ES2939643T3 - Proteína Rep como antígeno proteico para su uso en ensayos de diagnóstico - Google Patents

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Abstract

Se describe una proteína asociada a la replicación del ADN (Rep) para uso en el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM), en la que (a) una cantidad aumentada de proteína Rep o fragmentos de la misma en una muestra de un sujeto en comparación con una cantidad en un muestra de control; o una mayor cantidad de anticuerpos anti-proteína Rep con antígeno en una muestra de un sujeto en comparación con una cantidad en una muestra de control se correlaciona con un diagnóstico de EM, en el que la proteína Rep es una Rep MSBI1 o MSBI2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína Rep como antígeno proteico para su uso en ensayos de diagnóstico
La invención se refiere a métodos para diagnosticar la esclerosis múltiple (EM) en los que una cantidad al menos 2 veces mayor de una proteína asociada a la replicación del a Dn (Rep) o una cantidad al menos 2 veces mayor de anticuerpos anti-Rep en una muestra de un sujeto en comparación con una cantidad en una muestra de control se correlaciona con el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM). En particular, la invención se refiere a una proteína Rep codificada en el genoma MSBI1. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y descripciones que ya no entran en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas se consideran simplemente ejemplos adecuados para comprender la invención.
La etiología de la esclerosis múltiple (EM) no se ha resuelto. Por ello, existe una demanda de un biomarcador para la EM que pueda utilizarse para el diagnóstico de la EM y/o el seguimiento de la EM o un tratamiento de la EM y/o evaluar una predisposición a la EM.
La esclerosis múltiple (EM) se caracteriza por la desmielinización de las lesiones que dañan las células nerviosas del cerebro y la médula espinal. Los síntomas de la EM se presentan como episodios de empeoramiento repentino (recaídas, exacerbaciones, brotes, ataques) o como un empeoramiento gradual a lo largo del tiempo (formas progresivas). La desmielinización inicia procesos inflamatorios que desencadenan células T y la liberación de citoquinas y anticuerpos. Para el diagnóstico de la EM se utilizan, entre otros, la neuroimagen, el análisis del líquido cefalorraquídeo y los potenciales evocados.
Se aisló un espectro de 17 moléculas de ADN diferentes, aunque parcialmente relacionadas, a partir de diferentes materiales de prueba (tejido cerebral de esclerosis múltiple (EM), suero bovino, leche) (Funk, Gunst et al. 2014, Gunst, Zur Hausen et al. 2014, Lamberto, Gunst et al. 2014, Whitley, Gunst et al. 2014). Entre estos aislados se aislaron dos moléculas de ADN estrechamente relacionadas con el aislado Sphinx 1.76 (1.758 pb; n° de acceso HQ444404, (Manuelidis L. 2011)), asociado a la encefalopatía espongiforme transmisible (EET), a partir de tejido cerebral de pacientes con EM. Estos aislados fueron MSBI1.176 (MSBI, aislado cerebral de esclerosis múltiple) (1.766 pb) y MSBI2.176 (1.766 pb) que se designan como "genoma MSBI1" y "genoma MSBI2", respectivamente. MSBI1,176 comparte un 98% de similitud nucleotídica con la secuencia de Sphinx 1.76. Los grandes marcos de lectura abiertos (ORF) de los aislados codifican una proteína putativa de replicación del ADN que comparte una gran similitud entre ellos. Otra característica común es la presencia de repeticiones en tándem similares a iterones. La alineación de esta región de repeticiones indica una variación en el núcleo de nucleótidos individuales. Estas repeticiones tipo iterón pueden constituir los sitios de unión de las proteínas Rep. El sitio de los aislados se ha depositado en el banco de datos EMBL con los números de acceso LK931491 (MSBI1.176) y LK931492 (MSBI2.176) (Whitley C. et al. 2014) y se han alineado y descrito en el documento WO 2016/005064.
Otros aislados se obtuvieron de la leche de vaca. Estos aislados de leche de vaca (CMI) fueron CMI1.252, CMI2.214 y CMI3.168, que se designan como "genoma CMI1", "genoma CMI2" y "genoma CMI3", respectivamente. Las secuencias de los aislados se han depositado en el banco de datos EMBL con los números de acceso LK931487 (CMI1.252), LK931488 (CMI2.214) y LK931489 (CMI3.168) y se han alineado y descrito en el documento WO 2016/005064.
EP 2868751 describe un método para detectar un polipéptido codificado por un ácido polinucleico HCBI.
EP 2966176 busca ácidos nucleicos en muestras humanas y animales que se asemejan a patógenos virales o bacterianos y revela el aislado MSBI1.176. MSBI1.
Los presentes inventores han descubierto que el genoma MSBI1 muestra una producción significativa de ARN transcrito y que la proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 se expresa en células humanas. Los presentes inventores han descubierto que la proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 y MSBI2 (MSBI1 Rep y MSBI2 Rep) representa un biomarcador para ensayos de cribado de patogenicidad. Como proteína asociada a la replicación del ADN (RepB), la proteína Rep tiene actividad de unión al ADN y puede ser esencial para el inicio de la replicación de moléculas de ADN episomal o viral. Las proteínas Rep, que son estructuralmente similares a la Rep codificada en el genoma MSBI1 según la presente invención, muestran un marcado potencial de autooligomerización y agregación, que se describió en sistemas procariotas in vivo e in vitro (Giraldo, Moreno-Díaz de la Espina et al. 2011, Torreira, Moreno-Del Álamo et al. 2015).
La presente invención proporciona una plataforma para ensayos de cribado de diagnóstico específicos de patógenos basados en el uso de una proteína Rep como antígeno.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-Rep se utilizan como marcadores patogénicos debido al vínculo de la actividad patogénica del agente aislado de ADN (MSBI1) con la expresión de la proteína Rep. Los sueros de pacientes que contienen cantidades elevadas de anticuerpos anti-Rep indican que el paciente correspondiente estuvo definitivamente expuesto a proteínas relacionadas con Rep o que él mismo expresó Rep durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo como para iniciar una respuesta inmune específica de Rep. Como diana para los anticuerpos humanos se utiliza la proteína Rep como antígeno. Basándose en la cuantificación de la cantidad de anticuerpos anti Rep, se puede diagnosticar o monitorizar la EM aguda, así como la predisposición a la EM. Dado que se ha reconocido que el aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep inducidos o de proteína Rep expresada en una muestra indica el inicio y/o el estado de la EM, el aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep y de proteína Rep, respectivamente, puede utilizarse como biomarcador patogénico para el diagnóstico de la EM.
Ventajosamente, el biomarcador patogénico de la EM puede detectarse en muestras de sangre, como suero o plasma, y no es necesario obtener muestras del líquido cefalorraquídeo.
Por lo tanto, la invención proporciona una proteína asociada a la replicación del ADN (Rep) para su uso en el diagnóstico de la esclerosis múltiple (EM). La proteína Rep está codificada por el genoma MSBI1 y comprende (i) una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:1;
(ii) un fragmento de SEQ ID NO:1 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la descrita en s Eq iD NO:1; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:1.
Otra proteína Rep que no forma parte de la invención reivindicada está codificada por el genoma MSBI2 y comprende (i) una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:8;
(ii) un fragmento de SEQ ID NO:8 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la descrita en s Eq iD NO:8; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:8.
Otra proteína Rep que no forma parte de la invención reivindicada está codificada por el genoma CMI1 y comprende (i) una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:10;
(ii) un fragmento de SEQ ID NO:10 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en s Eq ID n O:10; o
(iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:10.
Otra proteína Rep que no forma parte de la invención reivindicada está codificada por el genoma CMI2 y comprende (i) una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:11;
(ii) un fragmento de SEQ ID NO:11 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la descrita SEQ ID NO:11; o bien (iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:11.
Otra proteína Rep que no forma parte de la invención reivindicada está codificada por el genoma CMI3 y comprende (i) una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:12;
(ii) un fragmento de SEQ ID NO:12 que es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:12; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprenda una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:12.
Una mayor cantidad de proteína Rep en una muestra de un sujeto en comparación con una cantidad de proteína Rep en una muestra de control se correlaciona con un diagnóstico de EM, es decir, indica EM. De acuerdo con la presente invención, el diagnóstico de EM o una predisposición a la EM se indica mediante un aumento de la cantidad de proteína Rep de al menos 2 veces en comparación con una muestra de control.
