CN102781226B - 通过超声波及温度控制的标准化组织样本保护 - Google Patents
通过超声波及温度控制的标准化组织样本保护 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了通过超声波及温度控制的标准化组织样本方法及其装置,其包括在冰冷固着剂中存放组织样本,在冷冻的温度下让固着剂穿透,和利用超声波加速固着剂穿透。同时说明了超声波的用途和在脱水、清洁和注入步骤中温度控制的用途。
Description
技术领域
本发明涉及组织样本领域,更具体地,本发明涉及一种通过超声波及温度控制的标准化组织样本保护。
背景技术
1.组织保护领域的概况
当从病患身体上取出组织样本之后,缺血性层叠立即开始。缺血性层叠导致很多易受影响的细胞分子,例如mRNA(信使核糖核酸)降解、组织样本中蛋白质脱磷酸作用。因此,越久的组织样本缺血,越多的病患组织样本分析前的改变将会发生。这种改变常常阻碍正确的判断和敏感分子的诊断和预测报告[Liotta 2000,Emmert-Buck 2000,Compton 2007,Hewitt 2008,Espina 2008]。通过将组织样本保存在一个深度冰冻的环境来阻止分子改变的快速冷冻法,是一个为细胞分析的组织样本保存的标准方法。然而,除了高额的花费和复杂的设备外,快速冷冻破坏了组织样本的细胞形态。好的组织形态是诊断组织样本需求量最重要的关键。
在现行的外科组织学实践中,组织样本总是被一大团或粗鲁的放置入固着剂中固定。固定的组织然后通过脱水、清除、注入石蜡、然后牢牢的嵌入到石蜡块中。福尔马林是最常被临床病理学用来做固定剂的[Hewiit 2008,Fox 1985,1987,Boon 1988]。现代的组织学是以组织形态被福尔马林固定和石蜡植入(FFPE)组织展示为基础的。福尔马林固定的组织在大多数临床病理学实验室常常被拿到一个恒温的房间一整夜或更长时间。易受影响的分子可能会比样本完全浸泡入福尔马林前减少。对比甲醛和蛋白质在室温中快速反应,引起组织外围的大范围交联排列和组织中心的小范围的交联排列。长时间的固定时间有时必须防止中心区域赶上边缘区域在交联的范围[Medawar 1941;Boon 1988;Helander 1994,1999;Ruijter1997]。
福尔马林固定组织样本有以下2个主要问题:(1)生物分子被大范围的交联严重的破坏;(2)由于各种不同的固着时间,交联水平也呈现出不同的样本。因此传统的FFPE样本通常不是标准的。缺少标准化和分子的大量改变,是FFPE组织样本被用于数量上的分子分析的主要障碍。
一定数量的无交联固着剂试图发展成为适应定量分子分析。[Wenk 2006;Wester K2003;Boon 2008;Espina 2009]。无交联固着剂提供的组织形态学不同于那些福尔马林提供的——一个约束无交联固着剂在诊所病理学群体被广泛接受的主要因素。解决组织保存问题的一个理想的方法是发展一种方法,可以产生不仅拥有高标准的FFPE形态,而且高质量的分子,类似用一种简单的和有效的快速冷冻组织方式。
2.相关技术的解释
传统方法是用在隔离溶解的含10%磷酸(盐)缓冲液的甲醛来准备固着组织,一系列的渐增的脱水乙醇的浓聚物,和可以导致组织样本脱水的二甲苯,在石蜡前注入。由于这些进程必须花费这些时间,通常8小时或者更长时间,习惯上完成这些分开的步骤:固着,脱水,干燥,注入,一整夜的在为了完成那些任务所设计的自动机械仪器中,(例如,U.S.Pat.Nos.3,892,197,4,141,312,and 5,049,510)。一个典型的自动组织样本处理器(TISSUE-TEK)需要超过8小时,并且程序设定的处理一组组织样本。
在水溶液中,甲醛分子[HCOH]与水结合,形成甲二醇[CH2(OH)2],与未水合的甲醛分子相平衡生存,如下:
HCOH+H2O←→CH2(OH)2
低温倾斜这些平衡的甲二醇分子将比未水合的甲醛分子更快渗入组织。不管怎样,是甲醛分子建立了这种交联的桥梁。福尔马林固着剂跟温度有说不清的关系:1)低温有益于分子作为组织样本保存,使交联变缓慢,但福尔马林扩散至组织样本变的更加容易;2)高温有益于减轻交联的HCOH形成,但同时,交联的蛋白质在组织边缘放缓福尔马林渗透入组织中央;3)在低温下,分子扩散速度一般变低,是由于分子运动的减少,所引起的福尔马林穿透速度的明显减少。
在室温中,福尔马林固着按先后顺序有一个惯例的组织样本(1-4mm在最厚的部分),如下:(1)甲二醇迅速扩散到内部大约需要1-4h;(2)成功步骤(甲二醇脱水和交联反应)一起大约需要24h;因此,甲二醇的扩散在这里不是被稠密的交联的蛋白质网络阻碍的。然而,在高温下,所有的3个步骤都被加速。因为脱水和交联也在某些甲二醇存在的被加热组织中首先完成,也就是说,组织大块的边缘,进一步的扩散进入中心是被稠密的蛋白质网络阻碍产生的。
