CN105524965A - 一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种收率高、生产周期短、产品纯度高的牛肌腱胶原蛋白提取方法，包括如下步骤：牛肌腱预处理后冷冻、破碎，将破碎后的牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.1％牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在40℃酶解后，得酶解液；将酶解液离心后，取沉淀，用0.1％乙酸溶解后过滤，得滤液；将滤液盐析，得盐析液；两次离心、加水溶解后，再加0.1％乙酸继续溶解，冻干即得牛肌腱胶原蛋白。本发明的有益效果在于：用适冷蛋白酶MCP-01在缓冲液体系下水解肌腱，使胶原微纤维中的胶原三螺旋分子暴露，胶原纤丝发生膨胀和松散，使其快速水解且水解充分，进而提高收率和产品纯度。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物工程领域，具体地说是一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是一种生物性高分子物质，是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质，主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物质基础。
大多数的胶原蛋白在天然状态下不溶于水，在体内以胶原原纤维或称胶原纤维的形式存在。胶原原纤维的基本结构单位是原胶原分子，肽链(亚基)相互缠绕成独特的三股右手螺旋结构。由于上述结构非常稳定，胶原蛋白很难被生物学降解，只有少数的蛋白酶能够在特定的pH和温度条件下水解胶原纤维，这类酶被称为胶原蛋白酶。按照其来源，胶原蛋白酶可以分为微生物胶原蛋白酶和动物胶原蛋白酶。其中，哺乳动物胶原蛋白酶以基质金属蛋白酶为主。
目前国内外的胶原蛋白主要从鱼皮、动物皮及肌腱中提取制备，临床上胶原海绵是无过敏性、无菌冻干胶原，是促进伤口痊愈的特效药,还可作为各种外科手术填充剂和止血药,疗效显著，用途广泛。
一般胶原蛋白的提取主要采用酸溶、酶解、盐析等方法，最后冻干成品经干热病毒灭活和钴-60辐照。公告号为CN100366303C的发明专利公开了一种肌腱、韧带防粘连生物膜的制备方法，以牛肌腱组织为基料，经过除杂、清洗、酸、碱、酶处理、硫酸软骨剂交联，冷冻干燥、灭菌后制得蛋白纯度在95％以上的医用胶原蛋白。
但是上述方法并未公开具体的工艺参数，例如用何种酶处理、处理时间，而现有的制备方法又存在以下缺陷：酶解过程中采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，反应时间长，收率低，纯度低，生产的胶原蛋白材料存在机械性能、生物稳定性等方面的缺陷，限制其实际应用。为克服上述缺点，也采用高电压脉冲法提取，但是仍然无法达到令人满意的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种收率高、生产周期短、产品纯度高的牛肌腱胶原蛋白提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05％～0.15％牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38℃～42℃酶解后，得酶解液；
将酶解液离心后，取沉淀，用0.08％～0.12％乙酸溶解后过滤，得滤液；
将滤液盐析，得盐析液；
将盐析液离心，取沉淀，用水溶解后再加0.08％～0.12％乙酸继续溶解，得胶原蛋白液；
将胶原蛋白液冷冻干燥后，即得牛肌腱胶原蛋白。
本发明的有益效果在于：提取效率高，现有的提取方法每千克肌腱能提取86.7克胶原蛋白产品，采用本发明方法收率能提高到106.2克，收率提高近20％；产品纯度高，紫外扫描图谱呈现在250～500nm之间均无吸收峰，同时在180～240nm之间有强吸收峰，表明在波长280am附近无吸收峰，不含杂蛋白；而在230am及以下存在强烈的吸收峰，表明胶原蛋白的羰基及肽键的特征吸收峰强，胶原蛋白含量近100％；生产周期短，由原来的两天时间现缩短至一天，原有的酶解时间需长达8小时，而采用适冷蛋白酶MCP-01酶解时间可控制在4小时内，当日就能完成生产过程；产品弹性好，亲水性强，生物相容性好。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：用适冷蛋白酶MCP-01在缓冲液体系下水解肌腱，使胶原微纤维中的胶原三螺旋分子暴露，胶原纤丝发生膨胀和松散，使其快速水解且水解充分，进而提高收率和产品纯度。
请参照图1，一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05％～0.15％牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38℃～42℃酶解后，得酶解液；
将酶解液离心后，取沉淀，用0.08％～0.12％乙酸溶解后过滤，得滤液；
将滤液盐析，得盐析液；
将盐析液离心，取沉淀，用水溶解后再加0.08％～0.12％乙酸继续溶解，得胶原蛋白液；
