JP2011525197A - 高純度コラーゲンの調製 - Google Patents

Abstract

【課題】コラーゲンを調製する方法を提供する。
【解決手段】本方法では、先ずコラーゲン基質を作製し、次にこのコラーゲン基質からコラーゲンを抽出する。
【選択図】なし

Description

本発明は、コラーゲンの調製方法に関する。

コラーゲンは繊維状タンパク質であり、軟骨、腱、真皮、及び他の結合組織に見つかる。コラーゲンは産業と医薬品の両方に広く使用されてきた。

通常、コラーゲンは非コラーゲン物質を取り除く酸性又は酵素処理により結合組織から単離される。コラーゲン純度を高めるために、この処理を数回繰り返さなければならない。この繰り返し処理は単離処理時間を長くするだけでなく、コラーゲン歩留りを低下させる。
高純度コラーゲンを調製する新しい方法が求められている。

本発明は、先ず結合組織（例えば、真皮または腱）からコラーゲン基質を作製し、次にこのコラーゲン基質からコラーゲンを抽出することで、高純度のコラーゲンを調製する方法を提供する。より具体的には、この方法は次のステップを含む：（i）２０ｍｍ²〜２ｍ²（例えば、２５ｍｍ²〜９００ｃｍ²）の範囲の表面を有する結合組織を準備する、（ii）第１酸性溶液を用いて該結合組織の体積を５０％以上（例えば１００％〜５００％）膨張させ、膨張した結合組織を作る、（iii）該膨張した結合組織を洗浄して非コラーゲン物質を取り除くことで、コラーゲン基質を作製する、及び（iv）該コラーゲン基質から抽出溶液を用いてコラーゲンを抽出して、コラーゲン含有溶液を作製する。

前記膨張させるステップは、前記結合組織を前記第１酸性溶液に浸漬することで実行されてもよい。好ましくは、この浸漬処理は同時に該結合組織に液体を噴射するか又は超音波処理することで実行される。該第１酸性溶液はｐＨが１〜６（例えば、２〜４）でほぼ無塩、即ち、塩を含まないか又は非常に低い濃度で塩を含むので、この溶液のイオン強度は０．００５Ｍ以下である。この酸性溶液は、他にもあるが、蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、又はこれらの混合物から調製できる。好ましくは、この酸性溶液は０．１〜６Ｍ酢酸溶液である。

前記膨張させるステップ後、得られた膨張した結合組織を洗浄して非コラーゲン物質を取り除くことで、コラーゲン基質を作製することが出来る。前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を洗剤、タンパク質分解酵素、又はこれらの混合物を含む洗浄液に浸漬することで実行されてもよい。この浸漬処理の間、該結合組織に超音波処理を行うか又は液体を噴射することが出来る。

次に、コラーゲン基質を抽出溶液に浸漬してコラーゲン含有溶液を作る。この抽出溶液は弱い有機酸、例えばシュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、又はこれらの混合物を含み、コラーゲン溶解に適切なｐＨ（例えば、４未満）の酸性溶液であってもよい。或いは、この抽出溶液は、塩（例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌ）をコラーゲン溶解に適切な濃度（例えば、１Ｍ）で含む中性溶液（例えば、０．０５Ｍトリス緩衝液）である。１つの実施例では、コラーゲン基質を細かく砕いてコラーゲン粉末を作製し、該粉末を前記抽出溶液と混合してコラーゲン含有溶液を作製することで、コラーゲンをコラーゲン基質から抽出する。前記細かく砕くステップと前記混合するステップは、同時に実行することが出来る。

次に、従来の方法によりコラーゲン含有溶液からコラーゲンを沈澱されることが出来る。１つの実施例では、コラーゲンを透析により沈澱させる。別の実施例では、コラーゲン含有溶液に塩を１．０Ｍ〜４．０Ｍの濃度で混合してコラーゲンを沈澱させる。得られたコラーゲンを脱塩するのが好ましい。更に別の実施例では、コラーゲン含有溶液のｐＨを４．５〜８に調整することでコラーゲンを沈澱させる。

