CN111579769A - 一种对组织样本进行免疫标记的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对组织样本进行免疫标记的方法，具体地，本发明(a)提供一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；和(b)将所述的标记体系置于电场作用下进行标记处理，从而使得所述的探针进入所述组织样本内部，从而对所述组织样本进行免疫标记，获得经免疫标记的组织样本。本发明不仅能够缩短探针进入组织样本内部的时间，还能保持组织内部的完整性，具有极大的应用价值。
Description
本申请是申请日为2015年4月30日、申请号为201510219570.4、发明名称为“一种对组织样本进行免疫标记的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种对组织样本进行免疫标记的方法。
背景技术
研究生物医学组织在细胞和亚细胞尺度的三维空间结构，是理解其正常功能的基础，也能为掌握器官疾病的发生和发展过程提供依据。以前对人和其它动物组织的研究主要为解剖学尺度的研究，而在细胞和亚细胞尺度的研究则受限于解析能力的限制，通常只能研究组织切片的结构信息。基于组织连续切片的三维重构技术研究组织则非常耗时和费力。
近年来组织透明化技术的迅猛发展使人们获得完整生物组织的高分辨率三维结构成为可能，目前最常用的是CLARITY技术，其通过将水凝胶(Hydrogel)的交联形成的多聚物与组织中的生物分子(蛋白和DNA等)固定，并通过使用十二烷基硫酸钠(SDS)去掉细胞膜等对光线具有很强散射的生物分子，能在保证组织结构不被破坏的前提下，快速将生物组织透明化，并实现完整组织的深度(～6mm)三维成像。CLARITY技术最早应用于小鼠脑组织的透明化和结构研究，并逐步拓展到整个小鼠中主要器官(肾脏、肝等)，展示了这种技术在获取生物组织完整三维高分辨率结构信息方面的巨大潜在价值。
然而，将CLARITY技术用于研究完整组织三维高分辨率结构时，标记探针(特别是抗体)从完整组织的表面到达组织内部需要很长的时间，极大的阻碍了该技术的推广和应用。例如，对于5mm厚的完整小鼠大脑样品，一个完整免疫标记需要至少1.5月的时间才能完成。
因此，本领域迫切需要开发一种能够极大程度的缩短组织样本的免疫荧光标记时间，并且还能保持组织内部完整性的快速免疫标记方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够极大程度的缩短组织样本的免疫荧光标记时间，并且还能保持组织内部完整性的快速免疫荧光标记方法。
本发明的第一方面提供了一种对组织样本进行免疫标记的方法，包括步骤：
(a)提供一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；和
(b)将所述的标记体系置于电场作用下进行标记处理，从而使得所述的探针进入所述组织样本内部，从而对所述组织样本进行免疫标记，获得经免疫标记的组织样本。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述标记处理的时间为1min-5h时，较佳地，20min-1h，更佳地，30min。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述标记处理的温度为4-50℃，较佳地，10-40℃，更佳地，37℃。
在另一优选例中，所述的方法还包括：(c)对所述经免疫标记的组织样本进行检测。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的检测包括荧光检测。
在另一优选例中，所述的电场具有以下特征：电压为25V，电极间距离为2.2cm,电场强度为11.3V/cm。
在另一优选例中，所述的标记体系的pH为5-11。
在另一优选例中，所述的探针包括：抗体、核酸探针。
在另一优选例中，所述的探针带有可检测标志物。
在另一优选例中，所述的可检测标志物包括：荧光团、生色团、化学发光团。
在另一优选例中，当所述的探针为抗体时，所述标记体系的pH为5-11。
在另一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述单克隆抗体的等电位(PI)为6.4-9.0。
在另一优选例中，所述的组织样本是表达内源荧光蛋白的组织样本。
