JP2019536006A - 診断アッセイに使用するためのタンパク質抗原としてのrepタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
(ii)配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができる配列番号1の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
(ii)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができる配列番号8の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
(ii)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができる配列番号10の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号10に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
(ii)配列番号11に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができる配列番号11の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号11に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
(ii)配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができる配列番号12の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
(a)対象からの試料をRepタンパク質とインキュベートする工程;
(b)Repタンパク質と免疫学的複合体を形成する対象からの試料中の抗体の量を検出する工程;及び
(c)対照試料中の量と比較して、Repタンパク質に結合した抗体の量を神経変性疾患の診断と相関させる工程を含む、対象における神経変性疾患を診断する方法を提供する。
(a)対象からの試料をRepタンパク質とインキュベートする工程;
(b)Repタンパク質と免疫学的複合体を形成する対象からの試料中の抗体の量を検出する工程;及び
(c)対照試料中の量と比較して、Repタンパク質に結合した抗体の量をMSの診断と相関させる工程を含む、対象におけるMSを診断する方法を提供する。
(a)抗Rep抗体によって対象からの試料中のRepタンパク質の量を検出する工程、及び
(b)対照試料中の量と比較して、工程(a)で対象からの試料中に検出されたRepタンパク質の量を神経変性疾患の診断と相関させる工程を含む、患者における神経変性疾患を診断する方法を提供する。
(a)抗Rep抗体によって対象からの試料中のRepタンパク質の量を検出する工程、及び
(b)対照試料中の量と比較して、工程(a)で対象からの試料中に検出されたRepタンパク質の量をMSの診断と相関させる工程を含む、患者におけるMSを診断する方法を提供する。
(a)抗Rep抗体によって対象からの試料中のRepタンパク質の量を検出する工程、及び
(b)対照試料中の量と比較して、工程(a)で対象からの試料中に検出されたRepタンパク質の量を神経変性疾患、例えばMSの診断と相関させる工程を含む。
DSM ACC3327に基づく抗体AB01 523−1−1;
DSM ACC3328に基づく抗体AB02 304−4−1;
DSM ACC3329に基づく抗体MSBI1 381−6−2;
DSM ACC3330に基づく抗体MSBI1 761−5−1。
抗体MSBI1 961−2−2は、2017年10月6日にDSMZに寄託された。
MSBI1 Repタンパク質精製
MSBI1ゲノム内で同定された全長Repオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするヌクレオチド酸分子を、大腸菌高収率無細胞インビトロ翻訳系(Expressway(商標)無細胞大腸菌発現システム、Invitrogen)に基づくタンパク質発現を可能にする発現プラスミド(pEXP5−CT、Invitrogen)にクローニングする。インビトロ翻訳反応内で配列番号1のアミノ酸配列を有する合成Repタンパク質を、100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl、pH8.0の5mMイミダゾールを含有する20反応容積の8M尿素試料緩衝液pH8.0を添加することによって変性させる。Repタンパク質は、その後、Repタンパク質に融合したC末端His6−タグに基づく変性条件下(洗浄用に20mMイミダゾール及びタンパク質溶出用に300mMイミダゾール)で精製される。精製の質は、クマシータンパク質染色及び抗Repタンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって決定される。Repタンパク質純度は、デンシトメトリーで計算され、95%以上である。精製タンパク質を直接ELISAに基づく血清スクリーニングに使用するか、又はSDS−Pageに供し、続いてニトロセルロース膜上に転写ブロッティングして、1Dサイズ分解Repタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションを行う。
血清マスタープレートの生成
血清試料を最初に等分して、試料の凍結融解サイクルを低減する。次いで、U字型96ウェルプレート中、0.02%(w/v)アジ化ナトリウム最終濃度で安定化されたPBS pH7.2中に1:1希釈の血清を生成することによってマスタープレートを確立する。このプレートは、4℃で保管し、滅菌条件下で取り扱うと少なくとも2ヶ月間安定であり、個々のスクリーニング実験の前にさらなる血清希釈(1:20の最終希釈)のためのテンプレートとして使用される。