En otras realizaciones, un aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep en una muestra de un sujeto en comparación con la cantidad de anticuerpos anti-Rep en una muestra de control se correlaciona con un diagnóstico de EM, es decir, es indicativo de EM. Según la presente invención, el diagnóstico de EM o la predisposición a padecer EM se indica mediante un aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep de al menos 2 veces en comparación con una muestra de control.
La proteína Rep de la presente invención puede emplearse en prácticamente cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos o respuestas inmunitarias mediadas por células. Así pues, la presente invención también abarca la detección de respuestas inmunitarias mediadas por células, por ejemplo, células T, contra la proteína Rep.
La invención proporciona un método de diagnóstico de EM en un sujeto que comprende los pasos de
(a) incubar una muestra obtenida de un sujeto con una proteína Rep;
(b) detectar la cantidad de anticuerpos en la muestra del sujeto que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep; y
(c) correlacionar una cantidad al menos 2 veces mayor de anticuerpos unidos a la proteína Rep, en comparación con una cantidad en una muestra de control, con un diagnóstico de EM.
En realizaciones particulares, la proteína Rep está inmovilizada, por ejemplo, unido a un soporte o portador, seguido de la incubación de la proteína Rep inmovilizada con la muestra del sujeto.
En otras realizaciones, la proteína Rep se expresa en células y, a continuación, se incuban las células con la muestra del sujeto.
En ciertas realizaciones, la cantidad de anticuerpos que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep se cuantifica mediante un agente de unión adicional acoplado a un compuesto generador de señales capaz de unirse a los anticuerpos anti-Rep del complejo inmunológico, por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado detectablemente, preferiblemente anticuerpo antihumano.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la muestra del sujeto se inmovilizan y, a continuación, se incuban con una cantidad definida de proteína Rep.
La muestra del sujeto y la muestra de control es una muestra de sangre, como suero o plasma.
La invención proporciona un método de diagnóstico de EM en un paciente que comprende los pasos de
(a) detectar la cantidad de proteína Rep en una muestra de un sujeto mediante anticuerpos anti-Rep que se unen a un epítopo comprendido por SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3; y
(b) correlacionar una cantidad al menos 2 veces mayor de proteína Rep detectada en la muestra de un sujeto en el paso (a) en comparación con una cantidad en una muestra de control con diagnóstico de EM.
En tales realizaciones, la muestra de un sujeto y la muestra de control se seleccionan del grupo que consiste en una muestra de suero, una muestra de plasma o una muestra de tejido.
En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-Rep se une a un epítopo que está dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos de 1 a 136, de 137 a 229 y de 230 a 324 de SEQ ID NO:1.
En otras realizaciones, la invención proporciona un kit para su uso en el diagnóstico de la EM que comprende (a) una proteína Rep MSBI1, (b) un anticuerpo antihumano según la Tabla 1 acoplado a una etiqueta detectable y capaz de unirse al anticuerpo anti-Rep según la invención, y (c) una matriz sólida adecuada para inmovilizar una proteína Rep según (a) o anticuerpos anti-Rep, donde los anticuerpos de ayuda se sospechan en una muestra, en particular un suero o una muestra de plasma.
En determinadas realizaciones, el kit se prepara para su uso en un inmunoensayo, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en un ensayo inmunoenzimático (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un inmunoensayo enzimático (EIA), un inmunoensayo de fluorescencia (FIA), un inmunoensayo de luminiscencia (LIA) y un ensayo en tira.
Breve descripción de los dibujos:
Figura 1 muestra un ejemplo de cribado de suero de 2 * 8 muestras mediante incubación de suero de tiras de membrana de proteína Rep resueltas en tamaño 1D. Las tiras de nitrocelulosa que contienen proteína Rep se incubaron con dos diluciones diferentes de suero/plasma (1:500 y 1:2000) del conjunto de muestras de suero de EM o del conjunto de plasma de donante sano. Las IgG humanas unidas a Rep se detectaron con anticuerpos secundarios anti-IgG humana acoplados a HRP. Las señales de los anticuerpos en el tamaño de la diana de proteína Rep de longitud completa (véase la tinción de proteína Coomassie y los controles anti-Rep WB a la derecha) se cuantificaron mediante densitometría.
Figura 2 muestra una cuantificación de las sero-respuestas Rep-específicas basadas en el cribado ELISA. Se colocaron 50, 100, 200, 400 u 800 ng de proteína Rep (antígeno diana) por cada 96 pocillos. Tras el bloqueo y el lavado, el antígeno de la proteína Rep se incubó con una muestra de suero de EM o una muestra de plasma de control a una dilución de 1:500 durante 6 horas a temperatura ambiente (TA). Tras el lavado y la incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG humana HRP acoplado a HRP y un último paso de lavado, se cuantificó la presencia de IgG humanas unidas a Rep mediante reacción con sustrato TMB y medición de la absorción a 450 nm. La cuantificación revela una buena correlación entre la intensidad de la señal y la cantidad de proteína Rep (antígeno). Por término medio, los niveles de intensidad de la señal del pool de EM superan las intensidades del pool de control en al menos un factor de 1,9. En general, el cribado de suero basado en ELISA reveló anticuerpos detectables en suero para al menos una dilución de suero de 1:1000 (datos no mostrados), por lo que es probable que el título para este experimento sea mayor de 1:1000 en la región de 1:2000-1:4000 o incluso mayor tras la optimización de la plataforma.
Figura 3 muestra una cuantificación de las sero-respuestas Rep-específicas basadas en el cribado ELISA. Se colocaron 200 ng de proteína Rep (antígeno diana) por cada 96 pocillos. Tras el bloqueo y el lavado, el antígeno de proteína Rep se incubó con 7 sueros MS individuales o 7 sueros de control individuales por duplicado a una dilución de 1:500 durante 6 h a temperatura ambiente (TA). Tras el lavado y la incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG humana HRP acoplado a HRP y un último paso de lavado, se cuantificó la presencia de IgG humanas unidas a Rep mediante reacción con sustrato TMB y medición de la absorción a 450 nm. Las intensidades medias de las muestras de EM superan la intensidad media de los sueros de control en al menos un factor de 8, con algunas muestras de EM que revelan un factor de 10-16 sobre las intensidades medias de control.
Figura 4 a 6 muestran datos de imágenes de inmunofluorescencia obtenidos mediante el empleo de los anticuerpos anti-Rep A, B, C, D1 y D2 que se designan en las coordenadas “y”.
Figura 7 muestra un análisis Western Blot, en el que A, B, C y D1 designan los grupos de los anticuerpos anti-Rep empleados.
Figura 8 muestra una alineación de secuencias de la secuencia MSBI1 "optimizada" (=SEQ ID NO:13) frente a la "original" (=el tipo salvaje; SEQ ID NO:12). Los codones optimizados están marcados.
La invención proporciona ensayos de cribado diagnóstico para la presencia de anticuerpos anti-Rep como marcadores patogénicos. Las muestras que contienen cantidades elevadas de anticuerpos anti-Rep indican que el sujeto correspondiente estuvo definitivamente expuesto a la proteína relacionada con Rep o que él mismo expresó la proteína Rep durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo como para inducir una respuesta inmune específica de la proteína Rep. Con tales ensayos de cribado puede realizarse un diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la EM basados en la cuantificación de anticuerpos anti-Rep. En realizaciones alternativas, la proteína Rep puede detectarse y cuantificarse directamente en muestras mediante anticuerpos anti-Rep.
La "Proteína Rep" como se usa aquí se refiere a una proteína asociada a la replicación del ADN (RepB). La proteína Rep comprende actividad de unión al ADN y podría ser esencial para la iniciación de la replicación de moléculas de ADN episomal/viral. En general, la proteína Rep se refiere a una proteína Rep del grupo del genoma Small Sphinx (Whitley et al., 2014). La proteína Rep según la invención es una proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep). No forma parte de la invención reivindicada una proteína Rep codificada en el genoma MSBI2 (MSBI2 Rep), una proteína Rep codificada en el genoma CMI1 (CMI1 Rep), una proteína Rep codificada en el genoma CMI2 (CMI2 Rep) o una proteína Rep codificada en el genoma CMI3 (CMI3 Rep). Preferiblemente, la proteína Rep MSBI1 está codificada por MSBI1.176 depositada en el banco de datos EMBL con el n.° de acc. LK931491 y tiene la secuencia de aminoácidos representada en NO. ID. SEC. :1 (Whitley, Gunst et al. 2014). No forma parte de la invención reivindicada la proteína CMI1 Rep codificada por CMI1.252, depositada en el banco de datos EMBL con el n.° de acc. LK931487 y que tiene la secuencia de aminoácidos representada en NO. ID. SEC. :10; la proteína CMI2 Rep codificada por CMI2.214, depositada en el banco de datos EMBL con el n.° de acc. LK931488 y que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en NO. ID. SEC. :11; la proteína CMI3 Rep codificada por CMI3.168, depositada en el banco de datos EMBL con el n° de acc. LK931489 y que tiene la secuencia de aminoácidos representada en NO. ID. SEC. :12. En una realización preferida particular, la proteína Rep comprende una región N-terminal conservada entre genomas pequeños de Esfinge que consiste esencialmente de aminoácidos de 1 a 229 de NO. ID. SEC. :1 y una región variable C-terminal específica para MSBI1.176 que consiste esencialmente de aminoácidos 230 a 324 de NO. ID. SEC. :1. La región conservada N-terminal comprende un primer dominio putativo de unión al ADN que consiste esencialmente en los aminoácidos de 1 a 136 de NO. ID. SEC. :1 y un segundo dominio putativo de unión al ADN que consiste esencialmente en los aminoácidos de 137 a 229 de NO. ID. SEC. :1.