将胶原蛋白液冷冻干燥后，即得牛肌腱胶原蛋白。由于胶原蛋白是水不溶性蛋白，具有特殊超分子结构，除了胶原蛋白酶外，其他蛋白酶很难降解，而适冷蛋白酶MCP-01是分离自深海沉积物的适冷菌Pseudoalteromonassp.SM9913分泌的主要蛋白酶，适冷蛋白酶MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P结构域和PKD结构域四部分，含有C端的PKD结构域作用于不溶性底物，使胶原微纤维中的胶原三螺旋分子暴露，胶原纤丝发生膨胀和松散，大大提高了蛋白质水解效率，减少了酶解的时间。由于PKD结构域的对胶原纤丝的膨胀作用与温度关系较大，以往都认为4～10℃条件下用适冷蛋白酶MCP-01酶解胶原蛋白，效果较好，但是我们发现在Tris-HCL缓冲液中在38℃～42℃条件下酶解，并配合后续的多次离心和溶解，在相同时间内得到的胶原蛋白纯度最高、收率最大。进一步的，38℃～42℃时适冷蛋白酶MCP-01在pH＝8的Tris-HCL缓冲液中活性最高，可大大提高酶解效率，减少酶解时间。
进一步的，所述预处理包括：剔除牛肌腱上的肉、骨、膜后，用2倍牛肌腱体积的体积分数为0.3％的聚山梨酯80水溶液搅拌清洗牛肌腱，用水冲洗牛肌腱至溶液清澈，然后用2倍牛肌腱体积的0.005mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛肌腱，再用水冲洗至牛肌腱表面为中性，最后将牛肌腱浸泡在水中，剔除牛肌腱上粘附的膜后用水冲洗牛肌腱至无杂物。
经过上述预处理后，牛肌腱上的杂物可以完全除去，避免对后续的胶原蛋白提取造成影响。
进一步的，所述缓冲液中Tris-HCL的浓度为0.01mol/L，缓冲液pH＝8.0，缓冲液体积为2倍牛肌腱体积。
在上述酸碱环境和比例下，牛肌腱可以宰最短时间内水解完全，同时使用的酶、缓冲液量最少，有利于降低提取成本。
进一步的，将冻干后的牛肌腱胶原蛋白进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对胶原蛋白的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活，然后进行钴-60辐照，得医用胶原蛋白无菌制品。
具体的，上述牛肌腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
步骤1、剔除牛肌腱上的肉、骨、膜后，用2倍牛肌腱体积的体积分数为0.3％的聚山梨酯80水溶液搅拌清洗牛肌腱，用水冲洗牛肌腱至溶液清澈，然后用2倍牛肌腱体积的0.005mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛肌腱，再用水冲洗至牛肌腱表面为中性，最后将牛肌腱浸泡在水中，剔除牛肌腱上粘附的膜后用水冲洗牛肌腱至无杂物；
步骤2、将冲洗至无杂物的牛肌腱冷冻、破碎，将破碎后的牛肌腱放入2倍牛肌腱体积的浓度为0.01mol/L、pH＝8.0的Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.1％牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在40℃酶解后，得酶解液；将酶解液离心后，取沉淀，用0.1％乙酸溶解后过滤，得滤液；将滤液盐析，得盐析液；将盐析液离心，将沉淀加水溶解后再次离心，然后加水溶解沉淀，再加0.1％乙酸继续溶解，冻干即得牛肌腱胶原蛋白；
步骤3、将冻干后的牛肌腱胶原蛋白进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对胶原蛋白的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活，然后进行钴-60辐照，得医用胶原蛋白无菌制品。
以下实施例中所采用的牛肌腱均来自于新鲜屠宰的牛蹄筋，经摘挑剔除肌腱上的肉、骨、膜等物后牛肌腱总量约为17kg。
实施例1所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。
(1)称取2kg牛肌腱；
(2)用2倍体积的0.3％(V/V)聚山梨酯80水溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液清澈；
(3)用2倍体积的0.005M氢氧化钠溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液为中性；
(4)将肌腱浸泡在水中，用弯剪剔除肌腱上粘附的膜；
(5)用水冲洗至无杂物；
(6)将清洗好的肌腱排列整齐，放入-30℃冷冻30分钟；
(7)取出肌腱，用刀将其切成1-2mm厚，2-4mm粗的颗粒；
(8)称取肌腱2kg，加40L纯水，用破碎机高速破碎；
(9)滤去水分并尽量挤掉已破碎肌腱中的水分；
(10)加4L0.01MTris-HCL,pH8.0缓冲液；
(11)加0.1％适冷蛋白酶MCP-0140℃进行酶解4小时；
(12)离心，沉淀用40L0.1％乙酸进行溶解；
(13)60目筛挤压过滤，收集滤液；
(14)滤液加10％氯化钠进行析盐；
(15)离心，弃去上清，沉淀加水至原来的一半，搅拌溶解；
(16)重复步骤14两次；
(17)加纯水至40L，再加40ml乙酸溶解；
(18)分装冻干；
