーゲンとの反応は、抗原抗体反
応及びそれに伴う凝集反応である。

【００３１】上記抗原抗体反応において、添加される液
体成分、例えば、検体の希釈用緩衝液等としては、一般
に生化学的な用途に用いられている緩衝液、例えば、り
ん酸系、グリシン系、トリス系等の緩衝液等を使用する
ことができる。

【００３２】上記抗原抗体反応における反応液のｐＨ
は、７．０〜８．５が好ましく、特には、７．５〜８．
５が好ましい。上記反応液中には、安定剤としてＢＳ
Ａ、ショ糖；感度を高めるために、ポリエチレングリコ
ール、デキストラン等の水溶性多糖類；防腐剤としてア
ジ化ナトリウム；塩濃度調整のために、塩化ナトリウム
等が添加されていてもよい。

【００３３】上記検体と上記モノクローナル抗体が固定
化されたラテックス粒子との反応条件は、上記抗原抗体
反応が起こりうる条件であれば特に限定されないが、反
応は、恒温で行うのが好ましく、特に２５〜３７℃で行
うことが好ましい。反応時間も特に限定されないが、５
秒〜１５分が好ましい。

【００３４】上記ラテックス粒子の凝集の程度を測定す
る方法としては特に限定されない。例えば、凝集を定性
的又は半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度
の程度との比較から結合物の凝集の程度を目視によって
判定することができる。また、凝集を定量的に測定する
場合には、簡便性及び精度の点から、例えば、光学的に
測定することが好ましい。

【００３５】上記光学的な測定方法としては特に限定さ
れず、例えば、凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえ
る比濁法；凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化
としてとらえる粒度分布による測定法；凝集塊の形成に
よる前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光
強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。

【００３６】上記各測定方法は、速度試験を利用するこ
とができる。上記速度試験は、レートアッセイとも呼ば
れ、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これら
の時点間における測定値の増加分、すなわち、増加速度
に基づき凝集の程度を求める試験である。本発明におい
ては、測定の簡便さ、迅速性の点から、比濁法を用いた
速度試験を行うことが好ましい。

【００３７】上記モノクローナル抗体が固定化されたラ
テックス粒子を含んでなるラテックス試薬は、全自動分
析装置等の測定装置にも適用することができるため、施
術者によって結果が乖離するということもなく、より精
度の高い測定結果が得られ、ＩＶ型コラーゲンの測定用
試薬として提供することができる。上記測定用試薬に
は、必要に応じて、検体の希釈用緩衝液やＩＶ型コラー
ゲンの標準品が添付されていてもよい。上記ラテックス
試薬からなるＩＶ型コラーゲンの測定用試薬もまた、本
発明のひとつである。

【００３８】本発明のＩＶ型コラーゲンの免疫測定法
は、ＩＶ型コラーゲンのモノクローナル抗体が固定化さ
れたラテックス粒子を含んでなるラテックス試薬を用い
ているので、測定者の熟練の程度を問わず、迅速、簡便
で、かつ、正確にＩＶ型コラーゲンの定量を行うことが
できる。

【００３９】本発明においては、ＥＩＡ法の固相である
ビーズとは構成物質、大きさ、固相表面の荷電状況や、
粗さ、疎水性の強さ等が大きく異なるラテックス粒子を
用いているが、上記モノクローナル抗体として、ラテッ
クス粒子に固定化されてもＩＶ型コラーゲンと特異的に
反応するものを選別して使用しているので、ＥＩＡ法と
同等の特異性を有しており、性能も優れている。

【００４０】また、本発明においては、上記モノクロー
ナル抗体として、抗ヒトＩＶ型コラーゲン抗体であるク
ローン４Ｈ１２及びクローン１Ｄ６を用いた場合、ＩＶ
型コラーゲンに対しての特異性が優れているので、より
正確なＩＶ型コラーゲンの定量を行うことができる。な
お、クローン４Ｈ１２〔マウス由来単クローン性抗ヒト
ＩＶ型コラーゲン抗体産生ハイブリドーマ（ＩＶ−４Ｈ
１２）〕は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２８４７とし
て、クローン１Ｄ６（ハイブリドーマＩＶ−１Ｄ６）
は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０１２として、それぞ
れ茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−
８５６６）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に受託されており、保管されている。