1Dサイズ分解Repタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションによる血清スクリーニング
1D分解Repタンパク質膜ストライプと血清とのインキュベーションに基づくスクリーニングアッセイのために、20μg精製Repタンパク質をSigma Tru−PAGE 4〜20%プレキャストゲルに充填する。ゲルポケットを分離する壁は、ゲル充填の前に除去され、サイズマーカーのための1つの大きなポケット及び1つのポケットが生じる。1Dサイズ分解SDS−PAGE後、標準的な湿式/タンク転写ブロットプロトコルを使用してタンパク質をニトロセルロース膜上に転写ブロットする。その後、ブロット膜上のタンパク質(約40kDaのランニングハイトにある全長Repタンパク質の本質的に1つのバンド)をPonceauSで可視化して転写品質をチェックし、完全な1Dサイズ分解膜の幅2mm及び高さ2mmの膜ストライプのカットを準備する。次いで、ストライプを各500μlの無血清ブロッキング試薬(Genetex Tridentユニバーサルブロッキング試薬)で1時間ブロッキングする。その後、血清は、2つの異なる血清希釈に基づいて特徴付けられる。血清インキュベーションを4℃で14時間(一晩)線形振盪装置で実行する。その後、膜ストリップを室温で3×5分間、PBS−T pH7.2の0.1%Tween−20で洗浄する。血清内のRep特異的結合ヒトIgGの検出は、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体と室温で1時間インキュベートすることによって行われる。室温で3×5分間、PBS−T pH7.2の0.1%Tween−20で3回洗浄した後、各個々の血清インキュベーションのストリップをプラスチックホイル上にテープで固定する。次いで、ホイルをECL基質(Biorad Clarity)とインキュベートして、BioRad WesternBlot検出システムで結合ヒトIgGを可視化する。タンパク質膜上のRepバンドに特異的に結合するIgGの量に対応するシグナルをデンシトメトリーによって定量する。
表2:血清陽性血清/血漿試料の定量化。
ELISAによる血清スクリーニング
適量の精製Repタンパク質(通常、1ウェルあたり50〜200ng)を、Maxisorp 96ウェルELISAプレート(Fisher Scientific)に予め分注した8M尿素pH8.0とPBS pH7.2との1:1混合物に添加する。タンパク質を線形振盪装置上で4℃で14時間プレートマトリックスに結合させる。次いで、プレートをPBS−T pH7.2の0.1%Tween−20によって室温で3×5分間洗浄し、続いて4℃で少なくとも14時間、0.02%アジ化ナトリウムを最終的に含有するPBS pH7.2の1%(w/v)BSAでブロッキングする。その後、血清を1:500の希釈で添加し、インキュベーションを室温で6時間実行する。その後、プレートをPBS−T pH7.2の0.1%Tween−20によって室温で3×5分間洗浄する。血清内のRep特異的結合ヒトIgGの検出は、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体と室温で1時間インキュベートすることによって行われる。室温でPBS−T pH7.2の0.1%Tween−20で3×5分間3回洗浄した後、100μlのTMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、HRP感受性)基質溶液をウェルごとに添加して、室温で5分インキュベートする。100μlの8M酢酸/1M硫酸を添加して反応を停止させる。シグナル強度は、450nmで吸光度を測定することにより、Perkin Elmer ELISA適合装置で定量化される。
免疫蛍光分析
HEK293TT細胞(125.000/ウェル)を、DMEM 10%FCS(1×Glutamax(Gibco)及び1×非必須アミノ酸(Gibco)を補充した)中の免疫蛍光8ウェルチャンバー中で24時間培養し、続いて自己蛍光マーカータンパク質ZsGreenを発現する対照プラスミドZsGreen1CI(Clontech)、又はZsGreen−Rep融合タンパク質をコードする3’末端に全長MSBI1 Rep ORFを有する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン(PEI)によりDNAトランスフェクションを行った。DNAトランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで洗浄し、室温で20分間4%PFA PBSを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて10分間PBS 0.5%Triton X−100で透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、ブロッキングをPBS 1%BSAで室温にて45分間実行した。マウスモノクローナル抗Rep抗体(表1参照)とのインキュベーションを、1:500抗体希釈を含むPBS 1%BSA(一次抗体を欠く対照を含めた)中で37℃にて1時間実行した。細胞をPBSで3回洗浄した後、PBS 1%BSAと室温で15分間インキュベートした。次いで、二次抗体(AlexaFluor546ヤギ抗マウス、1:500;DNAマーカーHoechst 33342、1:5.000)とのインキュベーションを、PBS 1%BSA中、室温で45分間実行した。カバースリップ(Dakoマウント培地)でマウントする前に、細胞をPBS 1%BSAで3回及びPBSで3回洗浄した。免疫蛍光画像をZeiss Cell Observerで撮影した(対物レンズ20倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間)。
免疫蛍光分析