調製されたコラーゲンは凍結乾燥、空気乾燥、又は真空乾燥され、コラーゲン粉末、スポンジ、シート、又は薄膜を形成することが出来る。調製されたコラーゲン粉末は酸性溶液中に分散されコラーゲン懸濁液を形成するか、又はタンパク質分解酵素で処理されテロペプチドのないコラーゲンを生成する。タンパク質分解酵素の例は、これらに限定されないがペプシン、ブロメライン、キモパパイン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、フィシン、パパイン、ペプチダーゼ、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、トリプシン、微生物プロテアーゼ、及びこれらの混合物を含む。

本発明の１つ以上の実施形態を下記に詳細に説明する。本発明の他の特徴及び利点は、下記の実施例の詳細な説明と添付の請求項から明らかとなるであろう。

コラーゲンは、約３００ｎｍの長さと約１．５ｎｍの直径を有する３重らせん棒状分子である。複数のコラーゲン分子がコラーゲン原繊維を形成し、コラーゲン原繊維の束がコラーゲン繊維を形成する。共有結合架橋がコラーゲン分子間及び分子内に存在し、結合組織内で繊維網を形成する。

下記に、先ず多孔質コラーゲン基質を結合組織から直接作製し、次にこのコラーゲン基質からコラーゲンを抽出することで高純度コラーゲンを調製する方法を説明する。

＜コラーゲン基質の調製＞
出発物質、即ち、結合組織は、牛、豚、馬、羊、鶏、鴨、七面鳥、雁、鯨、鮫などの動物に由来してもよい。コラーゲン基質を作製するのに適した結合組織は、これらに限定されないが真皮、皮下組織、靭帯、腱、腱膜、軟骨、及び骨組織を含む。必要であれば、結合組織を先ず手作業（例えば、肉眼解剖）、又は機械で清掃し、脂肪、脂質等の望ましくない物質を取り除く。１つの実施例では、新鮮な動物の皮膚から脂質を取り除き、その皮膚を生理食塩水で数回洗浄し、その動物の皮膚の表面層を皮膚切断器で取り除くことで真皮が得られる。この真皮をリン酸緩衝生理食塩水で更に洗浄してもよい。

もし望むなら、結合組織を先ず適切な有機溶剤又は有機溶剤と水との混合物で処理し、有機溶剤を結合組織に浸透させてもよい。有機溶剤の例は、これらに限定されないがアルコール、ケトン、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、Ｎ,Ｎ‐ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又はこれらの混合物を含む。有機溶剤と水との混合物を使用する場合、有機溶剤と水との比率は１：５超（例えば、１：４、１：１、又は４：１）である。

結合組織は、毛又は毛根を含む場合、毛又は毛根を分解するタンパク質分解酵素（例えば、ディスパーゼ、トリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、ブロメライン、フィシン、又はこれらの混合物）で処理してもよい。

次に、上記の結合組織のいずれかを有効量の酸性溶液に十分な時間浸清し、結合組織を所望の程度、即ち、元の厚みより約５０％以上大きな厚み（例えば、元の厚みの２〜５倍）になるまで膨張させる。この酸性溶液は有機酸、例えば蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、又はこれらの混合物から調製できる。１つの実施例では、酸性溶液は濃度０．１〜６Ｍ（例えば、０．１〜２Ｍ又は０．５〜１．２５Ｍ）の酢酸溶液である。より良好な膨張効果を得るために、本発明で使用される酸性溶液はほぼ無塩である。

上記膨張ステップでは、結合組織は上記の酸性溶液中に浮遊する。もし望むなら、１つ又は複数の液体流を結合組織に当てて酸性溶液の結合組織への浸透を容易にし、結合組織を所望の程度に膨張させるのに必要な時間を低減してもよい。液体流は結合組織と酸性溶液が入った容器に設けられたノズル又は孔から噴出してもよい。

或いは又は加えて、（例えば、超音波振動装置で生成された）超音波又は（例えば、電磁場で生成された）高周波数水波を酸性溶液に浸清された結合組織に当てて、酸性溶液の結合組織への浸透を助けてもよい。

上記の膨張ステップから得られた膨張した結合組織を、洗浄液を用いて洗浄し非コラーゲン物質を膨張した結合組織からほぼ取り除き、これによりコラーゲン基質を作製する。洗浄液は洗剤、キレート試薬、タンパク質分解酵素、又はこれらの混合物を含んでよい。

