KR20190066027A - 진단 분석에 사용하기 위한 단백질 항원으로서 rep 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, (a) 대조군 샘플 대비 개체 샘플에서의 Rep 단백질 또는 이의 단편의 2배 이상의 양적 증가; 또는 대조군 샘플 대비 개체 샘플에서의 anti-Rep 항체의 2배 이상의 양적 증가가 MS 진단과 상관관계가 존재하며, Rep 단백질이 MSBI1 Rep 또는 MSBI2 Rep인, 다발성 경화증 (MS)을 진단하는데 사용되는 DNA-복제-관련 (Rep) 단백질을 개시한다.

Description

진단 분석에 사용하기 위한 단백질 항원으로서 REP 단백질
본 발명은, 예를 들어, 다발성 경화증 (MS)과 같은 신경퇴행성 질환을 진단하는데 사용하기 위한 DNA-복제-관련 (DNA-replication-associated)(Rep) 단백질 또는 anti-Rep 항체의 검출 및 정량화 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 MSBI1 게놈-코딩된 Rep 단백질에 관한 것이다.
다발성 경화증 (MS)의 병인은 밝혀지지 않았다. 이에, MS 진단 및/또는 MS 모니터링 또는 MS의 치료 및/또는 MS의 소인 (predisposition)을 평가하는데 사용될 수 있는 MS 바이오마커가 요구되고 있다.
다발성 경화증 (MS)은 뇌와 척수의 신경 세포를 손상시키는 MS 병변의 탈수초화를 특징으로 한다. MS 증상은 갑작스러운 악화 에피소드 (재발, 악화, 발작, 공격) 또는 시간 경과에 따른 점진적인 악화 (진행성 형태)로서 발생한다. 탈수초화는 T 세포를 촉발하여 사이토카인과 항체를 분비시키는 염증성 프로세스를 개시한다. MS 진단에, 특히 신경 촬영술, 뇌척수액 분석 및 유발 전위 (evoked potentials)를 이용한다.
여러가지 시험 물질 (다발성 경화증 (MS) 뇌 조직, 소 혈청, 밀크)로부터 17종의 상이하지만 서로 부분적으로 관련있는 DNA 분자들이 분리되었다 (Funk, Gunst et al. 2014, Gunst, Zur Hausen et al. 2014, Lamberto, Gunst et al. 2014, Whitley, Gunst et al. 2014).
이들 DNA 분자 분리물들 중에서도, 전파성 해면상 뇌증 (TSE)-관련 분리물 Sphinx 1.76 (1,758 bp; 등재번호 HQ444404, (Manuelidis L. 2011))과 밀접하게 관련된 2개의 DNA 분자가 MS 환자의 뇌 조직으로부터 분리되었다. 이들 분리물은 MSBI1.176 (MSBI, 다발성 경화증 뇌 분리물) (1,766 bp) 및 MSBI2.176 (1,766 bp)으로, 각각 "MSBI1 게놈" 및 "MSBI2 게놈"으로 명명된다. MSBI1,176은 Sphinx 1.76의 서열과 98%의 뉴클레오티드 유사성을 공유한다. 이들 분리물의 큰 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 서로 높은 유사성을 가진 추정상의 DNA 복제 단백질을 코딩한다. 또 다른 공통적인 특징은 iteron-유사 탠덤 리피트가 존재한다는 것이다. 이 리피트 영역의 정렬이 단일 뉴클레오티드의 코어 내 변형을 나타낸다. 이러한 iteron-유사 리피트가 Rep 단백질에 대한 결합 부위를 구성할 수 있다. 분리물의 서열은 등재번호 LK931491 (MSBI1.176) 및 LK931492 (MSBI2.176)으로 EMBL 데이타뱅크에 등록되었으며 (Whitley C. et al. 2014), WO 2016/005064에서 정렬 및 기술된 바 있다.
추가의 분리물이 소 젖에서 수득되었다. 이러한 소 젖 분리물 (CMI)은 CMI1.252, CMI2.214 및 CMI3.168이며, 각각 "CMI1 게놈", "CMI2 게놈" 및 "CMI3 게놈"으로 명명된다. 분리물의 서열은 EMBL 데이타뱅크에 등재번호 LK931487 (CMI1.252), LK931488 (CMI2.214) 및 LK931489 (CMI3.168)로 등록되었으며, WO 2016/005064에서 정렬 및 기술된 바 있다.
Funk, M., et al. (2014). "Isolation of protein-associated circular DNA from healthy cattle serum". Genome Announc 2(4) Giraldo, R., et al. (2011). "RepA-WH1 prionoid: a synthetic amyloid proteinopathy in a minimalist host." Prion 5(2):60-64 Gunst, K., et al. (2014). "Isolation of bacterial plasmid-related replication-associated cirular DNA from a serum sample of a multiple sclerosis patient." Genome Announc 2(4). Lamberto, I., et al. (2014). "Mycovirus-like DNA virus sequences from cattle serum and human brain and serum samples from multiple sclerosis patients." Genome Announc 2(4). Manuelidis L., 2011. "Nuclease resistant circular DNAs co-purify with infectivity in scrapie and CJD". J. Neurovirol. 17:131-145. Torreira, E., et al. (2015). "Amyloidogenesis of bacterial prionoid RepA-WH1 recaptiulates dimer to monomer transitions of RepA in DNA replication initiation." Structure 23(1):183-189 Whitley, C., et al. (2014). "Novel replication-competent cirulara DNA molecules from healthy cattle serum and milk and multiple sclerosis-affected human brain tissue." Genome Announc 2(4).
본 발명자들은, MSBI1 게놈이 전사된 RNA을 현저하게 생산하고, MSBI1 게놈-코딩 Rep 단백질이 인간 세포에서 발현된다는 것을, 알게 되었다. 본 발명자들은, MSBI1 및 MSBI2 게놈-코딩 Rep 단백질 (MSBI1 Rep 및 MSBI2 Rep)이 병원성 스크리닝 분석을 위한 바이오마커라는 것을, 발견하게 되었다. DNA-복제-관련 단백질 (RepB)로서, Rep 단백질은 DNA 결합 활성을 가지고 있으며, 에피좀 또는 바이러스 DNA 분자의 복제 개시에 필수적일 수 있다. 본 발명에 따른 MSBI1 게놈-코딩 Rep와 구조적으로 유사한 Rep 단백질들이 자기-올리고머화 (self-oligomerization) 및 응집의 현저한 가능성이 있으며, 이는 원핵생물 시스템에서 생체내 및 시험관내에서 확인되었다 (Giraldo, Moreno-Diaz de la Espina et al. 2011, Torreira, Moreno-Del Alamo et al. 2015).
본 발명은 항원으로서 Rep 단백질의 사용에 기반한 병원체-특이적인 진단 스크리닝 분석용 플랫폼을 제공한다.
특정 구현예에서, anti-Rep 항체는 분리된 DNA (예, MSBI1)의 병리학적 활성과 Rep 단백질 발현 간의 상관관계로 인해 병원성 마커 (pathogenic marker)로서 사용된다. anti-Rep 항체가 증가된 양으로 함유된 환자의 혈청은, 해당 환자가 분명히 Rep-관련 단백질에 노출되었거나 또는 Rep 특이적인 면역 반응을 개시할 만큼 충분한 기간 동안 Rep를 자체적으로 발현하였다는 것을, 의미한다. 인간 항체의 타겟으로서 Rep 단백질이 항원으로 사용된다. anti-Rep 항체의 정량 시험 결과에 기초하여, 급성 MS 뿐만 아니라 MS 소인을 진단 또는 모니터링할 수 있다. 샘플 내 유도된 anti-Rep 항체 또는 발현된 Rep 단백질의 양적 증가가 MS 개시 및/또는 MS 상태를 나타내는 것으로 인식되므로, anti-Rep 항체 및 Rep 단백질의 양적 증가는 각각 MS를 진단하기 위한 병원성 바이오마커로서 사용될 수 있다.
유익한 점은, MS에 대한 병원성 바이오마커는 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플에서 검출할 수 있으며, 뇌척수액으로부터 샘플을 취하지 않아도 된다는 것이다.
그래서, 본 발명은 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 다발성 경화증 (MS)의 진단에 사용하기 위한 DNA-복제-관련 (Rep) 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, Rep 단백질은 MSBI1 게놈에 의해 코딩되며, (i) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 1의 단편; 또는
(iii) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있으며, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질은 MSBI2 게놈에 의해 코딩되며, (i) 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 8의 단편; 또는
(iii) 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있으며, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질은 CMI1 게놈에 의해 코딩되며, (i) 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 10의 단편; 또는
(iii) 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있으며, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질은 CMI2 게놈에 의해 코딩되며, (i) 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 11의 단편; 또는
(iii) 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있으며, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질은 CMI3 게놈에 의해 코딩되며, (i) 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 12의 단편; 또는
(iii) 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있으며, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 대조군 샘플 내 Rep 단백질 양과 비교해, 개체의 샘플 내 Rep 단백질의 양적 증가는, 신경 퇴행성 질환, 예를 들어, MS의 진단과 상관관계가 있으며, 즉 MS임을 의미한다. 본 발명에서, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단 또는 신경퇴행성 질환, 예를 들어, MS에 대한 소인은, 대조군 샘플 대비 2배 이상의 Rep 단백질의 양적 증가에 의해 식별된다.
다른 구현예들에서, 대조군 샘플 내 anti-Rep 항체의 양과 비교해, 개체의 샘플 내 anti-Rep 항체의 양적 증가는, 신경 퇴행성 질환, 예를 들어, MS의 진단과 상관관계가 있으며, 즉 MS임을 의미한다. 본 발명에서, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단 또는 신경퇴행성 질환, 예를 들어, MS에 대한 소인은, 대조군 샘플 대비 2배 이상의 anti-Rep 항체의 양적 증가에 의해 식별된다.
본 발명의 Rep 단백질은 항체 또는 세포-매개 면역 반응을 검출하기 위해 공지된 항원을 이용하는 모든 분석 포맷에 실제 이용될 수 있다. 즉, 본 발명은 Rep 단백질에 대해 세포-매개, 예를 들어 T 세포성 면역 반응을 검출하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 개체에서 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법을 제공한다:
(a) 개체의 샘플을 Rep 단백질과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 개체의 샘플에서 Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 검출하는 단계; 및
(c) Rep 단백질에 결합된 항체의 양을, 대조군 샘플에서의 양과 비교해, 신경퇴행성 질환의 진단과 상호관련시키는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 개체에서 MS 진단 방법을 제공한다:
(a) 개체의 샘플을 Rep 단백질과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 개체의 샘플에서 Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 검출하는 단계; 및
(c) Rep 단백질에 결합된 항체의 양을, 대조군 샘플에서의 양과 비교해, MS 진단과 상호관련시키는 단계.