为了加速组织进程,美国专利号4,656,047,4,839,194,和5,244,787利用微波能量,美国专利号3,961,097,5,089,288,和6,291,180利用超声波能量,美国专利号5,023,187利用红外线能量。
能影响组织固着的超声波的三个因素如下:1)微型的气孔和高效的对流在固着中根据超声波生产了,而且组织样本增加了组织对固着剂分子的浸透性;2)超声波引起了温度的逐渐增加,导致交联速度的逐渐增快;3)超声波可能产生固着剂中的自由基也跟福尔马林产生交联。
当针对个人的要正在朦胧地出现,对高质量和高标准的组织样本有了一个迫切的需求。这种需要,当把它们转变成FFPE组织样本准备,需要组织样本很快地而且平均地被固定,而且处理步骤标准化。因此,建立程序和可能完成所有这些的仪器设备是可取的。
缺乏标准化的记录和缺乏福尔马林组织固着的内部控制是FFPE组织样本的主要缺陷。长时间的陷于固着剂中,尤其那些大的样本是做及时的诊断的最主要的限制。它也被视为激励手术室和病理学实验室中改变前置固定组织操作程序的一个主要的因素。在大多数的医院中,组织在手术室中被放在福尔马林之中;因此,病理学家不能够控制固定时间。因为福尔马林固着的持续时间影响交联的程度,也就是依次影响分子数量的化验的有效性,因此,实际上不可能在石蜡切片上做到标准化的数量上的研究报告。除此之外,大于25克的固体样品并不总是能在24小时的福尔马林中被固定完成。将外科手术样本切成较小的片以促进固定,但是对最终的解剖方向并不受欢迎,而且时常延迟前置固定时间巨大分子结构的改变,尤其参与细胞路径信号的细胞成份,连同组织自溶,在组织从病患身上移下后立即发生。在被大多数的病理部门用的记录中,福尔马林固着是在室温或促进福尔马林渗透的更高的温度中完成的。在持续很长时间的渗透阶段在周围的温度,易受影响分子自溶的下降,例如mRNA,使磷酸化蛋白质和蛋白质抗原可能发生。除了巨大分子变化之外,在周围温度引起的福尔马林边缘的迁延照射不断发生,导致过度固着,同时大的样本中心固着不完全。这些不规则的固定常常导致免疫组织化学化验和可能的许多其他分子测试结果不一致。
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发明内容
这个发明是有关那些被用于促进固着和组织样本进程的利用超声波和温度控制来实现标准化的组织样本保存的方法和装置。首先,这个发明涉及一种低温的固着方法,其包括:(a)在一冷冻的低温下将组织样本浸入到固着剂中;(b)用一重叠的超声波冷冻系统来照射固着剂中的组织样本以保持组织样本和固着剂温度保持在低点;(c)随意地,关掉重叠冷却系统,并提高组织样本温度,并继续单独超声波照射固着剂,或与其他加热方法结合;(d)随意地,用化学试剂或冷却停止(淬熄)交联反应。
这个发明也涉及组织样本保存方法,其包括:(a)固着步骤,其包含:i)组织样本在从病患身上切离之后立即浸泡入固着剂中,并保持低温直至下一个步骤;ii)组织样本在寒冷的固着剂中被超声波照耀,样本/固着剂的温度被一个有层次的冷却系统用超声波彻底的、均匀的穿透固着剂分子;iii)随意地,固着剂的温度然后在冷却系统被关掉的时候,被其他类型的超声波、微波炉或能源升起。(b)至少一个脱水步骤,其包含,固着的组织样本浸泡入一个脱水的环境,然后用超声波照射固着的组织样本;(c)至少一个清洁程序,其包含,浸泡这个固着过的、脱水的组织样本进入一个洁净的环境,然后用超声波照射固着过的、脱水的组织样本;(d)一个浸透步骤,包含浸泡这个固着过的、脱水过的,并且清洁过的组织样本进溶解的蜡或者石蜡中,然后用超声波照射固着过的、脱水过的,并且清洁过的组织样本。
本发明也与组织样本保存装置相关,其包含至少一个为了陈放组织样本和保存反应物容器,一用来产生超声波填满组织保存反应物超声波发电系统,和一外加超声波发电系统来维持一个低的温度的温度控制系统。
附图说明
图1:用超声波和温度控制标准化的预分析组织样本保存工作流程;
图2:不同福尔马林浓度的固着剂环境的交联结果;
图3:溶菌酶,BSA,肌红蛋白,核糖核酸酶A,胰蛋白酶和蛋白,在1x PBS,pH 7,20mg/ml.情况下分别溶解;每50ml蛋白质溶液与相同容量的NBF混合,在特定温度下培养10分钟。培养后,每培养的6ml混合物由2ml 4倍的SDS装载缓冲并装载到一个良好的SDSPAGE,用电泳疗法分开,并用考马斯蓝进行染色;
图4:一个US变频器包含在一个可从溶解室(反应室)移动的变频器外罩内的US反应室构造;在这个结构中,声波通过一种方向发出。组织样本可以使依附在一个可移动外罩上,然后可以与外罩一起从这个反应室移动到另外个反应室;
图5:一个US变频器包含在一个可从溶解室(反应室)移动的变频器外罩内的US反应室构造。在这个结构中,声波通过一种方向发出。组织样本可以使依附在一个可移动外罩上,然后可以与外罩一起从这个反应室移动到另外个反应室;