洗浄液を調製するための典型的な洗剤は、これらに限定されないがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テゴ化合物（例えば、Tween 80、Triton W. R. 1339、ｐ‐イソオクチルポリオキシ‐エチレンフェノール重合体、及びTriton A20）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、エマゾール４１３０（ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン）、ルブロールＷ、ノニデットＰ４０を含む。１つの実施例では、０．０１〜１０％のＳＤＳを含む洗浄液を使用して、膨張した結合組織を４〜４５℃で１〜１５０時間処理する。

洗浄液に含まれるキレート試薬は、これらに限定されないがエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１,４,７,１０‐テトラアザシクロドデカン‐１,４,７,１０‐四酢酸（ＤＯＴＡ）、１,４,７,１０‐テトラアザシクロドデカン‐１,４,７,１０‐テトラキス（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、トランス‐１,２‐ジアミノシクロヘキサン‐四酢酸（ＣＤＴＡ）、４,５‐ジヒドロキシベンゼン‐１,３‐ジスルホン酸（タイロン）、チオ尿素、８‐ヒドロキシキノリン‐５‐スルホン酸、３,６‐ジスルホ‐１,８‐ジヒドロキシ‐ナフタレン、Eriochromeschwarz T（１‐（１‐ヒドロキシ‐２‐ナフチルアゾ）‐２‐ヒドロキシ‐５‐ニトロ‐４‐ナフタレンスルホン酸）、プルプル酸アンモニウムなどを含む。好ましくは、キレート試薬は濃度０．０１〜１００ｍＭのＥＤＴＡである。

或いは又は加えて、洗浄液は、細胞外基質関連タンパク質、他の非コラーゲンタンパク質、及びコラーゲン分子のテロペプチドを取り除くための１つ以上のタンパク質分解酵素、例えばフィシン、ペプシン、トリプシン、ディスパーゼ、及びハーモライシン（hermolysin）を含んでもよい。制限酵素消化、即ち、コラーゲン繊維の完全性を維持しながら非コラーゲンタンパク質を分解する時の条件は当分野において周知である。

洗浄ステップでは、上記の洗浄液のいずれにおいても膨張した結合組織を十分な時間浮遊させることが出来る。１つの実施例では、膨張した結合組織に向けて１つ又は複数の液体流をノズル又は孔から噴出させて、非コラーゲン物質の除去を容易にする。この液体流は水、洗剤含有溶液、又は酵素含有溶液の流れであってよい。別の実施例では、膨張した結合組織は洗浄液に浸漬され、超音波で処理して洗浄効率を向上させる。

結合組織から非コラーゲン物質を除去するための従来の方法（例えば、米国特許第７４９８４１２号、第５９９３８４４号、及び第５３７４５３９号参照）も本発明で使用することが出来る。

洗浄ステップから得られたコラーゲン基質を保存のため液体窒素で冷凍し凍結乾燥することができる。或いは、リン酸緩衝生理食塩水に浸漬し、４℃で保存することが出来る。必要であれば、コラーゲン基質は標準の化学的又は物理的方法で架橋結合されてもよい。コラーゲン分子を架橋結合するための薬品は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド、及びポリエポキシ化合物（例えば、グリコール・ジグリシジル・エーテル、ポリオール・ポリグリシジル・エーテル、及びジカルボン酸ジグリシジルエステル）を含む。

コラーゲン基質を調製するための上記の方法は、従来の方法と少なくとも２つ点で異なる。第１に、結合組織の繊維状コラーゲン網を壊す酷烈な物理的又は化学的処理（例えば、粉砕、均質化、又は強い酸性／塩基性処理）を必要としない。第２に、従来の方法はコラーゲン繊維を安定させるために塩を使用するが、上記の方法はほぼ無塩の酸性溶液を使用して結合組織を膨張させる。