【００４１】更に、本発明のＩＶ型コラーゲンの免疫測
定法によれば、１０〜２０分程度でＩＶ型コラーゲンの
定量が可能であるため、従来の酵素免疫学的定量法によ
る１段階サンドイッチ法で要した３〜４時間と比較して
も非常に短時間で定量ができ、かつ、高い精度で多数の
検体の測定を容易に行うことができる。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００４３】実施例１ 抗ヒトＩＶ型コラーゲンペプチ
ドモノクローナル抗体の作製 （ａ）抗原−ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲンの調
製 ヒト胎盤を材料としてマイネ（Ｍａｙｎｅ）らの方法
〔アーテリー（Ａｒｔｅｒｙ）７巻、２６２〜２８０
頁、１９８０年〕に従って、０．５Ｎ酢酸でホモジェナ
イズし、ペプシン消化酵素（１ｍｇ／ｍｌ）でコラーゲ
ンを可溶化後、最終濃度２Ｍとなるように塩化ナトリウ
ムを加え、コラーゲンを析出させた。これを０．５Ｎ酢
酸に溶解し、０．７Ｍ塩化ナトリウム含有０．５Ｎ酢酸
溶液で透析することにより、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型
コラーゲンを析出させ、その上清を１．２Ｍ塩化ナトリ
ウム含有０．５Ｎ酢酸溶液で透析し、ＩＶ型コラーゲ
ン、Ｖ型コラーゲンを析出させた。

【００４４】ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン画分を
０．５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）に溶解させ、２．２Ｍ塩化ナトリウム
含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）でＩＶ
型コラーゲンを析出させ、Ｖ型コラーゲンと分別した。
得られたＩＶ型の純度をサイクス（Ｓｙｋｅｓ）らの方
法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．）７２巻、１４７２〜
１４８０頁、１９７６年〕に従って、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）で調べたところ、約９０％であった。なお、そ
の際、１７４ｋＤ、１３５ｋＤ、１０８ｋＤ、９２ｋ
Ｄ、７８ｋＤ、６８ｋＤ、６０ｋＤ、５６ｋＤ、４３ｋ
Ｄ、３４ｋＤ及び２９．５ｋＤ（メルカプトエタノール
存在下）の１１個の異なるバンドが検出された。

【００４５】（ｂ）抗体産生細胞の調製 ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン１００μｇを完全
フロイントアジュバントとともに８週齢のＢＡＬＢ／ｃ
雌マウス２匹に初回腹腔内投与した。２回目以降は、
０．５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）に溶解させた抗原１００μｇを２〜４
週間ごとに、２〜４回ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに追加免役
した。最終免疫として脾臓摘出３日前に静脈内投与し脾
細胞を調製した。

【００４６】（ｃ）細胞融合 以下の材料及び方法を用いる。 ・ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｄｉ
ｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に重炭酸ナト
リウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍ
Ｍ）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ）、ペニシリンＧカリ
ウム（５０ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０
μｇ／ｍｌ）、及び、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２
μｍ Ｔｏｙｏメンブレンフィルターで除菌濾過した。 ・ＮＳ−１培地：ＲＰＭＩ １６４０培地に除菌濾過し
た仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社
製）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度となるように加えた。

【００４７】・ＨＡＴ培地：ＮＳ−１培地に更にヒポキ
サンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μ
Ｍ）、及び、チミジン（１６μＭ）を加えた。 ・ＨＴ培地：アミノプテリンを除去したこと以外は、Ｈ
ＡＴ培地と同様にして調製した。 ・ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ １６４０培地のポリ
エチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００、Ｍｅｒ
ｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ社製）５０％（ｗ／ｗ）無血清
培地を調製した。