图6:一个加入冷却/加热系统的US反应室结构。在这个结构中,固着剂或反应进程溶液在这个冷却/加热装置中冷却或者加热,并且在US反应室中循环进出;
图7:一个在US反应室中用来产生真空和压力的气泵/活塞的结构。在这个结构中,US反应室的底部添加一个US变频器,利用升降来为US反应室产生压力和真空;
图8:一个在US反应室中用来产生真空和压力的气泵/活塞的结构。在这个结构中,US反应室的顶部升高或降低来为反应室提供压力和真空;
图9:牛的肾脏(1),肝脏(2),胰腺(3)组织样本H&E固着,在(A)室温中一整夜和在(B)4摄氏度(上翼片)的对比;和量化的每份原子核数量和原子核大小(下翼片);
图10:肝脏组织样本中心和边缘的H&E着色,利用和未利用US放射;
图11:在母牛肾组织样本上的IHC和蛋白质印迹研究,在4摄氏度下用US放射(US-LT-FFPE)30分钟和一整夜的在室温下(FFPE)。IHC化验为波形蛋白和细胞角蛋白没有抗原取回做准备。蛋白质印迹化验是用从相同数量的组织样本用各自的方法固定的完整的蛋白质抽出的;
图12:RNase A在放射性示踪物下在福尔马林和RNA,50%的甲醇,和用PBS在高压蒸汽灭菌器(120℃)中30分钟抑制活动的比较;
图13:RNaseA在指定数量的NBF在放射性示踪物下或4℃下5分钟,然后混合2μgtRNA培养和在室温下30分钟给RNase A反应和用2%的琼脂糖凝胶分开。tRNA分子长度在50-100核苷之间。
图14:固定在4度或室温中性缓冲福尔马林溶液中不同时间长度后,T47D细胞裂解液的SDS-PAGE和Western blot的分析。(1):通过考马斯亮蓝染色的SDS PAGE图片。(2):HER-2和ER抗体在westernblot膜上的染色。(3):不同固定时间长度和温度下,HER-2和ER的Western blot信号强度分析。
具体实施方式
现在,几乎所有临床的组织样本都是在室温的福尔马林中被处理。[Hewitt 2008,Boon2008]。在寒冷的福尔马林中处理组织是被深思熟虑过后,并且只偶尔用于研究。妨碍冰冻福尔马林固着程序在临床中被广泛接受的原因,包括下列各项:
1.普遍相信,一个充分的交联水平必须持续到组织样品被显微镜观察前被确保恰当的保存。
2.组织样本达到一个期望的交联水平,在寒冷的环境中比在室温中需要更多时间。
3.处理组织在室温中更为方便。
我们已经展示,组织样本在4摄氏度中用福尔马林固着一整夜产生极好的FFPE形态,虽然组织样本仍然看起来新鲜,但仍然要指出的是,微量的交联已经足够提供优质的福尔马林形态。
在寒冷的福尔马林固着组织中的完整有效的生物标记,比那些在传统室温方法处理免疫组织化学(IHC)和蛋白质印迹分析要更好。我们进一步示范,超声波(US)照射可以显著减少在组织样本在寒冷福尔马林中固定的时间。
一个好组织样本保存策略应该显示出立即禁止自我分解的能力(也就是,内生毁灭性的酵素的失活),减少分子改变的能力,产生维护组织样本最佳细胞和亚细胞形态的能力,和尽可能多的高分子从组织样本中恢复的能力。
中立的缓冲的福尔马林(NBF),常常当作10%NBF提及,是在磷酸盐缓冲盐水中10倍稀释的福尔马林溶液,其中甲醛含量大约为3.7-4%。NBF在常规组织保存中是常用的交联固着剂。低于4%含量的福尔马林溶液,例如,2%、1%甚至更低,被用来测试蛋白质交联效果。更低的福尔马林含量,产生更低的固着剂交联或改变呈像,因此,交联或分子修改水平是非常低的。
在这里发表的是一种在组织固着中通过减少固着剂浓度来控制和使交联/修改水平标准化的一种方法。与NBF(例如,3.7%-4%甲醛)相比,福尔马林溶液在进入较低浓度的组织样本的穿透能力更慢。不管怎样,通过超声波和/或其他方法减轻增加组织样本可渗透性的困难,低甲醛浓度的固着溶液可以被使用,同时,更少有毒的甲醛废料将被生产。由于更少的交联和其他生物分子修改被形成,低甲醛浓度的溶液可以更大程度上的使生物分子从固着的组织样本中恢复更便利,同时,在组织样本中通过产生一个规则的交联/修改水平的组织固着也更标准化。
同时发表的是一种控制交联/修改水平的方法,也可以说是,减缓组织自动降解,通过低温在组织固着时间中。在低温下,通过甲醛的生物分子交联/修改变得缓慢,所以,一个统一的、适度的交联/修改水平可以在组织样本中很容易的被实现。由于酶活性在低温中被大大的减少,缺血性的串联和组织降解将会大大的减少。低温(例如,0-25摄氏度,2-20摄氏度更好,最好是4-18摄氏度)可以被应用与整个固着步骤。它也可以应用于最先的渗透阶段,即被接受加热交联阶段。它甚至可以被应用于一连串的冷冻阶段-加热阶段-冷冻阶段,那里第二冷的阶段被用来停止或减缓在加热阶段的交联速度。
其他控制和使交联/修改水平标准化的方法,是通过向固着溶液中添加猝熄(停止)试剂。