특정 구현예에서, Rep 단백질을 고정 (immobilization)하고, 예를 들어, 지지체 또는 담체에 부착한 후 고정된 Rep 단백질을 개체의 샘플과 함께 인큐베이션한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질을 세포에서 발현시킨 후, 그 세포를 개체의 샘플과 함께 인큐베이션한다.
특정 구현예에서, Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양은, 면역학적 복합체의 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는 신호 발생 화합물에 커플링된 추가적인 결합 물질, 예를 들어, 검출가능하게 표지된 이차 항체, 바람직하게는 anti-인간 항체에 의해 정량한다.
다른 구현예들에서, 개체 샘플 내 항체를 고정한 다음, 정의된 양 (defined amount)의 Rep 단백질과 인큐베이션한다.
바람직하게는, 개체 샘플 및 대조군 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플이다.
다른 구현예들에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 환자에서 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법을 제공한다:
(a) 개체 샘플 내 Rep 단백질의 양을 anti-Rep 항체에 의해 검출하는 단계, and
(b) 대조군 샘플 내 양과 비교해 단계 (a)에서 개체 샘플에서 검출된 Rep 단백질의 양을 신경퇴행성 질환의 진단과 상호관련시키는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 환자에서 MS를 진단하는 방법을 제공한다:
(a) 개체 샘플 내 Rep 단백질의 양을 anti-Rep 항체에 의해 검출하는 단계, and
(b) 대조군 샘플 내 양과 비교해 단계 (a)에서 개체 샘플에서 검출된 Rep 단백질의 양을 MS의 진단과 상호관련시키는 단계.
이러한 구현예에서, 개체의 샘플 및 대조군 샘플은 혈청 샘플, 혈장 샘플 또는 조직 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, anti-Rep 항체는 서열번호 1의 아미노산 1번부터 136번까지, 137번부터 229번까지 및 230번부터 324번까지로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 이 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 포함된 에피토프에 결합한다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은, (a) Rep 단백질, 특히 MSBI1, MSBI2, CMI1, CMI2 또는 CMI3 Rep 단백질, (b) 본 발명에 따른 anti-Rep 항체에 결합할 수 있으며; 신호 발생 화합물이 커플링된 추가적인 결합 물질, 예를 들어 검출가능한 표지물질에 커플링된 anti-인간 항체, 및 (c) (a)에 따른 Rep 단백질을 고정하거나, 또는 샘플 내, 특히 혈청 또는 혈장 샘플 내에서 의심되는 anti-Rep 항체를 고정하기에 적합한 고체 매트릭스를 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 면역분석, 예를 들어, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성면역분석 (RIA), 효소 면역 분석 (EIA), 형광 면역분석 (FIA), 발광 면역분석 (LIA) 및 스트립 분석 (strip assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 분석에 사용하기 위해 제공된다.
도 1은 1D-크기-분리된 Rep 단백질 막 스트립의 혈청 인큐베이션에 의한 2 x 8 샘플의 혈청 스크리닝 예를 나타낸 것이다. Rep 단백질이 함유된 니트로셀룰로스 스크립을 MS 혈청 풀 또는 건강한 공여자 혈장 풀의 각각 2가지의 다른 혈청/혈장 희석물 (1:500 및 1:2000)과 함께 인큐베이션하였다. Rep-결합된 인간 IgG를 anti-인간 IgG HRP-커플링된 이차 항체로 검출하였다. 전장 Rep 단백질 타겟의 크기에서 관찰되는 항체 신호 (우측 코마시 단백질 염색 및 anti-Rep WB 대조군 참조)를 밀도측정기로 정량하였다.
도 2는 ELISA 스크리닝에 기반한 Rep-특이적인 혈청-반응의 정량 결과를 나타낸 것이다. Rep 단백질 (타겟 항원) 50, 100, 200, 400 또는 800 ng을 96웰에 스폿팅하였다. Rep 단백질을 차단 및 세척한 후, 항원을 MS 혈청 풀 샘플 (pooled MS serum sample) 또는 대조군 혈장 풀 샘플과 1:500 희석 비율로 6시간 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 이를 세척하고, HRP-커플링된 anti-인간 IgG HRP 이차 항체와 인큐베이션한 다음 마지막으로 세척한 후, Rep-결합된 인간 IgG의 존재를 TMB 기질 반응 및 450 nm에서의 흡광 측정으로 정량하였다. 정량 결과, 신호 강도와 Rep 단백질 (항원) 간에 양호한 상관관계가 확인되었다. 평균적으로, MS 풀의 신호 세기 수준은 대조군 풀의 세기에 1.9배 이상이다. 일반적으로, ELISA 기반의 혈청 스크리닝은 적어도 혈청 희석율 1:1000 (데이타 도시 안함)에서 검출가능한 혈청 항체를 식별하므로, 본 실험에서 역가는 1:2000-1:4000 범위에서 1:1000 보다 높거나 또는 심지어 플랫폼 최적화 후 더 높을 가능성이 있다.
도 3은 ELISA 스크리닝에 기반한 Rep-특이적인 혈청-반응의 정량 결과를 나타낸 것이다. Rep 단백질 (타겟 항원) 200 ng을 96웰 플레이트에 스폿팅하였다. Rep 단백질 항원을 차단 및 세척한 후, 7종의 MS 혈청 또는 7종의 대조군 혈청과 2세트로 1:500 희석 비율로 6시간 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 이를 세척하고, HRP-커플링된 anti-인간 IgG HRP 이차 항체와 인큐베이션한 다음 마지막으로 세척한 후, Rep-결합된 인간 IgG의 존재를 TMB 기질 반응 및 450 nm에서의 흡광 측정으로 정량하였다. MS 샘플의 평균 세기는 대조군 혈청의 평균 세기의 8배 이상이었고, 일부 MS 샘플들에서는 평균 대조군 세기의 10-16배였다.
도 4 - 6은 y 좌표에 표기된 anti-Rep 항체 A, B, C, D1 및 D2 적용시 수득된 면역형광 사진 데이타이다.
도 7은 웨스턴 블록 분석을 나타낸 것으로, A, B, C 및 D1은 사용된 anti-Rep 항체 군이다.
도 8은 "최적화된" (= 서열번호 13) vs. "오리지날" (= 야생형; 서열번호 15) MSBI1 서열을 정렬한 것이다. 최적화된 코돈이 표시된다.
본 발명은 병원성 마커로서 anti-Rep 항체의 존재에 대한 진단 스크리닝 분석을 제공한다. anti-Rep 항체를 증가된 양으로 포함하는 샘플은, 해당 개체가 명백하게 Rep-관련 단백질에 노출되었거나 또는 Rep 단백질 특이적인 면역 반응을 유도할만큼 충분한 기간 동안 Rep 단백질을 자체 발현하였다는 것을, 의미한다. 이러한 스크리닝 분석을 통해, anti-Rep 항체의 정량화에 기반한 MS 진단, 예후 예측 및 모니터링을 수행할 수 있다. 다른 구현예에서, Rep 단백질은 anti-Rep 항체에 의해 샘플에서 직접 검출 및 정량할 수 있다.
본원에서, "Rep 단백질"은 DNA-복제-관련 단백질 (RepB)을 지칭한다. Rep 단백질은 DNA 결합 활성을 포함하며, 에피좀/바이러스 DNA 분자의 복제 개시에 필수적일 수 있다. 일반적으로, Rep 단백질은 Small Sphinx Genome 그룹의 Rep 단백질을 지칭한다 (Whitley et al., 2014). 특히, 단백질은 MSBI1 게놈-코딩 Rep 단백질 (MSBI1 Rep), MSBI2 게놈-코딩 Rep 단백질 (MSBI2 Rep), CMI1 게놈-코딩 Rep 단백질 (CMI1 Rep), CMI2 게놈-코딩 Rep 단백질 (CMI2 Rep) 또는 CMI3 게놈-코딩 Rep 단백질 (CMI3 Rep)이다. 바람직하게는, MSBI1 Rep 단백질은 EMBL 데이타뱅크에 등재번호 LK931491로 등록된 MSBI1.176에 의해 코딩되며 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지거나, Rep 단백질은 EMBL 데이타뱅크에 등재번호 LK931492로 등록된 MSBI2.176에 의해 코딩되는 MSBI2이고 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 가진다 (Whitley, Gunst et al. 2014). 다른 바람직한 구현예에서, CMI1 Rep 단백질은 EMBL 데이타뱅크에 등재번호 LK931487로 등록된 CMI1.252에 의해 코딩되며 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. 다른 바람직한 구현예에서, CMI2 Rep 단백질은 EMBL 데이타뱅크에 등재번호 LK931488로 등록된 CMI2.214에 의해 코딩되며 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. 다른 바람직한 구현예에서, CMI3 Rep 단백질은 EMBL 데이타뱅크에 등재번호 LK931489로 등록된 CMI3.168에 의해 코딩되며 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. 특히 바람직한 구현예에서, Rep 단백질은 서열번호 1의 아미노산 1번부터 229번까지의 아미노산들로 필수적으로 구성되는 작은 Sphinx 게놈에 보존된 N-말단 영역과, 서열번호 1의 230번부터 324번까지의 아미노산들로 필수적으로 구성되는 MSBI1.176에 특이적인 C-말단 가변 영역을 포함한다. N-말단 보존된 영역은 서열번호 1의 1번부터 136번까지의 아미노산들로 필수적으로 구성되는 추정의 제1 DNA 결합 도메인과, 서열번호 1의 137번부터 229번까지의 아미노산들로 필수적으로 구성되는 추정의 제2 DNA 결합 도메인을 포함한다.
