CN113820382A - 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用，本发明通过对待测样本进行2D SDS‑PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选，并将2DSDS‑PAGE蛋白电泳结果图和2D Western blot的结果图进行拟合，筛选重合点，进行挖点，并进行蛋白质谱鉴定和搜库比对，即得异源抗原，本发明所述的筛选方法为免疫排斥原因排查和后续操作提供了有力的参考和支持，具有非常好的应用前景。

Description

一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种筛选方法，更具体地，本发明涉及一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用。
背景技术
随着移植免疫学的发展和外科技术的成熟，器官、组织或细胞移植也逐渐兴起，器官、组织或细胞移植分为同种移植和异种移植，其中，同种移植一般是指同种异体移植，即同种不同基因型个体之间的器官、组织或细胞的移植，也是临床上最常见的移植类型之一；异种移植是指将一个物种的器官、组织或细胞移植到另一个物种体内。无论是同种移植还是异种移植，均存在免疫排斥的现象，免疫排斥是指受者进行同种或异种器官、组织或细胞的移植后，外来的器官、组织或细胞等移植物作为一种“异己成分”被受者免疫系统识别，后者发起针对移植物的攻击、破坏和清除的免疫学反应。同种移植或异种移植的成功率的关键取决于受者和供者的器官、组织或细胞之间是否发生免疫排斥反应以及免疫排斥反应的强弱，因此，目前该领域亟需一种准确可靠、方便快捷的异源抗原的筛选方法，以用于筛选出免疫排斥相关的抗原，进而为免疫排斥原因排查和后续操作提供有力的参考。
血清蛋白质组分析(Serological proteome analysis，SERPA)技术是蛋白质组学与免疫学结合产生的一种高通量筛选和鉴定疾病相关抗原、抗体的新技术，目前被广泛应用于抗原和抗体的筛选和鉴定中，SERPA技术的主要原理是首先经二维凝胶电泳(2-DE)方法分离蛋白样品，并保证三块2-DE平行胶同时进行，每块凝胶的蛋白上样量一致。其中两块胶转到硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜上，然后分别用患者或正常对照血清与膜杂交进行血清免疫学分析，第三块未转膜的凝胶进行考马斯亮蓝染色，通过软件分析2-DE蛋白质印迹结果鉴别出患者血清与对照血清的免疫反应差异点，同时在介体胶中确定其对应的差异点，主要包括在患者血清唯一出现的点和在患者血清中升高明显的点。最后从介体胶上切取差异点进行鉴定，鉴定的方法包括Edman降解法以及敏感性和特异性高的质谱鉴定法。
目前，现有的筛选和鉴定抗原、抗体的SERPA技术存在以下缺陷：(1)SE RPA技术未明确血清来源，文献中一般描述为采用患者及对照血清进行分析；(2)SERPA技术未明确标记时血清的处理方式，文献中一般描述为采用患者及对照血清做一抗；(3)SERPA技术未明确图片拟合方式；此外，目前还存在考马斯亮蓝染色的2D胶不能做转膜，无法和抗体孵育，而转完膜并用抗体孵育做Wes tern blot的膜无法直接做质谱等问题，鉴于此，本发明的目的在于克服目前本领域存在的上述技术缺陷，提供一种新的异源抗原的筛选方法，以用于筛选出免疫排斥抗原，进而为免疫排斥原因排查和后续操作提供有力的参考和支持。
发明内容
鉴于此，为了弥补当前本领域现有技术存在的上述技术缺陷，本发明的目的在于一种新的异源抗原的筛选方法，以用于筛选出免疫排斥抗原，进而为免疫排斥原因排查和后续操作提供有力的参考和支持。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种筛选免疫排斥抗原的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行2D SDS-PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选；
(2)将2D SDS-PAGE蛋白电泳结果图和2D Western blot的结果图进行拟合，筛选重合点，进行挖点，进行蛋白质谱鉴定；
优选地，步骤(1)所述的在进行2D SDS-PAGE蛋白电泳之前，先做等电聚焦电泳。