此外发表的是一个通过无论是交联还是未交联固着剂的固着程序都可以使两阶段程序便利。作为交联固着剂,例如甲醛,这个发明关系到在低温下的渗透过程,可选择性的接受被一个交联阶段在热的或外界环境温度:在一个低温,在缺血性串联中大多数的酶的活性被抑制;在低温下,交联反映被抑制,甚至甲醛分子穿透整个组织样本的渗透;在高温下,交联反应是快速的,反应时间可以在短时间被限制以促进交联水平的标准化。
交联温度和时间可以被调整来生产更好的交联/修改水平。例如,组织样本可以被NBF在4-10摄氏度下一整夜,通过或不通过超声波照射固着,紧接着通过例行的脱水、清洁和石蜡注入,在一个组织自动处理机。在例行程序的室温下固着组织样本的组织样本结果的细胞的和亚细胞的形态学没有区别。然而,由于低水平的生物分子交联和修改,生物分子取出和检验的有效性,同生物分子的质量和完整度,都显著的改善。
对于没有交联的固着,也被称为凝结剂固着,例如醇类、酮、和其他以醇类和酮为基础的固着剂,连同以锌为基础的固着剂,在低温下,在缺血性串联中大多数酶类的活性是被抑制的,因此,自溶在固着剂渗透进入组织中的过程中是被抑制的。
外部的力量,例如超声波,被应用于克服,在低温下,固着剂分子缺乏渗透进组织样本的高效渗透能力,即在0-25摄氏度的范围内,更好的在4-18摄氏度,为了缩短固着时间。由于超声波在溶液和在溶液中的组织样本中照射而产生的适度发热,一个冷却系统被需要来保持这个低温。越强烈的超声波照射,需要越强力的冷却系统。超声波照射可以在相对较低强度的冷却系统下持续使用,或在相对较强的冷却系统下脉冲使用。
当固着剂分子在超声波照射下进入组织样本,冷却系统可以关闭,然后,溶液和组织温度被超声波单独或与其他加热装置结合提高(例如,微波加热、红外线加热、电阻加热和电子加热)。超声波使固着剂在低温下渗透进组织样本变的容易,同时,超声波可以提升温度为后面的交联或组织样本的分子凝结创造便利。
在福尔马林固着的例子中,建立一个低温的渗透规程可以显著减缓分子的改变,如同在渗透阶段的交联形成物一样。一旦甲二醇分子均匀的渗透浸入组织样本,它将有可能通过一套标准的时间和温度使接下来的不同类型和尺寸的组织样本的交联反映更好的被控制。超声波便利化的组织固着的新程序也许可以如下:1)从病患身上移除后立即将组织样本放入冷的固着剂中(或者非强制性的,放入一个特殊的US可穿透的容器,然后转移到)一个有冷却系统的超声波装置。这个组织样本经过超声波照射来提高当冷却系统被打开来维持低温时福尔马林的渗透速度。2)从组织样本中经过的声音信号被收集和分析来监视渗透程度(非强制的)。3)当渗透完成,冷却系统停止运作,超声波继续照射,或与其他加热系统一起,使组织样本的温度提高到交联温度;4)从组织样本中经过的声音信号被收集和分析来监视交联程度(非强制的);5)当交联完成,固定的组织样本可以直接受超声波便利化的接下来的程序(逐项工作流程)或降低温度至4摄氏度来停止交联程序,然后等待成批处理(常规工作程序)。
在福尔马林固着的例子中,渗透时间取决于组织厚度。
当组织厚度薄于4mm时,低温渗透时间应该在被超声波照射的情况下被控制在60分钟以内。为了保持低水平的交联,固着程序应该被在(有或者没有超声波照射的)一个低温的环境中实施。一个冷却系统被用来叠加超声波照射,当低温和超声波都被需要的时候。
当组织样本厚于5mm时,在低温下(比如4-15摄氏度)的固着渗透在超声波照射下可能需要更长时间(超过2小时),需要一个时间坡度来贯穿从渗透的低温到交联温度(25-70摄氏度)。超过5mm厚度的组织样本所需要的时间坡度被设定在10分值至6小时以内。超声波能力可以改变来调整溶液与组织样本的热传递。交联温度被设定在25-70摄氏度直接,40-60摄氏度之间更好,最好是在45-55摄氏度之间。交联时间被设定在2-60分钟,5-15分钟更好。
为了控制交联/分子修改水平,化学试剂或一个额外的冷却程序被用来阻止长时间的尝尝导致过交联的交联反应。因为由于不同的结构和内容所导致的不同组织类型性质的极大的反差,完成固着和处理程序的时间也各不相同。固着和处理时间也与处理组织样本的厚度有紧密的联系,同试剂保存时间一样。一个设定的时间意味着,固着或处理程序的持续时间是固定的,每一个特定的组织类型、厚度、保存试剂的温度,和超声波参数。根据我们的试验,薄于3mm厚的组织样本在4-15摄氏度在超声波照射下的福尔马林固着时间在10-20分钟之间。脂肪样本,例如体脂肪和乳腺,需要更长的固着时间。
超声波和温度控制也可以被用于组织样本保存的处理程序。由超声波照射引起的微型空洞导致立即的高压和低压在组织样本中的折中。这个结果导致组织的乳化作用和排气。超声波也在照射下在溶液中产生强的对流,引起充分的溶液循环。当超声波被应用时,没有搅拌是被需要的。超声波同时传递热进入培养溶液,因而充当一个热能资源。
