JP6276992B2

JP6276992B2 - 胸膜中皮腫患者の早期発見のための分子マーカー及びその発現解析方法

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Publication number: JP6276992B2
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Inventors: 聖柳澤; 隆高橋; 香平横井; 長谷川　好規; 好規長谷川; 健一郎小野; 香澄八木; 瞳増田; 俊幸竹内
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Description

本発明は、中皮腫の検査方法と、中皮腫の診断をするためのキットとに関する。具体的には、血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンの濃度を測定するステップを含む、中皮腫の検査方法と、ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を含む、中皮腫の診断をするためのキットとに関する。

中皮腫はアスベストの吸引により発生することが知られている。中皮腫は、発生箇所によって、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫及び心膜中皮腫に分類される。胸膜への発生が一番多く、中皮腫全体の８割ないし９割を占める（非特許文献１）。良性の胸膜中皮腫は、線維性中皮腫と称され、肺炎、外傷などの後に、胸膜に線維増生がおきた結果、限局性の腫瘤を形成するのに対し、悪性胸膜中皮腫は、胸膜中皮（肺を包む胸膜の肺側表面を覆う二重の膜）から発生する腫瘍で、悪性度の高い腫瘍である。悪性胸膜中皮腫は、外科療法、内科療法及び放射線療法を組み合わせた治療が行われるが、未だ予後の悪い腫瘍の１つに位置づけられる。中皮腫は、潜伏期間が非常に長いのが特徴であり、アスベストへの曝露から中皮腫発生までの期間は、１１〜５４年（中央値３８．６年）とされている。日本においてアスベストが最も多く使用された時期が１９７０〜９０年であることに鑑みて、２０３０年まで中皮腫患者は増え続けると予測されている。この長い潜伏期間は、早期発見に有用なスクリーニング法がない現状と相まって、発症の発見の遅れにつながっている。進行例の経過は極めて不良であり、早期に進展し、数年以内に亡くなる症例が大半である。しかしながら、治癒切除が可能であった早期発見例については、長期の生存が期待できる。そこで、早期発見を可能とする新規スクリーニング検査の開発が喫緊の課題となっている。

悪性胸膜中皮腫の早期診断は極めて困難であり、胸痛・胸水貯留による呼吸困難などの自覚症状を契機に発見された時には、すでに進行期である場合がほとんどである。悪性胸膜中皮腫の診断の際に有用とされるマーカーとしては、胸水中のヒアルロン酸、ＣＹＦＲＡ、ＣＥＡ等が挙げられるが、試料として胸水の採取が必要である点、診断精度が低い点等大きな問題点を有している。さらに、確実な診断を行うためには、生検材料を用いて的確な病理組織診断を行う必要性があり、精神的・肉体的・社会的負担は極めて大きい。また、悪性胸膜中皮腫は、組織型として、上皮型、肉腫型、その混合型（二相型）に分けられるが、特に肉腫型は有効な診断方法がなく、予後は劣悪である。そのため、悪性中皮腫として診断されたときには、すでに広範囲に進展し、根治手術が不可能であることが多く、予後はきわめて不良で、１年生存率が５０％程度、２年生存率が２０％程度とされている。

アスベスト曝露により非腫瘍性炎症性の障害が肺・胸膜に生じるため、アスベスト曝露者では、中皮腫未発症の段階で既にレントゲン異常が認められる。そこで、レントゲン検査はスクリーニングとして有用性が低いと考えられている。また曝露者の数に対して実際に発症する症例の割合は小さい。アスベスト曝露者にとって簡便かつ安価で信頼性の高い検査方法が渇望されているのが現状である。

まず、本発明者らは、血中の腫瘍マーカーとしてのメソテリン陽性例が、上皮型の中皮腫に限定されていることに着目し、肉腫型の胸膜中皮腫例についても陽性例が認められうる、マーカーの探索を試みた。肉腫型胸膜中皮腫の診断は、細胞診、胸膜生検、画像診断が必要と提唱されており、きわめて診断が困難である（非特許文献２）。本発明者らは、質量分析装置を利用したＩＤＡ（ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ）、データベースを駆使したバイオインフォマティクス解析、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現との比較、モチーフ検索によるタンパク質機能予測、内部標準資料との比較による定量化などの工程を通じて、胸膜中皮腫組織試料中のタンパク質発現プロファイルを、プロテオーム解析結果のマイニング技術を応用して解析することにより、数百種類のタンパク質に関する発現情報の取得を試み、これに成功した。

さらに血液中のマーカーとしての候補絞込み検討を進めるため、血液を対象としたプロテオミクス解析：質量分析装置を利用したＭＲＭ（ＭｕｌｔｉｐｌｅＲｅａｃｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を行った。そして、前記数百種類のタンパク質のうちの特に数十種のタンパク質については、対照の正常胸膜中皮組織試料と比較して、悪性胸膜中皮腫組織試料ではその存在量が増大していることを確認した。さらに、悪性胸膜中皮腫症例血液試料では、対照の中皮腫以外の呼吸器疾患症例と比較して、ペリオスチンの濃度が上昇していることを確認した。

ペリオスチンは当初、骨芽細胞特異的因子−2（ＯＳＦ−2）と呼ばれ、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定された分子である（非特許文献３）。ペリオスチン遺伝子がコードするアミノ酸配列には、一般的なシグナル配列と、システインリッチドメインと、約１５０個のアミノ酸からなるＦａｓｃｉｃｌｉｎ１ドメインの４回繰り返しと、カルボキシル末端ドメインとが含まれる。ペリオスチンには、カルボキシル末端領域のみが異なるスプライシングバリアントのアイソフォームが４種類存在する。ペリオスチンは肺癌の腫瘍細胞自体ではなく腫瘍周辺のストロマ細胞に高発現であるとの報告（非特許文献４、５）、血清中のペリオスチンは非小細胞性肺癌存在診断における有用性は認められないものの、予後のマーカーの可能性を有するとの報告（非特許文献４、５）、乳癌で高発現との報告（非特許文献６）、胸腺癌で高発現との報告（非特許文献７）、膵臓癌で高発現との報告（非特許文献８）がある。しかしこれらの癌は中皮腫とは全く異なる病態である。さらに、ペリオスチンのスプライシングバリアントが形成されるカルボキシル末端ドメインの第１７エクソンのアミノ酸を認識する抗体が、心疾患や他の癌種の診断や治療に有効とされると開示する特許出願（特許文献１、２）がある。けれども、ペリオスチンの発現及び血中への存在と、中皮腫との関係についてはこれまで知られていなかった。