在另一优选例中，所述荧光蛋白为GFP蛋白。
在另一优选例中，所述组织样本为脑组织、胃组织、肝组织、肺组织或其组合。
在另一优选例中，所述组织样本来源于哺乳动物、人、或其组合。
在另一优选例中，所述组织样本来源于小鼠、大鼠、人、或其组合。
在另一优选例中，所述的组织样本为经透明化处理的样本。
在另一优选例中，所述样本为片状样本，具有第一主表面和第二主表面。
在另一优选例中，所述的片状样本的厚度为2-20mm，较佳地，3-18mm，更佳地，5-10mm。
在另一优选例中，所述的片状样本的截面积为1-100cm2。
在另一优选例中，所述的电场通过位于所述样本左右两侧或上下两侧的电极施加。
在另一优选例中，所述的电场通过位于所述样本的第一主表面和第二主表面外侧的电极施加。
在另一优选例中，所述探针进入组织样本内部的时间为20min-1h，较佳地，30-50min，更佳地，30-40min。
在另一优选例中，所述探针进入组织样本内部的时间比传统方法缩短了800倍。
在另一优选例中，所述的免疫标记为免疫荧光标记。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性和非治疗性的体外方法。
本发明第二方面提供了一种对组织样本进行免疫标记的装置，所述装置包括：
用于放置所述组织样本的容器；其中，所述容器用于盛放一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；
用于产生电场的电极对，其中，所述电极对位于所述组织样本的左右两侧或上下两侧，从而产生驱动所述探针进入所述的组织样本内部的电场；和
电源，所述电源与所述电极对电连接。
在另一优选例中，所述容器为圆形。
在另一优选例中，所述容器的直径为1-10cm，较佳地，3-4cm，更佳地，3.5cm。
在另一优选例中，所述电极直径为0.1-1mm，较佳地，0.2-0.8mm，更佳地，0.3-0.6mm；所述电极的长度为2-15cm，较佳地，4-10cm，更佳地，5-9cm。
本发明第三方面提供了一种对组织样本进行免疫标记的试剂盒，所述试剂盒含有：
第一容器，所述容器中含有待进行免疫标记的组织样本；
第二容器，所述容器中含有对所述组织样本进行标记的探针；
第三容器，所述容器中含有缓冲液，所述缓冲液的pH为5-11；
第四容器，所述容器中含有电极板、电源插头，形成一个电场强度(V/cm)为5-15的电场。
标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于对组织样本进行免疫标记。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了IgG在电场作用下的运动情况。
图2显示了在组织凝胶复合物中IgG的荧光定量结果。
图3显示了电场的免疫染色后Thy1-YFP小鼠脑片的YFP信号情况。
图4显示了电场的Thy1-YFP小鼠脑片的anti-YFP免疫染色结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，通过调节外加电场强度，探针能够快速进入到组织样本内部，对组织样本进行免疫标记，并能够保持组织内部的完整性，具体地，当外加电场强度(V/cm)为5-15时，探针在20min-1h之内即可到达组织内部，对组织进行免疫标记。本发明不仅能够缩短探针进入组织样本内部的时间，还能保持组织内部的完整性，具有极大的应用价值。
对组织样本进行免疫标记
如本文所用，所述“对组织样本进行免疫标记”通常指用抗体去特异性结合抗原的一种标记方法，其利用特定抗体的特异性结合性质来分离抗原、导向抗原、以及/或定量抗原。
在本发明中，所述“对组织样本进行免疫标记”是指在外加电场的作用下，用探针对组织样本内部进行免疫标记，与传统的方法相比，该方法不仅能够加速探针进入组织样本内部，还能保持组织样本内部的完整性。具体地，在外加电场的作用下，探针在20min－1h内即可进入组织样本内部，极大的缩短了完整透明化组织免疫标记的时间，与传统抗体分子扩散的方法相比，该方法可以将时间缩短800倍。
本发明提供的对组织样本进行免疫标记的方法，包括如下步骤：
(a)提供一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；
(b)将所述的标记体系置于电场作用下进行标记处理，从而使得所述的探针进入所述组织样本内部，从而对所述组织样本进行免疫标记，获得经免疫标记的组织样本。