实施例2所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。
(1)称取5kg牛肌腱；
(2)用2倍体积的0.3％(V/V)聚山梨酯80水溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液清澈；
(3)用2倍体积的0.005M氢氧化钠溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液为中性；
(4)将肌腱浸泡在水中，用弯剪剔除肌腱上粘附的膜；
(5)用水冲洗至无杂物；
(6)将清洗好的肌腱排列整齐，放入-30℃冷冻30分钟；
(7)取出肌腱，用刀将其切成1-2mm厚，2-4mm粗的颗粒；
(8)称取肌腱5kg，加100L纯水，用破碎机高速破碎；
(9)滤去水分并尽量挤掉已破碎肌腱中的水分；
(10)加10L0.01MTris-HCL,pH8.0缓冲液；
(11)加0.1％适冷蛋白酶MCP-0140℃进行酶解4小时；
(12)离心，沉淀用100L0.1％乙酸进行溶解；
(13)60目筛挤压过滤，收集滤液；
(14)滤液加10％氯化钠进行析盐；
(15)离心，弃去上清，沉淀加水至原来的一半，搅拌溶解；
(16)重复步骤14两次；
(17)加纯水至100L，再加100ml乙酸溶解；
(18)分装冻干；
实施例3所有操作均在万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。
(1)称取10kg牛肌腱；
(2)用2倍体积的0.3％(V/V)聚山梨酯80水溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液清澈；
(3)用2倍体积的0.005M氢氧化钠溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液为中性；
(4)将肌腱浸泡在水中，用弯剪剔除肌腱上粘附的膜；
(5)用水冲洗至无杂物；
(6)将清洗好的肌腱排列整齐，放入-30℃冷冻30分钟；
(7)取出肌腱，用刀将其切成1-2mm厚，2-4mm粗的颗粒；
(8)称取肌腱10kg，加200L纯水，用破碎机高速破碎；
(9)滤去水分并尽量挤掉已破碎肌腱中的水分；
(10)加20L0.01MTris-HCL,pH8.0缓冲液；
(11)加0.1％适冷蛋白酶MCP-0140℃进行酶解4小时；
(12)离心，沉淀用200L0.1％乙酸进行溶解；
(13)60目筛挤压过滤，收集滤液；
(14)滤液加10％氯化钠进行析盐；
(15)离心，弃去上清，沉淀加水至原来的一半，搅拌溶解；
(16)重复步骤14两次；
(17)加纯水至200L，再加200ml乙酸溶解；
(18)分装冻干。
实施例4将所提取的胶原蛋白纯品置于紫外光谱中扫描，根据紫外扫描特征判定胶原蛋白纯度，扫描分析结果如表1所示。
表1
| 批次 | A180 | A200 | A220 | A240 | A260 | A280 | A300 |
| 20150923 | 1.22 | 1.71 | 3.64 | 1.62 | 0.18 | 0.16 | 0.15 |
| 20150924 | 1.22 | 1.70 | 3.58 | 1.63 | 0.19 | 0.15 | 0.14 |
| 20150925 | 1.20 | 1.69 | 3.56 | 1.61 | 0.19 | 0.17 | 0.15 |
本发明通过紫外光谱中扫描，胶原蛋白纯品和所提取的牛筋胶原蛋白的紫外扫描图谱呈现出了相似的特征，在250～500nm之间均无吸收峰，同时在180～240nm之间有强吸收。所提取的胶原蛋白样品在波长280nm附近无吸收峰，表明不含杂蛋白；而在230nm及以下存在强烈的吸收峰，这是胶原蛋白的羰基及肽键的特征吸收峰，呈现了蛋白的特征吸收，排除了杂蛋白存在的可能性，可推断此存在的蛋白为胶原蛋白。因此，可认为所提取的样品中所含的蛋白为胶原蛋白，不存在杂蛋白，所提取的胶原蛋白纯度较高。
综上所述，本发明提供的牛肌腱胶原蛋白的提取方法的有益效果在于：提取效率高，现有的提取方法每千克肌腱能提取86.7克胶原蛋白产品，采用本发明方法收率能提高到106.2克，收率提高近20％；产品纯度高，紫外扫描图谱呈现在250～500nm之间均无吸收峰，同时在180～240nm之间有强吸收峰，表明在波长280am附近无吸收峰，不含杂蛋白；而在230am及以下存在强烈的吸收峰，表明胶原蛋白的羰基及肽键的特征吸收峰强，胶原蛋白含量近100％；生产周期短，由原来的两天时间现缩短至一天，原有的酶解时间需长达8小时，而采用适冷蛋白酶MCP-01酶解时间可控制在4小时内，当日就能完成生产过程；产品弹性好，亲水性强，生物相容性好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05％～0.15％牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38℃～42℃酶解后，得酶解液；
将酶解液离心后，取沉淀，用0.08％～0.12％乙酸溶解后过滤，得滤液；
将滤液盐析，得盐析液；
将盐析液离心，取沉淀，用水溶解后再加0.08％～0.12％乙酸继续溶解，得胶原蛋白液；