国際公開第ＷＯ２００７／０７７９３４号パンフレット国際公開第ＷＯ２００９／００１９４０号パンフレット

ＦｕｊｉｍｏｔｏＮ．ら、ＪＣａｎｃｅｒＲｅｓＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．、１３６：１７５５、２０１０Ｈｕｓａｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１３３：１３１７、２００９ＴａｋｅｓｈｉｔａＳ．ら、ＢｉｏｃｈｅｍＪ、２９４：２７１、１９９３ＳａｓａｋｉＨ．ら、ＪｐｎＪＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、９２：８６９、２００１ＳａｓａｋｉＨ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．、９２：８４３、２００１ＳｈａｏＲ．ら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．、２４：３９９２、２００４ＳａｓａｋｉＨ．ら、ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．、７２：３７、２００１ＢａｒｉｌＰ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２６：２０８２、２００７

簡便かつ安価で信頼性の高い中皮腫の検査方法と、該検査方法に用いるキットとを開発する必要がある。

本発明は、被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップを含む、中皮腫の検査方法を提供する。

本発明の中皮腫の検査方法において、前記ヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップは、ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を用いる場合がある。

本発明の中皮腫の検査方法において、前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体の場合がある。

本発明の中皮腫の検査方法において、前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる抗体を２種類用いる場合がある。

本発明の中皮腫の検査方法において、前記中皮腫は悪性胸膜中皮腫の場合がある。

本発明の中皮腫の検査方法において、前記中皮腫は肉腫型又は二相型の悪性胸膜中皮腫の場合がある。

本発明の中皮腫の検査方法において、前記血液試料は被検者の血漿又は血清の試料の場合がある。

本発明は、ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を含む、中皮腫の診断をするためのキットを提供する。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体の場合がある。前記キットはＥＬＩＳＡ法によりヒトペリオスチンタンパク質の濃度が測定される場合がある。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は、前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる２種類の抗体の場合がある。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる２種類の抗体の一方が固相化された固体支持体と、前記２種類の抗体の他方に対する特異的結合パートナーとを含む場合がある。前記キットはサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりヒトペリオスチンタンパク質の濃度が測定される場合がある。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記中皮腫の診断は、中皮腫のおそれのある被検者が、中皮腫の患者かどうかを判断する場合がある。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記中皮腫の診断は、中皮腫のおそれのある被検者が、中皮腫の患者か、中皮腫以外の呼吸器疾患の患者かを判断する場合がある。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記中皮腫の患者は悪性胸膜中皮腫の患者の場合がある。

本発明の中皮腫の診断をするためのキットにおいて、前記中皮腫の患者は肉腫型又は二相型の悪性胸膜中皮腫の患者の場合がある。

本発明は、被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップを含む、中皮腫の診断方法を提供する。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記ヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップは、ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を用いる場合がある。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体の場合がある。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記ヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップは、前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる抗体を２種類用いる場合がある。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記中皮腫の診断は、中皮腫のおそれのある被検者が、中皮腫の患者かどうかを判断する場合がある。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記中皮腫の診断は、中皮腫のおそれのある被検者が、中皮腫の患者か、中皮腫以外の呼吸器疾患の患者かを判断する場合がある。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記中皮腫の患者は悪性胸膜中皮腫の患者の場合がある。

本発明の中皮腫の診断方法において、前記中皮腫の患者は肉腫型又は二相型の悪性胸膜中皮腫の患者の場合がある。

本発明において、中皮腫は、中皮細胞に由来する腫瘍であって、原発組織に基づく分類によれば、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫及び心膜中皮腫のいずれをも指す。また、腫瘍組織を構成する細胞タイプに基づく分類によれば、悪性中皮腫は、上皮型と、肉腫型と、これらの混合型（二相型）とのいずれをも指す。本発明の中皮腫は、胸膜中皮腫の場合があり、肉腫型悪性胸膜中皮腫の場合がある。中皮腫の検査はアスベスト曝露者の健康のために重要であるため、本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法は胸膜悪性胸膜中皮腫に適用されることが好ましい。従来の生化学的マーカーによる中皮腫の検査方法では肉腫型及び二相型の悪性胸膜中皮腫を検出できないのに対し、本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法は肉腫型及び二相型の悪性胸膜中皮腫を検出できる。そこで、本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法は、肉腫型又は二相型の悪性胸膜中皮腫に適用されることが好ましい。本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法は、中皮腫の患者を健常者から判別するために用いられる場合がある。本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法は、悪性胸膜中皮腫の患者を、悪性胸膜中皮腫以外の呼吸器疾患の患者から判別するために用いられる場合がある。ここで悪性胸膜中皮腫以外の呼吸器疾患とは、肺癌と、癌以外の呼吸器疾患とを指す。癌以外の呼吸器疾患は、ＣＯＰＤ及び良性の胸膜中皮腫を含むが、これに限られない。

本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法における被検者は、中皮腫の検査を受ける必要のある全ての人間を指す。本発明の中皮腫の検査方法の被検者は、咳、痰、胸痛、呼吸困難等の症状を示す場合がある。前記被検者は、中皮腫のおそれのある被検者の場合がある。前記中皮腫のおそれのある被検者は、前記症状のある人、及び／又は、アスベスト吸引又は曝露を経験したか、あるいは、その疑いのある人を含むが、これらに限られない。

本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法における血液試料は、全血、血漿、血清のいずれであってもかまわない。前記血液試料は、採血後に分離された血漿又は血清が好ましい。本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法のための採血と、必要な場合には、血漿又は血清の調製とは、当業者に周知のいずれかの技術を用いて実施される。簡潔には、血漿の調製には、ＥＤＴＡその他のキレート剤を含むが、これに限定されない、血液凝固阻害剤が、採取された全血試料に添加された後、遠心により細胞成分が除去される。血清の調製では、採取された全血試料で血液凝固反応を起こさせて、遠心分離により血沈から血清を分離させる。本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法のための胸水の採取と、必要な場合には、胸水検体の調製とは、当業者に周知のいずれかの技術を用いて実施される（例えば、ＰｏｒｃｅｌＪ．Ｍ．及びＬｉｇｈｔＲ．Ｗ．（Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．、７３：１２１１、２００６）を参照せよ）。

本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法における、ヒトペリオスチンタンパク質は、配列番号２に列挙されるアミノ酸６３０個からなるアミノ酸配列を含む、いずれかのヒトペリオスチン遺伝子産物と、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体と結合するヒトペリオスチン遺伝子座のいずれかの突然変異体の遺伝子産物とを指す。