【００４８】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＮＳ
−１（Ｐ３−ＮＳ１−１）との融合は、オオイ（Ｏｉ）
らの方法〔セレクティッド・メソッド・イン・セルラー
・イミュノロジー（エディティッド・バイ・ビー・ビー
・ミシェル・アンド・エス・エム・シージ）（Ｓｅｌｅ
ｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ
ａｎｄ Ｓ．Ｍ．ＳＨｉｉｇｉ）、ダブリュ・エイチ・
フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９８０年、３５１
〜３５２頁〕を若干改変して行った。

【００４９】上記（ｂ）項で調製した有核脾細胞（生細
胞率９５％）とミエローマ細胞（生細胞率９５％）と
を、５〜６：１の割合で融合させた。脾細胞とミエロー
マ細胞とを別々にＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。
次に、同じ培地に懸濁し、融合させるため、上記割合で
混合した。容量５０ｍｌの円錐形スチロール樹脂製試験
管（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ社製）を用い、４０ｍｌの
ＲＰＭＩ １６４０培地中４００×ｇ、１０分間遠心
し、上清を完全に吸出した。沈殿細胞に３７℃加温ＰＥ
Ｇ４０００溶液１ｍｌを穏やかに攪拌しながら１分間で
滴下し、更に１分間攪拌し、細胞を再懸濁、分散させ
た。

【００５０】次に、３７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地
１ｍｌを１分間で滴下した。この操作を更に１回繰り返
した後、同培地７ｍｌを２〜３分間で常に攪拌しながら
滴下し、細胞を分散させた。これを４００×ｇ、１０分
間遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次に、この
沈殿細胞に３７℃加温ＮＳ−１培地１０ｍｌを速やかに
加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌのピペットを用いて注
意深くピペッティングして分散させた。更に、同培地２
０ｍｌを加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロ
ウェル（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ社製）にウェル当たり
５．９×１０⁵ 個／０．１ｍｌの細胞をまき込んだ。な
お、９６穴マイクロウェルは、前処理として０．２ｍｌ
のＮＳ−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（３７℃）で
一晩保温し、使用時に培地を吸引除去したものを用い
た。細胞融合が完了したマイクロウェルを７％炭酸ガス
／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下でインキ
ュベートした。

【００５１】（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 培養１日目にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目に培
地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え
た。１４日目にＨＴ培地に切り換え、以降３〜４日ごと
に同じ操作を繰り返した。通常は、２〜３週間で充分な
ハイブリドーマの生育が観察される。

【００５２】ハイブリドーマ生育全ウェルについて、
（ｅ）項記載の固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）法
により陽性ウェルをチェックした。次に、フィーダーと
して、１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌ
をポリスチレン製２４穴セルウェル（Ｉｗａｋｉ Ｇｌ
ａｓｓ社製）に加えたものを用い、上記で検出された各
陽性ハイブリドーマの全内容物を移した。これを、上記
（ｃ）項における場合と同様に、７％炭酸ガス存在下、
３７℃で約１週間インキュベートした。その間、１〜２
回、各ウェルの上清０．５ｍｌを新しいＨＴ培地０．５
ｍｌと交換した。ハイブリドーマが充分生育した時点
で、ＥＬＩＳＡ法により陽性を再確認し、それぞれにつ
いて（ｆ）項記載の限界希釈法によるクローニングを行
った。なお、クローニングに使用した後の残液をポリス
チレン製２５ｃｍ³ 組織培養フラスコ（Ｉｗａｋｉ Ｇ
ｌａｓｓ社製）に移し、凍結保存用試料を調製した。

【００５３】（ｅ）ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＩＶ型コ
ラーゲンペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索 レナード（Ｒｅｎｎａｒｄ）らの方法〔アナリティカル
・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
１０４巻、２０５〜２１４頁、１９８０年〕を若干改変
した方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体の
検出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプレ
ート（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
社製）を０．５〜１．０μｇのペプシン可溶化ヒトＩＶ
型コラーゲンでコートし、更にその他を１％ＢＳＡでコ
ートしブロックした。これにハイブリドーマ生育ウェル
の上清の一部を加えて室温で約１時間インキュベートし
た。二次抗体として西洋わさび由来ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｃａｐ
ｐｅｌ Ｌａｂ．社製）を加え、更に室温で約１時間イ
ンキュベートした。次に、過酸化水素と基質であるｏ−
フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を加え、生成した褐色の
程度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋
曹達工業社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。