将胶原蛋白液冷冻干燥后，即得牛肌腱胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的牛肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于：牛肌腱酶解前，用2倍牛肌腱体积的体积分数为0.3％的聚山梨酯80水溶液搅拌清洗牛肌腱，用水冲洗牛肌腱至溶液清澈，然后用2倍牛肌腱体积的0.005mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛肌腱，再用水冲洗至牛肌腱表面为中性，最后将牛肌腱浸泡在水中，剔除牛肌腱上粘附的膜后用水冲洗牛肌腱至无杂物。
3.根据权利要求1所述的牛肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于：所述缓冲液中Tris-HCL的浓度为0.01mol/L，缓冲液pH＝8.0，缓冲液体积为2倍牛肌腱体积。
4.根据权利要求1所述的牛肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于：将冻干后的牛肌腱胶原蛋白进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对胶原蛋白的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活，然后进行钴-60辐照，得医用胶原蛋白无菌制品。
5.根据权利要求1所述的牛肌腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、剔除牛肌腱上的肉、骨、膜后，用2倍牛肌腱体积的体积分数为0.3％的聚山梨酯80水溶液搅拌清洗牛肌腱，用水冲洗牛肌腱至溶液清澈，然后用2倍牛肌腱体积的0.005mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛肌腱，再用水冲洗至牛肌腱表面为中性，最后将牛肌腱浸泡在水中，剔除牛肌腱上粘附的膜后用水冲洗牛肌腱至无杂物；
步骤2、将冲洗至无杂物的牛肌腱冷冻、破碎，将破碎后的牛肌腱放入2倍牛肌腱体积的浓度为0.01mol/L、pH＝8.0的Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.1％牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在40℃酶解后，得酶解液；将酶解液离心后，取沉淀，用0.1％乙酸溶解后过滤，得滤液；将滤液盐析，得盐析液；将盐析液离心，将沉淀加水溶解后再次离心，然后加水溶解沉淀，再加0.1％乙酸继续溶解，冻干即得牛肌腱胶原蛋白；
步骤3、将冻干后的牛肌腱胶原蛋白进行分装、真空度检测和轧盖后，在98～100℃水浴保温30分钟的条件下对胶原蛋白的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活，然后进行钴-60辐照，得医用胶原蛋白无菌制品。
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|---|---|
| CN (1) | CN105524965A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110151789A (zh) * | 2018-02-11 | 2019-08-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种用于治疗卵巢早衰的产品 |
| CN111349585A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-30 | 山东大学 | 一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶vp9及其编码基因与应用 |
| CN111499921A (zh) * | 2020-04-12 | 2020-08-07 | 江苏安泰康健康科技有限公司 | 明胶海绵及其制备方法及储存方法 |
| CN112741898A (zh) * | 2019-10-29 | 2021-05-04 | 浙江大学 | 矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用 |
| CN113768815A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-10 | 浙江崇山生物制品有限公司 | 一种胶原蛋白植入剂及其制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1795933A (zh) * | 2004-12-24 | 2006-07-05 | 于海鹰 | 肌腱、韧带防粘连生物膜的制备及应用 |
| CN101126104A (zh) * | 2007-05-22 | 2008-02-20 | 上海市食品研究所 | 采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法 |
| CN102154421A (zh) * | 2010-12-15 | 2011-08-17 | 南通市优普保鲜技术有限公司 | 鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法 |