本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法における、ヒトペリオスチンタンパク質の濃度は、いかなる方法で測定されてもかまわない。一般に、ヒトペリオスチンタンパク質の濃度は、ヒトペリオスチンタンパク質と特異的に結合しうるいずれかの分子を用いて測定される。ヒトペリオスチンタンパク質の濃度は、ヒトペリオスチンタンパク質と特異的に結合する抗体を用いて測定されることが好ましい。ここで、ヒトペリオスチンタンパク質と特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体とからなるグループから選択される場合がある。

ヒトペリオスチンタンパク質と特異的に結合する、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、当業者に周知のいずれかの技術を用いて作製される。本明細書の実施例には、ヒトペリオスチンタンパク質と特異的に結合する、モノクローナル抗体の作製技術が開示されるが、本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法は、前記実施例に記載のモノクローナル抗体に限ることなく実施することができる。

本明細書における「抗体の抗原結合断片」とは、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。前記抗原結合断片は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体をそれぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンで分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）_２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。

本発明の抗体において、組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当な哺乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明の抗体において、キメラ抗体は、前記本発明の組換え抗体の抗原結合部位が、前記ポリペプチドに結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質の場合がある。前記キメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む単鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（Ｖ_ＨＤ）とを含む。前記組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。

本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法における「被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップ」は、被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のペリオスチンに結合した抗ペリオスチン抗体か、該抗ペリオスチン抗体の特異的結合パートナー等かの標識により検出又は定量される場合がある。前記抗ペリオスチン抗体は、直接的に、又は、リンカーを介して、ビオチンのような低分子リガンド、酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素、化学発光性化合物等で標識される場合がある。抗ペリオスチン抗体に対する特異的結合パートナーは、抗ペリオスチン抗体と特異的に結合することができる当業者に知られたあらゆる物質を含む。前記抗ペリオスチン抗体に対する特異的結合パートナーは、被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のペリオスチンタンパク質の濃度を測定することに支障がないことを条件として、抗ペリオスチン抗体と結合しうるいかなるレセプター又はリガンドであってもかまわない。前記レセプター又はリガンドは、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質その他の生体高分子の場合がある。本発明で用いられる抗ペリオスチン抗体に対する特異的結合パートナーは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体とからなるグループから選択される場合がある。抗体の抗原結合断片は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。前記抗ペリオスチン抗体に対する特異的結合パートナーは、酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素等で標識される場合がある。前記酵素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等である。前記酵素は、適切な基質と組み合わせて用いられることが一般的である。検出するステップは、分光光度計で吸光度を測定するステップか、発光計測装置で発光又は蛍光の強度を測定するステップかを含む場合がある。さらに、ラテックス粒子その他の微粒子に結合される場合がある。その場合には、検出するステップは、比濁計で濁度を測定するステップを含む場合がある。定量するステップは、既知の濃度又は量のヒトペリオスチンタンパク質に結合した抗ペリオスチン抗体の量を数値化してプロットした検量線を作成するステップと、前記検量線を用いて、未知の濃度又は量の被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質に結合した前記抗ペリオスチン抗体の量から該被検者の前記血液試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度又は量を算出するステップとを含む場合がある。検量線を作成するために、濃度又は量が知られたヒトペリオスチンタンパク質が少なくとも２種類あればよいが、定量精度を確保するために３種類又は４種類以上あることが好ましい。検出又は定量するステップは、被験試料に結合しなかった抗ペリオスチン抗体及び他の抗体を洗浄により除去するステップを含む場合がある。ここで酵素で標識された抗体等を用いる測定技術をＥＬＩＳＡ法という。そして、前記試料中のヒトペリオスチンタンパク質を固体支持体に捕捉するためと、該固体支持体に捕捉されたヒトペリオスチンタンパク質を検出又は定量するためとに、ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる、２種類の抗ヒトペリオスチンタンパク質抗体を用いる測定技術をサンドイッチＥＬＩＳＡ法という。前記２種類の抗ヒトペリオスチン抗体は、エピトープの異なる２種類のモノクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とであってもかまわない。

本発明の中皮腫の診断方法において、被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度が決定されるとき、前記濃度が基準値よりも高い値を示す場合に、前記被験者は中皮腫の疑いがあると判断される。前記基準値は、当業者に周知な統計処理によって算出することができる。

本発明の中皮腫の検査方法、キット及び／又は診断方法における「被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップ」は、当業者に知られたさまざまな手法によって実施される場合がある。例えば、前記手法は、既に説明されたＥＬＩＳＡ法及びラテックス凝集法の他、表面プラズモン共鳴法で実施される場合がある。

本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットは、本発明の抗ペリオスチン抗体の他、検量線を作成するための既知の濃度又は量の対照試料を含む場合がある。前記対照試料は、ヒトペリオスチンタンパク質か、その融合タンパク質かの場合がある。

本発明は、本発明の中皮腫の診断方法を実行できるように構成される、ペリオスチンの免疫学的分析装置を提供する。前記装置には、ＣＣＤカメラ等の検出ユニット、分光光度計、蛍光分光光度計、比濁計、表面プラズモン共鳴測定器等の測定ユニット、試薬、洗浄液及び／又は試料の注入及び／又は除去のためのディスペンサーユニット、ＥＬＩＳＡ法用マルチウェルプレートや表面プラズモン共鳴用センサーチップのハンドリングのためのロボットアームユニット、それらの制御のための制御ユニット等が含まれる。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

ヒトペリオスチンタンパク質の機能ドメインの位置と、各アイソフォームの構造と、本発明のペリオスチン抗体作製に用いられた免疫原の構造との関係を示す模式図。ＰＯＳＴＮ７８１でコーティングされたマイクロプレートを用いて、ヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ７８１を免疫原として作製されたモノクローナル抗体の反応性を調べた結果のグラフ。ＰＯＳＴＮ６３０でコーティングされたマイクロプレートを用いて、ヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ６３０を免疫原として作製されたモノクローナル抗体の反応性を調べた結果のグラフ。中皮腫患者及び健常者の血漿検体のそれぞれのペリオスチンの濃度の分布を示すグラフ。中皮腫患者の血漿検体について、同一検体のペリオスチン及びＳＭＲＰの血漿中の濃度をプロットした相関図。患者検体のうち、血漿検体と血清検体とにおけるペリオスチン濃度を比較したグラフ。本実施例の悪性胸膜中皮腫、肺癌及び癌以外の呼吸器疾患（図６では「呼吸器疾患」と表される。）の患者検体中のペリオスチン濃度の分布を比較したグラフ。ペリオスチン濃度をマーカーとする、肺癌と癌以外の呼吸器疾患とを合わせた中皮腫以外の呼吸器疾患患者に対する、本実施例の悪性胸膜中皮腫患者検体のＲＯＣ曲線を示すグラフ。株化癌細胞の培養上清中のペリオスチンが測定された結果を表すグラフ。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