本发明中所述的“SDS-PAGE蛋白电泳”，为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)，是一种可以根据蛋白质的分子量分离样本中蛋白的技术，在电荷的影响下分离大分子称为电泳(Electrophoresis)，在SDS-PAGE中使用的凝胶是聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)，使蛋白质呈线性化的试剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，SDS是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能够使蛋白质分子中的二硫键还原，SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS中的十二烷基磺酸根带负电，因此，其余蛋白质结合后形成的蛋白质-SDS复合物带有负电荷。
本发明中所述的“Western blot”，蛋白质免疫印迹实验，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
进一步，所述方法中每次做两张2D SDS-PAGE蛋白电泳胶；
优选地，所述两张2D SDS-PAGE蛋白电泳胶中一张做考马斯亮蓝染色、或银染；
更优选地，所述两张2D SDS-PAGE蛋白电泳胶中一张做考马斯亮蓝染色；
优选地，所述两张2D SDS-PAGE蛋白电泳胶中另一张做转膜后，做2DWesternblot；
更优选地，所述转膜的方法为湿法转移；
最优选地，所述转膜中用到的转移膜包括硝酸纤维素膜、PVDF膜；
最优选地，所述转膜中用到的转移膜为PVDF膜。
进一步，所述2D Western blot是采用受者的血清或血清提取物进行的；
优选地，所述受者血清或血清提取物为直接标记的血清或血清提取物；
更优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甙酶、或葡萄糖氧化酶直接标记的血清或血清提取物；
最优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶直接标记的血清或血清提取物。
进一步，步骤(2)中所述拟合的方式为将2D SDS-PAGE蛋白电泳结果图和2DWestern blot的结果图中以某几个蛋白点及印迹点为参考进行图片的拟合；
优选地，步骤(2)中所述拟合还包括对拟合后的蛋白点进行一一标记。
进一步，步骤(1)中所述的待测样本为细胞、或组织。
优选地，步骤(1)中所述的方法还包括对待测样本进行膜蛋白的提取。
进一步，所述细胞、或组织来源于哺乳动物；
进一步，所述哺乳动物包括(但不限于)：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、犬、猪、羊、猴、人；
优选地，所述哺乳动物为人。
进一步，所述方法还包括如下步骤：
(a)对待测样本的膜蛋白进行1D SDS-PAGE蛋白电泳；
(b)采用受者血清或血清提取物对步骤(a)中的膜蛋白进行1D Western blot；
(c)将步骤(a)和步骤(b)得到的结果作为2D SDS-PAGE蛋白电泳和2DWesternblot筛选的参考；
优选地，步骤(b)中所述的受者血清或血清提取物为直接标记的血清或血清提取物；
更优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甙酶、或葡萄糖氧化酶直接标记的血清或血清提取物；
最优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶直接标记的血清或血清提取物。
进一步，步骤(1)中所述的2D Western blot包括如下步骤：
(a)将2D SDS-PAGE蛋白电泳胶进行转膜；
(b)用封闭液室温下封闭1h、或4℃条件下封闭过夜；
(c)加入直接标记的受者血清或血清提取物进行孵育，室温下孵育1h、或4℃条件下孵育过夜；
(d)孵育结束后，取出膜，并用TBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min；
(e)将发光液A液和B液混合均匀后，滴在膜上进行显影；
(f)在暗室中，将胶片置于膜上，盖上压片夹进行曝光，曝光后将胶片放入显影液中进行显影。
进一步，步骤(a)中所述转膜的方法为湿法转移；
优选地，所述转膜中用到的转移膜包括硝酸纤维素膜、PVDF膜；
更优选地，所述转膜中用到的转移膜为PVDF膜；
优选地，步骤(b)中所述的封闭液包括BSA、血清、或脱脂奶粉配置成的溶液；
更优选地，步骤(b)中所述的封闭液为BSA；
最优选地，步骤(b)中所述的封闭液为5％BSA；
