JP2005345197A

JP2005345197A - 超音波を使った生体組織の迅速処理法

Info

Publication number: JP2005345197A
Application number: JP2004163359A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiko Yamada; 仁彦山田; Yasuhiko Kitayama; 康彦北山; Kiyotaka Ishihara; 清隆石原; Hironobu Minae; 博信薬袋
Original assignee: Jokoh Co Ltd
Current assignee: Jokoh Co Ltd
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2004-06-01
Publication date: 2005-12-15

Abstract

【課題】
生体の一部を数ミリから１〜２ｃｍ程採取してきて検査する生検材料ではこれらの過程に通常２〜３日と長時間かかっており、最終診断が出るのに３〜５日程必要である。このうち組織の固定からパラフィン浸透までの組織包埋が大部分の時間を占めている。
【解決手段】
本発明は上記課題を解決することを目的とし、組織に固定から脱水、中間処理工程、パラフィン浸透の工程に超音波を照射し、温度を５０℃〜７０℃に保持することで従来よりも短時間で綺麗な組織診断用の病理組織検体を作成できる。
【選択図】
図１

Description

本発明は、生体組織切片作成時に超音波を照射することによって迅速かつ高感度な病理組織検体の作成を可能にする方法に関するものである。

従来、病理診断用の生体組織切片作成には組織のホルマリンによる固定工程からアルコールによる脱水工程、キシレンによる中間処理工程、パラフィンによるパラフィン浸透工程等の工程を経た後、パラフィンの充填を行い、パラフィンブロックを作成する。その後パラフィンブロックの薄切を行い、スライドガラスに貼り付けた後キシレンによる脱パラフィン・脱キシレン・脱アルコール等を行い、各種の染色法で染色してカバーグラスをかけるという手順を踏む。

生体の一部を数ミリから１〜２ｃｍ程採取してきて検査する生検材料では、これらの過程に通常２〜３日間かかっており、最終診断が出るのに３〜５日必要である。このうち組織の固定工程からパラフィン包埋工程までの組織包埋が大部分の時間を占めている。

従来の生体組織処理法フローチャートは次のようになる。
１、生検で採取された組織(約５ｍｍ以下)の固定工程
１０％〜２０％緩衝ホルマリン液（常温）：５〜６時間
２、脱水工程（常温）
７０％アルコール１時間
８０％アルコール１時間
９０％アルコール１時間
９５％アルコール１時間
１００％アルコール１１時間
１００％アルコール２１時間
１００％アルコール３１時間
３、中間処理工程（常温）
キシレン１１時間
キシレン２１時間
キシレン３１時間
４、パラフィン浸透工程（６０℃）
パラフィン１１時間
パラフィン２１時間
パラフィン３１時間
５、パラフィンの充填と冷却
６、薄切
７、６０℃で伸展３０分
８、脱パラフィン、脱キシレン、脱アルコールに２０分
９、染色約１５分

生検以外の手術で切除された胃や大腸、乳腺、肝臓、腎臓、肺などの大きな検体では上記のように組織の固定から切片作成までに４〜５日かかり、従って最終診断までに６〜１０日かかるのが一般的である。

超音波は高周波電気エネルギーを機械エネルギーに変換する振動子により発生し、容器の中の液に伝達され液中に高低の圧力波を交互に起こすことによって効果を発揮する。液中に無数の微小な泡が形成され低圧力波の間に空洞(キャビテーション)をつくり、次の高圧力波の間にこれらの空洞は破裂し、その機械的な衝撃で液の浸透性を高めることが出来る。

通常病理組織検体は最初に１０％〜２０％緩衝ホルマリン液によって組織の固定を行う。常温で生検の検体であれば最低４〜５時間、手術材料では１〜２日は必要であるが、一般的には４〜５日間は浸けっぱなしの状態になっている。しかし過固定は組織の変性・破壊が強くなり、また核DNAも高度に変性してしまうのでその後の遺伝子解析にも不都合となる。
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生体の一部を数ミリから１〜２ｃｍ程採取してきて検査する生検材料ではこれらの過程に通常２〜３日と長時間かかっており、最終診断が出るのに３〜５日必要である。このうち組織の固定からパラフィン浸透までの組織包埋が大部分の時間を占めている。

本発明は上記課題を解決することを目的とし、その手段は生体組織にホルマリン固定液を浸透させる固定工程、脱水剤を浸透させる脱水工程、キシレンを浸透させる中間処理工程、パラフィンを浸透させるパラフィン浸透工程で超音波を照射することで従来よりも短時間で綺麗な組織診断用の病理組織検体を作成できる。この時温度を約６０℃に保持する。