低压和随意的二选一的低或者高压应用于固着剂和其他组织保存试剂,在提高组织固着和处理程序中有帮助。组织保存试剂包括固着试剂(固着剂),脱水试剂(酒精,酮,等),清洁试剂(二甲苯,二甲苯替代物),和石蜡。
代表性的,组织样本固着在交联固着剂中必须承受在酒精中脱水。这个发现表明,用超声波来推动脱水程序。温度在脱水程序中是一个重要因素。在脱水程序中温度越高,所需时间越短,反之亦然。根据我们的试验,当合适的温度到达时,在脱水程序中的超声波照射结果是最大限度利用的。为了脱水程序的快速实现,脱水溶液保存在低于脱水溶液的沸点0-25摄氏度,更好的是低于沸点5-10摄氏度。例如,当100%的乙醇(在标准大气压下的沸点是78.4摄氏度)被用做脱水溶液,适宜的温度是50-78摄氏度。一个在脱水程序中的超声波照射的其他功能是保持溶液温度,单独的或与其他加热装置一起。不过,由于产生最佳形态的结果的中等温度被需要,尽管处理时间可能延长。中等温度指在4-50摄氏度的范围内。超声波照射可以在中等温度下显著缩短脱水程序。
清洁是在酒精被清洁溶液(例如二甲苯或二甲苯替代物)代替情况下的组织处理中的一个程序。二甲苯和二甲苯替代物是蜡和石蜡的混合物。所以,清洁程序是为了下一个蜡渗透程序便利的步骤。清洁试剂也有移除组织脂肪部分的功能。这个发现表明使用结合温度控制系统的超声波可以提升清洁步骤的效率。超声波在40-80摄氏度的范围内被应用于清洁程序,0-15摄氏度更好,更好的是0-5摄氏度高于用作下一个渗透程序中的蜡熔点。有些研究者用二丙酮作为清洁溶剂。由于二丙酮在与蜡的混合中的缺乏性,它必须通过加热或真空从蜡中浓缩。在这个发现中,我们揭露出超声波被应用于使蜡中的二丙酮蒸发掉,通过它的排气和加热功能。首选的使二丙酮蒸发的超声波照射的温度范围在低于它沸点(即在标准大气压下82.3摄氏度)0-15摄氏度。
在用凝结固着剂准备组织样本的例子中,例如酒精,酮,含酒精或含酮为基础的固着剂和其他非交联固着剂,初始低温是固着的首选。组织样本被立即放在冷冻的固着剂中并保存在低温下,直到超声波照射开始是促进生物分子保存的首选。当非交联固着剂被应用,由蛋白质交联引起的组织外围的非坚硬的外层将会形成。在低温下的固着剂渗透将会使缺血性的串联或组织样本中的自动降解减慢。超声波将会在冷却系统关闭后被应用于提高和保持溶液温度,单独或与其他加热装置一起。根据我们的研究,无论有或者没有应用超声波,凝结固着剂在它们沸点以下0-20摄氏度工作最有效率。一个温度坡度是需要的。
自从在一个冷冻的温度下,固着溶液最初渗透浸入组织样本,在一个较少的液体状况中组织结构的组织结构,可以引起强烈气穴现象的低频率的超声波可以被使用。一旦组织样本被固着完成,它们变得更加稳定,因此可以持续保持更强壮的气穴现象。在这个发布的发明中,超声波的频率范围是100KHz至5MHz,200KHz至2MHz更好0.4MHz至1.5MHz。超声波动力的总功率范围是0.1至100瓦,5至60瓦更好,最好的是在10至30瓦。
这个发明也发布了一个组织样本准备装置,它包含了至少一个超声波容器,至少一个超声波产生和发出装置,一系列组织固着和处理溶液,至少一个连接超声波容器的冷却装置。可选择的组成部分包括,但不局限于,以下几项:乘装冷固着剂的样本器皿,一个充满冷固着剂的乘装样本器皿的冷冻柜,至少一个链接超声波容器的加热系统,至少一个声音信号收集器,至少一个声音信号分析仪,和一个中央处理器(CPU)。
这个超声波反应室是关键部件。除了乘装溶液和样本,他们也对向容器中的溶液和组织样本传递的适当的超声波能量的总额负责。我们的研究表明,超声波在容器的溶液中的均匀分布对组织固着和处理的一致性很重要。从变频器至容器中的溶液的能量传递的效率,机器效率和可靠性的一个重要因素,是视耦合效率而定的。我们首选的超声波反映室将会由不锈钢或其他作为一整片的金属合金制成,同时,变频器依附在装置外表面的底部。其他超声波反应室的构造,包含一个金属、塑料、玻璃或瓷制的用来乘装固着剂或处理溶液的容器,和一个可以在有溶液的容器中可移动的变频器外壳,这个变频器外壳可以设定从一边或从两边发出超声波。
这个变频器外壳的功能是用来密封压电式换能器,以防止保存反应物浸入到变频器中。为了使超声波从变频器外壳的一边发出,这个变频器通过胶水粘合在外壳平坦的一面,同时这个变频器的另一面是不受控制的。为了使超声波可以从变频器外壳的两边发出,这个变频器可以通过浇水粘合在外壳平坦的双边,或自由的淹没在外壳的惰性液体中。在这种情况下,超声波是通过惰性液体和外壳平坦的双边传递,来保存组织反应试剂。如果超声波从外壳的双边发出,组织样本可以放置在变频器外壳双边的任一边上,双倍数量的组织样本可以被保存。
在福尔马林固着程序的一个具体体现中,低温阶段(0-15摄氏度)和高温阶段(35-75摄氏度)可以在相关首选温度下的乘装着固着剂的同一个超声波反应器或两个不同的超声波反应器中工作。