La "proteína Rep" también engloba fragmentos y variantes de la proteína con NO. ID. SEC. :1 que son capaces de unir un anticuerpo anti-Rep específico para la proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1. Preferiblemente, dicho fragmento es un fragmento inmunogénico de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1 que abarca al menos un epítopo para un anticuerpo antiproteína Rep contra la proteína Rep de NO. ID. SEC. :1 y, preferiblemente, comprende al menos 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 50 aminoácidos contiguos. En realizaciones particulares, el fragmento comprende o consiste esencialmente en un dominio de la proteína Rep, por ejemplo, la región conservada N-terminal, la región variable C-terminal, el primer o segundo dominio de unión al ADN. Una variante de la proteína con NO. ID. SEC. :1 comprende una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos en comparación con NO. ID. SEC. :1 y tiene una homología de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1, en la que la variante es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1. Dentro de la definición de variante se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, ácido nucleico peptídico (PNA), etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural. El término proteína Rep incluye proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, con una secuencia líder o con una secuencia Tag y similares. En ciertas realizaciones de la invención, las etiquetas proteicas se injertan genéticamente en la proteína Rep descrita anteriormente. En particular, al menos una etiqueta proteica se une a un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos como la descrita en NO. ID. SEC. s:1,14. Dichas etiquetas proteínicas pueden eliminarse mediante agentes químicos o por medios enzimáticos. Ejemplos de etiquetas proteicas son las etiquetas de afinidad o cromatografía para purificación. Por ejemplo, la proteína Rep puede fusionarse a una secuencia Tag, por ejemplo, seleccionada del grupo formado por Etiqueta-His6 (No. Id. Sec.:4), Etiqueta -T7 (S No. Id. Sec.:5), Etiqueta-Bandera (No. Id. Sec.:6)y Etiqueta -Strep-II (No. Id. Sec.:7). a Etiqueta-His (No. Id. Sec.:4), a Etiqueta - T7 (No. Id. Sec.: 5), Etiqueta-Bandera (No. Id. Sec.: 6) o Etiqueta-Strep-II (No. Id. Sec.:7). Además, las etiquetas de fluorescencia como la proteína de fluorescencia verde (GFP) o sus variantes pueden unirse a una Rep-proteína según la invención.
En una realización particular preferida, la proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep) está optimizada en codones para la producción en líneas celulares humanas (p. ej. HEK-293, HEK293TT, HEK293T, HEK293FT, HaCaT, HeLa, SiHa, CaSki, HDMEC, L1236, L428, BJAB, MCF7, Colo678, cualquier línea celular primaria) así como líneas celulares bovinas (por ejemplo, MAC-T) o murinas (por ejemplo, GT1-7). En cuanto a la optimización de codones, las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos pueden diseñarse para emplear codones que se utilizan en los genes del sujeto en el que se va a producir el antígeno. En una realización preferida, los codones utilizados son codones "humanizados". Este uso de codones proporciona una expresión eficiente de los antígenos en células humanas. Puede utilizarse cualquier método adecuado de optimización de codones. Tales métodos y la selección de tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. De acuerdo con la presente invención, dicha variante de codón optimizado de la proteína Rep codificada en el genoma MSBI1 (MSBI1 Rep) comprende o tiene la secuencia descrita en SEQ ID. No.: 13 y comprende o tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID. En total, se sustituyeron 686 nucleótidos del gen MSBI1 Rep de 927 nucleótidos que codifica para la proteína Rep (desde el codón de inicio hasta el codón de parada) para mejorar el uso del codón. Un uso de codones perfecto con una adaptación óptima hacia, por ejemplo, el uso de codones humanos se describe mediante un índice de adaptación de codones (CAI) de 1 que indica que todos los codones están optimizados para la expresión humana. Para el gen Rep original codificado con MSBI1, se calculó un CAI de 0,67 para el sistema humano, que está muy por debajo del CAI de 0,8, que se considera el umbral inferior para una buena adaptación de codones. Tras la optimización de codones del gen MSBI1 rep, se calculó un CAI de 0,94 para el ADN optimizado, lo que indica una adaptación de codones casi óptima para el sistema humano. En especial, se modificaron 18 codones muy poco utilizados, la mayoría de los cuales representaban codones que codificaban leucina con una frecuencia de uso muy baja (<10%) en el sistema humano. En la Figura 8 se muestra un alineamiento de secuencias de la secuencia MSBI1 optimizada para codones de NO. ID. SEC. :13 frente a la secuencia MSBI1 de tipo salvaje de NO. ID. SEC. :15.
La proteína Rep de la invención, incluidos los fragmentos Rep y las variantes Rep definidas anteriormente, puede prepararse mediante síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución homogénea o en fase sólida. Los polipéptidos según esta invención también pueden prepararse mediante técnicas de ADN recombinante. En el Ejemplo 1 se muestra un ejemplo para la producción y purificación de una proteína Rep según la invención.
El "Sujeto" como se usa aquí se refiere a un individuo o paciente mamífero, incluyendo murinos, ganado, por ejemplo, bovinos, simios y humanos. Preferiblemente, el sujeto es un paciente humano.
La "Muestra" como se usa aquí se refiere a una muestra biológica que abarca muestras líquidas y sólidas. Las muestras líquidas abarcan líquidos sanguíneos como, por ejemplo, suero, plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR). Las muestras sólidas abarcan muestras de tejido como cultivos de tejido o muestras de biopsia.
La expresión "Correlaciona con", tal como se utiliza aquí, se refiere a una cantidad, es decir, nivel o título, de anticuerpos anti-Rep y proteína Rep, respectivamente, con una correlación significativa con un estado de enfermedad de, EM. La correlación se determina detectando el grado de diferencia en la cantidad presente en una muestra de un sujeto a analizar y una muestra de control. Por "muestra de control" se entiende una sola muestra o una media de varias, es decir, más de dos, muestras de control. El control se toma de un individuo sano al que no se le ha diagnosticado EM. Alternativamente, la correlación puede determinarse teóricamente detectando el grado de diferencia en la cantidad presente en una muestra para un sujeto a analizar con un valor de corte predeterminado. Un valor de corte es un valor de referencia con una separación estadísticamente significativa entre diferentes estados de enfermedad, por ejemplo, entre el estado sano y el estado enfermo. El valor de corte puede determinarse mediante el análisis estadístico de un panel suficientemente grande de muestras de prueba de pacientes con antecedentes de enfermedad y muestras de un grupo de prueba sano mediante pruebas estadísticas conocidas en la técnica.
En ciertas realizaciones, un diagnóstico, por ejemplo, de EM, se indica por una cantidad al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces mayor de proteína, es decir, proteína Rep y anticuerpos anti-Rep, respectivamente, en la muestra del sujeto en comparación con una muestra de control.
El "Anticuerpo anti-Rep" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo que se une a un nivel detectable a la proteína Rep en los métodos de la invención cuya afinidad es más fuerte a la proteína Rep de la invención que a una proteína no-Rep. Preferiblemente, la afinidad del antígeno por la proteína Rep es al menos 2 veces mayor que la unión de fondo. En particular, el anticuerpo anti-Rep es específico para la MSBI1 Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es específico para MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep y/o CMI3 Rep. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-Rep se une a un epítopo dentro de los aminoácidos de 1 a 136 de la NO. ID. SEC.: 1.