또한, "Rep 단백질"은, 서열번호 1 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 Rep 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 1 또는 서열번호 8의 단백질의 단편 및 변이체를 포괄한다. 바람직하게는, 이러한 단편은, 서열번호 1 또는 서열번호 8의 Rep 단백질에 대한 anti-Rep 단백질 항체의 하나 이상의 에피토프를 포함하는, 서열번호 1 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 단백질의, 면역원성 단편이며, 바람직하게는 적어도 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 50개의 연속적인 아미노산들을 포함한다. 특정 구현예에서, 단편은 Rep 단백질의 도메인, 예를 들어, N-말단 보존된 영역, C-말단 가변 영역, 제1 또는 제2 DNA 결합 도메인을 포함하거나, 또는 이들로 필수적으로 구성된다. 서열번호 1 또는 서열번호 8을 가진 단백질의 변이체는 서열번호 1과 비교해 하나 이상의 아미노산 결손, 치환 또는 부가를 포함하며, 서열번호 1 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 가지며, 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 Rep 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예, 비-천연 아미노산, 펩타이드 핵산 (PNA) 등)를 함유한 폴리펩타이드, 치환된 연결을 가진 폴리펩타이드 뿐만 아니라 당해 기술 분야에 공지된 천연 또는 비-천연적인 그외 변형을 가진 폴리펩타이드도 변이체의 정의에 포함된다. 용어 Rep 단백질은 이종의 아미노산 서열과, 리더 서열과 또는 Tag-서열 등과의 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 단백질 테그가 전술한 Rep 단백질, 예를 들어, MSBI1, MSBI2, CMI1, CMI2 또는 CMI3로 이루어진 군으로부터 선택되는 Rep 단백질에 유전자 이식된다. 특히, 하나 이상의 단백질 테그가 서열번호 1-3, 8-12, 14 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드에 부착된다. 이러한 단백질 테그는 화학적 물질 또는 효소적 수단에 의해 제거할 수 있다. 단백질 테그의 예로는 정제를 위한 친화성 또는 크로마토그래피 테그가 있다. 예를 들어, Rep 단백질은, 예를 들어, His6-Tag (서열번호 4), T7-Tag (서열번호 5), FLAG-Tag (서열번호 6) 및 Strep-II-Tag (서열번호 7), His-Tag (서열번호 4), T7-Tag (서열번호 5), FLAG-Tag (서열번호 6) 또는 StrepII-Tag (서열번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택되는 Tag-서열과 융합할 수 있다. 나아가, 그린 형광 단백질 (GFP) 또는 이의 변이체 등의 형광 테그가 본 발명에 따른 Rep-단백질에 부착될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, MSBI1 게놈-코딩 Rep 단백질 (MSBI1 Rep)은 인간 세포주 (예, HEK-293, HEK293TT, HEK293T, HEK293FT, HaCaT, HeLa, SiHa, CaSki, HDMEC, L1236, L428, BJAB, MCF7, Colo678, 임의의 1차 세포주) 뿐만 아니라 보바인 세포주 (예, MAC-T) 또는 뮤라인 세포주 (예, GT1-7)에서 생산하기 위해 코돈-최적화된다. 코돈 최적화와 관련하여, 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항원을 생산한 개체의 유전자에 사용되는 코돈을 이용하도록 설계될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 사용되는 코돈은 "인간화된" 코돈이다. 이러한 코돈 용법은 인간 세포에서 항원을 효과적으로 발현할 수 있게 해준다. 코돈 최적화에 적합한 임의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법과 방법의 선택은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서, MSBI1 게놈-코딩 Rep 단백질 (MSBI1 Rep)의 코돈-최적화된 변이체는 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 또는 가지며, 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 또는 가진다. 요컨대, 코돈 용법을 개선하기 위해, Rep 단백질을 코딩하는 MSBI1 Rep 유전자의 뉴클레오티드 927개 (개시 코돈에서 정지 코돈까지) 중 686개가 치환된다. 예를 들어, 인간 코돈 용법에 가장 최적으로 개조된 완벽한 코돈 용법은 코돈 적응 지수 (CAI, codon adaptation index) 1로 표시되며, 이는 전체 코돈이 인간 발현을 위해 최적화되었다는 것을 의미한다. 오리지날 MSBI1-코딩된 Rep 유전자의 경우, 인간 시스템에 대한 CAI는 0.67로 계산되는데, 이는 코돈 적응 양호 수준에서 낮은 역치로서 간주되는 CAI 0.8 보다 훨씬 낮다. MSBI1 rep 유전자를 코돈 최적화한 후, 최적화된 DNA의 CAI는 0.94로 계산되며, 이는 인간 시스템의 최적 코돈 적응에 거의 근접하다는 것을 의미한다. 특히, 매우 드물게 사용되는 코돈 18개가 변형되며, 이들 대부분이 인간 시스템에서 빈도가 매우 낮은 (<10%) 루신을 코딩하는 코돈이다. 서열번호 13의 코돈-최적화된 MSBI1 서열을 서열번호 15의 야생형 MSBI1 서열과 서열 정렬하여 도 8에 나타낸다.
본 발명의 Rep 단백질은, 전술한 Rep 단편 및 Rep 변이체를 비롯하여, 고전적인 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 합성은 균질한 용액 중에 또는 고상에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 또한 재조합 DNA 기법을 이용해 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 Rep 단백질의 제조 및 정제 방법은 실시예 1에 나타낸다.
본원에서 "개체"는, 뮤라인, 소, 예를 들어, 보바인, 유인원 및 인간 등의 포유류 개체 또는 환자를 지칭한다. 바람직하게는, 개체는 인간 환자이다.
본원에서, "샘플"은 액체 및 고체 샘플을 망라한 생물학적 샘플을 지칭한다. 액체 샘플은, 예를 들어, 혈청, 혈장 및 뇌척수액 (CSF)과 같은 혈액 액체를 포함한다. 고체 샘플은 조직 배양물 또는 바이옵시 표본 (biopsy specimen)과 같은 조직 샘플을 포함한다.
본원에서, "와 상호관련시킨다"는 anti-Rep 항체 및 Rep 단백질 각각의 양, 즉, 수준 또는 역가가, 예를 들어, MS의 질환 상태와 유의한 상관관계를 가지는 것을 의미한다. 상관관계는 검사할 개체로부터 유래된 샘플과 대조군 샘플에 존재하는 양 차이 수준을 검출함으로써 결정된다. "대조군 샘플"은 단일 샘플이거나, 또는 여러가지, 즉 3종 이상의 대조군 샘플의 평균을 의미한다. 대조군은 MS로 진단되지 않은 건강한 개체로부터 수집된다. 다른 예로, 상관관계는 검사할 개체로부터 유래된 샘플에 존재하는 양과 사전 결정된 컷-오프 값 간의 차이 정도를 검출함으로써, 이론적으로 결정할 수 있다. 컷-오프 값은 서로 다른 질환 상태 간의, 예를 들어 건강한 상태와 질병에 걸린 상태를 통계학적으로 유의하게 구분하는 기준값이다. 컷-오프 값은 병력을 가진 환자에서 유래된 시험 샘플들과 건강한 실험군으로부터 유래된 샘플들로 된 충분히 큰 규모의 패널을 당해 기술 분야에 공지된 통계학적 검정에 의해 통계학적으로 분석함으로써 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, 진단, 예를 들어, MS 진단은, 대조군 샘플과 비교해, 개체 유래 샘플에서의, 단백질, 즉 Rep 단백질 및 anti-Rep 항체의 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배의 양적 증가에 의해, 확인된다.
본원에서, "anti-Rep 항체"는 본 발명의 방법에서 Rep 단백질에 대한 검출가능한 수준에서의 항체 결합성을 의미하며, 이의 친화성은 비-Rep 단백질에 비해 본 발명의 Rep 단백질에 대해 더 강하다. 바람직하게는, Rep 단백질에 대한 항원 친화성은 백그라운드 결합 보다 적어도 2배 높다. 특히, anti-Rep 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 MSBI1 Rep 또는 MSBI2 Rep에 특이적이다. 특정 구현예에서, 항체는 MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep 및/또는 CMI3 Rep에 교차-특이성을 나타낸다. 특정 구현예에서, anti-Rep 항체는 MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep 및/또는 CMI3 Rep 중 적어도 2종, 바람직하게는 전체에 대해 교차-특이성을 나타내며, 서열번호 1의 아미노산 1번부터 내지 136번까지의 영역 내에 에피토프에 결합한다.
모든 분석들의 공통적인 특징은, Rep 단백질이 샘플에 존재하는 임의의 anti-Rep 항체와 결합할 수 있는 조건 하에, Rep 단백질을 anti-Rep 단백질 항체가 함유된 것으로 추정되는 샘플과 접촉시키는 것이다. 이러한 조건은 전형적으로 Rep 단백질을 과량으로 사용하는 생리학적 온도, pH 및 이온 세기일 것이다. Rep 단백질과 샘플의 인큐베이션 후, 항원을 포함하는 면역학적 복합체를 검출한다. 특정 구현예에서, Rep 단백질을 신호 발생 화합물, 예를 들어, 검출가능한 표지 물질과 커플링시키거나, 또는 신호 발생 화합물과 커플링된 부가적인 결합 물질, 예를 들어 2차 anti-인간 항체를 면역학적 복합체 검출에 사용한다.
Anti-Rep 항체는 단백질 항원으로서 Rep 단백질을 이용한 분석으로 검출 및 정량할 수 있으며, 단백질 항원은 샘플에서 의심되는 포유류, 예를 들어 인간 항체의 타겟으로 사용된다. 바람직하게는, Rep 단백질을 정제하며 (예, 실시예 1 참조), 샘플은 예를 들어 혈청 또는 혈장 샘플일 수 있다. 본 방법은 Rep 단백질을 매트릭스에 고정시킨 다음 고정된 Rep 단백질을 샘플과 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 마지막으로, Rep 단백질과 샘플 내 항체 간에 형성된 면역학적 복합체의 Rep-결합된 항체를, 신호 발생 화합물과 커플링된 검출 결합 물질, 예를 들어, HRP-기질을 이용한 정량화가 가능한 HRP-(호스래디시-퍼옥시다제)-커플링된 2차 검출 항체에 의해, 정량한다. 이러한 신호 발생 화합물 또는 표지 물질은 자체 검출가능하거나, 또는 부가적인 화합물과 반응하여 검출가능한 산물을 생성할 수 있다.
다른 구현예들에서, anti-Rep 항체는, 샘플의 항체를 매트릭스에 고정시킨 다음 표지할 수 있거나 또는 Tag 단백질을 포함하는 Rep 단백질을 정의된 양으로 사용해 함께 인큐베이션하며, 이때 매트릭스 상에 존재하는 고정된 anti-Rep 항체는 단백질-샘플 액체 혼합물로부터 Rep 단백질을 포획하게 되며, 이 후 결합된 Rep 단백질을 정량함으로써, 간접적으로 정량한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질을 세포에서 발현시킬 수 있으며, 이들 세포를 샘플과 인큐베이션한다. 그런 후, 세포에 의해 발현된 Rep 단백질에 결합된 샘플 유래 anti-Rep 항체를 검출하고, 정량한다.
면역분석의 설계에 상당한 변형이 이루어지며, 많은 포맷들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 프로토콜은, 예를 들어, 고체 지지체 또는 면역침강을 이용할 수 있다. 대부분의 분석법들은 신호 발생 화합물과 커플링된 결합 물질, 예를 들어, 표지된 항체 또는 표지된 Rep 단백질의 사용을 포함하며; 표지 물질은, 예를 들어, 효소, 형광, 화학발광, 방사성 또는 염료 분자일 수 있다. 면역학적 복합체로부터 신호를 증폭시키는 분석법 역시 공지되어 있으며; 그 예로는 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하는 분석법, 효소-표지된 및 매개된 면역분석, 예를 들어 ELISA 분석이 있다.
