JP2006510890A - グアニル酸結合タンパク質−1(gbp−1)の検出のためのelisa方法 - Google Patents
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Abstract
Description
内皮は、細胞に向けられた免疫反応、月経、創傷治癒、炎症、アレルギー、心臓血管疾患及び腫瘍成長などの多くの生理学的過程並びに病態生理学的過程において重要な器官である。内皮の病態機能は、内皮細胞の活性化に密接に関係する。
GBP−1の構造/機能関係に関するさらに詳細な解析は、興味深いことに炎症性サイトカインによっても誘導される白血球に対する内皮細胞の接着能力が、GBP−1により影響されないことを示した(Guenziら、2001)。従って、GBP−1は、内皮細胞に対する炎症性サイトカインの抗増殖効果を選択的制御する、炎症性組織活性化に対する新たな分子マーカーである。
従って、本発明は、組織試料の培養上清、体液試料又は細胞培養上清からの試料における、GBP−1またはこのタンパク質の断片の同定及び/又は定量化のインビトロの方法であって、本方法が
(a)試料と、GBP−1又はこのタンパク質の断片に特異的に結合する第一受容体とを接触させ;そして
(b)受容体とGBP−1又はこのタンパク質の断片との特異的結合を検出する
工程を含んでなる、前記方法に関する。
本発明による方法の好ましい態様は、さらに第一受容体と接触する前に:
(a’)サンプル中に含まれるタンパク質を標識する;または
(b’)第一受容体を標識する
工程(a’)または(a’’)を含んでなる。
本発明の方法の代わりの態様によれば、受容体は、GBP−1又はこのタンパク質の断片に接触した後に表面に固定される。受容体は、種々の手段により固定化される。適切な方法は、例えば受容体の型又は表面の材料など、種々の因子に依存する。固定化は、共有的に又は吸着により行いうる。本発明に関する方法の好ましい態様によれば、受容体はタンパク質であり、特に好ましくは抗体である。また好ましいのは、受容体としてのペプチド又は有機分子の使用である。
ビーズの例は、所望によりリガンドが結合し、受容体の表面への固定化を推進する、セファロースビーズ又はラテックスビーズである。例えば、そのようなリガンドは、抗体のFc部分を介して抗体の表面への結合を推進するプロテインA又はプロテインGである。受容体の担体材料への結合は、共有化学カップリング反応(例えば、ヒドラジドカップリング)によっても達成可能である。実施例3は、対応する方法を記載する。リガンドを用いた受容体の表面への固定化の他の例は、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンの使用である。
(a’’’)ビーズを、そこに結合した第一受容体とGBP−1又はこのタンパク質の断片の複合体とともに沈殿させる
工程(a’’’)をさらに含んでなる。
用語ポリペプチドは、30アミノ酸より多くのアミノ酸鎖を通常含んでなるペプチドを言い、タンパク質を含む。
モノクローナル抗体及びその産生方法は、当業者に知られている。これらは、Kohlar及びMilstein(1975)により初めて記載された方法に基づく。この方法は、とりわけ、Harlow及びLaneによる研究室マニュアル(Antibodies、A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory;(1988);第6章)に詳細に記載される。この定義により、二特異性抗体、合成抗体及びそれらの抗体の断片又は誘導体も含んでなる。これらは、Fab、Fv又はscFcのような断片、及びそれらの抗体又はそれらの抗体の断片の化学的に修飾された誘導体を含んでなる。
好ましくは、本発明による方法は、ELISA、EIA又はRIAである。
適切な方法は、原則としてHarlowとLaneの引用文中、及びRehmの引用文中から、当業者に知られている。
さらに、本発明は、陽性の検出が炎症性疾患の存在の指標である、GBP−1又はこのタンパク質の断片の検出のために、以上で定義された体液又は細胞培養上清の試料の使用を言う。
実施例1:ベクター構築体の産生
237bpのGBP−1プロモーター断片(pro237−GBP−1)を、オリゴヌクレオチド5’−ATTTGAAGCTTCTGGTTGAG−3’[HindIII切断部位(下線)の挿入]又は5’−TGGCTTCTAGCACTTCTG−3’と構築体pro3757−GBP−1から、PCR増幅(PCR2 Advantage Kit、Clontech)を用いて生成した。構築体pro3757−GBP−1は、ベクターpT−Adv(Clontech)中に、3757bpの5’調節配列をGBP−1遺伝子(gi:4503938、NM_002053)のATGコドンの上流に含む。237bpの断片を、アンチセンスの方向性でベクターpT−Advとライゲーションし、HindIIIで切断し、そしてpGL3 Basic Vector(Promega)の中にサブクローニングした。すべての構築体をEndofree Maxi Kit(Qiagen)を用いて精製し、そして検証のためにシークエンスした。
HEK293T細胞(ヒトアデノウイルスタイプ5(Ad5)DNAで形質転換され(ATCC CRL 1573)、SV40 T抗原でさらに形質転換したヒト胎児上皮腎臓細胞株)を、トランスフェクションの24時間前に3×105細胞/ウェル(6マルチウェルプレート、Corning)でまいた。選択プラスミドpBABE−Puro(P.Monini、ウイルス学研究室、Insituto Superiore di Sanita、イタリア、ローマ)と1:5の比率で使用される試験プラスミドpro237−GBP−1の、合計0.8μgのプラスミドを、6ウェルプレートのウェルごとに使用した。試験プラスミドpro237−GBP−1は、指標遺伝子のホタルのルシフェラーゼに連結した237bpプロモーター断片を含有し、選択プラスミドpBABE−Puroは、その後の選択が実行されるピューロマイシン耐性遺伝子を含有する。細胞のトランスフェクションを、Effectene(Qiagen)の製造業者の説明書に従い実行し、そして選択を24時間後に0.7μg/mlピューロマイシン(Sigma)で開始した。8−10日に、個々のクローンの増殖を観察し、それらをその後クローニングリングでトリプシン処理し、そして96ウェルプレート(Falcon)の1つのウェルに移した。相当するコンフルエンスにおいて、クローンをさらに継代し、そしてルシフェラーゼアッセイにおいてレポーター遺伝子活性を検討した。クローンを、炎症性サイトカインIFN−γ、IL−1β及びTFN−αで刺激し、そして5時間緩衝し、そして1×受動的(passive)溶解緩衝液(Promega)中で回収した。溶解物をホタルのルシフェラーゼ活性についての検討し、そして対応する安定クローンを確立した。