| CN102224938A (zh) * | 2011-05-11 | 2011-10-26 | 山东大学 | 适冷蛋白酶mcp-01在肉类嫩化中的应用 |
| CN102994601A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-27 | 山东大学 | 一种利用海洋胶原蛋白酶mcp-01制备胶原蛋白小肽的方法 |
| CN103571901A (zh) * | 2012-08-06 | 2014-02-12 | 江苏奥普莱医疗用品有限公司 | 大分子活性胶原蛋白的制备方法 |
| CN103937861A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-23 | 天津市赛宁生物工程技术有限公司 | 一种含有长节段纤维的胶原蛋白 |
| CN104357522A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-02-18 | 四川龙王洞生态农业开发有限公司 | 一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法 |
-
2016
- 2016-02-26 CN CN201610105946.3A patent/CN105524965A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1795933A (zh) * | 2004-12-24 | 2006-07-05 | 于海鹰 | 肌腱、韧带防粘连生物膜的制备及应用 |
| CN101126104A (zh) * | 2007-05-22 | 2008-02-20 | 上海市食品研究所 | 采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法 |
| CN102154421A (zh) * | 2010-12-15 | 2011-08-17 | 南通市优普保鲜技术有限公司 | 鱼类加工废弃物皮、骨、鳞中胶原蛋白的提取方法 |
| CN102224938A (zh) * | 2011-05-11 | 2011-10-26 | 山东大学 | 适冷蛋白酶mcp-01在肉类嫩化中的应用 |
| CN103571901A (zh) * | 2012-08-06 | 2014-02-12 | 江苏奥普莱医疗用品有限公司 | 大分子活性胶原蛋白的制备方法 |
| CN102994601A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-27 | 山东大学 | 一种利用海洋胶原蛋白酶mcp-01制备胶原蛋白小肽的方法 |
| CN103937861A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-23 | 天津市赛宁生物工程技术有限公司 | 一种含有长节段纤维的胶原蛋白 |
| CN104357522A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-02-18 | 四川龙王洞生态农业开发有限公司 | 一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110151789A (zh) * | 2018-02-11 | 2019-08-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种用于治疗卵巢早衰的产品 |
| CN110151789B (zh) * | 2018-02-11 | 2021-02-26 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种用于治疗卵巢早衰的产品 |
| CN112741898A (zh) * | 2019-10-29 | 2021-05-04 | 浙江大学 | 矿化肌腱胶原在制备修复骨-肌腱连接处的药物中的应用 |
| CN111349585A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-30 | 山东大学 | 一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶vp9及其编码基因与应用 |
| CN111499921A (zh) * | 2020-04-12 | 2020-08-07 | 江苏安泰康健康科技有限公司 | 明胶海绵及其制备方法及储存方法 |
| CN113768815A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-10 | 浙江崇山生物制品有限公司 | 一种胶原蛋白植入剂及其制备方法 |
| CN113768815B (zh) * | 2021-09-13 | 2022-08-09 | 浙江崇山生物制品有限公司 | 一种胶原蛋白植入剂及其制备方法 |
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