면역분석은 혼성적인 (heterogeneous) 또는 단일한 (homogeneous) 포맷일 수 있으며, 표준 타입 또는 경쟁적인 타입일 수 있다. 혼성적인 포맷의 경우, 폴리펩타이드 (Rep 단백질 또는 anti-Rep 항체)를 인큐베이션한 후 폴리펩타이드로부터 샘플을 용이하게 분리하기 위해, 전형적으로 고체 매트릭스 또는 지지체 또는 담체에 결합된다. 사용될 수 있는 고체 지지체에 대한 예로는 니트로셀룰로스 (예, 막 또는 마이크로타이터 웰 형태), 폴리비닐 클로라이드 (예, 시트 또는 마이크로타이터 웰), 폴리스티렌 라텍스 (예, 비드 또는 마이트로타이터 플레이트), 폴리비닐리딘 플루오라이드 (Immunolon으로 공지되어 있음), 디아조화 페이퍼 (diazotized paper), 나일론막, 활성화된 비드 (activated bead) 및 단백질 A 비드가 있다. 항원성 폴리펩타이드를 포함하는 고체 지지체는 전형적으로 시험 샘플로부터 이를 분리한 후, 결합된 anti-Rep 항체를 검출하기 전에, 전형적으로 세척한다. 표준 포맷 및 경쟁적인 포맷 둘다 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
단일한 포맷의 경우, 시험 샘플을 용액 중에 Rep 단백질과 인큐베이션한다. 예를 들어, 시험 샘플을 형성된 임의의 Rep 단백질-항체 복합체이 석출되는 조건에 둘 수 있다. 이러한 분석에 대한 표준적인 포맷 및 경쟁적인 포맷은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
표준적인 포맷의 경우, 항체-Rep 단백질 복합체에서 anti-Rep 항체의 양을 직접 모니터링한다. 이는, anti-Rep 항체 상의 에피토프를 인지하는 (표지된) anti-이종 (예, anti-인간) 항체는 복합체 형성으로 결합 여부를 측정함으로써, 달성할 수 있다. 경쟁적인 포맷의 경우, 샘플 내 anti-Rep 항체의 양은 복합체에서 기지량의 표지된 항체 (또는 다른 경쟁성 리간드)의 결합성에 대한 경쟁적인 효과를 모니터링함으로써, 추정한다.
anti-Rep 항체 (또는 경쟁적인 분석의 경우, 소정량의 경쟁성 항체)를 포함하는 형성된 복합체는, 포맷에 따라, 다수의 공지된 기법들 중 임의 기법으로 검출한다. 예를 들어, 복합체 내 비-표지된 anti-Rep 항체는 표지 물질 (예, 효소 표지 물질, 예를 들어, HRP)과 복합체를 형성한 anti-이종 Ig 접합체를 이용하여 검출할 수 있다.
면역침강 또는 응집반응 분석 포맷의 경우, Rep 단백질과 anti-Rep 항체 간의 반응으로 용액 또는 현탁액으로부터 석출되는 네트워크가 형성되며, 석출물로 된 가시적인 층 또는 필름이 형성된다. anti-Rep 항체가 샘플 내에 존재하지 않는다면, 가시적인 석출물은 형성되지 않는다.
선택되는 고상은 폴리머 비드, 유리 비드, 니트로셀룰로스, 미세입자, 반응 트레이의 마이크로웰, 시험관 및 자기 비드를 포함할 수 있다. 신호 발생 화합물은 효소, 발광 화합물, 발색체, 방사성 원소 및 화학발광 화합물을 포함할 수 있다. 효소의 예로는 알칼라인 포스파타제, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 및 베타-갈락토시다제 등이 있다. 인핸서 화합물의 예로는 바이오틴, anti-바이오틴 및 아비딘 등이 있다. 인핸서 화합물 결합성 물질의 예로는 바이오틴, anti-바이오틴 및 아비딘 등이 있다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은, 샘플 내 Rep 단백질의 증가된 양을 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단 또는 소인과 상호관련시키거나, 또는 질환, 예를 들어 MS를 모니터링하는데 이용하거나, 또는 질환, 예를 들어, MS의 치료를 모니터링하는데 이용하는, 방법을 제공한다. 이러한 구현예에서, 샘플 내 Rep 단백질은 anti-Rep 항체에 의해 검출한다.
이러한 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 개체 샘플 내 Rep 단백질의 양을 anti-Rep 항체에 의해 검출하는 단계; 및
(b) 대조군 샘플 내 양과 비교해 단계 (a)에서 개체 샘플에서 검출된 Rep 단백질의 양을 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단과 상호관련시키는 단계.
혈청 또는 혈장 샘플에서 Rep 단백질을 검출하는 상기한 방법에 사용될 수 있는 분석에 대한 예로는, 비-제한적으로, 면역침강, 면역형광, 도트 블롯팅 및 서든 블롯 등이 있다.
예를 들어, 혈청 샘플을 anti-Rep 단백질 항체와 함께 인큐베이션하여, 샘플 내 Rep 단백질을 포획할 수 있으며, 그 후 Rep 단백질의 면역침강 단계 및 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 검출 단계를 수행할 수 있다.
다른 예로, 도트 블롯 막을 혈청과 함께 인큐베이션한 다음, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 단계를 수행할 수 있다.
다른 예로, 샘플의 혈청 희석물을 SDS-PAGE에 로딩한 다음 웨스턴 블롯을 수행한다.
추가적인 구현예들에서, 면역조직화학적 방법 또는 면역형광 현미경 검경을 통해 조직 샘플에서 Rep 단백질을 검출한다.
특정 구현예에서, 샘플 내 Rep 단백질을 검출 또는 포획하기 위해 anti-Rep 항체를 사용한다.
용어 "항체"는, 바람직하게는, 서로 다른 에피토프 특이성을 가진 모든 다클론 항체들로 필수적으로 구성된 항체 뿐만 아니라 개별 단일클론 항체 조제물로 필수적으로 구성된 항체를 지칭한다. 본원에서, "항체"(Ab) 또는 "단일클론 항체" (Mab)는 온전한 면역글로불린 분자 뿐만 아니라 Rep 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편 (예, Fab 및 F(ab')2 단편)을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 결핍되어 있으며, 순환계에서 더 빨리 소거되며, 온전한 항체 보다 비-특이적인 조직에 대한 결합성이 낮을 수 있다. 따라서, 이들 단편이 바람직하며, 또한 Fab 또는 그외 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물들이 바람직하다. 또한, 본 발명의 목적에 따라 이용가능한 항체로는 키메라, 단쇄, 다중기능성 (예, 2 특이성) 및 인간화된 항체 또는 인간 항체 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 신호 발생 화합물이 커플링되며, 예를 들어, 검출가능한 표지를 가진다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 직접 또는 간접적으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 항체에 결합시키기에 적합한 다른 표지 물질을 알거나, 또는 일상적인 실험을 이용해 이를 알아낼 수 있을 것이다.
Anti-Rep 항체는, 바람직하게는, 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 방법에 의해 서열번호 1 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 Rep 단백질 또는 이의 단편에 대해, 제조 (구축)한다.
특정 구현예에서, Small Sphinx Genome 군으로부터 유래된 수종 또는 모든 유형의 Rep 단백질에 결합할 수 있는 anti-Rep 항체 (anti-Small-Sphinx-유사 Rep 항체 또는 anti-SSLRep 항체)를 본 발명의 방법에 이용한다. 이러한 anti-SSLRep 항체는 서열번호 1의 아미노산 1번부터 229번까지의 Rep 단백질의 보존된 N-말단 영역 내 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 서열번호 2 (서열번호 1의 아미노산 32-49) 또는 서열번호 3 (서열번호 1의 아미노산 197-216) 내 에피토프에 결합하는 anti-SSLRep 타입의 anti-Rep 항체를 사용한다. 서열번호 2 및 서열번호 3의 펩타이드 단편은 Small Sphinx Genome 군으로부터 유래된 Rep 단백질들에 고도로 보존되어 있으며, 자체 친수성 특징으로 인해 노출되는 것으로 보인다. anti-SSLRep 타입의 anti-Rep 항체는, 예를 들어, 마우스 또는 기니아피그를, 서열번호 2 또는 3에 나타낸 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 펩타이드로 면역화하거나; 또는 다른 면역원성 단편, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 1번부터 229번까지의 보존된 N-말단 Rep 단백질 영역으로부터 유래되는 아미노산을 적어도 8-15개 포함하는 다른 면역원성 단편에 의해 면역화함으로써, 생산할 수 있다.
추가적인 구현예들에서, MSBI1 Rep 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체를 사용한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 전장 Rep 단백질로 마우스 또는 기니아피그와 같은 포유류를 면역화함으로써, 생산할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 척수액 또는 뇌액과 같은 여러가지 체액 타입들에서 최대 pg 내지 fg 범위로 Rep 단백질을 검출할 수 있는, anti-Rep 항체를 이용한다.
본 발명의 방법에서, 특정 유형의 anti-Rep 항체 또는 2종 이상의 여러가지 유형의 anti-Rep 항체들로 된 풀 (pool)을 이용할 수 있다. 여러가지 유형의 anti-Rep 항체 풀을 이용한다면, anti-Rep 항체 풀은 Rep 단백질, 특히, MSBI1 Rep 단백질 (서열번호 1)의 서로 다른 도메인, 예를 들어, 제1 DNA 결합 도메인 (예, 서열번호 1의 aa 1-136), 제2 DNA 결합 도메인 (예, 서열번호 2의 aa 137-229) 및/또는 가변성 도메인 (예, 서열번호 1의 aa 230-324) 내 서로 다른 에피토프에 결합하는 여러가지 anti-Rep 항체를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 환자 및/또는 건강한 개체에서 Rep 단백질에 대한 프로브를 스크리닝하기 위해 anti-Rep 항체를 사용한다. 환자, 예를 들어, 신경퇴행성 질환 환자의 조직에서 선택적인 Rep 단백질 검출은, 샘플에서 검출된 Rep 단백질의 단리된 DNA 게놈과 샘플이 유래된 환자의 질병 간의 인과관계를 시사해준다.
예를 들어, 웨스턴 블롯과 같은 anti-Rep 항체 방법에 의해 Rep 단백질을 검출하는 경우, 면역형광 현미경 검경 또는 면역조직화학적 방법을 적용할 수 있다.
특정 구현예에서, 특정 세포 위치에서 Rep 단백질을 검출할 수 있는 anti-Rep 항체를 이용한다. 예를 들어, anti-Rep 항체는 세포질, 핵막 및 핵에서 Rep 단백질을 검출할 수 있거나, 또는 세포질에서 스페클 (speckle)을 검출할 수 있다. 이러한 anti-Rep 항체 그룹의 예를 표 1에 나타낸다.