Una característica común de todos los ensayos es que la proteína Rep se pone en contacto con una muestra sospechosa de contener anticuerpos contra la proteína Rep en condiciones que permitan a la proteína Rep unirse a cualquier anticuerpo de este tipo presente en la muestra. Tales condiciones serán típicamente temperatura fisiológica, pH y fuerza iónica utilizando un exceso de proteína Rep. La incubación de la proteína Rep con la muestra va seguida de la detección de inmunocomplejos formados por el antígeno. En ciertas realizaciones, la proteína Rep se acopla a un compuesto generador de señal, por ejemplo, una etiqueta detectable, o se utiliza un agente de unión adicional, por ejemplo, un anticuerpo secundario antihumano, acoplado a un compuesto generador de señal para detectar el complejo inmunitario.
Los anticuerpos anti-Rep pueden detectarse y cuantificarse en ensayos basados en la proteína Rep como antígeno proteico, que sirve de diana para los anticuerpos de mamífero, por ejemplo, humanos, sospechosos en la muestra. Preferiblemente, la proteína Rep está purificada (por ejemplo, véase el Ejemplo 1) y las muestras pueden ser, por ejemplo, muestras de suero o plasma. Los métodos incluyen la inmovilización de la proteína Rep en una matriz seguida de la incubación de la proteína Rep inmovilizada con las muestras. Por último, los anticuerpos unidos a Rep del complejo inmunológico formado entre la proteína Rep y los anticuerpos de las muestras se cuantifican mediante un agente de unión de detección acoplado a un compuesto generador de señal, por ejemplo, un anticuerpo de detección secundario acoplado a HRP (rábano-peroxidasa) que permite una cuantificación basada en sustrato HRP. Este compuesto generador de señal o etiqueta es detectable por sí mismo o puede reaccionar con un compuesto adicional para generar un producto detectable.
En otras realizaciones, los anticuerpos anti-Rep se cuantifican indirectamente en que primero los anticuerpos de la muestra se inmovilizan en una matriz, seguido de incubación con una cantidad definida de proteína Rep que puede estar marcada o comprender una proteína Tag, en que los anticuerpos anti-Rep inmovilizados y presentes en la matriz capturan la proteína Rep de la mezcla líquida proteína-muestra, seguido de cuantificación de la proteína Rep unida.
En otras realizaciones, la proteína Rep puede expresarse en células y estas células se incuban con la muestra. A continuación, se detectan y cuantifican los anticuerpos anti-Rep de la muestra unidos a la proteína Rep expresada por las células.
El diseño del inmunoensayo está sujeto a una gran variación, y se conocen muchos formatos en la técnica. Los protocolos pueden, por ejemplo, utilizar soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de agentes de unión acoplados a compuestos generadores de señales, por ejemplo, anticuerpos marcados o proteínas Rep marcadas; las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o colorantes. También se conocen ensayos que amplifican las señales del complejo inmunitario; ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, como los ensayos ELISA.
El inmunoensayo puede ser de formato heterogéneo u homogéneo, y de tipo estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido (proteína Rep o anticuerpo anti-Rep) está típicamente unido a una matriz sólida o soporte o portador para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Algunos ejemplos de soportes sólidos que pueden utilizarse son la nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillos de microtitulación), el cloruro de polivinilo (por ejemplo, en láminas o pocillos de microtitulación), el látex de poliestireno (por ejemplo, en perlas o placas de microtitulación, el fluoruro de polivinilidina (conocido como Immunolon), el papel diazotizado, las membranas de nailon, las perlas activadas y las perlas de proteína A. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos suele lavarse después de separarlo de la muestra de ensayo y antes de la detección de los anticuerpos anti-Rep unidos. Los formatos estándar y competitivo son conocidos en la técnica.
En un formato homogéneo, la muestra de ensayo se incuba con la proteína Rep en solución. Por ejemplo, puede hacerse en condiciones que precipiten cualquier complejo Rep proteína-anticuerpo que se forme. Ambos formatos estándar y competitivo para estos ensayos son conocidos en el arte.
En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos anti-Rep en los complejos anticuerpo-proteína Rep se monitoriza directamente. Esto puede lograrse determinando si los anticuerpos antixenogénicos (marcados) (por ejemplo, antihumanos) que reconocen un epítopo en los anticuerpos anti-Rep se unirán debido a la formación del complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos anti-Rep en la muestra se deduce monitorizando el efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando competidor) en el complejo.
Los complejos formados que comprenden anticuerpo anti-Rep (o en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo competidor) se detectan por cualquiera de una serie de técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Rep no marcados en el complejo pueden detectarse usando un conjugado de Ig anti-xenogénica complejado con una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta enzimática, como, por ejemplo, HRP).
En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre la proteína Rep y el anticuerpo anti-Rep forma una red que precipita de la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no hay anticuerpo anti-Rep presente en la muestra, no se forma precipitado visible.
La fase sólida seleccionada puede incluir perlas poliméricas o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, micropocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo y perlas magnéticas. El compuesto generador de señales puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radiactivo y un compuesto quimioluminiscente. Algunos ejemplos de enzimas son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la beta-galactosidasa. Algunos ejemplos de compuestos potenciadores son la biotina, la antibiotina y la avidina. Los ejemplos de miembros de unión de compuestos potenciadores incluyen biotina, antibiotina y avidina.
En otras realizaciones, la invención proporciona métodos en los que una cantidad aumentada de proteína Rep en una muestra se correlaciona con un diagnóstico o predisposición de EM.
En tales realizaciones la proteína Rep en la muestra es detectada por anticuerpos anti-Rep.
Tales métodos comprenden los pasos de
(a) detectar la cantidad de proteína Rep en una muestra de un sujeto mediante anticuerpos anti-Rep; y
(b) correlacionar la cantidad de proteína Rep detectada en la muestra de un sujeto en el paso (a) en comparación con una cantidad en una muestra de control con un diagnóstico de EM.
Los ejemplos de ensayos que pueden usarse en tales métodos para la detección de proteína Rep en muestras de suero o plasma incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, transferencia de puntos y Western Blot.
Por ejemplo, una muestra de suero puede incubarse con anticuerpos contra la proteína Rep para capturar la proteína Rep en la muestra, seguido de un paso de inmunoprecipitación de la proteína Rep y, a continuación, un paso de detección por SDS-PAGE y Western Blot.
En otro ejemplo, una membrana dot blot puede incubarse con suero, seguido de la etapa de SDS-PAGE y Western Blot.
En otro ejemplo, diluciones de suero de la muestra se cargan en SDS-Page seguido de Western Blot.
En otras realizaciones, la proteína Rep se detecta en muestras de tejido mediante métodos inmunohistoquímicos o microscopía de inmunofluorescencia.
En ciertas realizaciones se utilizan anticuerpos anti-Rep para la detección o captura de la proteína Rep en la muestra.
El término "anticuerpo", preferiblemente, se refiere a anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpos policlonales agrupados con diferentes especificidades epitópicas, así como distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de anticuerpos (como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) capaces de unirse específicamente a la proteína Rep. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener una unión tisular menos inespecífica que un anticuerpo intacto. Por lo tanto, se prefieren estos fragmentos, así como los productos de una biblioteca de expresión de FAB u otras inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos útiles para los fines de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena única, multifuncionales (por ejemplo, biespecíficos) y humanizados o anticuerpos humanos.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este está acoplado a un compuesto generador de señal, por ejemplo, lleva una etiqueta detectable. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser directa o indirectamente marcado detectablemente, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscentes, un quelante metálico o una enzima. Los expertos en la materia conocerán otras etiquetas adecuadas para unirse al anticuerpo o podrán determinarlas mediante experimentación rutinaria.
Los anticuerpos anti-Rep son, preferiblemente, criados (generados) contra una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1 o un fragmento de esta por métodos bien conocidos por los expertos en la materia.
En ciertas realizaciones, se usan anticuerpos anti-Rep en los métodos de la invención que son capaces de unirse a varios o todos los tipos de proteínas Rep del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (anticuerpo Rep anti-Pequeña Esfinge o anti-SSLRep anticuerpo). Dicho anticuerpo anti-SSLRep se une a un epítopo dentro de la región N-terminal conservada de la proteína Rep de los aminoácidos 1 a 229 de NO. ID. sEc. :1. En realizaciones particulares se utilizan anticuerpos anti-Rep del tipo anti-SSLRep que se unen a un epítopo dentro de NO. ID. SEC. :2 (aminoácidos 32-49 de NO. ID. SEC. :1) o NO. ID. SEC. :3 (aminoácidos 197-216 de NO. ID. SEC. :1). Los fragmentos peptídicos de NO. ID. SeC. :2 y NO. ID. SeC. :3 están altamente conservados entre las proteínas Rep del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña y parecen estar expuestos debido a su carácter hidrofílico. Los anticuerpos anti-Rep del tipo anti-SSLRep pueden producirse mediante inmunización, por ejemplo de ratones o cobaya, por péptidos que consisten esencialmente en las secuencias de aminoácidos como se representa en NO. ID. SEC. s:2 o 3; o por otros fragmentos inmunogénicos, preferiblemente que comprenden al menos 8-15 aminoácidos, derivados de la región conservada N-terminal de la proteína Rep de los aminoácidos 1 a 229 de NO. ID. SEC. :1.