＜コラーゲン基質からのコラーゲン抽出＞
上記の方法で調製されたコラーゲン基質を、例えば攪拌、かき混ぜ、均質化、切り刻み、引き裂き、切断、粉砕、せん断、又はこれらの組合せで細かくすることが出来る。コラーゲン基質は細かくされてもされなくても、抽出溶液にコラーゲンをかなりの程度溶解させるのに適切な時間浸漬することが出来る。１つの実施例では、細かくされたコラーゲン基質を穏やかな機械動作（例えば、攪拌、かき混ぜ、又は混合）のもと抽出溶液と混合し、コラーゲンの溶解を容易にする。

抽出溶液は酸性溶液、又は塩含有中性溶液であり、コラーゲンが溶解するｐＨ値又は塩濃度を有している。この抽出溶液を作るのに適切な酸は、これらに限定されないが蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、及びこれらの混合物を含む。酢酸を使用する場合、その濃度は０．１〜６Ｍ（例えば、０．１〜２Ｍ又は０．５〜１．２５Ｍ）の範囲であってよい。典型的な塩はＫＣｌ及びＮａＣｌを含み、それらの濃度は０．１〜２Ｍ（例えば、１Ｍ）の範囲であってよい。中性溶液の例はリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）及びトリス緩衝液を含む。ｐＨ７〜８の中性緩衝液を使用する場合、1つ以上の中性塩（例えば、１Ｍ ＫＣｌ又はＮａＣｌ）をこの緩衝液に加え、緩衝液中のコラーゲンの溶解度を増大させてもよい。抽出溶液を作るのに適切な他の緩衝液は、これらに限定されないがグリシン‐ＨＣｌ緩衝液、クラーク‐ラブス緩衝液、クエン酸‐Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液、ブリットン‐ロビンソン緩衝液、クエン酸‐クエン酸ナトリウム緩衝液、β:β’‐ジメチルグルタル酸‐ＮａＯＨ緩衝液、酢酸ナトリウム‐クエン酸ナトリウム緩衝液、コハク酸‐ＮａＯＨ緩衝液、カコジル酸ナトリウム‐ＨＣｌ緩衝液、マレイン酸水素ナトリウム‐ＮａＯＨ緩衝液、Ｎａ₂ＨＰＯ₄‐ＮａＨ₂ＰＯ₄緩衝液、重炭酸ナトリウム‐５％ＣＯ₂緩衝液、イミダゾール（グリオキサリン）‐ＨＣｌ緩衝液、２,４,６‐トリメチルピリジン（コリジン）緩衝液、塩酸トリエタノールアミン‐ＮａＯＨ緩衝液、ナトリウム５,５’‐ジエチルバルビツール酸緩衝液、ジメチルロイシルグリシン緩衝液、及びＮ‐エチルモルホリン‐ＨＣｌ緩衝液を含む。

抽出後、不溶性の物質を、例えば遠心分離又は濾過により取り除き、コラーゲン含有溶液を作ることが出来る。必要であれば、不溶性の物質を同じ抽出溶液から１回又は複数回取り出すことが出来、可溶性画分をコラーゲン含有溶液と混合することが出来る。

コラーゲン含有溶液にタンパク質分解酵素消化を行ってテロペプチドを取り除き、テロペプチドのないコラーゲンを作製することが出来る。この消化に適切なタンパク質分解酵素は、これらに限定されないがペプシン、ブロメライン、キモパパイン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、フィシン、パパイン、ペプチダーゼ、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、トリプシン、微生物プロテアーゼ、及びこれらの混合物を含む。消化反応の条件は使用する酵素に依って変わる。例えば、ペプシンを使用する場合、反応混合物はｐＨ約２〜５を有し、酵素の濃度は処理するコラーゲンの約０．００１〜１０重量％であってよい。コラーゲン含有溶液の濃度は０．５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ（例えば、１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌ）であってよい。

更なる精製のために、上記のコラーゲン含有溶液からコラーゲンを沈澱させることが出来る。この沈澱処理を所望の純度レベルを達成するまで繰り返すことが出来る。１つの実施例では、約１２０００〜約１４０００の遮断分子量の透析管を使用してコラーゲン含有溶液を緩衝液に対して透析することで、コラーゲンを沈澱させる。別の実施例では、コラーゲン含有溶液に塩（例えば、ＮａＣｌ等のハロゲン化アルカリ金属）を約１．０Ｍ〜４．０Ｍの濃度になるよう加えることでコラーゲンを沈澱させ、遠心分離で集めて、次に限外濾過、透析、又は希釈酸性溶液による洗浄により脱塩する。更に別の実施例では、コラーゲン含有溶液のｐＨをコラーゲンが不溶性となるｐＨ値に調整することでコラーゲンを沈澱させる。国際公開第２００４／０９６８３４号を参照。コラーゲン精製は上記の方法の任意の組合せによっても達成できる。沈澱したコラーゲンを再浮遊させ、限外濾過膜を用いた緩衝液交換を行ってもよい。