抗ペリオスチン抗体の作製
（１）ヒトペリオスチンタンパク質の構造
図１はヒトペリオスチンタンパク質の機能ドメインの位置と、各アイソフォームの構造と、本発明のペリオスチン抗体作製に用いられた免疫原の構造との関係を示す模式図である。図１において、ＥＭＩ及びＦａｓｃｉｃｌｉｎ１は、それぞれ、ＥＭＩＬＩＮ相同ドメイン及びファシクリン相同ドメインを表す。ｉｓｏ１ないし４はそれぞれヒトペリオスチンのアイソフォーム１ないし４を表す。ＰＯＳＴＮ７８１は、ヒトペリオスチンタンパク質アイソフォーム３のアミノ酸７８１個のポリペプチドのカルボキシル末端にｍｙｃタグ及びｈｉｓタグ（「ｍｙｃｈｉｓ」と表す。）を融合させた組換えタンパク質を表す。ＰＯＳＴＮ６３０は、４個のファシクリンドメインまでを含む、ヒトペリオスチンタンパク質の全てのアイソフォームに共通のアミノ酸６３０個のポリペプチドのカルボキシル末端にｍｙｃタグ及びｈｉｓタグを融合させた組換えタンパク質を表す。ヒトペリオスチンタンパク質アイソフォーム３のアミノ酸７８１個のアミノ酸配列が配列番号１に列挙される。ヒトペリオスチンタンパク質の全てのアイソフォームに共通の４個のファシクリンドメインまでを含むアミノ酸６３０個のアミノ酸配列が配列番号２に列挙される。

（２）ヒトペリオスチンのｃＤＮＡ取得
ヒトペリオスチンタンパク質の４種類のアイソフォームのｃＤＮＡ配列（アイソフォーム１：ＮＭ＿００６４７５、アイソフォーム２：ＮＭ＿００１１３５９３４、アイソフォーム３：ＮＭ＿００１１３５９３５、アイソフォーム４：ＮＭ＿００１１３５９３６）に基づき、アイソフォーム１から４に共通である５’ＵＴＲ領域と３’ＵＴＲ領域にプライマーが設計された。第１段階のＰＣＲ反応に用いられたプライマーは、５’−ＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＴＣ−３’（配列番号４）で、第２段階のＰＣＲ反応に用いられたプライマーは５’−ＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣ−３’（配列番号５）及び５’−ＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣ−３’（配列番号６）である。ヒトｃＤＮＡライブラリインサートの混合物（ｍｏｓａｉｃｃＤＮＡ（商標）、Ｇｅｎｏｆｉ，ＬＬＣ、ＳａｎＣｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ９２６７３）を鋳型として、ＰＣＲ増幅酵素（ＫＯＤＦＸ、東洋紡績株式会社）と前記プライマーとを用いたｎｅｓｔｅｄＰＣＲによってペリオスチンのタンパク質コード領域全長を含むｃＤＮＡが増幅された。第１段階のＰＣＲ反応は［９８°Ｃ２０秒、５５°Ｃ２０秒、６８°Ｃ２分３０秒］を２５サイクル、第２段階のＰＣＲ反応は［９８°Ｃ１５秒、５５°Ｃ１５秒、６８°Ｃ２分３０秒］を３０サイクルの条件で実施された。第２段階のＰＣＲ反応の増幅産物はクローニングベクターｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、メルク株式会社）にクローニングされ、オートシークエンサー（アプライドバイオシステム）を用いて塩基配列が確認された。クローニングされたｃＤＮＡはアイソフォーム３と一致していたため、ＰＯＳＴＮｉｓｏ３−ｐＴ７と命名された。

（３）ヒトペリオスチン組換えタンパク質の分泌発現システムの構築
ヒトペリオスチン組換えタンパク質を動物細胞に発現させるためのベクターとして、ＣＭＶプロモーターで制御され、ＩＲＥＳ配列により目的遺伝子の産物とＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＥＧＦＰ融合タンパク質とが同時に発現されるｐＱＣｘｍｈＩＰＧが用いられた。ｐＱＣｘｍｈＩＰＧは、発明者らによりＢＤＲｅｔｒｏ−Ｘ（商標）ＱＶｅｃｔｏｒｓのｐＱＣＸＩＰベクターを改変して作製された。ＰＯＳＴＮ７８１発現ベクターは次のように構築された。目的配列のＰＣＲによる増幅は、ＰＯＳＴＮｉｓｏ３−ｐＴ７を鋳型として、ＫＯＤＦＸを用いて行われた。５’プライマー（５’−ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣ−３’、配列番号７、下線部はＮｏｔＩ認識配列）と、３’プライマー（５’−ＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣ−３’、配列番号８、下線部はＸｈｏＩ認識配列）とが用いられた。反応条件は、［９４°Ｃ１５秒、５５°Ｃ１５秒、６８°Ｃ２分３０秒］を３０サイクルであった。得られたＰＣＲ反応産物は、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで消化され、ｐＱＣｘｍｈＩＰＧのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入され、発現ベクターｐＱＣｘｍｈＩＰＧ−ＰＯＳＴＮ７８１が構築された。ＰＯＳＴＮ６３０発現ベクターは次のように構築された。目的配列のＰＣＲによる増幅は、上記ＰＯＳＴＮｉｓｏ３−ｐＴ７を鋳型として、Ｐｆｕ酵素（プロメガ株式会社）を用いて行われた。５’プライマー（５’−ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣ−３’、配列番号９、下線部はＮｏｔＩ認識配列）と３’プライマー（５’−ＧＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣ−３’、配列番号１０、下線部はＸｈｏＩ認識配列）とが用いられた。反応条件は、［９８°Ｃ１５秒、５５°Ｃ１５秒、６８°Ｃ２分３０秒］を３０サイクルであった。得られたＰＣＲ反応産物は、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで消化され、ｐＱＣｘｍｈＩＰＧのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入され、発現ベクターｐＱＣｘｍｈＩＰＧ−ＰＯＳＴＮ６３０が構築された。

