CN105985429A - 一种具有生物活性的无菌胶原液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有生物活性的无菌胶原液及其制备方法,该胶原液的制备方法为将动物的筋腱进行脱脂、切片、消毒、低温粉碎,再进行酸溶酶解、过滤除渣、盐析、纯化、灌装封口、冷冻、低温辐照灭菌后即可得到无菌的胶原液。本发明在低温条件下辐照,保持了胶原的活性,避免了胶原在辐照的过程中变性失活或者发生交联反应,从而影响其功能。本发明采用超滤纯化代替传统的透析纯化,同样的效果是缩短了纯化的时间,另外采用自动化系统代替传统的半自动操作,避免了人手污染,保证了产品的洁净度、纯度、生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有生物活性的无菌胶原液及其制备方法。
背景技术
胶原是由三条肽链拧成螺旋形的纤维状的细胞外蛋白质,占全身蛋白质的30% 以上,具有独特的生理活性。胶原蛋白富含人体必需的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸,是细胞外基质中最重要的组成部分,具有强的生物活性及生物功能,能参与细胞的迁移、分化和增殖,使骨腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度,且由于其微弱的抗原性和良好的生物相容性,在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛。
胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质,广泛分布于角膜、皮肤、骨骼、韧带、腱等部位,是组成结缔组织的重要结构蛋白。因此从动物组织提取胶原是获得胶原的重要途径。在提取胶原的生产过程中会产生一些副产品胶原蛋白和明胶,明胶是由胶原变性解螺旋后不再具有生物活性的肽链组成。胶原之所以具有生物活性,主要取决于它的三螺旋结构,所以明胶是没有生物活性的。
目前,胶原的提取方法主要有碱法、酸法、盐法及酶法。碱法提取的优点在于反应迅速彻底,其缺点在于造成胶原肽键水解,破坏胶原的三螺旋结构,使含有羟基和巯基的氨基酸破坏且产生消旋。其产生的D 型氨基酸有毒,有的甚至有致癌、致畸和致突变的危害,因此,碱法提取胶原不适合用于生物医用材料用胶原的提取。酸法提取胶原主要是通过低离子浓度及酸性环境破坏胶原分子间的盐键和Schiff
键,从而使胶原纤维溶胀、溶解来提取胶原。其优点在于最大限度的保持胶原分子的三螺旋结构,即生物活性,其缺点主要是产率低。中性盐法提取胶原的主要缺点是其工艺不稳定,使得提取的胶原分子结构也不稳定。
现有常规的酶法具有水解反应快、对环境友好等优点,而且提取的胶原纯度高、物理化学性质稳定,酶解可切除胶原分子端肽的非螺旋区,降低胶原的抗原性,但其缺点是水解不够彻底,制备出的胶原的生物活性低。
目前医用的胶原对微生物限度具有严格的要求,基本上所有的产品都要求达到无菌级别,但提供工艺上目前很难实现。
发明内容
为了解决上述存在问题,本发明通过研究,采用最终灭菌法来控制胶原及其产品的微生物限度,使其达到无菌的同时也不改变其生物活性,从而是其应用更加安全,有效。
本发明的目的在于提供一种具有生物活性的无菌胶原液。
本发明的另一目的在于提供一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,包括如下步骤:
1)将动物的筋腱进行脱脂、切片、消毒;
2)将上述消毒后的筋腱在超低温条件下进行粉碎,得到细丝状的筋腱纤维;
3)将粉碎后的筋腱组织进行酸溶酶解,再过滤除渣得胶原原液;
4)将胶原原液进一步盐析、纯化,即可得到高纯度的胶原液;
5)将纯化后的高纯度胶原液在十万级或以上洁净环境下进行灌装,分装并封口;
6)将封口好的高纯度胶原液进行冷冻;
7)将冷冻后的胶原液放入装有干冰或超低温冰盒的泡沫箱或保温箱中并密封,进行低温辐照灭菌,解冻后即可得到无菌的胶原液。
进一步的,上述筋腱为牛筋腱、猪筋腱或鼠尾筋腱。
一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,步骤2)中所述的粉碎温度为-150℃~-60℃。
进一步的,上述步骤3)中所述的酸溶酶解的具体操作为:将所获得的筋腱纤维加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中,以10~50rpm的搅拌速度搅拌3~10小时。
进一步的,上述纯化是采用超滤纯化系统进行的纯化,超滤系统纯化的条件为:进口端压力为10~40psi,回流端压力为0~10psi,进行恒体积的6~12倍超滤。
进一步的,上述步骤6)中所述的冷冻温度为-80℃~-10℃,冷冻时间为18~72h。
进一步的,上述步骤7)中所述低温辐照灭菌的剂量为15~40kGy,温度为-75℃~0℃。
进一步的,上述胶原原液的酸溶酶解、盐析、纯化、灌装过程均在温度20℃~28℃,。
一种具有生物活性的无菌胶原液,所述的胶原液是按照上述任一所述的方法制成的。
上述具有生物活性的无菌胶原液在制备皮肤损伤修复产品、创面修复产品、医学美容产品或化妆品中的应用。