新鮮に調製された細胞溶解物を、GBP−1と反応しない2μlのウサギの前血清(pre−serum)、及び25μlのプロテインA/Gアガロースビーズと、少なくとも3時間4℃で振動台において前精製した。ビーズをペレットにした後に、上清を、25μlプロテインA/Gアガロースビーズ、及び1μlのGBP−1に対するポリクローナルウサギ血清とともに、一晩、4℃にて振動台上でインキュベートした。ビーズを4、5回、PBSで洗浄した。その後に、ビーズを、30μlのLaemmli試料緩衝液(2×)で再懸濁し、そして5分煮沸した。試料を、SDS−PAGE(10%)で分離し、そしてウエスタンブロット又はオートラジオグラフィーで解析した。
実施例4:GBP−1ELISA
以下の緩衝液を、開発したGBP−1ELISAのために使用した:
0.1%Tween20を含有するPBS(PBS−T)並びに0.1%Tween20及び2%BSAを含有するPBS(PBS−TB)。
ELISAの感度を、GBP−1−His(細菌から精製し、そして精製のために6ヒスチジン残基がカルボキシ末端に追加されているGBP−1タンパク質)の希釈連続を用いてPBS中で決定した。
試験内の結果の再現性を、3重の測定により決定した。従って、ばらつきを以下のように計算した:
ばらつき=(標準偏差/平均値)×100%
GBP−1を健康な被験者の血清(PBS中で1:2に希釈)に加えることにより、異なったGBP−1−His濃度の3つの試験溶液(400ng/ml、180ng/ml、40ng/ml)を生産した。アッセイ内のばらつきをそれぞれの溶液で決定した:
GBP−1−His 400ng/l;アッセイ内のばらつき=2.7%
GBP−1−His 180ng/l;アッセイ内のばらつき=2.8%
GBP−1−His 40ng/l;アッセイ内のばらつき=2.0%
2.アッセイ間のばらつき:
ELISAの再現性を、アッセイ間のばらつきを決定するために、異なった試験において決定した。この効力のために、上に示した溶液のそれぞれを6回測定した。アッセイ間のばらつきを以上に記載するように計算した。
GBP−1−His 400ng/l;アッセイ間のばらつき=4.4%
GBP−1−His 180ng/l;アッセイ間のばらつき=2.8%
GBP−1−His 40ng/l;アッセイ間のばらつき=3.0%
Claims (15)
- 組織試料の培養上清、体液試料または細胞培養上清からの試料における、グアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片の同定及び/又は定量化のインビトロの方法であって、該方法が
(a)試料と、グアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片に特異的に結合する第一受容体とを接触し;そして
(b)受容体とグアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片との特異的結合を検出する
工程を含んでなる、前記方法。 - 第一受容体と接触する前に、
(a’)サンプル中に含まれるタンパク質を標識する;又は
(a’’)第一受容体を標識する
工程(a’)又は(a’’)をさらに含んでなる、請求項1の方法。 - グアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片と接触する前に、受容体を表面に固定する、請求項1又は2の方法。
- グアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片と接触した後に、受容体を表面に固定する、請求項1又は2の方法。
- 表面の材料が、セファロース、ラテックス、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル、ニトロセルロース及びシリコンからなる群より選択される、請求項3または4のいずれか1つの方法。
- 表面が膜、ビーズ、チップ又はプレートである、請求項3ないし5のいずれか1つの方法。
- 特異的結合の検出の工程の前に、
(a’’’)ビーズを、そこに結合した第一受容体とグアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片の複合体と沈殿させる
工程(a’’’)をさらに含んでなる、請求項6の方法。 - 工程(b)における特異的結合の検出が、ゲル電気泳動的分割、所望によりさらにウエスタンブロット解析を含んでなる、請求項7の方法。
- 工程(a)における、グアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片と第一受容体との特異的結合の検出のために、試料がグアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片に対する第二受容体と接触される、第二受容体はグアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片のエピトープに結合し、第二受容体は、第一受容体のグアニル酸結合タンパク質−1またはこのタンパク質の断片への結合後に接近可能である、請求項1ないし8のいずれか1つの方法。
- グアニル酸結合タンパク質−1又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体が標識される、請求項9の方法。
- グアニル酸結合タンパク質−1又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体の標識が、シグナルを放出する系を含むか、あるいはシグナルを放出する系を含んでなるさらなる第三受容体により特異的に認識されるものである、請求項10の方法。
- シグナルを放出する系が、該シグナルを放出する酵素を含んでなる、請求項11の方法。
- 第一受容体及び第二受容体、並びに所望により第三受容体が、ペプチド、ポリペプチド、低分子物質、抗体又はそれらの断片若しくは誘導体およびアプタマーからなる群より選択される、請求項9ないし12のいずれか1つの方法。
- 方法がELISA、EIA又はRIAである、請求項1ないし13のいずれか1つの方法。
- 方法が自動的に実行される、請求項1ないし14のいずれか1つの方法。
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