항체 그룹 Rep 단백질 위치 특이성 항체 DSMZ 기탁
그룹 A 세포질 + 핵막 (+핵) MSBI1 + small-sphinx-유사 AB01 523-1-1
 DSM ACC3327
그룹 B 세포질 내 스페클 MSBI1 + small-sphinx-유사 AB02 304-4-1
 DSM ACC3328
그룹 C 세포질 + 핵막 (+ 핵) MSBI1 특이성 MSBI1 381-6-2 DSM ACC3329
그룹 D 세포질 내 스페클 MSBI1 특이성 D1: MSBI1 961-2-2D2: MSBI1 761-5-1 DSM ACC3330
그룹 A의 anti-Rep 항체는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열 내 에피토프 (서열번호 1의 aa 198-217)를 가지며, MSBI1 Rep 및 Small Sphinx Genome 군의 보존된 에피토프를 포함하는 Rep 단백질 (예, MSBI2, CMI1, CMI4)을 검출할 수 있다. 면역형광 분석에서, 이러한 anti-Rep 항체는, 주로 세포질과 핵막에 균일하게 분포하고; 추가적으로 약하지만 균일하게 핵내에 위치하는, 특이적인 Rep 위치화 패턴 (localisation pattern)을 검출한다. 이러한 그룹 A 항체의 일예는 그룹 A 항체로서 실시예에 사용된 항체 AB01 523-1-1 (DSM ACC3327)이다.
그룹 B의 anti-Rep 항체는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 내 에피토프 (서열번호 1의 aa 33-50)를 가지며, MSBI1 Rep 및 Small Sphinx Genome 그룹의 보존된 에피토프를 포함하는 Rep 단백질 (예, MSBI2, CMI1, CMI4)을 검출할 수 있다. 면역형광 분석에서, 이러한 anti-Rep 항체는 (종종 핵막 주변) Rep 단백질의 스페클 (세포질내 응집)을 특이적으로 검출한다. 이러한 그룹 B 항체의 일예는 그룹 B 항체로서 실시예에 사용된 항체 AB02 304-4-1 (DSM ACC3328)이다.
그룹 C의 anti-Rep 항체는 MSBI1 (서열번호 1)의 구조 에피토프를 특이적으로 검출한다. 면역형광 분석에서, 이러한 anti-Rep 항체는 특이적인 Rep 위치화 패턴을 검출하며, 이는 주로 세포질 및 핵막에 균일하게 분포하며, 추가적으로 약하지만 균일하게 핵내에 위치한다. 이러한 그룹 C 항체의 일예는 그룹 C 항체로서 실시예에 사용된 항체 MSBI1 381-6-2 (DSM ACC3329)이다.
그룹 D의 anti-Rep 항체는 MSBI1 (서열번호 1)의 구조 에피토프를 특이적으로 검출하며, "D1"으로 지칭되는 항체 MSBI1 961-2-2는 서열번호 9에 나타낸 에피토프 (aa 281-287)를 MSBI1의 C-말단 도메인에서 검출한다. "D2"로 지칭되는 항체 MSBI1 761-5-1 (DSM ACC3328)은 생체내 조건에서만 접근가능한 MSBI1의 3D 구조 에피토프를 검출하며, 웨스턴 블롯에서는 이용할 수 없다. 면역형광 분석에서, 이러한 anti-Rep 항체는 (종종 핵막 주변에서) Rep 단백질의 스페클 (세포질 응집체)을 특이적으로 검출한다.
특정 구현예에서, 그룹 A, B, C 또는 D의 anti-Rep 항체; 또는 그룹 A, B, C 또는 D의 2종 이상의 anti-Rep 항체 조합을 사용해, 프로브에서 Rep 단백질 위치화 타입과 이러한 Rep 단백질 위치화가 병원체 기능과 상호관련되어 있는 지를, 결정한다. 예를 들어, 스페클이 존재한다면. 특정 구현예에서, 즉, 본 발명의 방법 또는 키트에서, 그룹 A 및 B로부터 선택되는 하나 이상의 anti-Rep 항체를 그룹 C 및 D로부터 선택되는 하나 이상의 anti-Rep 항체와 조합한다. 특정 구현예에서, 즉, 본 발명의 방법 또는 키트에서, 그룹 A의 anti-Rep 항체를 그룹 B, C 및 D로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 anti-Rep 항체와 조합한다. 예를 들어, 그룹 A의 anti-Rep 항체를 그룹 C 및 D의 다른 anti-Rep 항체와 조합할 수 있다. 이러한 서로 다른 그룹의 anti-Rep 항체들의 조합은, 특히 MS 진단에서, 진단 평가의 식별성 (distinctness)을 높인다. 이들 그룹 A, B, C 또는 D 항체는 MS 진단에 사용하기 바람직하다.
아래 항체들은 2017년 9월 28일자로 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁되었다:
항체 AB01 523-1-1, 기탁번호 DSM ACC3327;
항체 AB02 304-4-1, 기탁번호 DSM ACC3328;
항체 MSBI1 381-6-2, 기탁번호 DSM ACC3329; 및
항체 MSBI1 761-5-1, 기탁번호 DSM ACC3330.
항체 MSBI1 961-2-2는 2017년 10월 6일자로 DSMZ에 기탁되었다.
추가적인 구현예들에서, MS 진단에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는 anti-Rep 항체 및/또는 Rep 단백질을 검출하기 위한 물질을, MS 진단 분석에서 상기 물질의 사용 설명서와 함께 포함할 수 있다. 키트는 다음과 같은 구성 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 본 발명에 따른 바이오마커, 즉 Rep 단백질 및 anti-Rep 항체, 예를 들어, 표 1의 항체 각각; 신호 발생 화합물, 포획 물질을 부착하기 위한 고체 매트릭스, 샘플 희석제, 세척 완충제. 신호 발생 화합물은 본 발명의 바이오마커와 직접 커플링되거나 또는 본 발명의 바이오마커에 결합할 수 있는 부가적인 결합 물질과 커플링되는 검출가능한 표지 물질을 의미한다.
본 발명은 후술한 실시예를 비-제한적인 예로 들어 추가로 예시된다:
실시예 1:
MSBI1 Rep 단백질 정제
MSBI1 게놈에서 동정된 전장 Rep 오픈 리딩 프래임 (ORF)을 코딩하는 핵산 분자를, E. coli 고 수율 무-세포성 시험관내 번역 시스템(ExpresswayTM Cell-Free E. coli Expression System, Invitrogen)에 기반하여 단백질을 발현할 수 있는 발현 플라스미드 (pEXP5-CT, Invitrogen)에 클로닝한다. 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 5 mM 이미다졸이 함유된 8M 우레아 샘플 완충제를 20 부피배로 첨가하여, 시험관내 번역 반응에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 합성된 Rep 단백질을 변성시킨다. 그런 후, 변성 조건 (세척시 20 mM 이미다졸, 단백질 용출시 300 mM 이미다졸) 하에 Rep 단백질에 융합된 C-말단 His6-tag를 이용해, Rep 단백질을 정제한다. 정제 순도를 코마시 단백질 염색 및 anti-Rep 단백질 항체를 이용한 웨스터 블롯팅으로 확인한다. Rep 단백질 순도를 밀도 측정을 이용해 계산하였으며, 95% 보다 높았다. 정제된 단백질은 ELISA를 이용한 혈청 스크리닝에 바로 사용하거나, 또는 SDS-PAGE를 실시한 다음 니트로셀룰로스 막 상에 블롯팅을 이동시키고, 1D-크기-분리된 Rep 단백질 막 스트립과 혈청을 인큐베이션한다.
실시예 2:
혈청 마스터 플레이트 제조
혈청 샘플을 먼저 샘플 냉동-해동 사이클을 줄이기 위해 분액한다. 그런 후, U자형의 96웰 플레이트에서 소듐 아지드 최종 농도 0.02% (w/v)로 안정화한 PBS pH 7.2 중에 1:1로 혈청 희석물을 만들어, 마스터 플레이트를 구축한다. 이 플레이트는 4℃에 보관하며, 무균 조건 하에 사용할 경우 적어도 2달간 안정적이며, 이를 개별 스크리닝 실험을 수행하기 전 추가적으로 혈청을 희석 (최종 희석 1:20)하기 위한 주형으로 사용한다.
실시예 3:
1D-크기 분리된 Rep 단백질 막 스트립과 혈청의 인큐베이션에 의한 혈청 스크리닝
1D-크기 분리된 Rep 단백질 막 스트립과 혈청의 인큐베이션에 기반한 스크리닝 분석을 위해, 정제된 Rep 단백질 20 ㎍을 Sigma Tru-PAGE 4-20% 프리케스트 겔에 로딩한다. 겔 포켓을 분리시키는 월 (wall)을 겔 로딩하기 전에 제거하여 큰 포켓 하나와 크기 마커용 포켓 하나를 만든다. 1D-크기 분리형 SDS-PAGE를 수행한 후, 단백질을 표준 습식/탱크 이동 블롯 프로토콜을 이용해 니트로셀룰로스 막 상으로 이동-블롯팅한다. 그 후, 블롯 막 상의 단백질 (약 40 kDa 전개 길이 위치에서 기본적으로 전장 Rep 단백질 밴드 하나)을 PonceauS로 가시화하여, 이동 품질을 체크하고, 1D 크기 분리된 막 전장 길이 x 2 mm 폭으로 막 스트립을 잘라 준비한다. 그런 후, 스트립에 무혈청성 차단 시약 (Genetex Trident 유니버셜 차단 시약) 각 500 ㎕를 1시간 처리하여 차단 처리한다. 그 후, 혈청 희석물 2종을 이용해 혈청의 특징을 확인한다. 혈청 인큐베이션은 선형 교반 장치에서 4℃ 하 14시간 (밤새) 동안 수행한다. 그런 다음, 막 스트립을 실온에서 PBS-T pH7.2 0.1% Tween-20으로 3x5분 세척한다. HRP-커플링된 염소 anti-인간 IgG (H+L) 이차 항체와 실온에서 1시간 인큐베이션하여, 혈청 내 Rep-특이적으로 결합된 인간 IgG를 검출한다. 이를 실온에서 PBS-T pH 7.2 0.1% Tween-20으로 3x5분 세척한 다음, 각각의 개별 혈청 인큐베이션을 수행한 스트립들을 플라스틱 호일 위에 테이프로 고정한다. 그런 후, 이 호일을 ECL 기질 (Biorad Clarity)과 인큐베이션하여, BioRad 웨스턴 블롯 검출 시스템으로 결합된 인간 IgG를 가시화한다. 단백질 멤브레인 상의 Rap 밴드에 특이적으로 결합된 IgG의 양에 대응되는 신호를 밀도측정에 의해 정량한다.
1D-크기 분리된 Rep 단백질 막 스트립 결과의 예를 도 1에 나타내며, 혈청양성 혈청/혈장 샘플의 정량 결과를 표 2에 나타낸다: 2가지 희석 수준 (1:500 및 1:2000)에서 거의 50%의 혈청 샘플들에서 매우 강한 신호가 관찰되었으며, 21개 중 단 3개만 완전히 음성이었다. 혈장 대조군의 경우, 샘플 7개는 1:500 희석 수준에서 중간 수준의 신호를 나타내었으며 (추가적인 일부 하나의 샘플은 매우 약한 신호를 나타냄), 1:2000 희석 수준에서는 샘플 단 3개만 매우 약한 신호를 나타내었고, 그외 샘플들 모두 혈청음성이었다. 모든 정량 결과들은, MS-혈청 세기가 대조군 혈장 세기와 비교해 적어도 30배 이상의 신호를 나타내는 경향을 유지하였다.