Se utilizan anticuerpos anti-Rep específicos para la proteína Rep MSBI1. Dichos anticuerpos pueden producirse, por ejemplo, mediante inmunización de un mamífero, como ratones o cobayas, con una proteína Rep de longitud completa que tenga la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1.
Los métodos de la invención utilizan anticuerpos anti-Rep que son capaces de detectar la proteína Rep hasta rangos de picogramo a femtogramo en diferentes tipos de líquidos corporales como, por ejemplo, sangre, suero, líquido cefalorraquídeo o líquido cerebral.
En los métodos de la invención puede utilizarse un tipo específico de anticuerpo anti-Rep o un conjunto de dos o más tipos diferentes de anticuerpos anti-Rep. Si se usa un conjunto de diferentes tipos de anticuerpos anti-Rep, el conjunto de anticuerpos anti-Rep puede comprender diferentes anticuerpos anti-Rep que se unen a diferentes epítopos dentro de diferentes dominios de la proteína Rep, por ejemplo, primer dominio de unión al ADN (por ejemplo, aa 1-136 de NO. ID. SEC. :1), segundo dominio de unión al AdN (por ejemplo, aa 137-229 de nO. ID. SEC. :2) y/o dominio variable (por ejemplo, aa 230-324 de NO. ID. SEC. :1), en particular, de la proteína Rep MSBI1 (NO. ID. SEC. :1).
En otra realización, los anticuerpos anti-Rep se utilizan para el cribado de sondas de pacientes y/o individuos sanos para una proteína Rep. La detección selectiva de una proteína Rep en tejidos de pacientes, por ejemplo, de una enfermedad neurodegenerativa, es indicativa de una causalidad entre el genoma de ADN aislado de la proteína Rep detectada en la muestra y la enfermedad del paciente del que procede la muestra.
Para la detección de una proteína Rep mediante anticuerpos anti-Rep pueden aplicarse métodos como, por ejemplo, Western Blot, microscopía de inmunofluorescencia o métodos inmunohistoquímicos.
En determinadas realizaciones, se utilizan anticuerpos anti-Rep capaces de detectar una proteína Rep en determinadas localizaciones celulares. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Rep puede detectar la proteína Rep en el citoplasma, la membrana nuclear y el núcleo o detectar motas en el citoplasma. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de tales grupos de anticuerpos anti-Rep:
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Los anticuerpos anti-Rep del grupo A tienen un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos representada en NO. ID. SeC. :3 (aa 198-217 de NO. ID. SEC. :1) y son capaces de detectar MSBI1 Rep y proteínas Rep que comprenden este epítopo conservado del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (por ejemplo, MSBI2, CMI1, cMI4). En ensayos de inmunofluorescencia tales anticuerpos anti-Rep detectan un patrón específico de localización de Rep, en el que la localización principal está homogéneamente distribuida sobre el citoplasma y la membrana nuclear; y una localización adicional débil y homogéneamente distribuida se observa en el núcleo. Un ejemplo de dicho anticuerpo del grupo A es el anticuerpo AB01 523-1-1 (DSM ACC3327) que se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo A.
Los anticuerpos anti-Rep del grupo B tienen un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos representada en NO. ID. SEC. :2 (aa 33-50 de NO. ID. SEC. :1) y son capaces de detectar MSBI1 Rep y proteínas Rep que comprenden este epítopo conservado del grupo del Genoma de la Esfinge Pequeña (por ejemplo, MSBI2, CMI1, CMI4). En ensayos de inmunofluorescencia tales anticuerpos anti-Rep detectan específicamente motas (agregaciones citoplasmáticas) de la proteína Rep (a menudo en la periferia de la membrana nuclear). Un ejemplo de tal anticuerpo del grupo B es el anticuerpo designado como AB02304-4-1 (DSM ACC3328) que se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo B.
Los anticuerpos anti-Rep del grupo C detectan específicamente un epítopo estructural de MSBI1 (NO. ID. SEC. :1). En ensayos de inmunofluorescencia, tales anticuerpos anti-Rep detectan un patrón de localización específico de Rep, en el que la localización principal se distribuye homogéneamente por el citoplasma y la membrana nuclear; y se observa una localización adicional débil y homogéneamente distribuida en el núcleo. Un ejemplo de tal anticuerpo del grupo C es el anticuerpo MSBI1 381-6-2 (DSM ACC3329) que se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo C.
Los anticuerpos anti-Rep del grupo D detectan específicamente un epítopo estructural de MSBI1 (NO. ID. SEC. :1), donde el anticuerpo MSBI1 961-2-2 designado como "D1" detecta un epítopo representado en NO. ID. sEc. :9 (aa 281-287) en el dominio C-terminal de MSBI1. El anticuerpo MSBI1 761-5-1 (DSM ACC3328) designado como "D2" detecta un epítopo estructural 3D de MSBI1 que es exclusivamente accesible en condiciones in vivo y no es accesible en Western Blots. En los ensayos de inmunofluorescencia, estos anticuerpos anti-Rep detectan específicamente motas (agregaciones citoplasmáticas) de la proteína Rep (a menudo en la periferia de la membrana nuclear.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-Rep de los grupos A, B, C o D; o una combinación de anticuerpos anti-Rep de al menos dos grupos diferentes A, B, C o D se utilizan para determinar el tipo de localización de la proteína Rep en una sonda y si dicha localización de la proteína Rep se correlaciona con una función patógena. Por ejemplo, si hay motas presentes. En ciertas realizaciones, es decir, métodos o kits de la invención, al menos un anticuerpo anti-Rep seleccionado de los grupos A y B se combina con al menos un anticuerpo anti-Rep seleccionado de los grupos C y D. En realizaciones particulares, es decir, métodos o kits de la invención, un anticuerpo anti-Rep del grupo A se combina con al menos otro anticuerpo anti-Rep seleccionado de los grupos B, C y D. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Rep del grupo A puede combinarse con otros anticuerpos anti-Rep de los grupos C y D. Tales combinaciones de anticuerpos anti-Rep de diferentes grupos aumentan la distinción de la evaluación diagnóstica, en particular para el diagnóstico de EM. Se prefieren estos anticuerpos de los grupos A, B, C o D para su uso en el diagnóstico de la EM.
Los siguientes anticuerpos se depositaron en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares] el 28 de septiembre de 2017:
anticuerpo AB01 523-1-1 bajo DSM ACC3327;
anticuerpo AB02304-4-1 bajo DSM ACC3328;
anticuerpo MSBI1 381-6-2 bajo DSM ACC3329; y
anticuerpo MSBI1 761-5-1 bajo DSM ACC3330.
El anticuerpo MSBI1 961-2-2 ha sido depositado bajo DSM ACC3331 en DSMZ el 6 de octubre de 2017.
En otras realizaciones, se proporciona un kit para su uso en el diagnóstico de la EM. El kit puede comprender material para detectar anticuerpos anti-Rep y/o proteína Rep junto con instrucciones para el uso de los materiales en ensayos para el diagnóstico de eM. El kit puede comprender uno o más de los siguientes componentes: un biomarcador según la invención, es decir, proteína Rep y anticuerpos anti-Rep, por ejemplo, anticuerpos de la Tabla 1, respectivamente; un compuesto generador de señal, una matriz sólida para fijar un agente de captura, un diluyente para las muestras, un tampón de lavado. El compuesto generador de señal se refiere a una etiqueta detectable que está acoplada a un agente de unión adicional capaz de unirse al biomarcador de la invención o directamente acoplada al biomarcador de la invención.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, aunque sin limitarse a ellos:
Ejemplo 1:
Purificación de la proteína MSBI1 Rep
Una molécula de ácido nucleótido que codifica el marco de lectura abierto (ORF) Rep de longitud completa identificado dentro del genoma MSBI1 se clona en un plásmido de expresión (pEXP5-CT, Invitrogen) que permite la expresión de proteínas basada en un sistema de traducción in vitro sin células de alto rendimiento de E. coli (ExpresswayTM Cell-Free E. coli Expression System, Invitrogen). La proteína Rep sintetizada que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1 dentro de la reacción de traducción in vitro se desnaturaliza añadiendo 20 volúmenes de reacción de tampón de muestra de urea 8 M pH 8,0 que contiene 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 5 mM imidazol. Posteriormente, la proteína Rep se purifica en condiciones desnaturalizantes (20 mM de imidazol para el lavado y 300 mM de imidazol para la elución de la proteína) a partir de una etiqueta His6 C-terminal fusionada a la proteína Rep. La calidad de la purificación se determina mediante tinción de proteínas de Coomassie y Western Blotting con anticuerpos antiproteína Rep. La pureza de la proteína Rep se calcula densitométricamente y es superior al 95%. La proteína purificada se utiliza directamente para el cribado de suero basado en ELISA o se somete a SDS-Page seguido de transferencia a membranas de nitrocelulosa para la incubación en suero de tiras de membrana de proteína Rep resueltas en tamaño 1D.