本发明的有益效果是:
1)本发明在低温条件下对胶原液进行辐照灭菌,可使产品达到无菌(无菌保证水平SAL=10-6)的同时,保持胶原的活性,避免了胶原在辐照的过程中变性失活或者发生交联反应造成的功能下降甚至失活。
2)本发明采用超滤纯化代替传统的透析纯化,效果是缩短了纯化的时间,另外采用自动化系统代替传统的半自动操作,避免了人手污染,保证了产品的洁净度、纯度、生物活性。
3)本发明将动物组织在超低温条件下进行粉碎,破碎组织成粉末状或细丝状,使组织在酸溶酶解的过程中大大的增加了反应的接触面积,使反应的时间缩短和提高产率,有利于胶原保存完好的生物活性。
附图说明
图1为实施例1制备的胶原液的SDS-PAGE电泳检测,M为sigma标准品,1为实施例1制备的胶原液。
具体实施方式
一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,包括如下步骤:
1)将动物的筋腱进行脱脂、切片、消毒;
2)将上述消毒后的筋腱在超低温条件下进行粉碎,得到细丝状的筋腱纤维;
3)将粉碎后的筋腱组织进行酸溶酶解,再过滤除渣得胶原原液;
4)将胶原原液进一步盐析、纯化,即可得到高纯度的胶原液;
5)将纯化后的高纯度胶原液在十万级或以上洁净环境下进行灌装,分装并封口;
6)将封口好的高纯度胶原液进行冷冻;
7)将冷冻后的胶原液放入装有干冰或超低温冰盒的泡沫箱或保温箱中封口,进行低温辐照灭菌,解冻后即可得到无菌的胶原液。
优选的,上述筋腱为牛筋腱、猪筋腱或鼠尾筋腱。
优选的,上述步骤2)中所述的粉碎温度为-150℃~-60℃。
优选的,上述步骤3)中所述的酸溶酶解的具体操作为:将所获得的筋腱纤维加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中,以10~50rpm的搅拌速度搅拌3~10小时。
优选的,上述冰醋酸和胃蛋白酶的混合液的体积为筋腱纤维的100~200倍。
优选的,上述冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中含0.1~0.5mol/L的冰醋酸和300~400mg/L的胃蛋白酶。
优选的,上述步骤4)中所述的盐析为将胶原原液加入等体积的1.4mol/L的氯化钠溶液进行盐析,取沉淀,将沉淀重新加入0.2~0.5mol/L冰醋酸溶液中进行溶解。
优选的,上述步骤4)中所述的纯化是采用超滤纯化系统进行的纯化,超滤系统纯化的条件为:进口端压力为10~40psi,回流端压力为0~10psi,进行恒体积的6~12倍超滤。
优选的,上述步骤6)中所述冷冻时间为18~72h,冷冻温度为0℃以下,更优选为-80℃~-10℃。
优选的,上述步骤7)中所述低温辐照灭菌的辐照剂量为15~40kgy,温度为0℃以下,更优选为-75℃~0℃。
优选的,上述胶原原液的酸溶酶解、盐析、纯化、灌装过程均在温度20℃~28℃下进行。
优选的,上述胶原原液生产过程均在万级环境下进行。
一种具有生物活性的无菌胶原液由上述所述的方法制成。
上述方法制成的具有生物活性的无菌胶原液在制备美容、药剂中的应用。
实施例
1
1)新鲜的健康牛筋腱,切除油脂去筋膜,清洗去除杂质,冷冻后切片,消毒、保存备用
2)取上述消毒过后的牛筋腱在-80℃~-60℃条件下进行粉碎,得到细丝状的筋腱纤维;
3)在筋腱纤维中加入100倍体积的0.5mol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液中,持续搅拌3小时,环境温度范围为25~28℃,搅拌速度50rpm;
将上述混合液过滤除渣得胶原原液;
4)将上述胶原原液加入等体积的1.4mol/L的氯化钠溶液进行盐析,取沉淀,将沉淀重新加入0.5mol/L的冰醋酸进行溶解,
通过超滤设备进行纯化,超滤系统的条件为:口端压力为40psi,回流端为10psi,进行恒体积的6倍超滤即可得到高纯度的胶原液;
5)将上述纯化后的高纯度胶原液在十万级或以上洁净环境下采用半自动灌装设备进行灌装,分装入铝箔袋中,封口;
6)将封口好的高纯度胶原液-18℃以下进行冷冻24小时;
7)将冷冻好的胶原液装入保温箱中,保温箱中装入4片超低温冰盒,使保温箱的温度维持在0℃以下,密封保温箱,送到辐照中心进行25kgy的辐照,室温解冻后即可得到具有生物活性的无菌胶原液。
实施例
2
1)新鲜的健康猪筋腱,切除油脂去筋膜,清洗去除杂质,冷冻后切片,消毒、保存备用
2)取上述消毒过后的猪筋腱在-150℃~-100℃条件下进行粉碎,得到细丝状的筋腱纤维;
3)在筋腱纤维中加入150倍体积的0.4mol/L的冰醋酸和300mg/L的胃蛋白酶的混合液中,持续搅拌10小时,环境温度范围为25~27℃,搅拌速度10rpm;
将上述混合液采用40目的滤网进行过滤除渣得胶原原液;
4)将上述胶原原液加入等体积的1.4mol/L的氯化钠溶液进行盐析,取沉淀,将沉淀重新加入0.4mol/L的冰醋酸进行溶解,通过超滤设备进行纯化,超滤系统的条件为:口端压力为10psi,回流端为0psi,进行恒体积的12倍超滤即可得到高纯度的胶原液;
5)将上述纯化后的高纯度胶原液在十万级或以上洁净环境下进行灌装,分装入铝箔袋中,封口;上述所述胶原原液的酸溶酶解、盐析、纯化、灌装过程均在温度20℃~28℃下进行;