혈청 희석 혈청 양성 샘플의 수
1:2000 17 3
1:500 21 8
MS 혈청 대조군 혈장
표 2: 혈청양성 혈청/혈장 샘플들의 정량 결과.
MS 혈청 풀과 건강한 대조군 혈장 풀 (각각 총 21건)에 대한 혈청/혈장 희석 수준 1:500 및 1:2000에서의 신호 세기에 따라, Rep-특이적인 인간 IgG 검출된 혈청/혈장을 카운팅하였다. 이들 2가지 희석 조건 (1:500 및 1:2000)에서 거의 50%의 혈청 샘플들이 매우 강한 신호를 나타내었으며, 21건 중 단 3건만 완전히 음성이었다. 혈장 대조군의 경우 샘플 7건이 1:500 희석 수준에서 중간 정도의 신호를 나타내었고 (매우 신호가 약한 일부 추가적인 샘플), 1:2000 희석 수준에서는 샘플 단 3건만 매우 약한 신호를 나타내었으며, 그외 샘플들은 모두 혈청 음성이었다. 모든 정량 결과는, MS-혈청 세기가 대조군 혈장 세기와 비교해 적어도 30배 이상의 강한 신호를 나타내는 경향을 유지하였다.
실시예 4:
ELISA에 의한 혈청 스크리닝
Maxisorp 96웰 ELISA 플레이트 (Fisher Scientific)에 투입한 8 M 우레아 pH 8.0 및 PBS pH 7.2 1:1 혼합물에, 정제된 Rep 단백질 (일반적으로 웰 당 50-200 ng)을 적량 첨가한다. 단백질을 선형 교반 장치 상에서 4℃에서 14시간 동안 플레이트 매트릭스에 결합시킨다. 그런 후, 플레이트를 실온에서 PBS-T pH 7.2 0.1% Tween-20으로 3x5분간 세척한 다음, 소듐 아지드를 최종 농도 0.02%로 포함하는 PBS pH 7.2 1%(w/v) BSA를 첨가하여 4℃에서 14시간 이상 동안 차단 처리한다. 그 후, 혈청을 1:500 희석 수준으로 첨가하여, 실온에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, 플레이트를 실온에서 PBS-T pH 7.2 0.1% Tween-20로 3x5분간 세척한다. HRP-커플링된 염소 anti-인간 IgG (H+L) 이차 항체와 실온에서 1시간 인큐베이션하여, 혈청 내 Rep-특이적으로 결합된 인간 IgG를 검출한다. 이를 실온에서 PBS-T pH7.2 0.1% Tween-20으로 3x5분간 세척한 다음, TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, HRP-민감성) 기질 용액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 실온에서 5분 인큐베이션한다. 여기에 8M 아세트산/1M 황산 100 ㎕를 첨가하여, 반응을 정지시킨다. 신호의 세기를 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 Perkin Elmer ELISA 호환 장치에서 정량한다.
ELISA 스크리닝에 기반한 Rep-특이적인 혈청-반응의 예시적인 정량 결과를 도 2에 나타낸다: 정량 결과, Rep 단백질 (항원)의 양과 신호 세기 간에 양호한 상관관계가 존재하는 것으로 확인된다. 평균적으로, MS 풀의 신호 세기 수준은 대조군의 세기 보다 적어도 1.9배 이상 강하다. 일반적으로, ELISA를 이용한 혈청 스크리닝 결과, 적어도 혈청 희석 수준 1:1000에서 검출가능한 혈청 항체가 관찰되었으며 (데이타 도시 안 함), 그래서 본 실험의 역가는 1:2000-1:4000 범위에서 1:1000 보다 높을 것이며, 심지어 플랫폼 최적화 후에는 더 높을 것임에 틀림없다.
실시예 5:
면역형광 분석
HEK293TT 세포 (125,000/웰)를 면역형광 8웰 챔버 내 DMEM 10% FCS (1x Glutamax (Gibco) 및 1x 비-필수 아미노산 (Gibco) 첨가)에 접종하여 24시간 배양한 다음 자동-형광 마커 단백질 ZsGreen을 발현하는 대조군 플라스미드 ZsGreen1CI (Clontech) 또는 ZsGreen-Rep 융합 단백질을 코딩하는 3-prime 말단에 전장 MSBI1 Rep ORF를 가진 동일한 플라스미드 중 하나를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 이용해 DNA 형질감염시켰다. DNA 형질감염 후 48시간 경과 시점에, 세포를 PBS로 헹구고, RT에서 PBS 4% PFA로 20분간 고정한 다음, 교반 장치에서 RT 하 10분간 PBS 0.5% Triton X-100을 처리하여 투과화하였다. 그런 후, 세포를 PBS로 헹구고, RT에서 45분간 PBS 1% BSA로 차단 처리하였다. 마우스 단일클론 anti-Rep 항체 (비교, 표 1)와의 인큐베이션을 PBS 1% BSA 중에서 1시간 동안 37℃에서 수행하였으며, 항체를 1:500으로 희석하였다 (일차 항체를 사용하지 않은 대조군이 포함됨). 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 PBS 1% BSA와 RT에서 15분 인큐베이션하였다. 그런 다음, 이차 항체 (AlexaFluor546 염소 anti-마우스, 1:500; DNA marker Hoechst 33342, 1:5.000)와 함께 PBS 1% BSA 중에서 RT에서 45분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 1% BSA로 3회, 그리고 PBS로 3회 헹군 다음 커버 슬립 (Dako 마운팅 매질)을 적층하였다. Zeiss Cell Observer (20x 대물렌즈, 샘플 및 대조군 더블릿에 대해 노출 시간 고정)로 면역형광 사진을 촬영하였다.
면역형광 사진 (도 4)에서, 그룹 A 및 C 항체를 이용한 항체 처리시 세포질 + 핵막 (+핵)-위치된 타겟 단백질이 특이적으로 검출되지만, 응집체는 검출되지 않는 것으로 보인다. 반면, 그룹 D 및 B의 항체는 스페클을 형성한 단백질과 특이적인 공동-위치화를 나타내며, 세포질 신호 수준은 약하거나 검출되지 않는다. ZsGreen 융합 단백질 단독을 항체와 대조군 인큐베이션한 경우, 유의한 신호는 검출되지 않았다 (항체 신호의 가시화에 사용된 노출 시간과 동일한 노출 시간).
실시예 6:
면역형광 분석
HEK293TT 세포 (125,000/웰)를 면역형광 8웰 챔버 내 DMEM 10% FCS (1x Glutamax (Gibco) 및 1x 비-필수 아미노산 (Gibco) 첨가)에 접종하여 24시간 배양한 다음 자동-형광 마커 단백질 ZsGreen을 발현하는 대조군 플라스미드 ZsGreen1CI (Clontech) 또는 ZsGreen-Rep 융합 단백질을 코딩하는 3-prime 말단에 전장 CMI1 Rep ORF를 가진 동일한 플라스미드 중 하나를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 이용해 DNA 형질감염시켰다. DNA 형질감염 후 48시간 경과 시점에, 세포를 PBS로 헹구고, RT에서 PBS 4% PFA로 20분간 고정한 다음, 교반 장치 상에서 RT에서 10분간 PBS 0.5% Triton X-100을 처리하여 투과화하였다. 그런 후, 세포를 PBS로 헹구고, RT에서 45분간 PBS 1% BSA로 차단 처리하였다. 마우스 단일클론 anti-Rep 항체 (표 1)와의 인큐베이션을 PBS 1% BSA 중에서 1시간 동안 37℃에서 수행하였으며, 항체를 1:500으로 희석하였다 (일차 항체를 사용하지 않은 대조군이 포함됨). 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 PBS 1% BSA와 RT에서 15분 인큐베이션하였다. 그런 다음, 이차 항체 (AlexaFluor546 염소 anti-마우스, 1:500; DNA marker Hoechst 33342, 1:5.000)와 PBS 1% BSA 중에서 RT에서 45분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 1% BSA로 3회, 그리고 PBS로 3회 헹군 다음 커버 슬립 (Dako 마운팅 매질)을 적층하였다. Zeiss Cell Observer (20x 대물렌즈, 샘플 및 대조군 더블릿에 대해 노출 시간 고정)로 면역형광 사진을 촬영하였다.
면역형광 사진 (도 5)에서, 그룹 A 항체는 응집체는 검출하지 않고 세포질 + 핵막 (+핵)-위치된 타겟 단백질을 특이적으로 검출하는 것으로 확인된 반면, 그룹 B 항체는 세포질에 위치된 타겟 단백질의 최소 백그라운드로 스페클 형태의 타겟 단백질을 검출하는 것으로 확인된다. 그룹 C 및 D의 MSBI1-특이 항체는 신호를 특이적으로 검출하지 않는다. 항체 D1 및 D2 둘다 "D" 그룹에 속하지만, 에티토프 인지에 약간의 차이가 가진다.
실시예 7:
면역형광 분석
HEK293TT 세포 (125,000/웰)를 면역형광 8웰 챔버 내 DMEM 10% FCS (1x Glutamax (Gibco) 및 1x 비-필수 아미노산 (Gibco) 첨가) 중에 접종하여 24시간 배양한 다음 플라스미드 pcDNA3.1(-) (Invitrogen) 또는 전장 MSBI1 Rep ORF (서열번호 13)의 코돈-최적화된 변이체를 발현하는 동일한 플라스미드 중 하나를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 이용해 DNA 형질감염시켰다. DNA 형질감염 후 48시간 경과 시점에, 세포를 PBS로 헹구고, RT에서 PBS 4% PFA로 20분간 고정한 다음, 교반 장치 상에서 RT에서 10분간 PBS 0.5% Triton X-100을 처리하여 투과화하였다. 그런 후, 세포를 PBS로 헹구고, RT에서 45분간 PBS 1% BSA로 차단 처리하였다. 마우스 단일클론 anti-Rep 항체 (표 1)와의 인큐베이션을 PBS 1% BSA 중에서 1시간 동안 37℃에서 수행하였으며, 항체를 1:500으로 희석하였다 (일차 항체를 사용하지 않은 대조군이 포함됨). 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 PBS 1% BSA와 RT에서 15분 인큐베이션하였다. 그런 다음, 이차 항체 (AlexaFluor546 염소 anti-마우스, 1:500; DNA marker Hoechst 33342, 1:5.000)와 PBS 1% BSA 중에서 RT에서 45분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 1% BSA로 3회, PBS로 3회 헹군 다음 커버 슬립 (Dako 마운팅 매질)을 적층하였다. Zeiss Cell Observer (20x 대물렌즈, 샘플 및 대조군 더블릿에 대해 노출 시간 고정)로 면역형광 사진을 촬영하였다.