Ejemplo 2:
Generación de placas maestras de suero
Las muestras de suero se alicuotan primero para reducir los ciclos de congelación-descongelación de las muestras. A continuación, se establece una placa maestra generando una dilución 1:1 de suero en PBS pH 7,2 estabilizado con una concentración final de azida sódica al 0,02% (p/v) en una placa de 96 pocillos en forma de U. Esta placa es estable durante al menos 2 meses si se almacena a 4 °C y se manipula en condiciones estériles. Esta placa es estable durante al menos 2 meses si se almacena a 4 °C y se manipula en condiciones estériles, y se utiliza como plantilla para una dilución adicional del suero (dilución final 1:20) antes del experimento de cribado individual.
Ejemplo 3:
Cribado mediante incubación con suero de tiras de membrana de proteína Rep resueltas en tamaño 1D
Para los ensayos de cribado basados en la incubación de tiras de membrana de proteína Rep resueltas en 1D con suero, se cargan 20 |jg de proteína Rep purificada en geles prefabricados Tru-PAGE 4-20% de Sigma. Las paredes que separan los bolsillos del gel se eliminan antes de cargar el gel para producir un bolsillo grande y un único bolsillo para un marcador de tamaño. Después del SDS-PAGE resuelto en tamaño 1D, la proteína se transfiere a membranas de nitrocelulosa utilizando un protocolo estándar de transferencia de blot húmedo/en tanque. Después, la proteína en la membrana de blot (esencialmente una banda de proteína Rep de longitud completa a una altura de aproximadamente 40 kDa) se visualiza con PonceauS para comprobar la calidad de la transferencia y preparar el corte de tiras de membrana de 2 mm de anchura y la altura de la membrana completa resuelta en tamaño 1D. A continuación, las tiras se bloquean 1 h con cada 500 j l de reactivo de bloqueo sin suero (Genetex Trident universal blocking reagent).
A continuación, se caracteriza el suero a partir de dos diluciones de suero diferentes. La incubación del suero se realiza durante 14 h (toda la noche) a 4 °C en un dispositivo de agitación lineal.
A continuación, las tiras de membrana se lavan con PBS-T pH7,2 0,1% Tween-20 durante 3x5 min a temperatura ambiente. La detección de IgG humanas unidas específicamente a Rep dentro de los sueros se realiza mediante incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG humana de cabra (H+L) acoplado a HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS-T pH7,20,1% Tween-20 durante 3x5 min a temperatura ambiente, las bandas de cada incubación de suero individual se fijan con cinta adhesiva en una lámina de plástico.
A continuación, la lámina se incuba con sustrato ECL (Biorad Clarity) para visualizar las IgG humanas unidas en un sistema de detección WesternBlot de BioRad. Las señales correspondientes a la cantidad de IgGs que se unen específicamente a la banda Rep de la membrana proteica se cuantifican por densitometría.
En la Figura 1 se muestra un ejemplo de un resultado de bandas de membrana de proteína Rep resueltas en tamaño 1D y en la Tabla 2 se muestra la cuantificación de muestras de suero/plasma seropositivas: Casi el 50% de las muestras de suero dieron señales muy fuertes para ambas diluciones (1:500 y 1:2000) y sólo 3 de 21 fueron totalmente negativas. De los controles de plasma, 7 muestras dieron señales intermedias a la dilución 1:500 (alguna adicional con señales muy bajas) mientras que a la dilución 1:2000 sólo 3 muestras dieron una señal muy débil, mientras que todas las demás fueron seronegativas. Todas las cuantificaciones sostienen la tendencia de que las intensidades MS-suero muestran al menos un exceso de señal de 30 veces cuando se comparan con las intensidades del plasma de control.
Tabla 2: Cuantificación de muestras de suero/plasma seropositivas.
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Los sueros/plasma con detección de IgG humanas específicas de Rep se contaron según la intensidad de la señal para la dilución de suero/plasma de 1:500 y 1:2000 para el grupo de suero de EM y el grupo de plasma de control sano (cada uno 21 en total). Casi el 50% de las muestras de suero dieron señales muy fuertes para ambas diluciones (1:500 y 1:2000) y sólo 3 de 21 fueron totalmente negativas. De los controles de plasma,7 muestras dieron señales intermedias en la dilución 1:500 (alguna adicional con señales muy bajas) mientras que en la dilución 1:2000 sólo 3 muestras dieron una señal muy débil, mientras que todas las demás fueron seronegativas. Todas las cuantificaciones sostienen la tendencia de que las intensidades de MS-suero muestran al menos un exceso de señal de 30 veces cuando se comparan con las intensidades de plasma de control.
Ejemplo 4:
Detección de suero por ELISA
Se añade una cantidad apropiada de proteína Rep purificada (normalmente entre 50 y 200 ng por pocillo) a una mezcla 1:1 de urea 8 M pH 8,0 y PBS pH 7,2 predispuesta en una placa ELISA Maxisorp de 96 pocillos (Fisher Scientific). Se deja que la proteína se una a la matriz de la placa durante 14 h a 4°C en un dispositivo de agitación lineal. A continuación se lava la placa con PBS-T pH 7,2 0,1% Tween-20 durante 3x5 min a temperatura ambiente, seguido de bloqueo durante al menos 14 h a 4°C con PBS pH 7,2 1%(p/v) BSA conteniendo finalmente 0,02% de azida sódica. Después se añade el suero a una dilución de 1:500 y se incuba durante 6 h a temperatura ambiente. A continuación, se lava la placa con PBS-T pH 7,20,1% Tween-20 durante 3x5 min a temperatura ambiente. La detección de IgG humanas unidas específicamente a Rep en los sueros se realiza mediante incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG humana de cabra (H+L) acoplado a HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS-T pH 7,20,1% Tween-20 durante 3x5 min a temperatura ambiente, se añaden 100 pl de solución de sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, sensible a la HRP) por pocillo y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. La reacción se detiene añadiendo 100 pl de ácido acético 8M/ácido sulfúrico 1M. La intensidad de la señal se cuantifica en un dispositivo Perkin Elmer compatible con ELISA midiendo la absorbancia a 450 nm.
El resultado de un ejemplo de cuantificación de sero-respuestas Rep-específicas basadas en el cribado ELISA se muestra en la Figura 2: La cuantificación revela una buena correlación entre la intensidad de la señal y la cantidad de proteína Rep (antígeno). Por término medio, los niveles de intensidad de la señal del grupo de EM superan las intensidades del grupo de control en al menos un factor de 1,9. En general, el cribado de suero basado en ELISA reveló anticuerpos detectables en suero para al menos una dilución de suero de 1:1000 (datos no mostrados), por lo que es probable que el título para este experimento sea mayor de 1:1000 en la región de 1:2000-1:4000 o incluso mayor después de la optimización de la plataforma.