在一个体现中,真空可以应用在超声波反应器的溶液和组织样本中。真空可以由一个单独的真空泵产生。一个适度的真空也可以由一个建在超声波反应室中的活塞管结构产生。
常规的实验室冷却系统包括冰箱、冷藏室或甚至冰和干冰。我们用4摄氏度的冰箱、一个冰水池和一个-20摄氏度冷藏室来降低在超声波反应室用稳定的50瓦电力输出的超声波照射的冷却效果。温度最终可以到达一个稳定的水平,但不可以由操作员控制。我们发布了一个温度可调节的冷却/加热系统,并可以直接连接在超声波反应室上。它将包含一个冷却循环室(可调节温度在-20至60摄氏度)和一个循环温度连接装置,例如一个铜管,用橡皮管或一个冷却套管连接冷却循环室。循环的液体可以是水、乙醇、氟利昂。加热装置也可以由一个围绕在超声波反应室周围的加热垫实现。
确保固着和处理程序充分进行是非常重要的,尤其在快速程序中。因此,一个质量控制系统是被需要的。当超声波应用于使固着和处理便利,从组织样本固着和处理中反射和(或)传导超声波信号,可以提供信息来指示每一步骤的进展。一个适度复杂的声音监控系统可以被建立。
实例
实例1
我们在不同温度下用NBF处理溶菌酶和BSA60分钟,然后立即将交联产物放到SDS凝胶剂上以备分离。对于溶菌酶和BSA的交联水平在0-40摄氏度之间逐渐增加。SDS电泳显示,低聚物(溶菌酶)或在胶化的流动性(BSA)的大小在50摄氏度有一个显著的增长,在60摄氏度左右达到最大值。这个发现预示着在温度高于60摄氏度下,用NBF处理溶菌酶时,很大数量的聚集开始形成。这个聚集是在高度存在于分子间的交联溶菌酶分子中,并且可能不会被SDS电泳分离。没有聚集的在高温下在NBF被BSA观察,或许正是由于在BSA中的交联总是作用于分子内。
至于溶菌酶,在温度从0-20摄氏度提高到20-40摄氏度时交联的速度逐步增快,然后接着被提高到50摄氏度甚至更高时突然加快速度。至于BSA,温度从0-30摄氏度,交联缓慢加速,然后在温度到40摄氏度时突然加快速度。用这两种典型的蛋白质做的试验表明,福尔马林固着的交联形成率的加速与温度的增加有关,而且速度的加速幅度可能可以根据培养温度分成两种模式:1)在0摄氏度至40摄氏度时减缓加速幅度,和2)在40-100摄氏度时加快加速幅度。通过这两种蛋白质,我们推测,在50-60摄氏度之间是交联发生迅速,但可被控制的一个重要的温度范围。当温度高于60摄氏度,通过溶菌酶的试验表明,不溶的聚集体引起的分子间交联开始大批量的形成。
实例2
重要的交联发生在在50摄氏度中培养10分钟之后。在其他实验中,我们为各种不同的蛋白质测试交联形成物,在4摄氏度的福尔马林、室温,和在50摄氏度中培养10分钟,与在室温的福尔马林中培养一整夜相比较。如图表5所示,在4摄氏度下的交联速度是所有蛋白质测试中最缓慢的。然后,在50摄氏度中培养10分钟后的交联水平有了一个较大的增长,几乎可以与在室温中培养一整夜的交联水平相比较。对所有除了BSA的蛋白质,蛋白质沉淀在50摄氏度中培养10分钟后和在室温中一整夜后形成。这个实验表明,对于大多数蛋白质,在50摄氏度的福尔马林中培养10分钟就可以形成显著的交联形态。类似的结果也在5分钟培养后获得(材料没有显示出)。
实例3
1-4mm厚的组织样本被放置在组织存放盒中,然后被淹没在交联固着剂中(例如,福尔马林,4摄氏度)直至超声波照射。超声波被应用于为固着剂的温度单独或与其他加热装置结合,提高温度至50-80摄氏度。这个温度需要维持5-20分钟。
这个组织样本接着被放置在一个脱水剂中,例如,100%的乙醇。脱水剂的温度需要被超声波单独或与其他加热装置结合来提高到50-75摄氏度。这个温度需要通过超声波单独或与其他加热装置结合来维持5-30分钟。这个步骤至少反复进行1次。
这个组织样本接着被放置在一个清洁剂中,例如,二甲苯或二甲苯的替代物。清洁剂的温度需要被超声波单独或与其他加热装置结合来提高到50-75摄氏度这个温度需要通过超声波单独或与其他加热装置结合来维持5-30分钟。这个步骤至少反复进行1次。
这个组织样本然后被浸泡在温度在55摄氏度至70摄氏度的融化的蜡或石蜡中。然后用超声波对融化的蜡或石蜡照射5-30分钟。融化的蜡或石蜡的温度需要通过超声波单独或与其他加热装置结合来维持60-75摄氏度。
实例4
1-4mm厚的组织样本,被保存在组织盒中,并在4-25摄氏度下,浸没未交联固着剂(例如,100%乙醇,丙酮,或者40%异丙酮、40%丙酮、20%聚乙二醇(平均分子量为300)和1%二甲基硫氧化物(DMSO)的混合试剂)中。超声波单独或与其他加热装置结合用来使温度达到50-70摄氏度。这个温度需要维持5-20分钟。
脱水,清洁,蜡渗透步骤按照实例6中描述的执行。
实例5
3mm或更薄的组织样本,被保存在组织盒中,并在50-70摄氏度下浸没在NBF中。超声波单独照射或与其他加热装置结合用来维持NBF的温度5-15分钟。