면역형광 사진 (도 6)에서, 그룹 A 및 C 항체를 이용한 항체 처리시, 세포질 + 핵막 (+핵)-위치된 타겟 단백질이 특이적으로 검출되었지만, 응집물은 검출되지 않은 것으로 보인다. 반면, 그룹 D 및 B의 항체는 스페클을 형성한 단백질과 특이적인 공동-위치화를 나타내며, 세포질 신호 수준은 약하거나 검출되지 않았다. ZsGreen 융합 단백질 단독을 항체와 대조군 인큐베이션한 경우, 유의한 신호는 검출되지 않았다 (항체 신호의 가시화에 사용된 노출 시간과 동일한 노출 시간).
실시예 8:
웨스턴 블롯 분석
HEK293TT (1.5 Mio/6웰)를 6웰 세포 배양 플레이트에서 DMEM 10% FCS (1x Glutamax (Gibco) 및 1x 비-필수 아미노산 (Gibco) 첨가) 중에 접종하여 24시간 배양한 다음 N-말단 ZsGreen 테그와의 융합 단백질로서 전장 MSBI1, CMI1 또는 MSBI2 Rep 단백질의 과다발현을 코딩하는 ZsGreen1CI 플라스미드를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 이용해 DNA 형질감염시켰다. DNA 형질감염 후 48시간 경과 시점에, 세포를 PBS로 헹구고, 트립신 처리하여 탈착 후 다시 PBS로 헹구고, SDS-PAGE Lammli 완충제 중에서 세포 용해처리하였다 (98℃에서 5분간 끓임). 샘플을 큰 포켓이 1개 존재하는 프리케스트 12.5% SDS-PAGE에 로딩하였다. 트랜스블롯 후, 멤브레인을 각각 2개의 스트립으로 절단하여, PBS 5% 탈지유로 차단 처리한 다음, 표 1의 여러가지 마우스 단일클론 항체 (PBS 5% 탈지유 중에 1:1000로 희석)와 각각 인큐베이하였다. 스트립을 PBS 0.1% Tween20으로 3회 헹군 다음 HRP-커플링된 anti-마우스 이차 항체와 인큐베이션하여, Biorad ChemiDoc 장치에서 여러가지 ZsGreen-Rep 융합 단백질을 항체로 검출하는 웨스턴블롯 분석을 실시하였다. 양성 대조군 검출은 ZsGreen 항체 (OriGene, 1:2000)와의 인큐베이션을 토대로 수행하였다.
도 7은, 그룹 A 및 B의 항체가, MSBI1 Rep 융합 단백질 뿐만 아니라 CMI1 및 MSBI2 Rep 융합 단백질을 비롯하여, Rep 융합 단백질 3종 모두를 특이적으로 검출하는 반면, 그룹 C 및 D의 MSBI1-특이 항체는 MSBI1 Rep 융합 단백질만 검출함을 보여준다. 항체 D2는, SDS-PAGE의 변성 조건에서는 일반적이지 않은 3D 구조 에피토프를 검출하기 때문에 WB-음성일 가능성이 높으므로, 본 실험에서 테스트하지 않았다.
서열 요약
서열번호 서열
1 MSBI1.176에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAIIEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRMYELLICWRSTGKTPIIELDEFRKRIGVLDTEYTRTDNLKMRVIELALKQINEHTDITASYEQHKKGRVITGFSFKFKHKKQNSDKTPKNSDSSPRIVKHSQIPTNIVKQPENAKMSDLEHRASRVTGEIMRNRLSDRFKQGDESAIDMMKRIQSEIITDAIADQWESKLEEFGVVF
2 Rep 펩타이드 단편의 아미노산 서열
EARETGKGINANDPLTVH
3 Rep 펩타이드 단편의 아미노산 서열
KQINEHTDITASYEOHKKGRT
4 His-Tag (2개의 중성 스투퍼 아미노산 포함)
GAHHHHHH
5 T7-Tag
MASMTGGQQMG
6 FLAG-Tag
DYKDDDDK
7 Strep-II-Tag
WSHPQFEK
8 MSBI2.176에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSKLVVKDNALMNASYNLDLVEQRLILLAIIEARESGKGINANDPLTVHA
ESYINQFGVHRVTAYQALKDACDNLFARQFSYQSKSEKGNIQNHRSRWVS
EIIYIDTEATVKIIFAPAIVPLITRLEEQFTKYDIEQISDLSSAYAIRLY
ELLICWRSTGKTPIIGLGEFRNRVGVLDSEYHRIAHLKERVIEHSIKQIN
EHTDITATYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKPKQAEIATETPKTATNDPDTT
KPLTEPQIAKYSMILCKLGSISDLSNFPDYPAFANWIGNILRNPEKADEQ
IAKRIFTALKTETDYSKKN
9 MSBI.1 특이적인 에피토프
NRLSDRF
10 CMI1.252에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAILEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISELSSAYAVRLYELLICWRSTGKTPIIDLTEFRKRLGVLDTEYTRTDNLKMRVIELGLKQINEHTDITASYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKKTGAEMPKNSDSSPHIEKPSQIPANIAKQPENAKKDDLGHRASKITGLIMSNGLADRFKRGDESVIDMMKRIKEEITTDTTADQWENKLEEFGVIFQS
11 CMI2.214에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSDLIVKDNALMNASYNLDLVEQRLILLAILEARETGKGINANDPLTVHAESYINQFGVARQTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRANITSRWVSQIAYIDETATVEVIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRLYELLICWRSTGKTPVIELAEFRKRLGVLNDEYTRSDNFKKWIIENPIKQINEHTDITASYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKKTEPETPKNSDSSQRIEKPSQIPANIVKQPENANLSDLQHRASKITGLIMSNRLSDRFKQGDESIMQMMARIQSEITTDSIADQWQSKLEEFGVVF
12 CMI3.168에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAILEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRANITSRWVSQIAYIDETATVEVIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRLYELLICWRTTGKTPVLDLTEFRKRLGVLDTEYTRTDNLKMRVIEQSLKQINKHTDITASYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKKTEPETPKNNDSGVSKPKTVEIPAEVVKQPKNTNLSDLEKRVRMITGAIAKNNLASRFQHGNESPLDMMKRIQSEITSDETADLWQNKLESMGVVF
13 MSBI1 Rep 코돈-최적화된 DNA 서열
ATGAGCGACCTGATCGTGAAAGACAATGCCCTGATGAACGCCTCCTACAACCTGGCACTGGTCGAACAGAGACTGATTCTGCTGGCTATCATCGAGGCAAGGGAGACCGGCAAGGGCATCAACGCCAATGACCCCCTGACAGTGCACGCCAGCTCCTACATCAACCAGTTTAATGTGGAGCGCCACACCGCCTATCAGGCCCTGAAGGACGCCTGCAAGGATCTGTTTGCCCGGCAGTTCAGCTACCAGGAGAAGCGGGAGAGAGGCAGGATCAACATCACAAGCAGATGGGTGTCCCAGATCGGCTATATGGACGATACCGCCACAGTGGAGATCATCTTTGCACCAGCAGTGGTGCCTCTGATCACCAGGCTGGAGGAGCAGTTCACACAGTACGACATCGAGCAGATCTCCGGACTGTCTAGCGCCTACGCCGTGCGCATGTATGAGCTGCTGATCTGTTGGCGGTCTACCGGCAAGACACCTATCATCGAGCTGGATGAGTTCCGCAAGCGGATCGGCGTGCTGGACACCGAGTACACCAGAACAGATAACCTGAAGATGAGAGTGATCGAGCTGGCCCTGAAGCAGATCAATGAGCACACCGATATCACAGCCTCTTATGAGCAGCACAAGAAGGGCCGCGTGATCACCGGCTTCAGCTTTAAGTTCAAGCACAAGAAGCAGAACTCTGACAAGACACCAAAGAATAGCGATTCCTCTCCCCGGATCGTGAAGCACAGCCAGATCCCTACCAACATCGTGAAGCAGCCAGAGAATGCCAAGATGTCCGACCTGGAGCACAGGGCATCTAGGGTGACAGGCGAGATCATGAGAAATAGGCTGAGCGATCGGTTCAAGCAGGGCGACGAGTCCGCCATCGATATGATGAAGAGAATCCAGTCCGAGATCATCACCGACGCCATCGCCGATCAGTGGGAATCTAAACTGGAAGAGTTTGGAGTCGTGTTTGGAGCACATCACCATCATCATCACTGA
14 MSBI1 Rep 코돈-최적화된 단백질 서열 MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAIIEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRMYELLICWRSTGKTPIIELDEFRKRIGVLDTEYTRTDNLKMRVIELALKQINEHTDITASYEQHKKGRVITGFSFKFKHKKQNSDKTPKNSDSSPRIVKHSQIPTNIVKQPENAKMSDLEHRASRVTGEIMRNRLSDRFKQGDESAIDMMKRIQSEIITDAIADQWESKLEEFGVVFGA
15 MSBI1 Rep 야생형 DNA 서열
ATGAGCGATTTAATAGTAAAAGATAACGCCCTAATGAATGCTAGTTATAACTTAGCTTTGGTTGAACAGAGGTTAATTCTATTAGCAATCATAGAAGCGAGAGAAACAGGCAAAGGGATTAATGCCAATGATCCTTTAACAGTTCATGCAAGTAGCTATATCAATCAATTTAACGTAGAAAGGCATACGGCATATCAAGCCCTCAAAGATGCTTGTAAAGACTTGTTTGCCCGTCAATTCAGTTACCAAGAAAAGCGAGAACGAGGACGAATTAATATTACAAGTCGATGGGTTTCGCAAATTGGCTATATGGACGATACAGCAACCGTTGAGATTATTTTTGCCCCTGCGGTTGTTCCTCTGATTACACGGCTAGAGGAACAGTTCACCCAGTACGATATTGAGCAAATTAGCGGTTTATCGAGTGCATATGCTGTTCGTATGTACGAACTGCTGATTTGTTGGCGTAGCACAGGCAAAACACCAATTATTGAGCTAGACGAGTTTAGAAAGCGAATAGGTGTTTTAGATACTGAATACACTAGAACAGATAATTTAAAGATGCGAGTTATTGAATTAGCCCTAAAACAAATCAACGAACATACAGACATCACAGCAAGCTATGAACAACACAAAAAAGGGCGAGTGATTACAGGATTCTCATTCAAGTTTAAGCACAAGAAACAAAACAGCGATAAAACGCCAAAAAATAGCGATTCTAGCCCACGTATCGTAAAACATAGTCAAATCCCTCCAACATTGTAAAACAGCCTGAAAACGCCAAAATGAGCGATTTAGAACATAGAGCGAGCCGTGTTACAGGGGAAATAATGCGAAATCGTCTGTCAGATCGGTTTAAACAAGGCGATGAATCAGCAATCGACATGATGAAACGTATTCAAAGTGAAATAATAACCGATGCAATAGCAGACCAGTGGGAAAGCAAACTGGAGGAGTTTGGCGTGGTTTTTTAG
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3327 20170928 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3328 20170928 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3329 20170928 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3330 20170928 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3331 20171006
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum <120> Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays <130> K 3610PCT <150> EP16193119.1 <151> 2016-10-10 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MSBI1 Rep protein <400> 1 Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg 85 90 95 Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile 100 105 110 Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln 115 120 125 Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Ala Val Arg Met Tyr Glu Leu 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Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe 210 215 220 Lys Gln Lys Lys Lys Thr Glu Pro Glu Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser 225 230 235 240 Ser Gln Arg Ile Glu Lys Pro Ser Gln Ile Pro Ala Asn Ile Val Lys 245 250 255 Gln Pro Glu Asn Ala Asn Leu Ser Asp Leu Gln His Arg Ala Ser Lys 260 265 270 Ile Thr Gly Leu Ile Met Ser Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln 275 280 285 Gly Asp Glu Ser Ile Met Gln Met Met Ala Arg Ile Gln Ser Glu Ile 290 295 300 Thr Thr Asp Ser Ile Ala Asp Gln Trp Gln Ser Lys Leu Glu Glu Phe 305 310 315 320 Gly Val Val Phe <210> 12 <211> 324 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CMI3.168 <400> 12 Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Leu Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ala Asn Ile Thr Ser Arg 85 90 95 Trp Val Ser Gln Ile Ala Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Thr Val Glu Val 100 105 110 Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln 