JP2012141175A - 癌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】癌の検出方法は、生体から分離された血液サンプル中のEB1を定量することを含み、EB1の高値が癌の存在を示す。
【効果】本発明により、非侵襲的にEB1を定量することを利用した癌の検出方法が初めて提供された。本発明の方法によれば、癌の検出を非侵襲的に行うことができるので、被検者の負担が少なく、複数回の検査も容易であり、疾患のスクリーニング及びモニタリングに好適に利用することができる。
【選択図】図1
Description
ヒト癌細胞よりクローニングしたEB1遺伝子から大腸菌を用いてEB1全長組換えタンパク質を合成した。この操作は具体的に次のようにして行った。
EB1遺伝子(配列番号1)は、ヒト癌細胞SW480から抽出した全RNAを用いて、RT-PCR法により単離した。すなわち、上記全RNAからoligo-dTプライマーによりcDNAを合成し、該cDNAを鋳型として、EB1-Fwd-1 5'-ttctcgagatggcagtgaacgtatac-3' (26 mer)(配列番号2)とEB1-Rev-804 5'-ggctcgagttaatactcttcttgctcctc-3' (30 mer)(配列番号3)をプライマーとして用いてPCRを行ない(94℃−15秒、55℃−30秒、68℃−1分を30サイクル、Pfx platinum DNAポリメラーゼ(インビトロジェン社)及び添付のバッファーを使用)、EB1 cDNAを増幅した。得られたEB1 cDNAにEx Taqを用いてPolyA付加を行い、pGEM-Teasy Vector System(Promega社)を用いてpGEM-Teasyベクター(Promega社)に挿入した。次に、EB1組換えタンパク質を作製するため、EB1遺伝子をN末端にGST配列を持つpWG6Aに組み換え、大腸菌BL21を用いてGST-EB1として組換えタンパク質を作製した。GST-EB1組換えタンパク質はグルタチオンセファロース4B(GEヘルスケア)カラムを用いて、電気泳動による単一のバンド(分子量約50 kDa)が得られるレベルにまで精製した。
抗EB1抗体産生細胞株EB1-105由来のモノクローナル抗体を固相に、ビオチン標識したEB1-126由来モノクロナール抗体(「Biotin標識EB1-126」と記載)を標識用いたELISAにより、大腸癌、膀胱癌及び膵臓癌患者並びに健常人の血清中のEB1を免疫測定した。この操作は以下のようにして行った。
NUNC社製ELISAプレート(POLYSORP) にEB1-105抗体を10μg/mlの濃度にPBSで希釈し、100μl/ウェルずつ入れ、4 ℃で一晩放置し吸着させた。次にブロッキング用スキムミルク(5%Skim milk、0.1% Tween20(商品名)、1% NaN3、0.15M NaCl in 0.05M PBS pH 7.4)を200μl/ウェル入れ、37℃で5時間放置しブロッキングを行った。
Biotin標識EB1-126は標識抗体希釈緩衝液(1% BSA、25μg/ml Mouse IgG(Mab)、0.15M NaCl、0.1% NaN3 in 0.05M Tris-HCl pH 7.4)で1μg/mlに調製し使用した。アルカリフォスファターゼ標識アビジン(DAKO社製)は1% BSA in PBS pH 7.4で2000倍希釈した。
スタンダードはEB1全長組換えタンパク質を20ng/mlから2n希釈して調製した。
1)で準備したELISAプレートをPBSで3回洗浄後、検体希釈緩衝液(5% CS、1% BSA、25μg/ml Mouse IgG(Mab)、0.15M NaCl、0.1% NaN3 in 0.05M PBS pH 7.4)で5倍希釈した血清、 及びスタンダードを100μlずつ各ウェルに入れ、37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で3回洗浄後、Biotin標識EB1-126を100μl/ウェル入れ、37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄し、3.7g/mlの基質PNPP溶液(WAKO社製)を100μl/ウェル入れ室温で2時間放置後、405nmの波長を測定した。
スタンダード曲線(通常直線)に測定値を当てはめ血清EB1値を算出した。
結果を図1に示す。図1に示されるように、各癌患者の血清中のEB1濃度は、健常人の血清中のEB1濃度よりも高かった。この結果から、本発明の方法により各種癌の検出が可能であることが明らかになった。
Claims (6)
- 生体から分離された血液サンプル中のEB1を定量することを含み、EB1の高値が癌の存在を示す、癌の検出方法。
- 前記癌が大腸癌、膀胱癌及び膵臓癌から成る群より選ばれる少なくとも1種である請求項1記載の方法。
- 前記血液サンプルが血清又は血漿サンプルである請求項1又は2記載の方法。
- 抗EB1抗体を用いた免疫測定によりEB1を定量する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗EB1抗体がモノクローナル抗体である請求項4記載の方法。
- 免疫測定がELISAである請求項4又は5記載の方法。
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