优选地，步骤(c)中所述的直接标记的受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甙酶、或葡萄糖氧化酶直接标记的血清或血清提取物；
更优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶直接标记的血清或血清提取物。
2D SDS-PAGE蛋白电泳的原理是通过等电点和蛋白分子量两个维度的电泳来对目的混合蛋白进行分离展示，若用考马斯亮蓝染色，2D胶上会显示为不同的点，每个点理论上代表一种或一簇蛋白。如果2D胶图不用考马斯亮蓝染色，而是直接转膜，再将转到膜上的蛋白做标记的抗体孵育，并用相应的方法显色，可以找到和抗体作用的蛋白点或蛋白簇，如果可以对和相应抗体作用的蛋白点或蛋白簇进行挖点测序，利用现有的质谱技术，即可通过比库操作分析得到哪些蛋白和相应抗体作用，即所要筛选的靶蛋白，从而确定异源抗原；
目前本领域面临的技术难点是考马斯亮蓝染色后的2D胶不能做转膜，无法和抗体孵育，而转完膜并用抗体孵育做Western blot的膜上的点无法直接做质谱，因此，本申请的发明人基于现有技术存在的缺陷和技术难点设计了如下技术构思：同时做2张甚至多张蛋白2D电泳胶，其中一张做考马斯亮蓝染色，其中第二张用于转膜并孵育抗体做Westernblot，将Western blot结果图片与考马斯亮蓝染色图片进行拟合，拟合后将WB结果中和抗体作用的阳性点对应的考马斯亮蓝染色胶上的点进行挖取，并将挖取的点送质谱测序，获得对应蛋白的信息，所述蛋白即为异源抗原。
本发明中所述的“异源抗原”，同“免疫排斥抗原”，是指能引起机体发生免疫排斥反应的抗原，其中免疫排斥是指机体对移植物(异体器官、组织或细胞)通过特异性免疫应答使其破坏的过程，一般是指移植术后，受者可识别移植物抗原并产生应答。
本发明的第二方面提供了一种免疫排斥抗原的筛选系统。
进一步，所述筛选系统中包括如下单元：
(1)输入单元：对待测样本进行膜蛋白的提取，得到待测样本的膜蛋白，并将其作为输入端的信息进行输入；
(2)初筛单元：初筛单元用于对输入单元得到的待测样本的膜蛋白进行1DSDS-PAGE蛋白电泳，采用受者血清或血清提取物对膜蛋白进行1D Western blot，将得到的初筛结果作为2D SDS-PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选的参考；
(3)筛选单元：以初筛单元得到的初筛结果为参考，对待测样本进行2DSDS-PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选，得到筛选结果；
(4)拟合单元：将筛选单元得到的筛选结果中的2D SDS-PAGE蛋白电泳结果图和2DWestern blot的结果图进行拟合，筛选得到重合点，并进行挖点；
(5)鉴定单元：将拟合单元进行拟合后得到的重合点进行蛋白质谱鉴定；
(6)输入单元：将鉴定单元经蛋白质谱鉴定得到的蛋白进行搜库比对，即得免疫排斥抗原，输出免疫排斥抗原的结果；
优选地，所述的待测样本为细胞、或组织。
本发明的第三方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的方法在免疫相关疾病、或移植排斥相关的免疫排斥抗原筛选中的应用；
(2)本发明第二方面所述的筛选系统在筛选待测样本中的免疫排斥抗原中的应用。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明提供的筛选免疫排斥抗原这一技术是在现有的实验技术基础上的有效集成，确定本技术的使用方式及应用范围，解决现有实验及实际应用中存在的问题，从而筛选出异种抗原，操作步骤简洁明了，结果可信、可靠；
本发明提供了一种筛选哺乳动物体内免疫排斥抗原的筛选方法，为同种移植或异种移植中免疫排斥原因排查和后续操作提供了借鉴；
本发明提供的筛选方法与传统的SERPA技术相比，SERPA技术未明确血清来源，一般描述为采用患者及对照的血清进行分析，而本发明提供的筛选方法采用的是受者的血清直接进行分析；
本发明提供的筛选方法与传统的SERPA技术相比，SERPA技术未明确标记时血清的处理方式，一般描述为采用患者及对照血清做一抗，本发明提供的筛选方法采用对受者血清进行直接标记后用于分析；
本发明提供的筛选方法与传统的SERPA技术相比，SERPA技术未明确图片拟合方式，本发明提供的筛选方法采用处理后图片(考马斯亮蓝染色图片和Western blot印迹图片)进行拟合；
本发明提供的筛选方法为免疫相关疾病、器官移植免疫等各种排斥反应筛选出产生异源反应的抗原，为做后续操作及实验研究提供了有效的靶标。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示本发明所述的免疫排斥抗原筛选方法的流程图；