【００５４】（ｆ）クローニング 各ウェル中には、２種以上のハイブリドーマが生育して
いる可能性があるので、限界希釈法によりクローニング
を行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得
した。ＮＳ−１培地１ｍｌ当たりフィーダーとして１０
⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製
し、９６穴マイクロウェルの３６ウェル、３６ウェル及
び２４ウェルにウェル当たりそれぞれ５個、１個及び
０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目、１２日目
に各０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。クローニン
グ開始後１４〜１５日で充分なハイブリドーマの育成が
認められ、コロニー形成陰性ウェルが５０％以上である
群についてＥＬＩＳＡ法を行った。テストした全ウェル
が陽性でなかった場合には、抗体陽性ウェル中のコロニ
ー数を確認し、ウェル中に１コロニーのウェル４〜６個
を選び、再クローニングした。最終的に、ペプシン可溶
化ＩＶ型コラーゲンに対して２２株のクローンを得た。

【００５５】（ｇ）モノクローナル抗体のインビトロ増
殖及びインビボ増殖 上記（ｆ）項で得られた各クローンをＮＳ−１培地等の
適当な培養液で培養（インビトロ増殖）し、その培養上
清から各モノクローナル抗体を得ることができた（モノ
クローナル抗体たんぱく質濃度は、１０〜１００μｇ／
ｍｌ）。一方、大量に抗体を得るためには、脾細胞とミ
エローマ細胞の由来動物と同系の動物（ＢＡＬＢ／ｃ、
マウス）に腫瘍形成促進剤プリスタン（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ社製）をマウス１匹当たり０．５ｍｌ腹
腔内投与した。１〜３週間後にハイブリドーマ１×１０
⁷ 個を同じく腹腔内投与することにより、インビボで１
〜２週間後にモノクローナル抗体たんぱく質濃度４〜７
ｍｇ／ｍｌの腹水を得ることができた。

【００５６】（ｈ）モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖の
アイソタイプ 上記（ｇ）項で得られた各々の腹水をまずペプシン可溶
化ヒトＩＶ型コラーゲンをコートしたミクロタイトレー
ションプレートのウェルの各列に入れ、ＥＬＩＳＡ法に
従ってそれぞれの腹水中の各モノクローナル抗体を結合
させた。洗浄後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウスＩ
ｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として２，２′−アジノ
−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸−６）及び過酸
化水素水を用いて、重鎖、軽鎖のアイソタイプを検出し
た。結果を表１に示した。得られた各モノクローナル抗
体についてみると、これらのモノクローナル抗体のう
ち、１６個が免疫グロブリンγ１／κを有し、２個がγ
２ｂ／κを有し、１個がα／κを有し、３個がμ／κを
有していた。

【００５７】

【表１】

【００５８】（ｉ）モノクローナル抗体の精製 上記（ｇ）項で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽
和）後、０．０６Ｍ塩化ナトリウム含有４０ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の非吸着画分を分
取し、培地中の仔牛胎児血清及びマウス由来のたんぱく
質を分離、除去した。更に、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）で平衡化したプ
ロティンＡセルロファイン（生化学工業社製）カラムに
吸着させ、非吸着画分を除去した後、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出
することにより精製した。なお、溶出液は、直ちに１．
５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）により中和し
た。

【００５９】（ｊ）モノクローナル抗体の反応性 上記（ｉ）で得られた精製モノクローナル抗体の反応性
を組織染色及びウエスタンブロットにより調べた。組織
染色においては、ドライアイス−アセトン中で凍結した
肝臓細胞を厚さ４μｍの凍結切片としたものをアセトン
中に５分間浸漬後風乾した。得られた組織切片と精製モ
ノクローナル抗体とを室温で３０分間インキュベートし
た。二次抗体としてフルオロイソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣ）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ
Ｌａｂ．社製）を加え、更に室温で３０分間インキュ
ベートし、観察した。