HEK293TT細胞(125.000/ウェル)を、DMEM 10%FCS(1×Glutamax(Gibco)及び1×非必須アミノ酸(Gibco)を補充した)中の免疫蛍光8ウェルチャンバー中で24時間培養し、続いて自己蛍光マーカータンパク質ZsGreenを発現する対照プラスミドZsGreen1CI(Clontech)、又はZsGreen−Rep融合タンパク質をコードする3’末端に全長CMI1 Rep ORFを有する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン(PEI)によりDNAトランスフェクションを行った。DNAトランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで洗浄し、室温で20分間4%PFA PBSを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて10分間PBS 0.5%Triton X−100で透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、ブロッキングをPBS 1%BSAで室温で45分間実行した。マウスモノクローナル抗Rep抗体(表1)とのインキュベーションを、1:500抗体希釈を含むPBS 1%BSA(一次抗体を欠く対照を含めた)中で37℃にて1時間実行した。細胞をPBSで3回洗浄した後、PBS 1%BSAと室温で15分間インキュベートした。次いで、二次抗体(AlexaFluor546ヤギ抗マウス、1:500;DNAマーカーHoechst 33342、1:5.000)とのインキュベーションを、PBS 1%BSA中、室温で45分間実行した。カバースリップ(Dakoマウント培地)でマウントする前に、細胞をPBS 1%BSAで3回及びPBSで3回洗浄した。免疫蛍光画像をZeiss Cell Observerで撮影した(対物レンズ20倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間)。
免疫蛍光分析
HEK293TT細胞(125.000/ウェル)を、DMEM 10%FCS(1×Glutamax(Gibco)及び1×非必須アミノ酸(Gibco)を補充した)中の免疫蛍光8ウェルチャンバー中で24時間培養し、続いて対照プラスミドpcDNA3.1(−)(Invitrogen)又は全長MSBI1 Rep ORF(配列番号13)のコドン最適化変異体を発現する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン(PEI)によるDNAトランスフェクションを行った。DNAトランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで洗浄し、室温で20分間4%PFA PBSを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて10分間PBS 0.5%Triton X−100で透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、ブロッキングをPBS 1%BSAで室温で45分間実行した。マウスモノクローナル抗Rep抗体(表1)とのインキュベーションを、1:500抗体希釈を含むPBS 1%BSA(一次抗体を欠く対照を含めた)中で37℃にて1時間実行した。細胞をPBSで3回洗浄した後、PBS 1%BSAと室温で15分間インキュベートした。次いで、二次抗体(AlexaFluor488ヤギ抗マウス、1:500;DNAマーカーHoechst 33342、1:5.000)とのインキュベーションを、PBS 1%BSA中、室温で45分間実行した。カバースリップ(Dakoマウント培地)でマウントする前に、細胞をPBS 1%BSAで3回及びPBSで3回洗浄した。免疫蛍光画像をZeiss Cell Observerで撮影した(対物レンズ20倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間)。
ウエスタンブロット分析
HEK293TT(1,5Mio/6ウェル)を、DMEM 10%FCS(1×Glutamax(Gibco)及び1×非必須アミノ酸(Gibco)を補充したもの)中の6ウェル細胞培養プレート中で24時間培養し、続いてN末端ZsGreenタグとの融合タンパク質として全長MSBI1、CMI1、又はMSBI2 Repタンパク質の過剰発現をコードするZsGreen1CIプラスミドのポリエチレンイミン(PEI)によりDNAトランスフェクションを行った。DNAトランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理により脱着し、PBSで再度洗浄し、SDS−PAGE Laemmli緩衝液中で溶解した(98℃で5分間煮沸)。試料を1つの大きなポケットを有するプレキャスト12.5%SDS−PAGEゲル上に充填した。転写ブロット後、PBS 5%スキムミルクでブロッキングした後、表1の異なるマウスモノクローナル抗体(PBS 5%スキムミルク中1:1000希釈)とストライプを個々にインキュベートするために、膜の各2つのストライプを切断した。ストライプをPBS 0.1%Tween20で3回洗浄し、HRP結合抗マウス二次抗体とインキュベートして、Biorad ChemiDoc装置上で異なるZsGreen−Rep融合タンパク質を検出する抗体のウエスタンブロット分析を可能にした。ZsGreen抗体(OriGene、1:2000)とのインキュベーションに基づいて陽性対照検出を実行した。
参考文献:
配列表2 <223>Repペプチド
配列表3 <223>Repペプチド
配列表4 <223>Hisタグ
配列表5 <223>T7タグ
配列表6 <223>FLAGタグ
配列表7 <223>Trep IIタグ
配列表8 <223>MSBI2.176
配列表9 <223>MSBI1エピトープ
配列表10 <223>CMI1.252
配列表11 <223>CMI2.214
配列表12 <223>CMI3.168
配列表13 <223>コドン最適化MSBI1
配列表14 <223>MSBI1タンパク質