6)将封口好的高纯度胶原液-20℃以下进行冷冻24小时;
7)将冷冻好的胶原液装入保温箱中,保温箱中装入4kg的干冰,使保温箱的温度维持在-75℃~0℃,密封保温箱,送到辐照中心进行40 kGy的辐照,室温解冻后即可得到具有生物活性的无菌胶原液。
实施例
3
1)新鲜的健康鼠尾筋腱,去筋膜,清洗去除杂质,冷冻后切段,消毒、保存备用
2)取上述消毒过后的筋腱在-80℃~-60℃条件下进行粉碎,得到细丝状的筋腱纤维;
3)在筋腱纤维中加入200倍体积的0.1mol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液中,持续搅拌10小时,环境温度范围为27~28℃,搅拌速度15rpm;
将上述混合液过滤除渣得胶原原液;
4)将上述胶原原液加入等体积的1.4mol/L的氯化钠溶液进行盐析,取沉淀,将沉淀重新加入0.5mol/L的冰醋酸进行溶解,通过超滤设备进行纯化,超滤系统的条件为:口端压力为20psi,回流端为0psi,进行恒体积的8倍超滤即可得到高纯度的胶原液;
5)将上述纯化后的高纯度胶原液在十万级或以上洁净环境下进行灌装,分装入铝箔袋中,封口;上述所述胶原原液的酸溶酶解、盐析、纯化、灌装过程均在温度20℃~28℃下进行;
6)将封口好的高纯度胶原液-25℃以下冷冻20小时;
7)将冷冻好的胶原液装入保温箱中,保温箱中装入6片超低温冰盒,使保温箱内维持0℃以下,密封保温箱,送到辐照中心进行15kgy的辐照,室温解冻后即可得到具有生物活性的无菌胶原液。
上述实施例中制备的具有生物活性的无菌胶原液可注射于人体的皮下组织,起到填充,具有美容的效果,可用于制备美容药剂;可制备成胶原膜或粉剂,用于创面修复、皮肤损伤修复等。
SDS-PAGE
电泳检测
下面对实施例1制备的具有生物活性的无菌胶原液进行SDS-PAGE电泳检测,检测结果如果图1所示。从图1中可以看出,采用上述方法制备的胶原蛋白具有较高的生物活性及纯度。
为本领域的专业技术人员容易理解,以上所述仅为本发明专利的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均落在本发明要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)将动物的筋腱进行脱脂、切片、消毒;
2)将上述消毒后的筋腱在超低温条件下进行粉碎,得到细丝状的筋腱纤维;
3)将粉碎后的筋腱组织进行酸溶酶解,再过滤除渣得胶原原液;
4)将胶原原液进一步盐析、纯化,即可得到高纯度的胶原液;
5)将纯化后的高纯度胶原液在十万级或以上洁净环境下进行灌装,分装并封口;
6)将封口好的高纯度胶原液进行冷冻;
7)将冷冻后的胶原液放入装有干冰或超低温冰盒的泡沫箱或保温箱中并密封,进行低温辐照灭菌,解冻后即可得到无菌的胶原液。
2.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:所述筋腱为牛筋腱、猪筋腱或鼠尾筋腱。
3.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:步骤2)中所述的粉碎温度为-150℃~-60℃。
4.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:步骤3)中所述的酸溶酶解的具体操作为:将所获得的筋腱纤维加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中,以10~50rpm的搅拌速度搅拌3~10小时。
5.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:所述的纯化是采用超滤纯化系统进行的纯化,超滤系统纯化的条件为:进口端压力为10~40psi,回流端压力为0~10psi,进行恒体积的6~12倍超滤。
6.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:步骤6)中所述的冷冻温度为-80℃~-10℃,冷冻时间为18~72h。
7.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:步骤7)中所述低温辐照灭菌的剂量为15~40kGy,温度为-75℃~0℃。
8.根据权利要求1所述的一种具有生物活性的无菌胶原液的制备方法,其特征在于:所述的胶原原液的酸溶酶解、盐析、纯化、灌装过程均在温度20℃~28℃,。
9.一种具有生物活性的无菌胶原液,其特征在于:所述的胶原液是按照权利要求1~8任一所述的方法制成的。
10.权利要求1~8任一所述的方法制成的具有生物活性的无菌胶原液在制备皮肤损伤修复产品、创面修复产品、医学美容产品或化妆品中的应用。
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Legal Events
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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