【００６０】ウエスタンブロットにおいては、上記
（ａ）で得られたペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン、及
び、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンを細菌性コラゲナ
ーゼ処理し、ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン以外のト
リプルヘリックス部分を分解した後、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）でゲル濾過に
より得られるＩＶ型コラーゲン７ＳドメインをＳＤＳ−
ＰＡＧＥ後、たんぱく質をニトロセルロース膜に転写し
た。

【００６１】この膜を、精製モノクローナル抗体と室温
３時間インキュベートした。二次抗体としてＰＯＤ標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．
社製）を加え、更に室温で３時間インキュベートし、分
子中央三重らせん及び７Ｓドメインを有するペプシン可
溶化ＩＶ型コラーゲン及び分子中央三重らせんを含まな
いペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインとの反
応性を調べた。結果を表２に示した。得られたモノクロ
ーナル抗体のうち、１１個が肝臓組織切片と反応した。
また、得られたモノクローナル抗体のうち、１３個がペ
プシン可溶化ＩＶ型コラーゲン及びペプシン可溶化ＩＶ
型コラーゲン７Ｓドメインと反応したが、残り７個は、
ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンと反応し、ペプシン可
溶化ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインとは反応しなかっ
た。

【００６２】

【表２】

【００６３】実施例２ ＩＶ型コラーゲン測定用ラテッ
クス試薬の調製方法 （１）材料 ラテックス：ポリスチレンラテックス（平均粒径０．３
μｍ、積水化学工業社製）を用いた。 緩衝液： ・モノクローナル抗体希釈用緩衝液：５０ｍＭりん酸ナ
トリウム緩衝液（ＮａＰＢ）（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏと５０ｍＭ Ｎ
ａ₂ ＨＰＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏとを混合して、ｐＨを７．５に
調整したものを用いた。 ・ブロッキング用緩衝液：１％ＢＳＡ・ＮａＰＢ（ｐＨ
７．５） １００ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏと１００ｍＭ
Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・２Ｈ ₂ Ｏとを混合してｐＨを７．５
に調整したものに、ＮａＮ₃ を０．１％（ｗ／ｖ）、Ｂ
ＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａ
ｄｅ）を１．０％（ｗ／ｖ）となるように溶解させたも
のを用いた。

【００６４】・ラテックス懸濁用緩衝液：１％ＢＳＡ・
１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ
７．５） １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に、ＮａＮ₃ を
０．１％（ｗ／ｖ）、ＢＳＡを１．０％（ｗ／ｖ）とな
るように溶解させたものを用いた。 ・検体希釈用緩衝液：０．３５％ポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）・１００ｍＭＮａＰＢ（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏと１００ｍＭ
Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・２Ｈ ₂ Ｏとを混合してｐＨを７．５
に調整したものに、ＮａＮ₃ を０．１％（ｗ／ｖ）、Ｂ
ＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａ
ｄｅ）を１．０％（ｗ／ｖ）、ＰＶＰ（ＰＫ−９０、Ｂ
ＡＳＦ社製）を０．３５％（ｗ／ｖ）となるように溶解
させたものを用いた。

【００６５】標準品：正常ヒトプール血清（ＴＨＳ、Ｃ
ＤＰ社製）を凍結乾燥し、精製水で再度復元し、特開平
２−１５５３号公報に記載の方法でＩＶ型コラーゲンの
濃度を測定したものをヒト血清標準品として用いた。