图2显示1D蛋白电泳的抗体浓度优化的结果图，其中，A图：1:1000的抗体稀释浓度，B图：1:2000的抗体稀释浓度；
图3显示1D蛋白电泳的蛋白浓度优化的结果图，其中，A图：30μg蛋白、1:1000的抗体稀释浓度，B图：10μg蛋白、1:1500的抗体稀释浓度；
图4显示采用一抗直接标记后的结果图和采用二抗间接标记后的结果图，其中，A图：采用一抗直接标记后的结果图，B图：采用二抗间接标记后的结果图；
图5显示2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色后的结果图；
图6显示2D蛋白电泳转膜后Western blot的结果图；
图7显示对2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色后的结果图和2D蛋白电泳转膜后Westernblot的结果图进行拟合得到的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1免疫排斥抗原筛选方法的构建
1、实验材料
用于筛选目的抗原的组织或细胞为动物源组织和组织解离的细胞，来源于本研究实验用动物；血清或血清来源物质购自于上海拜力生物公司；2D蛋白电泳仪器及试剂购自于Biorad生命医学产品有限公司；1D蛋白电泳仪器及试剂购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
2、免疫排斥抗原筛选方法的构建
(1)2D Western blot蛋白质样本制备：制备的主要原则是尽可能溶解全部蛋白质，破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用，避免各类干扰物质，样品制备与IEF兼容等；本实验采用蛋白提取试剂盒提取目的蛋白；
(2)电泳：先做等电聚焦电泳(IEF)，胶条平衡，然后做电泳SDS-PAGE；
(3)考染：SDS-PAGE电泳结束后，取2张电泳凝胶中的1张凝胶用考马斯亮蓝染色。具体操作为直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶，并在水平摇床缓慢摇动2h，倾去染色液；用脱色液冲洗凝胶，用脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2h，倾去脱色液，再加入新脱色液进行脱色，直至获得清晰的蓝色的条带和干净的背景(通常2-4h的背景)；然后对凝胶进行照相和分析。
(4)转膜：SDS-PAGE电泳结束后，取2张电泳凝胶中的1张凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移，选用PVDF膜；
(5)封闭：5％BSA封闭1小时(室温)或过夜(4度)；
(6)血清标记：直接HRP标记的血清或血清来源物质孵育，孵育条件是室温1小时或4度过夜，孵育后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟；
(7)显影：将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上用于显影；
(8)取图片暗室中将胶片置于膜上，盖上压片夹，曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影，曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素；
(9)定影后，清洗胶片，晾干，标定marker，扫描图片和2D Western blot图片分析；
(10)图片拟合：将2D Western blot图片和2D PAGE电泳考马斯亮蓝染色图片拟合，筛选重合点进行挖点，送生工生物做蛋白质谱鉴定。
所述免疫排斥抗原筛选方法的流程图见图1。
实施例2免疫排斥抗原筛选方法的优化
1、1D蛋白电泳的抗体浓度的优化
实验方法：本实施例分别采用1:1000和1:2000两种不同的抗体稀释浓度对进行1D蛋白电泳的1D Western blot条件进行了优化；
实验结果：实验结果显示，1:2000的抗体稀释浓度的结果会相对更清晰(见图2A和B)，因此，选择使用1:2000的浓度稀释为最优的抗体浓度。
2、1D蛋白电泳的蛋白浓度的优化
实验方法：本实施例分别采用加样量30μg蛋白、10μg蛋白进行1D蛋白电泳的1DWestern blot条件的优化，其中，上述两组的抗体的稀释浓度分别为1:1000、1:1500；(1D蛋白电泳主要是确定最优的抗体浓度，本稀释度在1D电泳中是适用的，根据实验室做1D电泳和2D电泳WB的经验，在做2D电泳时浓度稍比1D电泳多一个稀释度，这样2D电泳WB中目的点会更清晰)