ヒトペリオスチン組換えタンパク質の分泌発現細胞株を樹立するためにレトロウイルスパッケージング細胞システム（ＰａｎｔｒｏｐｉｃＲｅｔｒｏｖｉｒａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｋ１０６３−１、タカラバイオ株式会社）が用いられた。コラーゲンがコーティングされた１００ｍｍディッシュで８０〜９０％コンフルエント状態のＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｋ１０６３−１、タカラバイオ株式会社）が準備され、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、前記発現ベクターｐＱＣｘｍｈＩＰＧ−ＰＯＳＴＮ７８１又はｐＱＣｘｍｈＩＰＧ−ＰＯＳＴＮ６３０と、ｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｋ１０６３−１）とがともに１１．２μｇずつコトランスフェクションされた。４８時間後、ウイルス粒子を含む上清が回収され、超遠心（１８，０００ｒｐｍ、１．５時間、４°Ｃ）により前記ウイルス粒子が沈殿物として分離された。前記沈殿物が３０μＬのＴＮＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）で懸濁され、レトロウイルスベクター濃縮液が調製された。レトロウイルスベクター濃縮液５μＬが、８μｇ／ｍＬ臭化ヘキサジメトリン（Ｈ−９２６８、シグマアルドリッチジャパン株式会社）と、１０％ウシ血清とを含むＤＭＥＭ（Ｄ５７９６、シグマアルドリッチジャパン株式会社）の１５０μＬで希釈され、ウイルス粒子含有培地が調製された。９６穴のマイクロプレートに約４０％コンフルエントの状態になるように準備された２９３Ｔの培地が、前記ウイルス粒子含有培地にスイッチされて、ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ−ＰＯＳＴＮ７８１又はｐＱＣｘｍｈＩＰＧ−ＰＯＳＴＮ６３０の遺伝子導入が行われた。前記遺伝子導入後、５μｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｐ−８８３３、シグマアルドリッチジャパン株式会社）と、１０％ウシ胎仔血清とを含むＤＭＥＭで拡大培養され、ヒトペリオスチン組換えタンパク質の発現細胞株ＰＯＳＴＮ７８１／ｓｔ２９３Ｔ及びＰＯＳＴＮ６３０／ｓｔ２９３Ｔが樹立された。

（４）ヒトペリオスチンタンパク質の精製
ヒトペリオスチン組換えタンパク質の発現細胞株ＰＯＳＴＮ７８１／ｓｔ２９３Ｔ及びＰＯＳＴＮ６３０／ｓｔ２９３Ｔは、２９３細胞用の無血清培地ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）によりそれぞれ１Ｌ培養された。培養上清からＴＡＬＯＮＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｋ１２５３−１）を用いて組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ７８１及びＰＯＳＴＮ６３０が回収され、ＰＢＳで透析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにて精製タンパク質が確認された。プロテインアッセイキットＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、５００−０００２ＪＡ、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いてタンパク質濃度が決定された。

（５）ヒトペリオスチン組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（４）で説明したとおり精製されたヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ７８１及びＰＯＳＴＮ６３０が同量のコンプリートアジュバント（Ｆ５８８１、シグマアルドリッチジャパン株式会社）と混合してエマルジョンにされ、ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢・メス）１匹あたり５〜２０μｇが３〜７日おきに６回感作された。最終免疫の３日後にマウスからリンパ球細胞が摘出され、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）との細胞融合が行われた。

細胞融合は常法に従って以下のとおり行われた。全ての培地中のウシ胎仔血清は、５６°Ｃで３０分間保温する処理によって非働化された。Ｐ３Ｕ１は、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養された。摘出されたマウスリンパ球細胞とＰ３Ｕ１とは、１：１０〜１：２の割合で混合され遠心された。沈殿された細胞に５０％ポリエチレングリコール４０００（１．０９７２７．０１００、メルク株式会社）を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心された。沈殿された融合細胞は、１５％ＦＢＳを含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１０６７−０３０、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ペニシリン及びストレプトマイシン）で適宜希釈され、ウェルあたり２００μＬで９６穴のマイクロプレートに播種された。融合細胞はＣＯ_２インキュベータ（５％ＣＯ_２、３７°Ｃ）中で培養され、コロニーが形成されたところで培養上清がサンプリングされ、スクリーニングされた。スクリーニングは、免疫に使用したＰＯＳＴＮ７８１又はＰＯＳＴＮ６３０でコーティングされた９６穴プレートに対するＥＬＩＳＡ法で陽性を示すウェルの融合細胞コロニーが選択された。１５％ウシ胎仔血清を含むＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１０６０−０１７）、ペニシリン及びストレプトマイシン）で拡大培養後、限界希釈法によってクローニングが行われた。こうして、ヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ７８１を免疫原とするハイブリドーマクローンが１３個（抗体番号：＃３−４−５、＃３−６−１、＃３−９−２、＃３−１０−２、＃３−１１−４、＃３−２０−３、＃３−２７−１、＃３−２８−３、＃３−２９−１、＃３−３０−１、＃３−３１−３、＃３−３３−３、＃３−３４−１）得られた。ヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ６３０を免疫原とするハイブリドーマクローンが１３個（＃６−１−２、＃６−３−１、＃６−９−１、＃６−１０−２、＃６−１３−２、＃６−１４−３、＃６−１６−３、＃６−１９−１、＃６−２０−１、＃６−２３−５、＃６−４３−１、＃６−４５−１、＃６−８８−１）得られた。

（６）抗ヒトペリオスチンモノクローナル抗体の反応性
（５）で得られた抗ヒトペリオスチンモノクローナル抗体のヒトペリオスチンに対する反応性は次のように検証された。各ハイブリドーマクローンの培養上清からプロティンＡ−セファロースを用いた一般的なアフィニティー精製法によりモノクローナル抗体が精製された。得られた精製抗体はそれぞれ５μｇ／ｍＬを最大濃度として段階希釈され、それぞれ免疫原のヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ７８１又はＰＯＳＴＮ６３０に対する反応強度がＥＬＩＳＡ法によって確認された。