脱水,清洁,蜡渗透步骤按照实例6中描述的执行。
实例6
5mm或更厚的新鲜的组织样本被浸没在4-10摄氏度范围的NBF中。超声波作用于NBF。一个冷却系统被用来冷却NBF以维持4-10摄氏度的温度。超声波照射需要持续至少30分钟。
当冷却系统完成。NBF的温度将被持续的超声波照射升高,直至55-80摄氏度。温度将单独被超声波照射或与其他加热设备结合维持10-30分钟。
实例7
我们在4摄氏度或室温下,将新鲜的牛肾、肝、和胰组织(3mm*5mm*5mm)固定在福尔马林中一整夜,然后将组织固定在自动组织处理器上。组织在4摄氏度下固着一整夜仍然保持新鲜,同时,组织在室温下固着一整夜就变得色彩不纯。FFPE石蜡块上3微米的零件,被H&E玷污,在显微镜下观察。固着在4摄氏度下的组织样本的细胞形态同更好的亚细胞资料一样,通常会有明显的、清晰的边缘。低温固着极大的降低了传统的存在于组织例行的固着程序的空泡形成。红血球的细胞溶解在低温的组织固着中也有减少。这两种固着方法中最突出的区别在胰样本中得到论证。胰样本在室温的福尔马林中固着一整夜,在细胞群中的蜂窝结构中显示出公开的毁灭。不管这儿是否有由于低温而产生的蜂窝状的或细胞内缩水,单位数量的大量的原子核和原子核大小都将准备被分析。数量上计算的结果显示没有由于低温而造成的可发觉的改变,相反的,较早前的一个肝组织在4摄氏度的福尔马林中固着一整夜的研究产生了组织缩水[Fox 1987]。人类卵巢癌的组织样本试验,也表现出在4摄氏度的福尔马林中固着比那些传统的室温的方式能产生更好的形态学结构。
实例8
我们用人体卵巢和肝脏组织研究US在一个冷冻的温度下提升福尔马林分子在组织样本中扩散的效果。固着在4摄氏度下18个小时比在US下固着在8摄氏度下5分钟,产生更好的形态容貌,比在室温下固着18个小时更好。
人体肝脏样本(3mm厚)被在US照射下固着在4摄氏度的福尔马林中30分钟。作为控制,同样大小的肝脏样本被固定在4摄氏度的福尔马林中30分钟,但没有US照射。有US照射的肝脏样本显示出更好的组织形态,同时没有US照射的肝脏样本显示出严重的完整红血球细胞和详细亚细胞结构的缺失。随后通过正常的酒精脱水,二甲苯清洁和石蜡填充的处理,没有US照射的组织固着在4摄氏度的福尔马林中30分钟,产生酒精固着形态,同时用US照射组织固着在4摄氏度的福尔马林中30分钟产生极佳的福尔马林固着形态。
实例9
母牛肾脏组织(3mm厚)用US(US-LT-FFPE)照射或在室温中一整夜(FFPE),用4摄氏度的福尔马林固着30分钟,然后将组织放在自动组织处理器上处理。在没有抗原检索(AR)程序下,波形蛋白和细胞角蛋白的IHC被取出。在IHC分析和用超声波照射固着的样本都比常规的FFPE样本产生更好的结果。IHC在US-LT-FFPE下的正染色区域的百分率指出,与传统FFPE方法相比,更多抗原决定基(抗原决定簇)被保护。从组织样本萃取的蛋白质也表现出US使固着在4摄氏度下的波形蛋白和细胞角蛋白的结果比传统的FFPE蛋白质印迹显示出更强的信号。
这个材料指出,在US-LT-FFPE组织样本中的抗原,比由于减少的交联水平的传统方法相当,被改进成一个较小程度、更多可用性的IHC检测和提取。
实例10
为了研究US是否可以减轻福尔马林固着大型组织的困难,我们将一个人体解剖下的整个前列腺样本保存在福尔马林中,并用US在10摄氏度下照射16小时和在25摄氏度下照射2小时。作为对比,一个外科手术移除的病患的整个前列腺样本被在室温的福尔马林中保存。在18小时的保存后,通过US方式固着的前列腺组织样本依然看起来很新鲜,血、脂肪和被膜组织都维持他们原本的外貌。通过传统方法固着一整夜的前列腺样本看起来变的很暗淡。我们用自己的手指触碰来大致判断这两个前列腺组织的硬度。用US方式保存的前列腺组织比用传统方式保存的更结实。
经过一整夜的保存后,这两个前列腺样本都经过MRI检测。通过US方式保存的前列腺样本在每个标准选择的边缘和中心区域都产生更深的、更均匀的图像,同时传统方式保存的前列腺产生在中心区域的分散亮点的不规则的图像。MRI成像中的深色区域意味着组织样本的稠密区域[Hennig 1986]。由福尔马林引起的交联在组织样本中产生一个密集的变化,可以由MRI现实出来。
实例11
我们已经设计了一系列的直接的生物化学试验方法来比较不同化学试剂,例如福尔马林,RNA Later,甲醇/酒精,例如用于抑制核糖核酸酶生物活性的加热设备(沸腾的或高压蒸汽的)。这个研究直接反映出福尔马林是最好的核糖核酸酶抑制者。我们也对比了福尔马林在室温和4摄氏度下的抑制能力。在这个对比实验中,我们没有找到任何区别。这个试验结果说明,福尔马林对在4摄氏度下的核糖核酸酶活性的立即抑制力不是取决于缓慢的交联作用。这是在无拘束溶液反应下的原始资料,然而,RNA的冷福尔马林的组织水平保存应该被更深入的研究。根据细胞蛋白质和核糖核酸酶的实验结果,我们建议,低温的福尔马林固着可以实现相似的酶抑制作用能力,它可以维持生物分子在一个低变化的水平(低水平的交联)。