实验结果：实验结果显示，加样10μg蛋白更容易获取清晰的Western blot结果图，易于对目的蛋白进行分析(见图3A和B)，因此，本发明选择10μg为最优的蛋白加样量。
实施例3免疫排斥抗原筛选方法的实际应用
1、直接进行血清来源物质标记和采用二抗间接标记的对比
实验方法：
如果直接用血清的话，需要抗体纯化柱进行血清内抗体纯化，如果用血清抗体，按下述方法进行标记。
抗体标记步骤：
使用浓度1-10mg/mL抗体进行标记，取抗体1mg(相当于100-1000μL，如果抗体是冻干的，加入适量的标记缓冲液)于活化HRP的管中，混匀，加入100μL的标记缓冲液；
室温、避光孵育3小时，在摇床上摇动；
加1/10反应体积的反应增强剂到标记反应管中；
涡旋混匀，室温黑暗孵育15分钟；
加100μL储存液到反应管中；
涡旋混匀，室温黑暗孵育15分钟后，抗体即标记完成。
实验结果：
实验结显示，对血清来源的物质进行一抗直接标记的结果显著优于二抗间接标记的结果，由于直接标记一抗做Western blot可以使用高浓度的抗体，而采用二种或多种抗体进行Western blot可能会引入多种抗体导致的干扰，而不能准备地标记靶标蛋白。同时二抗或多抗需要降低使用浓度从而获得清晰结果，从结果图中可以看出二抗间接标记所得目的靶标蛋白不清晰(见图4A和B)。
2、采用免疫排斥抗原筛选方法对待测样本进行筛选
实验方法：采用实施例1所述的筛选方法、实施例2中优化出的最优条件对样本中的免疫排斥抗原进行筛选，对所得的2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果图和2D蛋白电泳转膜后Western blot结果图进行拟合得到拟合后的结果图，将2D蛋白电泳转膜后Western blot结果图中的结果点对应2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果图选取考马斯亮蓝染色胶上的点进行挖点检测，并送质谱进行鉴定；
实验结果：2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果见图5，2D蛋白电泳转膜后Westernblot结果见图6，对所得的2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果图和2D蛋白电泳转膜后Westernblot结果图进行拟合得到的结果见图7，将2D蛋白电泳转膜后Western blot结果图中的结果点对应2D蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果图选取考马斯亮蓝染色胶上的点进行挖点检测，挖点后对目的点进行蛋白质谱鉴定的结果显示，共确定出17种蛋白为免疫排斥抗原。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种筛选免疫排斥抗原的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行2D SDS-PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选；
(2)将2D SDS-PAGE蛋白电泳结果图和2D Western blot的结果图进行拟合，筛选重合点，进行挖点，进行蛋白质谱鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中每次做两张2DSDS-PAGE蛋白电泳胶；
优选地，所述两张2D SDS-PAGE蛋白电泳胶中一张做考马斯亮蓝染色、或银染；
优选地，所述两张2D SDS-PAGE蛋白电泳胶中另一张做转膜后，做2DWestern blot。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述2D Western blot是采用受者的血清或血清提取物进行的；
优选地，所述受者血清或血清提取物为直接标记的血清或血清提取物；
更优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甙酶、或葡萄糖氧化酶直接标记的血清或血清提取物；
最优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶直接标记的血清或血清提取物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述拟合的方式为将2D SDS-PAGE蛋白电泳结果图和2D Western blot的结果图中以某几个蛋白点及印迹点为参考进行图片的拟合；