上記の方法のいずれかで得られたコラーゲンを真空中で凍結乾燥することが出来る。或いは適切な溶液中に再浮遊させてもよい。

更なる説明を省略しても上記の説明に基づいて当業者は本発明を完全に利用することが出来るであろう。従って、下記の具体例は単に例示であり、本開示をどのようにも限定しないと解釈されるべきである。引用した全ての公報を本明細書に援用する。

実施例１：コラーゲン基質を調製
豚の皮膚を採取した。脂質除去後、この皮膚を生理食塩水で数回洗浄した。皮膚の表面層を皮膚切断器で取り除いて厚さ０．３ｍｍの真皮を得た。この真皮をリン酸緩衝生理食塩水で更に洗浄した。洗浄後、真皮表面から全ての生理食塩水残留物を完全に除去した。

真皮を０．５Ｍ酢酸で満たされた容器内に入れ、３７℃で１日半培養して真皮を厚さ０．４５ｍｍまで膨張させた。培養中、真皮を浮遊させるために容器をシェーカーに載せた。

次に、得られた膨張した真皮をＳＤＳ（０．５％）及びＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含む溶液に室温で２時間浸漬して、非コラーゲン物質を除去しコラーゲン基質を作製した。このコラーゲン基質を無菌リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し残留ＳＤＳ及びＥＤＴＡを除去した。

実施例２：コラーゲン基質からコラーゲンを抽出
上記の実施例１で説明した方法で調製されたコラーゲン基質を０．５Ｍ酢酸溶液に１２〜２４時間攪拌しながら浸漬した。得られた混合物を２０００ｒｐｍ（７００×ｇ）で１時間遠心分離し、上澄み液を集め、４℃で保存した。

単離されたコラーゲンを含むこの上澄み液をペプシン（０．２ｍｇ／ｍｌ）で２４時間処理しテロペプチドのないコラーゲンを作製した。

実施例３：透析によるコラーゲン精製
上記の実施例２で説明した方法で、調製されたコラーゲン基質からコラーゲンを抽出し、コラーゲン含有溶液を作製した。この溶液を０．０２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液に対してセルロース透析膜（ＭＷＣＯ１２‐１４，０００）を用いて透析し、次に８０００×ｇで１時間遠心分離した。ペレットを集め、冷たいミリＱ水（MilliQ water）で数回すすぎ、次に冷たいミリＱ水中に再浮遊させた。この懸濁液を８０００×ｇで１時間遠心分離した。
得られたコラーゲンペレットを０．１Ｍ酢酸中に再浮遊させた。

実施例４：塩析又はｐＨ調整によるコラーゲン精製
上記の実施例２で説明した方法に従ってコラーゲン基質からコラーゲンを抽出し、コラーゲン含有溶液を作製した。

塩化ナトリウムをこの溶液に最終濃度が２．５Ｍとなるまで徐々に加えた。この処理で沈澱したコラーゲンを集め、蒸留水で洗浄し、次に０．１Ｍ酢酸溶液中に再浮遊させた。

或いは、１ＭのＮａＯＨをコラーゲン含有溶液に加え、そのｐＨを７に調整した。混合物を絶えず攪拌しながら冷室に３時間置き、コラーゲンを沈澱させた。その後、この混合物を４℃で１０分間遠心分離し、コラーゲンペレットを脱イオン水中に再浮遊させた。０．１ＭのＨＣｌでこの懸濁液のｐＨを３．５未満に調整し、コラーゲンを溶解させた。

他の実施形態
本明細書に開示した特徴の全ては任意に組み合わせることが出来る。本明細書に開示した各特徴は、同じか、又は等価な、又は類似の目的を果す別の特徴で置き換えてもよい。従って、特にことわらない限り、開示した各特徴は等価な、又は類似の特徴群の一例でしかない。