図２Ａは、５００ｎｇ／ｍＬのＰＯＳＴＮ７８１でコーティングされたマイクロプレートを用いてヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ７８１を免疫原とするモノクローナル抗体の反応性を調べた結果のグラフである。図２Ｂは、５００ｎｇ／ｍＬのＰＯＳＴＮ６３０でコーティングされたマイクロプレートを用いてヒトペリオスチン組換えタンパク質ＰＯＳＴＮ６３０を免疫原として使用されたモノクローナル抗体の反応性を調べた結果のグラフである。図２Ａ及びＢに示されるとおり、全てのモノクローナル抗体クローンが免疫原とする組換えタンパク質と濃度依存的に反応することが確認された。一方、前記ヒトペリオスチン組換えタンパク質と同じｍｙｃタグ及びｈｉｓタグを有する、別のヒト由来組み替えタンパク質に対して同様にＥＬＩＳＡ法で反応性を調べたところ、反応しなかった。そこで、（５）で得られたモノクローナル抗体は、いずれもタグ配列のオリゴペプチドを認識するものではないことが確認された。また、ＰＯＳＴＮ７８１を免疫原として得た１３個のモノクローナル抗体は全て、ＰＯＳＴＮ６３０にも反応した。そこで、本実施例で得られた全ての抗ヒトペリオスチンモノクローナル抗体は、４個のファシクリンドメインまでを含む、ヒトペリオスチンタンパク質の全てのアイソフォームに共通のアミノ酸６３０個（配列番号２）のポリペプチドを認識するとの結論に達した。

（７）サンドウィッチＥＬＩＳＡ法の構築
サンドウィッチＥＬＩＳＡ法の検出側抗体として使用するため、本実施例で得られた全てのモノクローナル抗体がビオチン標識された。すなわち、抗体溶液に、抗体１ｍｇあたり１６．７μＬの１０ｍＭＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、フナコシ株式会社）が混合され、室温で１時間インキュベートされた後、ＰＢＳで透析され未標識のビオチンが除去された。２６個のモノクローナル抗体クローンの中から、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法の捕捉と検出に適した抗体クローンの組み合わせは、以下のように２６×２６の総当りの組み合わせによって決定された。まず０．１ＭＮａＨＣＯ_３、０．１ＭＮａ_２ＣＯ_３及び０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０（ＳＵＰＥＬＣＯ、シグマアルドリッチジャパン株式会社）の溶液に１０μｇ／ｍＬの濃度で希釈された２６個の抗体クローンがそれぞれ９６穴マイクロプレートの各ウェルに５０μＬずつ添加され、４°Ｃ終夜又は室温２時間静置されて、抗体が前記マイクロプレートのウェル底面に固相化された。前記溶液を取り除いた後、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）、０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０及び５％ショ糖が添加されたＰＢＳ）が１５０μＬずつ分注された（４°Ｃ終夜又は室温２時間静置）。前記ブロッキングバッファーが取り除かれた後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０及び５０μｇ／ｍＬＭＡＫ−３３（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）が添加されたＰＢＳで、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ又は０ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈されたＰＯＳＴＮ７８１タンパク質が５０μＬ分注され、室温で１時間静置された。前記ＰＯＳＴＮ７８１タンパク質溶液が取り除かれた後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。ビオチン標識された２６個の抗体クローンが５μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ分注され、室温で１時間静置された。前記ビオチン標識抗体クローンの溶液が取り除かれた後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。１％ＢＳＡ、０．１３５ＭＮａＣｌ、０．１％ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅ、０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、１０ｍｇ／Ｌブロモフェノール・ブルー及び２０ｍＭＨＥＰＥＳで２００００倍に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ４０（ＳＤＴ、フナコシ株式会社）が５０μＬずつ分注され、室温で１時間静置された。前記Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ４０溶液が取り除かれた後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。ＴＭＢ−ＵＳ（Ｍｏｓｓ、コスモバイオ株式会社）が５０μＬずつ分注され、室温で３０分間静置して発色させた後、０．１８ＭＨ_２ＳＯ_４が５０μＬ分注されて発色が停止された。分光吸光度計で吸光度Ａ４５０／Ａ６２０が測定された。ＰＯＳＴＮ７８１タンパク質１０ｎｇ／ｍＬのウェルと０ｎｇ／ｍＬのウェルとの吸光度の差が２．０以上、かつ、抗原１ｎｇ／ｍＬのウェルと０ｎｇ／ｍＬのウェルとの吸光度の差が１．０以上となる抗体組み合わせが選択された。選択されたモノクローナル抗体の組み合わせは表１のとおりであった。

臨床検体の測定
（１）臨床検体への反応性
健常者の検体は、株式会社医学生物学研究所の倫理委員会組織；ＭＢＬ倫理審査委員会の承認（案件番号：０２２、承認日：２００７年３月２７日）を得て、健常者ボランティア検体を募集し、検体を提供した各健常者から書面により、事前に測定の同意が得られているものである。中皮腫患者の検体は、ＢＭＲ（ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（出願時点でＳｅｒａＣａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＭｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ．に統合されている。））に依頼し入手された（Part Code：DS-763 Desription：Mesothelioma Lot# BM203975〜BM203986）。実施例１（７）で説明されたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法のヒトペリオスチン精製組換えタンパク質のかわりに、１０００倍に希釈された前記血漿検体が用いられた。表１に示された抗体の組み合わせについて、健常者１６名の血漿検体と、中皮腫患者１１名の血漿検体とを測定した結果を表２に示す。

表２に示すとおり、中皮腫患者の血漿検体は、健常者の血漿検体に比べて全ての組み合わせで有意に高い測定値を示した。また、ｔ検定を行ったところ、ｐ値はいずれも０．０００５未満であった。これにより、ペリオスチンタンパク質の血中濃度が中皮腫の診断マーカーになる可能性が示唆された。

（２）ヒトペリオスチン血中濃度を測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法の確立
中皮腫の診断マーカーとしてのヒトペリオスチン血中濃度の有効性をさまざまな臨床検体を用いてさらに詳しく検討する前に、表１のリストから固相抗体と検出抗体の最適な組み合わせを選択した。標準物質としてＰＯＳＴＮ７８１の濃度を２ｎｇ／ｍＬから２倍希釈で７段階に希釈された希釈系列と、ＰＯＳＴＮ７８１を全く添加しない希釈液とへの反応性を評価し、標準物質への反応性が高くかつブランクの吸光度が低い組み合わせの代表例として固相抗体が＃６−１４−３、検出抗体が＃３−３４−１の組み合わせが選択された。以下の実験ではいずれもこの抗体の組み合わせが用いられた。