实例12
为了做一个粗略的在4摄氏度和室温下样品固着的蛋白质取出的对比试验,我们用培养的细胞做了个用蛋白质印迹法测量2种特定的蛋白质的时间过程的研究。
福尔马林分子进入培养细胞的扩散时间是可以被忽视的,既然这样,温育时间可以更好的代表交联时间。部分新鲜的成熟的乳癌T47D细胞,在4摄氏度或室温下,用不同的持续时间,用中性的缓冲福尔马林(NBF)保存。在细胞溶解产物中的蛋白质被SDS PAGE隔断,然后转移到硝酸纤维薄膜,用合并的单克隆抗体类探测,依照HER-2和ER,一个膜蛋白质和一个核内蛋白,分别地。考马斯蓝染色的SDS凝胶表现出,细胞在4摄氏度下固着比在室温下产生更多蛋白质溶解物,(在0.5-18小时中始终都是)。蛋白质印迹表现出,HER-2和ER蛋白质在4摄氏度的固着条件下,相似的信号强度需要0.5-4小时的固着时间才能被制造出来,与此同时,在室温下,只要0.5小时的固着时间,就能产生这两种蛋白质的清晰的信号。显著的,我们发现,就蛋白质提取物而言,室温下固着0.5个小时大致上等同于在4摄氏度下固着18个小时。
Claims (11)
1.一种保存组织样本的方法,其特征在于,其包括如下步骤:
a)将组织样本浸入4-10摄氏度的固着剂中,所述固着剂包括1%-10%重量的福尔马林水溶液,所述组织样本用福尔马林固着产生极好的FFPE形态;
b)用一重叠的超声波冷冻系统来照射固着剂中的组织样本以保持组织样本和固着剂温度保持在低点,先将所述组织样本和固着剂放入一个冷却机器中,
然后将所述组织样本和固着剂放入一个传送机器中,所述传送机器是指超声波放射;所述超声波是0.1MHz到5MHz频率之间;所述超声波的电力是在5-50瓦之间;所述方法进一步的包括如下步骤:a)关掉之前所说的冷却装置一个预先设定的时间;b)持续超声波照射以增加之前提到的组织样本到一个预先设定的温度;c)转换超声波照射开关来维持预先设定的温度数值并保持预先设定的时间。
2.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述固着剂包括至少50%容量的至少含以下化学药品中的一种化学物质的溶液:乙醇、甲醇、PEG、丙酮;所述温度是在4-10摄氏度。
3.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述超声波是在0.2MHz至2MHz之间。
4.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述超声波是在0.4MHz至1.5MHz之间。
5.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述超声波的电力是在在10-30瓦之间。
6.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述方法进一步的包括至少一个将固着的组织样本浸入一个温度在0-25摄氏度的脱水溶剂中的脱水程序。
7.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述方法进一步的包括至少一个干燥步骤,其包括:i)将固着的组织样本浸入一个温度在0-40摄氏度的脱水溶液中,ii)单独用超声波放射或与其他加热设备结合,来提高脱水溶液的温度至一个预先设定的值,然后iii)保持这个温度一定预先设定的时间;
至少一个清洁步骤,其包括:i)将脱水的组织样本浸入一个清洁溶液,ii)单独用超声波放射或与其他加热设备结合,来提高清洁溶液的温度至一个预先设定的值,然后iii)保持这个温度一定预先设定的时间;以及一个浸透步骤,其包括:i)将脱水的、清洁的组织样本浸入融化的石蜡中;ii)用超声波照射上述在融化的石蜡中的已脱水的、已干燥的组织样本一定预设的时间,然后,iii)将上述在融化的石蜡中的已脱水的、已干燥的组织样本进行真空。
8.根据权利要求1中的方法,其特征在于,其中所述传送机器是通过搅拌、震动或抽吸和抽空进行的。
9.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述方法进一步包括使所述组织样本和固着剂减压,所述低压指在10-20英寸汞的范围内。
10.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述方法进一步包括使所述组织样本和固着剂增压,所述高压是指超过标准大气压。
11.根据权利要求1中的方法,其特征在于,所述方法进一步包括所述组织样本和固着剂在高压和低压中不停交替。
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