上記の説明から、当業者は本発明の重要な特徴を容易に理解し、本発明の思想と範囲を逸脱することなく、様々な用途と条件に合わせて本発明の様々な変更と変形を想到する可能性がある。従って、他の実施形態も請求の範囲に入る。

Claims (21)

1. コラーゲン調製品を製造するための方法であって、
   ２０ｍｍ²〜２ｍ²の範囲の表面を有する結合組織を準備することと、
   ほぼ無塩でｐＨが１〜６の第１酸性溶液を用いて該結合組織の体積を５０％以上膨張させ、膨張した結合組織を作ることと、
   該膨張した結合組織を洗浄して非コラーゲン物質を取り除くことで、コラーゲン基質を作製することと、
   該コラーゲン基質から抽出溶液を用いてコラーゲンを抽出して、コラーゲン含有溶液を作製することと
   を含む方法。
2. 前記抽出するステップは前記コラーゲン基質を細かく砕いてコラーゲン粉末を作製し、該粉末を前記抽出溶液と混合して前記コラーゲン含有溶液を作製することで実行される請求項１に記載の方法。
3. 前記細かく砕くステップと前記混合するステップは、同時に実行される請求項２に記載の方法。
4. 前記抽出するステップ後に、前記コラーゲン含有溶液からコラーゲンを沈澱させ、該コラーゲンを乾燥させるか又は該コラーゲンを第２酸性溶液中に分散させることを更に含む請求項１に記載の方法。
5. 前記沈澱させるステップでは、前記コラーゲンを透析により沈澱させる請求項４に記載の方法。
6. 前記沈澱させるステップは、前記コラーゲン含有溶液に塩を１．０Ｍ〜４．０Ｍの濃度で混合してコラーゲンを沈澱させることで実行され、該方法は前記沈澱させるステップ後に、該コラーゲンを脱塩することを更に含む請求項４に記載の方法。
7. 前記沈澱させるステップは、前記コラーゲン含有溶液のｐＨを４．５〜８に調整してコラーゲンを沈澱させることで実行される請求項４に記載の方法。
8. 前記抽出するステップ後に、前記コラーゲン含有溶液にタンパク質分解酵素を含む溶液を混合してテロペプチドのないコラーゲンを作製することを更に含む請求項１に記載の方法。
9. 前記タンパク質分解酵素は、ペプシン、ブロメライン、キモパパイン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、フィシン、パパイン、ペプチダーゼ、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、トリプシン、微生物プロテアーゼ、及びこれらの混合物からなるグループから選択される請求項８に記載の方法。
10. 前記抽出溶液は、蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、及びこれらの混合物からなるグループから選択された酸を含む請求項１に記載の方法。
11. 前記抽出溶液は塩を含む請求項１に記載の方法。
12. 前記第２酸性溶液は、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、及びこれらの混合物からなるグループから選択された酸を含む請求項４に記載の方法。
13. 前記膨張させるステップは、前記結合組織を前記第１酸性溶液に浸漬しながら、該結合組織に液体を噴射することで実行される請求項１に記載の方法。
14. 前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を洗浄液に浸漬しながら、該膨張した結合組織に液体を噴射することで実行される請求項１に記載の方法。
15. 前記膨張させるステップは、前記結合組織を前記第１酸性溶液に浸漬しながら、該結合組織を超音波で処理することで実行される請求項１に記載の方法。
16. 前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を洗浄液に浸漬しながら、該膨張した結合組織を超音波で処理することで実行される請求項１に記載の方法。
17. 前記結合組織は真皮または腱に由来する請求項１に記載の方法。
18. 前記結合組織は２５ｍｍ²〜９００ｃｍ²の範囲の表面を有する請求項１に記載の方法。
19. 前記第１酸性溶液は、蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、及びこれらの混合物からなるグループから選択された酸を含む請求項１に記載の方法。
20. 前記酸性溶液は、２〜４のｐＨ値を有する請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１酸性溶液は、酢酸を０．１〜６Ｍの濃度で含む請求項１に記載の方法。