对组织样本进行免疫标记的装置
如本文所用，所述“对组织样本进行免疫标记的装置”包括：
用于放置所述组织样本的容器；其中，所述容器用于盛放一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；
用于产生电场的电极对，其中，所述电极对位于所述组织样本的左右两侧或上下两侧，从而产生驱动所述探针进入所述的组织样本内部的电场；和
电源，所述电源与所述电极对电连接。
用本发明所述的“对组织样本进行免疫标记的装置”对组织样本进行免疫标记，不仅能够缩短探针进入组织样本内部的时间，还能保持组织样本内部的完整性。
对组织样本进行免疫标记的试剂盒
如本文所用，所述“对组织样本进行免疫标记的试剂盒”包括：
第一容器，所述容器中含有一个带有荧光标记的组织样本；
第二容器，所述容器中含有探针；
第三容器，所述容器中含有一个pH为5-11的缓冲液；
第四容器，所述容器中含有电极板、电源插头，形成一个电场强度(电压降/cm)为1.5-6的电场。
标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于对组织样本进行免疫标记。
本发明所述的“对组织样本进行免疫标记的试剂盒”不仅能够快速的对组织样本内部进行免疫标记，还携带方便。
本发明的主要优点包括：
(1)在外加电场的作用下，探针在20min－1h内即可进入组织样本内部，极大的缩短了完整透明化组织免疫标记的时间。与传统抗体分子扩散的方法相比，该方法可以将时间缩短800倍。
(2)在外加电场的作用下，组织样本内部的结构依然保持完整性。
(3)本发明扩大了组织透明化技术的应用范围，并将能实现对大尺度生物组织的三维高分辨率结构信息的研究。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1制备透明化小鼠的脑组织样本
去脂完毕的小鼠脑片用剃须刀片修成长方形，并装载在两片盖玻片之间。调节蓝丁胶的厚度，保证脑片装载后蓝丁胶可以将脑片的上下边缘封闭。在两片盖玻片之间，沿着蓝丁胶的边缘加入少量的环氧树脂胶。
实施例2为透明化小鼠的脑组织样本配置电场装置
将制作好的玻片-脑片组合放入培养皿中，在35mm培养皿的盖子上钻两个直径1mm的小洞，并将两根直径为0.5mm、长8cm的铂金电极(购于Sigma)从小洞中穿过，将电极弯折成直角，用蓝丁胶在小洞处对电极进行加固，在培养皿中加入2ml抗体稀释液，将盖子盖在培养皿上，将培养皿装载在显微镜载物台上，用鳄鱼夹夹住电极并与电源(KXN-6020D,ZHAOXIN)相连。
实施例3电场加速抗体进入脑组织样本内部的检测结果
实验方法：
1)将6μl的IgG(购于分子探针公司)稀释于2000μl的0.1M的硼酸钠缓冲液(pH8.5)中。
2)将抗体稀释液加入培养皿中的，盖上电极盖。
3)在显微镜下找到样品的扩散边缘后，拍照记录。
4)静置30分钟后再次拍照记录抗体分子在脑片中的扩散情况。
5)打开电源，调节电压至25V，电泳30分钟后拍照记录。
6)处理图片及提取信息。
实验结果：
(1)如图1-2所示，结果表明，在电场的作用下，抗体较均匀的充满了整个脑片，与未加电场的对照组相比，抗体能够在30分钟内充满整个脑片。
(2)如果将抗体浓度达到最大浓度的50％处的组织深度定义为抗体的扩散前沿，那么在30分钟内IgG大约扩散到了组织内部3.9mm深的地方。因此，IgG分子自由扩散至相同的扩散前沿需要的时间大约是不加电场情况下的800倍。
实施例4对小鼠脑组织样本进行免疫染色
实验方法：
1)对去脂好的Thy1-YFP小鼠脑片进行封片。
2)将6μl的IgG抗体(抗GFP抗体，购于分子探针公司)稀释于2000μl的0.1M的硼酸钠缓冲液中(pH8.5)，并缓慢加入到培养皿中。
3)打开电源，调节电压至25V，电泳30分钟，帮助抗体进入组织内部。
4)关闭电源。静置孵育90分钟，让抗体和抗原充分结合。
5)打开电源。调节电压至25V，电泳30分钟，将组织内部未结合的抗体除去。
6)吸去培养皿中的抗体稀释液，换上2ml干净的0.1M硼酸缓冲液。
7)成像，观察标记结果。
实验结果：
如图3-4所示，经历了前后60分钟的电泳，Thy1-YFP小鼠脑片中的YFP信号依旧被完好的保护着，并且YFP信号能够很好的和抗体信号重合。