Ejemplo 5:
Análisis de inmunofluorescencia
Las células HEK293TT (125. 000/pocillo) se cultivaron durante 24 h en cámaras de inmunofluorescencia de 8 pocilios en DMEM 10% FCS (suplementado con 1* Glutamax (Gibco) y 1* aminoácidos no aminoácidos esenciales (Gibco)) seguido de transfección de ADN con polietilenimina (PEI) del plásmido de control ZsGreenlCI (Clontech) que expresa la proteína marcadora de autofluorescencia ZsGreen o el mismo plásmido con el ORF de MSBI1 Rep completo en el extremo de 3 primos que codifica una proteína de fusión ZsGreen-Rep. 48 horas después de la transfección del ADN, las células se lavaron con PBS, se fijaron durante 20 min a Rt con PFA al 4% en PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 10 min a RT en un dispositivo de agitación. Las células se lavaron con PBS y se bloquearon con PBS 1% BSA durante 45 minutos a temperatura ambiente. La incubación con los anticuerpos monoclonales de ratón anti-Rep (c.f. Tabla 1) se realizó durante 1 h a 37 °C en PBS 1% BSA con diluciones de anticuerpo 1:500 (se incluyeron controles sin anticuerpos primarios). Las células se lavaron tres veces con PBS seguido de incubación con PBS 1% BSA durante 15 min a RT. A continuación, se realizó la incubación con el anticuerpo secundario (AlexaFluor546 anti­ ratón de cabra, 1:500; marcador de ADN Hoechst 33342, 1:5.000) durante 45 min a RT en PBS 1% BSA. Las células se lavaron tres veces con PBS 1% BSA y tres veces con PBS antes de montarlas con cubreobjetos (medio de montaje Dako). Se tomaron imágenes de inmunofluorescencia en un Zeiss Cell Observer (objetivo de 20 aumentos, tiempo de exposición fijo para la muestra y los cubitos de control).
Las imágenes de inmunofluorescencia (Fig. 4) muestran que el tratamiento con anticuerpos de los grupos A y C conduce a la detección específica de proteína diana localizada en citoplasma membrana nuclear (+núcleo) sin detección de agregados. Por el contrario, los anticuerpos de los grupos B y D muestran colocalización específica con la proteína moteada y niveles nulos o débiles de señales citoplasmáticas. La incubación de control de los anticuerpos sobre la proteína de fusión ZsGreen sola no dio lugar a la detección de señales significativas (mismos tiempos de exposición utilizados para la visualización de las señales de los anticuerpos).
Ejemplo 6:
Análisis de inmunofluorescencia
Las células HEK293TT (125. 000/pocillo) se cultivaron durante 24 h en cámaras de inmunofluorescencia de 8 pocillos en DMEM 10% FCS (suplementado con 1* Glutamax (Gibco) y 1* aminoácidos no aminoácidos esenciales (Gibco)) seguido de la transfección de ADN con polietilenimina (PEI) del plásmido de control ZsGreenlCI (Clontech) que expresa la proteína marcadora de autofluorescencia ZsGreen o el mismo plásmido con el ORF de CMI1 Rep completo en el extremo de 3 primos que codifica una proteína de fusión ZsGreen-Rep. 48 horas después de la transfección del ADN, las células se lavaron con p Bs , se fijaron durante 20 min a Rt con PFA al 4% en PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 10 min a RT en un dispositivo de agitación. Las células se lavaron con PBS y se bloquearon con PBS 1% BSA durante 45 minutos a temperatura ambiente. La incubación con los anticuerpos monoclonales de ratón anti-Rep (Tabla 1) se realizó durante 1 h a 37 °C en PBS 1% BSA con diluciones de anticuerpo 1:500 (se incluyeron controles sin anticuerpos primarios). Las células se lavaron tres veces con PBS seguido de incubación con PBS 1% BSA durante 15 min a RT. A continuación, se realizó la incubación con el anticuerpo secundario (AlexaFluor546 anti­ ratón de cabra, 1:500; marcador de ADN Hoechst 33342, 1:5.000) durante 45 min a RT en PBS 1% BSA. Las células se lavaron tres veces con PBS 1% BSA y tres veces con PBS antes de montarlas con cubreobjetos (medio de montaje Dako). Las imágenes de inmunofluorescencia se tomaron en un Zeiss Cell Observer (objetivo 20x, tiempo de exposición fijo para la muestra y los dobletes de control).
Las imágenes de inmunofluorescencia (Fig. 5) muestran que mientras el anticuerpo del grupo A detecta específicamente proteína diana localizada en citoplasma membrana nuclear (+núcleo) sin detección de agregados, el anticuerpo del grupo B detecta proteína diana moteada con un fondo mínimo de proteína diana localizada en citoplasma. Los anticuerpos específicos de MSBI1 de los grupos C y D no conducen a la detección específica de señales. Ambos anticuerpos D1 y D2 pertenecen al grupo "D" pero tienen un reconocimiento del epítopo ligeramente diferente.
Ejemplo 7:
Análisis de inmunofluorescencia
Se cultivaron células HEK293TT (125.000/pocillo) durante 24 h en cámaras de inmunofluorescencia de 8 pocillos en DMEM FCS al 10 % (suplementado con 1 * Glutamax (Gibco) y 1 * aminoácidos no esenciales (Gibco)) seguido de transfección de ADN con polietilenimina (PEI) del plásmido de control pcDNA3.1(-) (Invitrogen) o del mismo plásmido que expresa una variante con codon optimizado del ORF completo de MSBI1 Rep (SEQ ID. No.: 13). 48 horas después de la transfección de ADN, las células se lavaron con PBS, se fijaron durante 20 min a TA con PBS al 4 % de PFA a TA y se permeabilizaron con PBS al 0,5 % Triton X-100 durante 10 min a TA en un dispositivo de agitación. Las células se lavaron con PBS y el bloqueo se realizó con PBS BSA al 1 % durante 45 min a temperatura ambiente. La incubación con los anticuerpos anti-Rep monoclonales de ratón (Tabla 1) se realizó durante 1 h a 37 °C en PBS 1% BSA con diluciones de anticuerpos 1:500 (se incluyeron controles que carecían de anticuerpos primarios). Las células se lavaron tres veces con PBS seguido de incubación con p Bs BSA al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente. Luego, se realizó la incubación con el anticuerpo secundario (anti-ratón de cabra AlexaFluor488, 1:500; marcador de ADN Hoechst 33342, 1:5.000) durante 45 min a TA en PBS 1% BSA. Las células se lavaron tres veces con PBS 1% BSA y tres veces con PBS antes del montaje con cubreobjetos (medio de montaje Dako). Las imágenes de inmunofluorescencia se tomaron en un Zeiss Cell Observer (objetivo 20x, tiempo de exposición fijo para los dobletes de muestra y control).
Las imágenes de inmunofluorescencia (Fig. 6) muestran que el tratamiento de anticuerpos con anticuerpos del grupo A y C conduce a la detección específica de proteína diana localizada en citoplasma membrana nuclear (+núcleo) sin detección de agregados. Por el contrario, los anticuerpos del grupo B y D muestran colocalización específica con proteína moteada y niveles de señales citoplasmáticas nulos o débiles. La incubación de control de los anticuerpos en la proteína de fusión ZsGreen sola no dio como resultado una detección de señal significativa (los mismos tiempos de exposición utilizados para la visualización de las señales del anticuerpo).
Ejemplo 8:
Análisis Western Blot
Se cultivaron HEK293TT (1,5 Mio/6 pocillos) durante 24 h en placas de cultivo celular de 6 pocillos en DMEM 10% FCS (suplementado con 1* Glutamax (Gibco) y 1* aminoácidos no esenciales (Gibco)) seguido de transfección de ADN con polietilenimina (PEI) de plásmidos ZsGreenlCI que codifican para la sobreexpresión de la proteína MSBI1 de longitud completa, CMI1 o MSBI2 Rep como proteína de fusión con una etiqueta N-terminal ZsGreen. 48 horas después de la transfección del ADN, las células se lavaron con PBS, se separaron por tripsinación, se lavaron de nuevo con PBS y se lisaron en tampón SDS-PAGE Lammli (hervir durante 5 min a 98 °C). Las muestras se cargaron en geles de SDS-PAGE prefabricados al 12,5% con un bolsillo grande. Después del transferblot, se cortaron dos franjas de la membrana para incubarlas individualmente con los diferentes anticuerpos monoclonales de ratón de la Tabla 1 (dilución 1:1000 en PBS 5% leche desnatada) después de bloquearlas con PBS 5% leche desnatada. Las tiras se lavaron tres veces con PBS 0,1% Tween20 y se incubaron con el anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a HRP permitiendo el análisis Westernblot de los anticuerpos que detectan las diferentes proteínas de fusión ZsGreen-Rep en un dispositivo Biorad ChemiDoc. La detección del control positivo se realizó a partir de la incubación con un anticuerpo ZsGreen (OriGene, 1:2000)
La Fig. 7 muestra que mientras los anticuerpos de los grupos A y B detectan específicamente las tres proteínas de fusión Rep, incluyendo las proteínas de fusión Rep CMI1 y MSBI2 además de la proteína de fusión Rep MSBI1, los anticuerpos específicos MSBI1 de los grupos C y D detectan exclusivamente la proteína de fusión Rep MSBI1. El anticuerpo D2 es WB-negativo muy probablemente debido a la detección de un epítopo de estructura 3D, que no prevalece en condiciones de desnaturalización en SDS-PAGE y no se analizó aquí.