配列表15 <223>MSBI1野生型
Claims (17)
- 多発性硬化症(MS)の診断に使用するためのDNA複製関連(Rep)タンパク質であって、
(a)対照試料中の量と比較して、対象からの試料中のRepタンパク質若しくはその断片の少なくとも2倍の増加量;又は
対照試料中の量と比較して、対象からの試料中の抗Rep抗体の少なくとも2倍の増加量が、
MSの診断と相関し、
(b)前記Repタンパク質が、
(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号1の前記アミノ酸配列を有するタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができる配列番号1の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の前記アミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的な抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む、DNA複製関連(Rep)タンパク質。 - 配列番号1の前記断片が、配列番号1のアミノ酸1〜229からなる前記アミノ酸配列内のエピトープを含む、請求項1に記載のRepタンパク質。
- 対照試料と比較して、少なくとも5倍のRepタンパク質若しくはその断片又は抗Rep抗体の増加量が、MSを示す、請求項1又は2に記載のRepタンパク質。
- 前記タンパク質が、配列番号13に示されるポリヌクレオチド酸によってコードされる、請求項1に記載のRepタンパク質。
- 抗体AB01 523−1−1(DSM ACC3327)、抗体AB02 304−4−1(DSM ACC3328)、抗体MSBI1 381−6−2(DSM ACC3329)、抗体MSBI1 761−5−1(DSM ACC3330)、及び抗体MSBI1 961−2−2からなる群から選択される、抗Rep抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法における請求項5に記載の抗Rep抗体の使用。
- 対象におけるMSを診断する方法であって、
(a)対象からの試料を請求項1の(b)で定義されたRepタンパク質とインキュベートする工程;
(b)Repタンパク質と免疫学的複合体を形成する前記対象からの前記試料中の抗体の量を検出する工程;及び
(c)対照試料中の量と比較して、前記対象からの前記試料中のRepタンパク質に結合した抗体の少なくとも2倍の増加量をMSの診断と相関させる工程を含む、方法。 - 工程(a)において、前記Repタンパク質が固定化された後、前記固定化されたRepタンパク質を前記対象からの前記試料とインキュベートする、請求項7に記載の方法。
- 工程(a)において、前記Repタンパク質を細胞内で発現させた後、前記細胞を前記対象からの前記試料とインキュベートする、請求項7に記載の方法。
- 工程(b)において、Repタンパク質と免疫学的複合体を形成する抗体の量が、シグナル生成化合物と結合した検出結合剤によって定量される、請求項8又は9に記載の方法。
- 工程(a)において、前記対象からの前記試料中の前記抗体を固定化した後、規定量のRepタンパク質とインキュベートする、請求項7に記載の方法。
- 前記対象からの前記試料が、血清又は血漿試料である、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 患者におけるMSを診断する方法であって、
(a)配列番号2又は配列番号3に含まれるエピトープに結合する抗Rep抗体により、対象からの試料中のRepタンパク質の量を検出する工程、及び
(b)対照試料中の量と比較して、工程(a)において対象からの前記試料中に検出されたRepタンパク質の少なくとも2倍の増加量をMSの診断と相関させる工程を含む、方法。 - Repタンパク質に特異的な前記抗体が、配列番号1の1〜136、137〜229、及び230〜324のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する、請求項13に記載の方法。
- 対象からの前記試料が、血清試料、血漿試料、又は組織試料からなる群から選択される、請求項13又は14に記載の方法。
- MSの診断に使用するためのキットであって、
(a)Repタンパク質であって、前記Repタンパク質が、
(i)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号1の前記アミノ酸配列を有するタンパク質に特異性を有する抗Rep抗体に結合することができる配列番号1の断片;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の前記アミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有し、かつ配列番号1の前記アミノ酸配列を有するタンパク質に特異性を有する抗Rep抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む、Repタンパク質、
(b)検出可能な標識に結合し、配列番号1の前記アミノ酸配列を有するタンパク質に特異性を有する抗Rep抗体に結合することができる抗ヒト抗体、及び
(c)血清又は血漿試料中に推測される配列番号1の前記アミノ酸配列を有するタンパク質に特異性を有する(a)によるRepタンパク質又は抗Rep抗体を固定化するのに好適な固体マトリックスを含む、キット。 - 酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫検定法(EIA)、蛍光免疫検定法(FIA)、ルミネセンスイムノアッセイ(LIA)、及びストリップアッセイからなる群から選択されるアッセイに使用するための請求項16に記載のキット。
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