臨床検体の測定
（１）中皮腫患者及び健常者の血漿試料中のペリオスチン濃度の測定
０．１ＭＮａＨＣＯ_３、０．１ＭＮａ_２ＣＯ_３及び０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０（ＳＵＰＥＬＣＯ）からなる溶液で１０μｇ／ｍＬに希釈された抗ヒトペリオスチンモノクローナル抗体＃６−１４−３が、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（ＮＵＮＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に５０μＬずつコーティングされ、４°Ｃ終夜又は室温２時間静置することによって抗体の固相化が行われた。前記抗体の溶液が取り除かれた後、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、株式会社ベリタス）、０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０及び５％ショ糖が添加されたＰＢＳ）が１５０μＬずつ分注され、４°Ｃ終夜又は室温２時間静置された。前記ブロッキングバッファー溶液が取り除かれた後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０及び５０μｇ／ｍＬＭＡＫ−３３が添加されたＰＢＳを希釈液として、ペリオスチン標準物質（ＰＯＳＴＮ７８１が２μｇ／ｍＬから２倍希釈で７段階に希釈された希釈系列）と、血漿検体（中皮腫患者１１名（ＢＭＲ）、健常者１６名）との５００倍希釈液と、ＰＯＳＴＮ７８１も血漿検体も全く添加されない希釈液だけとが調製され、それぞれ５０μＬずつ各ウェルに分注された。室温１時間静置後、前記血漿検体希釈液等の溶液が取り除かれ、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。ビオチン化された＃３−３４−１が１μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ分注された。室温１時間静置後、前記ビオチン化された＃３−３４−１溶液が取り除かれ、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。１％ＢＳＡ、０．１３５ＭＮａＣｌ、０．１％ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅ、０．１５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、１０ｍｇ／Ｌブロモフェノール・ブルー及び２０ｍＭＨＥＰＥＳからなる希釈液で２００００倍に希釈されたＳｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙ４０ＨＲＰ（ＳＤＴ）が、５０μＬずつ分注され、室温１時間静置された。前記Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙ４０ＨＲＰ溶液が取り除かれた後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄された。ＴＭＢ−ＵＳ（Ｍｏｓｓ，ＩＮＣ．）が５０μＬずつ分注され、室温３０分間静置して発色された後、０．１８ＭＨ_２ＳＯ_４が５０μＬ分注されて発色が停止された。分光吸光度計で吸光度Ａ４５０／Ａ６２０が測定され、その吸光度から、検体中に含まれるペリオスチンの濃度が定量された。図３は、中皮腫患者及び健常者の検体のそれぞれのペリオスチンの濃度の分布を示すグラフである。中皮腫患者及び健常者の検体についてｔ検定によるｐ値が計算されたところ、ｐ＝０．００００００６６であり有意差を認めた。

（２）可溶型メソテリン関連蛋白（ＳＭＲＰ）測定値との相関
前記（１）でペリオスチンの濃度が測定された血漿検体（中皮腫患者１１名（ＢＭＲ）、健常者１６名）において、従来からの中皮腫の血清診断マーカーである可溶型メソテリン関連蛋白（ＳＭＲＰ）の濃度が、ＳＭＲＰの濃度測定キット（ＭＥＳＯＭＡＲＫ、ＦｕｊｉｒｅｂｉｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ）の製造者の指示書に従って測定された。図４は、中皮腫患者の検体について、同一検体のペリオスチン及びＳＭＲＰの血漿濃度をプロットした相関図である。図４に示すとおり、ペリオスチン及びＳＭＲＰの血漿濃度の測定値には相関は認められなかった。ペリオスチンのカットオフ値を暫定的に１００ｎｇ／ｍＬとすると全１１例が陽性と認められた一方、ＳＭＲＰは基準のカットオフ値１．５ｎＭを採用すると、７例（６４％）のみが陽性と判定された。ＳＭＲＰ陰性の４例（３６％）は全てペリオスチン陽性となることも示された。

名古屋大学医学部呼吸器科グループで収集された患者検体の解析
本実施例の実験は、名古屋大学医学部生命倫理審査委員会の承認（承認番号：５４６−４、承認日：２０１１年７月２９日）を得て実施された。書面による同意が、検体を提供した患者から得られている。

名古屋大学医学部呼吸器科グループで収集された患者検体（血漿及び血清）のペリオスチン濃度が測定された。検体が得られた悪性胸膜中皮腫患者は、上皮型、二相型及び肉腫型でそれぞれ１４名、５名及び２名であった。上皮型、二相型又は肉腫型の診断は、Ｈｕｓａｉｎらの報告（Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１３３：１３１７、２００９）に従ってヘマトキシリン・エオジン染色法で行われた。肺癌患者は１１８名、癌以外の呼吸器疾患、例えばＣＯＰＤ等の患者は５３名であった。

まず、常法に従って同一患者から調製された血漿検体と血清検体とのペリオスチン濃度が実施例３と同じサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定された。図５は、血漿検体と血清検体とにおけるペリオスチン濃度を比較したグラフである。図５に示すとおり、血清中のペリオスチン濃度と、血漿中のペリオスチン濃度とは、同じ患者ではほぼ同じ測定値を示した。そこで、同一患者の血漿検体と、血清検体とでペリオスチン濃度に差はないことが確かめられた。したがって、以下の実施例では血清検体がペリオスチン濃度の測定に用いられた。

図６は、本実施例の悪性胸膜中皮腫、肺癌及び癌以外の呼吸器疾患（図６では「呼吸器疾患」と表される。）の患者検体のペリオスチン濃度の分布を比較したグラフである。図６から明らかなとおり、悪性胸膜中皮腫患者の検体のペリオスチン濃度は高い。

図７は、ペリオスチン濃度をマーカーとする、肺癌と、癌以外の呼吸器疾患とを合わせた中皮腫以外の呼吸器疾患患者に対する、本実施例の悪性胸膜中皮腫患者検体のＲＯＣ曲線を示すグラフである。本実施例のＲＯＣ解析の結果、ＡＵＣは０．９２７であった。ペリオスチン濃度の暫定的なカットオフ値を１３３ｎｇ／ｍＬとしたときの診断精度を計算したところ、悪性胸膜中皮腫患者に対する感度は０．８１０であった。また、悪性胸膜中皮腫以外の呼吸器疾患患者に対する特異度は０．９３６であった。そこで、ペリオスチンは、悪性胸膜中皮腫患者と悪性胸膜中皮腫以外の呼吸器疾患患者とを区別するうえにおいても非常に有効なマーカーであることも示された。

ペリオスチン濃度の暫定的なカットオフ値を１３３ｎｇ／ｍＬとして悪性胸膜中皮腫患者検体を組織型別に解析したところ、二相型では５検体中４検体（８０％）、肉腫型でも２検体中２検体（１００％）が陽性として検出された。一方ＳＭＲＰは、二相型では５検体中１検体（２５％）、肉腫型では２検体中０検体（０％）が陽性になるにとどまった。そこで、これらの悪性度の高い組織型の患者においても、血中ペリオスチンの濃度上昇を検出することが診断マーカーとして有用であることが示唆された。