结果表明，外置电场能够帮助IgG抗体快速进入组织样本内部，并对组织内部进行免疫标记。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种对组织样本进行免疫标记的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；和
(b)将所述的标记体系置于电场作用下进行标记处理，从而使得所述的探针进入所述组织样本内部，从而对所述组织样本进行免疫标记，获得经免疫标记的组织样本，其中所述的组织样本为经透明化处理的样本，所述的电场具有以下特征：电压为25V，电极间距离为2.2cm，电场强度为11.3V/cm，所述的样本的截面积为1-100cm2，所述的样本的厚度为2-20mm；
所述样本为片状样本，所述的电场通过位于所述样本左右两侧的电极施加，并且，所述缓冲液为pH为8.5的硼酸钠缓冲液；所述探针为IgG抗体；所述组织为脑组织。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：(c)对所述经免疫标记的组织样本进行检测。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述的检测包括荧光检测。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记体系的pH为5-11。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本具有第一主表面和第二主表面。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的样本的厚度为3-18mm。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)将6μl的IgG抗体稀释于2000μl的0.1M的硼酸钠缓冲液(pH8.5)中，从而获得抗体稀释液；
2)将所述抗体稀释液加入培养皿中的，盖上电极盖；
3)在显微镜下找到样品的扩散边缘后，拍照记录；
4)静置30分钟后再次拍照记录抗体分子在脑片中的扩散情况；
5)打开电源，调节电压至25V，电泳30分钟后拍照记录；
6)处理图片及提取信息，从而获得经免疫标记的组织样本。
8.一种对组织样本进行免疫标记的装置，其特征在于，所述装置包括：
用于放置所述组织样本的容器；其中，所述容器用于盛放一标记体系，所述标记体系含有待进行免疫标记的组织样本、用于对所述组织样本进行标记的探针和缓冲液；
用于产生电场的电极对，其中，所述电极对位于所述组织样本的左右两侧，从而产生驱动所述探针进入所述的组织样本内部的电场；和
电源，所述电源与所述电极对电连接，其中所述的组织样本为经透明化处理的样本，所述的电场具有以下特征：电压为25V，电极间距离为2.2cm，电场强度为11.3V/cm，所述的样本的截面积为1-100cm2，所述的样本的厚度为2-20mm；
所述样本为片状样本，所述的电场通过位于所述样本左右两侧的电极施加，并且，所述缓冲液为pH为8.5的硼酸钠缓冲液；所述探针为IgG抗体；所述组织为脑组织。
9.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述容器的直径为1-10cm。
10.一种对组织样本进行免疫标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
第一容器，所述容器中含有待进行免疫标记的组织样本；
第二容器，所述容器中含有用于对所述组织样本进行标记的探针；
第三容器，所述容器中含有缓冲液，所述缓冲液的pH为5-11；
第四容器，所述容器中含有电极板、电源插头，形成一个电场强度(V/cm)为5-15的电场；
标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于对组织样本进行免疫标记；其中所述的组织样本为经透明化处理的样本，所述的电场还具有以下特征：电压为25V，电极间距离为2.2cm，电场强度为11.3V/cm，所述的样本的截面积为1-100cm2，所述的样本的厚度为2-20mm；
所述样本为片状样本，所述的电场通过位于所述样本左右两侧的电极施加，并且，所述缓冲液为pH为8.5的硼酸钠缓冲液；所述探针为IgG抗体；所述组织为脑组织。
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