RESUMEN DE SECUENCIA
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 REFERENCIAS:
Funk, M., et al. (2014). "Isolation of protein-associated circular DNA from healthy cattle serum". Genome Announc 2(4)
Giraldo, R., et al. (2011). "RepA-WH1 prionoid: a synthetic amyloid proteinopathy in a minimalist host." Prion 5(2):60-64
Gunst, K., et al. (2014). "Isolation of bacterial plasmid-related replication-associated cirular DNA from a serum sample of a multiple sclerosis patient." Genome Announc 2(4).
Lamberto, I., et al. (2014). "Mycovirus-like DNA virus sequences from cattle serum and human brain and serum samples from multiple sclerosis patients." Genome Announc 2(4).
Manuelidis L., 2011. "Nuclease resistant circular DNAs co-purify with infectivity in scrapie and CJD". J. Neurovirol. 17:131-145.
Torreira, E., et al. (2015). "Amyloidogenesis of bacterial prionoid RepA-WH1 recaptiulates dimer to monomer transitions of RepA in DNA replication initiation." Structure 23(1):183-189
Whitley, C., et al. (2014). "Novel replication-competent cirulara DNA molecules from healthy cattle serum and milk and multiple sclerosis-affected human brain tissue." Genome Announc 2(4).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar la esclerosis múltiple (EM), en el que
(A) una cantidad al menos 2 veces mayor de una proteína asociada a la replicación del ADN (Rep) o fragmentos de la misma que tengan al menos 8 aminoácidos contiguos en una muestra de un sujeto en comparación con una cantidad en una muestra de control; o bien
(B) una cantidad al menos 2 veces mayor de anticuerpos anti-Rep en una muestra de un sujeto en comparación con una cantidad en una muestra de control
se correlaciona con un diagnóstico de EM, en el que
— la proteína Rep comprende
(i) una secuencia de aminoácidos como la descrita en NO. ID. SEC. :1;
(ii) un fragmento de NO. ID. SEC. :1 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. 1; o
(iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que tenga una secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1, y
— la muestra es (a) una muestra líquida seleccionada entre suero, plasma o líquido cefalorraquídeo o (b) una muestra sólida seleccionada entre cultivos de tejidos o muestras de biopsia.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el fragmento de NO. ID. SEC. :1 comprende un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1 a 229 de NO. ID. SEC. :1.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que una cantidad aumentada de proteína Rep o fragmentos de esta o anticuerpos anti-Rep de al menos 5 veces en comparación con una muestra de control indica EM.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína Rep está codificada por un ácido polinucleótido como se representa en NO. ID. SEC. :13.
5. Un anticuerpo anti-Rep seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo DSM ACC3327 (AB01 523-1-1), el anticuerpo DSM ACC3328 (AB02 304-4-1), el anticuerpo DSM ACCC3329 (MSBI1 381-6-2), el anticuerpo DSM ACC 3330 (MSBI761-5-1) y el anticuerpo DSM ACC 3331 (MSBI1 961-2-2).
6. Uso de un anticuerpo anti-Rep de la reivindicación 5 en un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Un método para diagnosticar EM en un sujeto que comprende los pasos de
(a) incubar una muestra seleccionada de una muestra de suero o plasma obtenida de un sujeto con proteína Rep como se define en la reivindicación 1;
(b) detectar la cantidad de anticuerpos en la muestra del sujeto que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep; y
(c) correlacionar una cantidad al menos 2 veces mayor de anticuerpos unidos a la proteína Rep en la muestra del sujeto, en comparación con una cantidad en una muestra de control, con un diagnóstico de EM.
8. El método de la reivindicación 7, en el que en el paso (a) se inmoviliza la proteína Rep y a continuación se incuba la proteína Rep inmovilizada con la muestra del sujeto.
9. El método de la reivindicación 7, en el que en el paso (a) la proteína Rep se expresa en células seguido de la incubación de las células con la muestra del sujeto.
10. El método de la reivindicación 8 o 9, en el que en el paso (b) la cantidad de anticuerpos que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep se cuantifica mediante un agente de unión detector acoplado a un compuesto generador de señales.
11. El método de la reivindicación 7, en el que en el paso (a) los anticuerpos de la muestra del sujeto se inmovilizan seguidos de incubación con una cantidad definida de proteína Rep.
12. Un método de diagnóstico de EM en un paciente que comprende los pasos de
(a) detectar la cantidad de proteína Rep en una muestra seleccionada de una muestra de suero, plasma o tejido de un sujeto mediante anticuerpos anti-Rep que se unen a un epítopo comprendido por NO. ID. SEC. :2 o NO. ID. SEC. :3, y
(b) correlacionar una cantidad al menos 2 veces mayor de proteína Rep detectada en la muestra de un sujeto en el paso (a) en comparación con una cantidad en una muestra de control con un diagnóstico de EM.
13. El método de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo específico para la proteína Rep se une a un epítopo que se encuentra dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos de 1 a 136, de 137 a 229 y de 230 a 324 de NO. ID. SEC. :1.
14. Un kit para uso en el diagnóstico de EM que comprende
(a) una proteína Rep, en la que la proteína Rep comprende:
(i) una secuencia de aminoácidos como se representa en NO. ID. SEC. :1;
(ii) un fragmento de NO. ID. SEC. :1 que es capaz de unir un anticuerpo anti-Rep con especificidad para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC.: 1; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y sea capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep con especificidad para una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC. :1,
(b) un anticuerpo antihumano acoplado a una etiqueta detectable seleccionada del grupo formado por el anticuerpo DSM ACC3327 (AB01 523-1-1), el anticuerpo DSM ACC3328 (AB02 304-4-1), el anticuerpo DSM ACCC3329 (MSBI1 381-6-2), el anticuerpo DSM ACC 3330 (MSBI761-5-1) y el anticuerpo DSM ACC 3331 (MSBI1 961-2-2), y
(c) una matriz sólida adecuada para inmovilizar una proteína Rep según (a) o anticuerpos anti-Rep con especificidad para una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de NO. ID. SEC.: 1 sospechada en una muestra de suero o plasma.
15. El kit según la reivindicación 14 para uso en un ensayo seleccionado del grupo que consiste en ensayo inmunoenzimático (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoenzimático (EIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayo de luminiscencia (LIA) y ensayo en tira.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3517960A1 (en) * 2018-01-30 2019-07-31 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of bmmf rep protein as biomarker for colon cancer
EP3653702A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-20 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Crystal structure of a replication protein encoded by a plasmid isolated from a multiple sclerosis patient
EP3699594A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-26 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for prostate cancer
CN113820382A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用
WO2023152327A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Diagnostic method for multiple sclerosis

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756302A (en) * 1996-07-16 1998-05-26 Pel-Freez Rabbit Meat, Inc. Human herpesvirus 6 detection assay
US6348344B1 (en) * 1997-09-02 2002-02-19 Insight Strategy & Marketing Ltd. Genetically modified cells and methods for expressing recombinant heparanase and methods of purifying same
US20060105419A1 (en) * 2004-08-16 2006-05-18 Biosite, Inc. Use of a glutathione peroxidase 1 as a marker in cardiovascular conditions
US20100167421A1 (en) * 2008-09-19 2010-07-01 University Of Utah Research Foundation Methods for identification and prediction of multiple sclerosis disease and therapy response
EP2868751A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-06 Deutsches Krebsforschungszentrum HCBI sequences as an early marker for the future development of cancer and diseases of the CNS and as a target for cancer treatment and prevention
EP2966176A1 (en) * 2014-07-10 2016-01-13 Deutsches Krebsforschungszentrum HCBI, MSBI, MSSI and CMI sequences as an early marker for the future development of cancer and diseases of the CNS and as a target for the treatment and prevention of these diseases
DE102014213512A1 (de) 2014-07-11 2016-01-14 Voith Patent Gmbh Maschine zur Herstellung einer Faserstoffbahn
EP3018478B1 (en) * 2014-11-04 2020-08-19 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG A novel diagnostically relevant autoantibody
EP3424942A1 (en) * 2017-07-07 2019-01-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Improved rep protein for use in a diagnostic assay

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RS64008B1 (sr) 2023-03-31
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