115 120 125 Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Ala Val Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Thr Thr Gly Lys 145 150 155 160 Thr Pro Val Leu Asp Leu Thr Glu Phe Arg Lys Arg Leu Gly Val Leu 165 170 175 Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu 180 185 190 Gln Ser Leu Lys Gln Ile Asn Lys His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe 210 215 220 Lys Gln Lys Lys Lys Thr Glu Pro Glu Thr Pro Lys Asn Asn Asp Ser 225 230 235 240 Gly Val Ser Lys Pro Lys Thr Val Glu Ile Pro Ala Glu Val Val Lys 245 250 255 Gln Pro Lys Asn Thr Asn Leu Ser Asp Leu Glu Lys Arg Val Arg Met 260 265 270 Ile Thr Gly Ala Ile Ala Lys Asn Asn Leu Ala Ser Arg Phe Gln His 275 280 285 Gly Asn Glu Ser Pro Leu Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile 290 295 300 Thr Ser Asp Glu Thr Ala Asp Leu Trp Gln Asn Lys Leu Glu Ser Met 305 310 315 320 Gly Val Val Phe <210> 13 <211> 999 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> codon-optimized MSBI1 <400> 13 atgagcgacc tgatcgtgaa agacaatgcc ctgatgaacg cctcctacaa cctggcactg 60 gtcgaacaga gactgattct gctggctatc atcgaggcaa gggagaccgg caagggcatc 120 aacgccaatg accccctgac agtgcacgcc agctcctaca tcaaccagtt taatgtggag 180 cgccacaccg cctatcaggc cctgaaggac gcctgcaagg atctgtttgc ccggcagttc 240 agctaccagg agaagcggga gagaggcagg atcaacatca caagcagatg ggtgtcccag 300 atcggctata tggacgatac cgccacagtg gagatcatct ttgcaccagc agtggtgcct 360 ctgatcacca ggctggagga gcagttcaca cagtacgaca tcgagcagat ctccggactg 420 tctagcgcct acgccgtgcg catgtatgag ctgctgatct gttggcggtc taccggcaag 480 acacctatca tcgagctgga tgagttccgc aagcggatcg gcgtgctgga caccgagtac 540 accagaacag ataacctgaa gatgagagtg atcgagctgg ccctgaagca gatcaatgag 600 cacaccgata tcacagcctc ttatgagcag cacaagaagg gccgcgtgat caccggcttc 660 agctttaagt tcaagcacaa gaagcagaac tctgacaaga caccaaagaa tagcgattcc 720 tctccccgga tcgtgaagca cagccagatc cctaccaaca tcgtgaagca gccagagaat 780 gccaagatgt ccgacctgga gcacagggca tctagggtga caggcgagat catgagaaat 840 aggctgagcg atcggttcaa gcagggcgac gagtccgcca tcgatatgat gaagagaatc 900 cagtccgaga tcatcaccga cgccatcgcc gatcagtggg aatctaaact ggaagagttt 960 ggagtcgtgt ttggagcaca tcaccatcat catcactga 999 <210> 14 <211> 326 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MSBI1 protein <400> 14 Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg 85 90 95 Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile 100 105 110 Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln 115 120 125 Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Ala Val Arg Met Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly Lys 145 150 155 160 Thr Pro Ile Ile Glu Leu Asp Glu Phe Arg Lys Arg Ile Gly Val Leu 165 170 175 Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu 180 185 190 Leu Ala Leu Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe 210 215 220 Lys His Lys Lys Gln Asn Ser Asp Lys Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser 225 230 235 240 Ser Pro Arg Ile Val Lys His Ser Gln Ile Pro Thr Asn Ile Val Lys 245 250 255 Gln Pro Glu Asn Ala Lys Met Ser Asp Leu Glu His Arg Ala Ser Arg 260 265 270 Val Thr Gly Glu Ile Met Arg Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln 275 280 285 Gly Asp Glu Ser Ala Ile Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile 290 295 300 Ile Thr Asp Ala Ile Ala Asp Gln Trp Glu Ser Lys Leu Glu Glu Phe 305 310 315 320 Gly Val Val Phe Gly Ala 325 <210> 15 <211> 974 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MSBI1 wild type <400> 15 atgagcgatt taatagtaaa agataacgcc ctaatgaatg ctagttataa cttagctttg 60 gttgaacaga ggttaattct attagcaatc atagaagcga gagaaacagg caaagggatt 120 aatgccaatg atcctttaac agttcatgca agtagctata tcaatcaatt taacgtagaa 180 aggcatacgg catatcaagc cctcaaagat gcttgtaaag acttgtttgc ccgtcaattc 240 agttaccaag aaaagcgaga acgaggacga attaatatta caagtcgatg ggtttcgcaa 300 attggctata tggacgatac agcaaccgtt gagattattt ttgcccctgc ggttgttcct 360 ctgattacac ggctagagga acagttcacc cagtacgata ttgagcaaat tagcggttta 420 tcgagtgcat atgctgttcg tatgtacgaa ctgctgattt gttggcgtag cacaggcaaa 480 acaccaatta ttgagctaga cgagtttaga aagcgaatag gtgttttaga tactgaatac 540 actagaacag ataatttaaa gatgcgagtt attgaattag ccctaaaaca aatcaacgaa 600 catacagaca tcacagcaag ctatgaacaa cacaaaaaag ggcgagtgat tacaggattc 660 tcattcaagt 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Claims (17)

  1. 다발성 경화증 (MS) 진단용 DNA-복제-관련 (replication-associated, Rep) 단백질로서,
    (a) 대조군 샘플 대비 개체 샘플에서의 Rep 단백질 또는 이의 단편의 2배 이상의 양적 증가; 또는
    대조군 샘플 대비 개체 샘플에서의 anti-Rep 항체의 2배 이상의 양적 증가는, MS의 진단과 상관관계 (correlation)가 있으며; 및
    (b) Rep 단백질이
    (i) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는 서열번호 1의 단편; 또는
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있고, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열을 포함하는, Rep 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 단편이 서열번호 1의 아미노산 1번부터 229번까지로 구성되는 아미노산 서열 내에 에피토프를 포함하는, Rep 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대조군 샘플 대비 Rep 단백질 또는 이의 단편 또는 anti-Rep 항체의 5배 이상의 양적 증가는 MS임을 의미하는 것인, Rep 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단백질이 서열번호 13에 나타낸 핵산 (polynucleotide acid)으로 코딩되는, Rep 단백질.
  5. 항체 AB01 523-1-1 (DSM ACC3327), 항체 AB02 304-4-1 (DSM ACC3328), 항체 MSBI1 381-6-2 (DSM ACC3329), 항체 MSBI1 761-5-1 (DSM ACC3330) 및 항체 MSBI1 961-2-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 anti-Rep 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 진단 방법에서의 제5항에 따른 anti-Rep 항체의 용도.
  7. MS 진단 방법으로서,
    (a) 개체 유래 샘플을, 제1항의 (b)에서 정의되는 Rep 단백질과 인큐베이션하는 단계;
    (b) 상기 개체 유래 샘플에서 Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 검출하는 단계; 및
    (c) 대조군 샘플 대비 상기 개체 유래 샘플에서 Rep 단백질에 결합된 항체의 2배 이상의 양적 증가를 MS의 진단과 상호관련시키는 단계를 포함하는, MS 진단 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 (a)에서, 상기 Rep 단백질을 고정 (immobilization)시킨 후 고정된 Rep 단백질을 상기 개체 유래 샘플과 인큐베이션하는, MS 진단 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    단계 (a)에서, 상기 Rep 단백질을 세포에서 발현시킨 다음 상기 세포를 상기 개체 유래 샘플과 인큐베이션하는, MS 진단 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    단계 (b)에서, Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 신호 발생 화합물과 커플링된 검출 결합 물질에 의해 정량하는, MS 진단 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    단계 (a)에서, 상기 개체 유래 샘플 내 항체를 고정한 다음 정의된 양 (defined amount)의 Rep 단백질과 인큐베이션하는, MS 진단 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체 유래 샘플이 혈청 또는 혈장 샘플인, MS 진단 방법.
  13. 환자에서 MS 진단 방법으로서,
    (a) 개체 샘플 내 Rep 단백질의 양을 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하는 에피토프에 결합하는 anti-Rep 항체에 의해 검출하는 단계, 및
    (b) 대조군 샘플 대비 단계 (a)에서 상기 개체 샘플 내에서 검출된 Rep 단백질의 2배 이상의 양적 증가를 MS 진단과 상호관련시키는 단계를 포함하는, 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 Rep 단백질에 특이적인 항체가, 서열번호 1의 아미노산 1번부터 136번까지, 137번부터 229번까지 및 230번부터 324번까지로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합하는, 진단 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 개체 샘플이 혈청 샘플, 혈장 샘플 또는 조직 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는, 진단 방법.
  16. MS 진단 키트로서,
    (a) (i), (ii) 또는 (iii)을 포함하는, Rep 단백질:
    (i) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열;
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는 서열번호 1의 단편; 또는
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있고, (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가진, 아미노산 서열,
    (b) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 anti-Rep 항체에 결합할 수 있는, 검출가능한 표지 물질에 커플링된, anti-인간 항체, 및
    (c) 상기 (a)에 따른 Rep 단백질을 고정하거나, 또는 혈청 또는 혈장 샘플 내에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 것으로 의심되는 anti-Rep 항체를 고정하기에 적합한, 고체 매트릭스
    를 포함하는, 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성면역분석 (RIA), 효소 면역 분석 (EIA), 형광 면역분석 (FIA), 발광 면역분석 (LIA) 및 스트립 분석 (strip assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 분석에 사용하기 위한, 키트.
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