【００６６】（２）ラテックス試薬の調製法 ラテックス液（固形分１０％）を６０μｌとり、モノク
ローナル抗体希釈用緩衝液〔５０ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ
７．５）〕５４０μｌとよく混合した。モノクローナル
抗体〔クローンナンバー１Ｄ６（クローン１Ｄ６）、１
４．７ｍｇ／ｍｌ〕をモノクローナル抗体希釈用緩衝液
で５ｍｇ／ｍｌに希釈し、これを１５μｌとり、更にモ
ノクローナル抗体希釈用緩衝液１２３５μｌを加え、よ
く混合した。それぞれ３０分室温でインキュベートした
後、ラテックス液をマグネチックスターラー上でよく攪
拌させながら、モノクローナル抗体希釈液を添加した。
そのまま６０分間攪拌した後、ブロッキング用緩衝液を
３ｍｌ添加し、更に９０分間続けて攪拌した。その後、
高速遠心機により、遠心洗浄（１５０００ｒｐｍ、４
℃、１５分）した後、上清をデカンテーションにより静
かに捨て、得られたラテックスペレットに、ラテックス
懸濁用緩衝液５ｍｌを添加し、よく分散させた。この操
作を３回繰り返した。３回目の洗浄の後、得られたラテ
ックスペレットをラテックス懸濁用緩衝液３．６ｍｌに
よく分散させ、超音波細胞破砕機（Ａｓｔｒａｓｏｎ、
Ｗ−８５０）で超音波処理を行った。得られたラテック
ス懸濁液（固形分０．１７％）を１Ｄ６抗体固定化ラテ
ックスとした。

【００６７】また、４Ｈ１２抗体固定化ラテックスは、
モノクローナル抗体として、クローンナンバー４Ｈ１２
（クローン４Ｈ１２、３２．１ｍｇ／ｍｌ）を用いたこ
と以外は、上記と同様にして得た。更に、全く同様の方
法で、クローンナンバー１Ｄ３、８Ｇ１２、９Ｃ７（以
下、それぞれ「クローン１Ｄ３」、「クローン８Ｇ１
２」、「クローン９Ｃ７」とする）を用いて、それぞれ
１Ｄ３抗体固定化ラテックス、８Ｇ１２抗体固定化ラテ
ックス、９Ｃ７抗体固定化ラテックスを調製した。

【００６８】（３）抗体結合ラテックスとＩＶ型コラー
ゲンとの結合能評価 上記（２）項で調製した種々の抗体固定化ラテックス上
の抗体のＩＶ型コラーゲン認識部位がラテックスとの結
合により、抗原抗体反応が阻害されてしまう部位である
か否かを以下の方法で調べた。抗体固定化ラテックスと
ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンとを３７℃、１０分間
インキュベートし、ＩＶ型コラーゲンと抗体固定化ラテ
ックスとを反応させた。これを遠心分離し、未結合のＩ
Ｖ型コラーゲンを特開平２−１５５３号公報に記載の方
法により測定した。

【００６９】抗体結合ラテックスとＩＶ型コラーゲンと
の結合能は、次式のように算出した。 結合能（％）＝（［添加抗原量］−［上清中抗原量］）
／［添加抗原量］×１００ 結果を表３に示した。この結果から明らかなように、特
開平２−１５５３号公報に記載の方法（ＥＩＡ法）で抗
原の検出が可能であったクローン１Ｄ３は、ラテックス
に固定化することにより、その結合能は消失した。同様
に、実施例１（ｅ）項においてＥＬＩＳＡ法により抗原
と反応することが確認されているクローン９Ｃ７、クロ
ーン８Ｇ１２もラテックスに固定化することにより、そ
の結合能は消失した。一方、クローン１Ｄ６、クローン
４Ｈ１２は、ラテックスに固定化しても、その結合能を
保持していた。これらの結果より、ラテックス試薬の材
料として適した抗体が存在すること、及び、その結合能
を評価することにより、ラテックス試薬に適した抗体を
選別することができることが判った。このような抗体
は、ラテックス上で抗原との結合に適した立体配置を保
持できているものと考えられる。

【００７０】

【表３】

【００７１】実施例３ ＩＶ型コラーゲン標準品の測定 以下の試薬を組み合わせて、ＩＶ型コラーゲン測定用試
薬とし、標準品で野感度を測定した。 ・ラテックス試薬（固形分０．１７％の１Ｄ６抗体固定
化ラテックスと４Ｈ１２抗体固定化ラテックス試薬とを
１：１で等量混合したもの） ・検体希釈用緩衝液 ・標準品（ＩＶ型コラーゲン濃度７００、３５０、１７
５、８３、０ｎｇ／ｍｌ）