２〜５ｍｍ大の検体であれば１５〜３０分で固定工程が終了する。手術で取り出された検体では厚さ１〜２ｃｍの検体では１〜２時間で固定工程が終了する。

脱水工程から包埋工程までの全包埋行程は約１時間で終了する。

本発明の超音波を使った生体組織処理法のフローチャートは次のようになる。
１、生検組織(約５ｍｍ以下)の固定工程
１０％〜２０％緩衝ホルマリン液（常温）：１５〜３０分
２、脱水工程（６０℃）
７０％アルコール５〜１０分
８０％アルコール５〜１０分
９５％アルコール５〜１０分
１００％アルコール５〜１０分
１００％アルコール５〜１０分
３、中間処理工程（６０℃）
キシレン１５〜１０分
キシレン２５〜１０分
４、パラフィン浸透工程（６０℃）
パラフィン１５〜１０分
パラフィン２５〜１０分
５、パラフィン充填と冷却
６、薄切
７、６０℃で伸展３０分
８、脱パラフィン、脱キシレン、脱アルコール２０分
９、染色約１５分

従来の方法より遥かに短時間で検体作成が可能となるのみならず、固定を６０℃というやや高温で行うことによってその後のＨＥ染色や、特殊染色・免疫染色の染色性の感度を上げることが可能となる。この高感度な染色性によって組織診断における精度の向上を計ることが出来るようになる。

本発明における組織の固定によって、細胞核のDNAが良好に維持されるため、in situ hybridization (ISH)による感染ウイルスの同定や蛍光色素を使用したFISH法などを含めた遺伝子解析にも有用となる。

固定工程は、ステンレス槽に１０％〜２０％の緩衝ホルマリン液を満たし、その中に、主に手術で取り出された胃や大腸、乳腺、肝臓などの臓器を、コルク板に針やピンで張りつけたものを逆さにして液に浮かせる。上ブタを閉じた状態で４０ＫＨｚ〜５０ＫＨｚの超音波をステンレス槽の底面から連続照射する。液温は約６０℃に維持する。この状態で厚さ１〜２ｃｍ程度の通常の手術材料であれば１〜２時間で固定が終了する。

また生検で採取された５ｍｍ以下の検体の固定工程は、プラスチック製のカセットに移し替えた状態で、ホルマリン液を満たしたステンレス槽の中に入れ、底面から４０ＫＨｚ〜５０ＫＨｚの超音波を照射する。液温は約６０℃に維持する。この状態で１５分から３０分で組織の固定が終了する。

脱水工程は、同じステンレス槽内で７０％アルコール５分、８０％アルコール５分、９５％アルコール５分、１００％アルコール５分二回底面から４０ＫＨｚ〜５０ＫＨｚの超音波を照射して脱水を行う。液温は約６０℃に維持する。

脱水工程が終了したらそのままカセットに入れた状態で、キシレンによる中間処理工程を行う。ステンレス槽内のキシレンの温度は約６０℃に設定し、底面から４０ＫＨｚ〜５０ＫＨｚ超音波を照射する。キシレン５分二回の処理を行う。

キシレンによる中間処理工程終了後、カセットに入れたままの検体をステンレス槽内に入れた状態でパラフィンによるパラフィン浸透工程を行う。６０℃５分で二回処理する。底面から４０ＫＨｚ〜５０ＫＨｚ超音波を照射する。

その後は通常の病理診断用検体作成と同様に、組織のパラフィンの充填を行った後冷却する。ブロックとして固まったところで組織を数ミクロンの厚さにミクロトームで薄切する。その後スライドガラス上にのせ、３８℃で３０分程組織の伸展を行う。次に脱パラフィン、脱キシレン、脱アルコールなどに約２０分かけた後、各種の組織染色を施す（約１５分）。ここで診断用スライドが完成となる。

このように短時間の固定工程からパラフィン浸透工程によって組織の状態が良好に維持されるため、その後の組織染色性も改善され、HE染色のみならず特殊染色や免疫染色でも高感度な染色性が得られる。同時にin situ hybridization (ISH)や蛍光を用いたFISHによる遺伝子・染色体解析、及び研究用のDNAや遺伝子の解析にも有用となる。

尚、本発明は、上記実施形態に限定されない。例えば、組織のホルマリン固定温度は６０℃に限定されず、組織の種類・大きさ等によって加温する温度範囲は任意である。超音波は、作用、効果を示す限り、通常の意味での超音波に限らず、その上、下限を越えた音波を照射しても良い。また、超音波は一方向に限らず、多方向から照射しても良い。

本発明の構成の例を示す模式図である。

符号の説明

１ステンレス槽
２超音波振動子
３上ブタ
４コルク板
５胃などの臓器
６針
７１０％或いは２０％の緩衝ホルマリン

Claims

生体組織切片作成において、固定液、脱水剤、中間処理剤又はパラフィンに生体組織を浸漬した状態又は接触した状態で、生体組織に前記液又は剤を浸透させる工程で、その何れか又はすべての工程で前記液又は剤又は組織を介して超音波を照射することを特徴とする組織処理法。
固定液、脱水剤、中間処理剤又はパラフィンを用いた生体組織切片作成において、その何れか又はすべての工程で、前記液又は剤の温度を４０℃〜７０℃に保持することを特徴とする請求項１に記載の組織処理法。
生体組織の固定から脱水、中間処理、パラフィン浸透までの工程の一部の工程又はすべての工程を連続して行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の組織処理法。