株化癌細胞の分泌するペリオスチン
本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって、さまざまな細胞タイプの株化癌細胞がペリオスチンを培地にどのくらい分泌するか検討するため、表３に示す株化癌細胞が用意された。

表中のコード番号の略称の説明は以下のとおりである。
ATCC：American Type Culture Collection
BRC：RIKEN BioResource Center
HSRRB：Health Science Research Resources Bank

図８は、表２に示す株化癌細胞の培養上清中のペリオスチンが固相抗体＃６−１４−３／検出抗体＃３−３４−１の測定系で測定された結果を表すグラフである。中皮腫由来の癌細胞株では、５種中３種（６０％）で高濃度のペリオスチンが検出された（図９）。一方で、それ以外は肺癌、乳癌の一部で若干の発現を認めたものの、その発現量は４分の１未満であり、大腸癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽腫、Ｂ細胞系やＴ細胞系、単球系、巨核球系の血液癌、臍帯血由来血管内皮細胞では発現していないことが認められた。そこで、ペリオスチンの発現と培養液中における存在とは中皮腫由来癌細胞株にかなり特異的であることが認められた。

胸水検体の測定
臨床検体として、血漿試料及び血清試料に加えて胸水試料も利用できるかどうか検討するために、中皮腫患者１名と、対照として肺腺癌患者１名との胸水試料中のペリオスチン濃度が測定された。本実施例の実験も名古屋大学医学部生命倫理審査委員会の承認（承認番号：５４６−５、承認日：２０１２年３月２７日）を得て実施された。書面による同意が、検体を提供した患者から得られている。

検体が得られた悪性胸膜中皮腫患者は二相型であった。常法に従って同一患者から調製された、血漿検体、血清検体及び胸水検体のペリオスチン濃度が、実施例３及び４と同じサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定された。採取された胸水検体は、血漿検体及び血清検体と同じ方法で調製された。胸水検体でのペリオスチン濃度は、血清検体及び血漿検体より高いので、１６０００倍希釈液が固相抗体との結合に供された。

その結果、当該中皮腫患者の血漿検体、血清検体及び胸水検体のペリオスチン濃度は、それぞれ、２４７．９ｎｇ／ｍＬ、２７９．２ｎｇ／ｍＬ及び６９２８．７ｎｇ／ｍＬであった。同時に測定された前記肺腺癌患者の血漿検体、血清検体及び胸水検体のペリオスチン濃度は、それぞれ、４７．４ｎｇ／ｍＬ、５３．６ｎｇ／ｍＬ及び１９３８．４ｎｇ／ｍＬであった。前記中皮腫患者の血清検体のペリオスチン濃度は、実施例４で設定された血清検体中のペリオスチン濃度の暫定的なカットオフ値１３３ｎｇ／ｍＬを超えており、血清検体中のペリオスチン濃度による診断では陽性であった。胸水検体中のペリオスチン濃度は、前記中皮腫患者でも前記肺腺癌患者でも、血漿検体及び血清検体のペリオスチン濃度に比べて数十倍高かった。そして胸水検体でも、前記中皮腫患者のペリオスチン濃度は前記肺腺癌患者に比べて３倍以上高かった。そこで、胸水検体においても、本発明のペリオスチン濃度を用いる中皮腫の検査方法は実施可能であることが示された。

本明細書において説明したとおり、本発明の中皮腫の検査方法によれば、上皮型、二相型及び肉腫型のいずれの悪性胸膜中皮腫でも検出できる。これにより、生検などの患者に大きな負担を強いることなく、早期に中皮腫を診断することが可能となり、中皮腫患者の早期治療に大きく貢献することができる。また、数百万人にものぼるアスベスト曝露者に対して中皮腫をスクリーニングするうえで信頼性が高く、簡便かつ安価な検査法を提供することができるため、アスベスト曝露者が気軽に繰り返し検査を受けることができ、中皮腫患者の早期発見治療を可能にし、治癒率の向上に大きく貢献することができる。さらに胸水貯留による症状を示す患者から採取される胸水から中皮腫を診断することも可能になる。

Claims

被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料中のヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップを含むことを特徴とする、中皮腫の検査方法。
前記ヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップは、ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を用いることを特徴とする、請求項１に記載の中皮腫の検査方法。
前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の中皮腫の検査方法。
前記ヒトペリオスチンタンパク質の濃度を測定するステップは、前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる抗体を２種類用いることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の中皮腫の検査方法。
前記中皮腫は悪性胸膜中皮腫であることを特徴とする、請求項４に記載の中皮腫の検査方法。
前記中皮腫は肉腫型又は二相型の悪性胸膜中皮腫であることを特徴とする、請求項４に記載の中皮腫の検査方法。
前記血液試料は被検者の血漿又は血清の試料であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の中皮腫の検査方法。
ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする、被検者の血液及び胸水のうち少なくともいずれか１種類の試料を用いて中皮腫の診断をするためのキット。
前記中皮腫の診断は、中皮腫のおそれのある被検者が、中皮腫の患者かどうかを判断することである、請求項８に記載の中皮腫の診断をするためのキット。
ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする、中皮腫の診断をするためのキットであって、前記中皮腫の診断は、中皮腫のおそれのある被検者が、中皮腫の患者か、中皮腫以外の呼吸器疾患の患者かを判断することである、中皮腫の診断をするためのキット。
前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体であることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか１つに記載の中皮腫の診断をするためのキット。
前記ヒトペリオスチンタンパク質に対する抗体は、前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる２種類の抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
前記ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる２種類の抗体の一方が固相化された固体支持体と、前記２種類の抗体の他方に対する特異的結合パートナーとを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の中皮腫の診断をするためのキット。
ヒトペリオスチンタンパク質と同時に結合することができる２種類の抗体の一方が固相化された固体支持体と、前記２種類の抗体の他方に対する特異的結合パートナーとを含み、前記２種類の抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体であることを特徴とする、中皮腫の診断をするためのキット。
前記中皮腫の患者は悪性胸膜中皮腫の患者であることを特徴とする、請求項９ないし１４のいずれか１つに記載の中皮腫の診断をするためのキット。
前記中皮腫の患者は肉腫型又は二相型の悪性胸膜中皮腫の患者であることを特徴とする、請求項１５に記載の中皮腫の診断をするためのキット。