【００７２】ラテックス試薬によるＩＶ型コラーゲンの
測定は、生化学用自動分析装置７１５０形（日立製作所
社製）を用いて行った。測定条件は、以下のとおりであ
った。 検体容量：２０μｌ ラテックス試薬：９０μｌ 検体希釈用緩衝液：１８０μｌ 測定波長：７００ｎｍ 測定温度：３７℃

【００７３】検体と検体希釈用緩衝液とを予めよく混合
した後、ラテックス試薬を添加してから約８０秒後と約
３２０秒後との吸光度の増加分（ΔＯＤ７００）を測定
し、これを１００００倍したものを吸光度変化量とし
た。標準品を検体として用いて、上記操作を行い、検量
線を作成した。

【００７４】比較例１ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、１Ｄ６抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）を用いたこと以外は、実施例３と同様に
して測定した。

【００７５】比較例２ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、１Ｄ６抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）及び８Ｇ１２抗体固定化ラテックス（固
形分０．１７％）を１：１で等量混合したものを用いた
こと以外は、実施例３と同様にして測定した。

【００７６】比較例３ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、１Ｄ６抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）及び９Ｃ７抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）を１：１で等量混合したものを用いたこ
と以外は、実施例３と同様にして測定した。

【００７７】比較例４ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、４Ｈ１２抗体固定化ラテックス（固
形分０．１７％）を用いたこと以外は、実施例３と同様
にして測定した。

【００７８】比較例５ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、４Ｈ１２抗体固定化ラテックス（固
形分０．１７％）及び１Ｄ３抗体固定化ラテックス（固
形分０．１７％）を１：１で等量混合したものを用いた
こと以外は、実施例３と同様にして測定した。

【００７９】比較例６ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、１Ｄ３抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）及び８Ｇ１２抗体固定化ラテックス（固
形分０．１７％）を１：１で等量混合したものを用いた
こと以外は、実施例３と同様にして測定した。

【００８０】比較例７ ラテックス試薬として、１Ｄ６抗体固定化ラテックス及
び４Ｈ１２抗体固定化ラテックスを１：１で等量混合し
たものの代わりに、１Ｄ３抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）及び９Ｃ７抗体固定化ラテックス（固形
分０．１７％）を１：１で等量混合したものを用いたこ
と以外は、実施例３と同様にして測定した。

【００８１】実施例３、比較例１〜７の吸光度変化量を
表４に示した。表４から明らかなように、クローン１Ｄ
６及びクローン４Ｈ１２のいずれか一方のモノクローナ
ル抗体を固定化しただけのラテックス試薬や、クローン
１Ｄ６及びクローン４Ｈ１２のいずれか一方とこれら以
外の抗体を固定化したラテックスとを混合したラテック
ス試薬は、１Ｄ６抗体固定化ラテックスと４Ｈ１２抗体
固定化ラテックスとを混合してラテックス試薬とした場
合と異なり、標準品での吸光度変化量の増加はみられ
ず、クローン１Ｄ６及びクローン４Ｈ１２の組み合わせ
のみがヒト血清中のＩＶ型コラーゲンを特異的に検出し
うる試薬であることが判った。

【００８２】

【表４】

【００８３】実施例４ ヒト血清中のＩＶ型コラーゲン
測定：ＥＩＡ法との相関性 健常人、肝癌（ＨＣＣ）、肝硬変（ＬＣ）を含むヒト血
清３０検体について、１Ｄ６抗体固定化ラテックスと４
Ｈ１２抗体固定化ラテックス試薬とを１：１で等量混合
したラテックス試薬を用いて、検体中のＩＶ型コラーゲ
ン濃度の測定を行った。実施例３で得られた検量線を用
いて、ＩＶ型コラーゲン濃度が未知のヒト血清３０検体
の吸光度変化量から、検体中のＩＶ型コラーゲン濃度を
求めた。結果を表５に示した。

【００８４】比較例８ 実施例４で使用したヒト血清３０検体中のＩＶ型コラー
ゲン濃度を、ＥＩＡ法（特開平２−１５５３号公報に記
載の方法）により測定した。結果を表５に示した。