优选地，步骤(2)中所述拟合还包括对拟合后的蛋白点进行一一标记。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的待测样本为细胞、或组织。
优选地，步骤(1)中所述的方法还包括对待测样本进行膜蛋白的提取。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(a)对待测样本的膜蛋白进行1D SDS-PAGE蛋白电泳；
(b)采用受者血清或血清提取物对步骤(a)中的膜蛋白进行1D Western blot；
(c)将步骤(a)和步骤(b)得到的结果作为2D SDS-PAGE蛋白电泳和2DWestern blot筛选的参考；
优选地，步骤(b)中所述的受者血清或血清提取物为直接标记的血清或血清提取物；
更优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甙酶、或葡萄糖氧化酶直接标记的血清或血清提取物；
最优选地，所述受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶直接标记的血清或血清提取物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的2D Western blot包括如下步骤：
(a)将2D SDS-PAGE蛋白电泳胶进行转膜；
(b)用封闭液室温下封闭1h、或4℃条件下封闭过夜；
(c)加入直接标记的受者血清或血清提取物进行孵育，室温下孵育1h、或4℃条件下孵育过夜；
(d)孵育结束后，取出膜，并用TBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min；
(e)将发光液A液和B液混合均匀后，滴在膜上进行显影；
(f)在暗室中，将胶片置于膜上，盖上压片夹进行曝光，曝光后将胶片放入显影液中进行显影。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述转膜的方法为湿法转移；
优选地，所述转膜中用到的转移膜包括硝酸纤维素膜、PVDF膜；
更优选地，所述转膜中用到的转移膜为PVDF膜；
优选地，步骤(b)中所述的封闭液包括BSA、血清、或脱脂奶粉配置成的溶液；
更优选地，步骤(b)中所述的封闭液为BSA；
最优选地，步骤(b)中所述的封闭液为5％BSA；
优选地，步骤(c)中所述的直接标记的受者血清或血清提取物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甙酶、或葡萄糖氧化酶直接标记的血清或血清提取物；
更优选地，所述受者血清为辣根过氧化物酶直接标记的血清或血清提取物。
9.一种免疫排斥抗原的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统中包括如下单元：
(1)输入单元：对待测样本进行膜蛋白的提取，得到待测样本的膜蛋白，并将其作为输入端的信息进行输入；
(2)初筛单元：初筛单元用于对输入单元得到的待测样本的膜蛋白进行1DSDS-PAGE蛋白电泳，采用受者血清或血清提取物对膜蛋白进行1D Western blot，将得到的初筛结果作为2D SDS-PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选的参考；
(3)筛选单元：以初筛单元得到的初筛结果为参考，对待测样本进行2DSDS-PAGE蛋白电泳和2D Western blot筛选，得到筛选结果；
(4)拟合单元：将筛选单元得到的筛选结果中的2D SDS-PAGE蛋白电泳结果图和2DWestern blot的结果图进行拟合，筛选得到重合点，并进行挖点；
(5)鉴定单元：将拟合单元进行拟合后得到的重合点进行蛋白质谱鉴定；
(6)输入单元：将鉴定单元经蛋白质谱鉴定得到的蛋白进行搜库比对，即得免疫排斥抗原，输出免疫排斥抗原的结果；
优选地，所述的待测样本为细胞、或组织。
10.如下任一方面应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1所述的方法在免疫相关疾病、或移植排斥相关的免疫排斥抗原筛选中的应用；
(2)权利要求9所述的筛选系统在筛选待测样本中的免疫排斥抗原中的应用。
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