【００８５】

【表５】

【００８６】以上の結果に基づき、実施例４の測定値と
ＥＩＡ法による測定値との相関を図１に示した。この結
果から明らかなように、実施例４で用いたラテックス試
薬は、ＥＩＡ法（特開平２−１５５３号公報に記載の方
法）と同等の相関性を示すことが判った。

【００８７】実施例５ ヒト血清中のＩＶ型コラーゲン
測定：同時再現性 ＥＩＡ法（特開平２−１５５３号公報による方法）で濃
度を測定したＩＶ型コラーゲン陽性ヒトプール血清（１
００、３１０、５８０ｎｇ／ｍｌ）３種類を、実施例３
の試薬を用いて各１０回繰り返し測定した。測定値の平
均、標準偏差、測定値のばらつき（Ｃ．Ｖ．）（％）値
を求めた。結果を表６に示した。

【００８８】比較例９ 実施例５で使用したＩＶ型コラーゲン陽性プールヒト血
清を、特開平２−１５５３号公報に記載のＥＩＡ法を用
いて、各１０回繰り返し測定した。測定値の平均、標準
偏差、Ｃ．Ｖ．（％）値を求めた。結果を表６に示し
た。

【００８９】

【表６】

【００９０】以上の結果から、実施例５で使用したラテ
ックス試薬は、特開平２−１５５３号公報に記載の方法
に優る同時再現性（測定精度）を示すことが判った。

【００９１】

【発明の効果】本発明のＩＶ型コラーゲンの免疫測定法
は、上述のとおりであるので、迅速、簡便で、かつ、正
確にＩＶ型コラーゲンの定量を行うことができ、肝疾患
の診断等に利用することができる。また、本発明で使用
されるラテックス試薬は、全自動分析装置に適用するこ
とができるので、ＩＶ型コラーゲンの測定用試薬として
も好適である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４の測定値とＥＩＡ法（比較例８）によ
る測定値との相関を示したグラフである。縦軸は、実施
例４の測定値であり、横軸は、ＥＩＡ法による測定値で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 篠田 潤一郎 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 小幡 賢一 高岡市長慶寺530番地 富士薬品工業株式 会社

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中のＩＶ型コラーゲン量を、抗ヒト
   ＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体が固定化されたラ
   テックス粒子を含んでなるラテックス試薬の凝集反応を
   利用して定量することを特徴とするＩＶ型コラーゲンの
   免疫測定法。
2. 【請求項２】 ＩＶ型コラーゲンは、７Ｓドメインと分
   子中央三重らせんドメインとを有してなるヒトＩＶ型コ
   ラーゲンである請求項１記載のＩＶ型コラーゲンの免疫
   測定法。
3. 【請求項３】 モノクローナル抗体は、ラテックス粒子
   への固定化により、ＩＶ型コラーゲンとの結合能が消失
   しないものである請求項１又は２記載のＩＶ型コラーゲ
   ンの免疫測定法。
4. 【請求項４】 モノクローナル抗体として、２種類の抗
   ヒトＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体を用いること
   を特徴とする請求項１、２又は３記載のＩＶ型コラーゲ
   ンの免疫測定法。
5. 【請求項５】 ２種類の抗ヒトＩＶ型コラーゲンモノク
   ローナル抗体は、クローン４Ｈ１２及びクローン１Ｄ６
   である請求項４記載のＩＶ型コラーゲンの免疫測定法。
6. 【請求項６】 モノクローナル抗体が固定化されたラテ
   ックス粒子を含んでなるラテックス試薬の凝集反応は、
   検体と前記ラテックス試薬とを混合することにより行う
   ものである請求項１、２、３、４又は５記載のＩＶ型コ
   ラーゲンの免疫測定法。
7. 【請求項７】 請求項１、２、３、４、５又は６記載の
   ＩＶ型コラーゲンの免疫測定法を行うために用いられる
   ＩＶ型コラーゲンの測定用試薬であって、モノクローナ
   ル抗体が固定化されたラテックス粒子を含んでなるラテ
   ックス試薬からなることを特徴とするＩＶ型コラーゲン
   の測定用試薬。