CN101126104A - 采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法，本发明采用酸酶复合，可同一批原料制备得到具有结构完整的酸溶性天然胶原蛋白和具有更好生物相容性的胃蛋白酶可溶性胶原蛋白，不但大大缩短生产周期，并且工艺设备要求低，生产成本低，产品得率高于55％，得到的活性胶原蛋白可广泛用于整容、化妆品及生医材料等方面。

Description

采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种天然活性胶原蛋白的制备方法，特别涉及到一种酸提取和酶解提取复合使用的、从动物皮中提取具有天然活性的胶原蛋白的方法。

技术背景

胶原蛋白是构成动物结缔组织的主要蛋白质，广泛存在于骨、腱、软骨、皮肤等结缔组织中，在脊椎动物中约占总蛋白的1/3左右。胶原蛋白具有独特的氨基酸组成和结构，其中脯氨酸和羟脯氨酸的含量是各种蛋白质中含量最高的；胶原蛋白中存在的羟基赖氨酸在其他蛋白质中不存在。

迄今为止，已定义了20种在遗传学上是独特的胶原类型，其中I型胶原最为常见。天然I型胶原蛋白是由两条完全相同的α₁链和一条α₂链构成的三螺旋结构大分子蛋白。I型胶原蛋白分子95％为三条螺旋链的结构，剩余的约5％为非胶原蛋白性的终端肽链结构领域。胶原蛋白的低抗原性，主要是由于胶原蛋白三螺旋链领域缺乏酪氨酸残基，目前市场上胶原蛋白产品的抗原性除杂质外主要来自胶原蛋白N和C端的非螺旋肽链。天然活性胶原蛋白能保持其良好的三维空间网状结构，具有良好的生物材料特性，可广泛应用于组织工程等领域。而去除了端肽的活性胶原蛋白具有更加良好的生物相容性及促进血小板凝结的功效，其在外科缝合、烧伤敷料、整形美容、硬组织修复等方面有着广泛的应用。同时由于胶原蛋白具有良好的保水、抗紫外辐射及促进表皮细胞生长的能力，所以其在高档化妆品中也有很大的市场应用。

目前国内市场上作为天然活性胶原蛋白产品较少，而水解胶原蛋白和胶原多肽产品较多，这与产品采用的技术路线和方法有关。

水解胶原蛋白和胶原多肽，一般采用酶法提取，水解的产品结构破坏程度较大，分子量分布较广，从几千到十万不等，适合于用于保健食品和低档化妆品。而目前市场上采用单一的酸法或酶法提取工艺众多，其工艺简单但耗时，且提取得率较低，产品稳定性较难控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的方法，包括如下步骤：

(1)先将脱脂去除非胶原蛋白后的动物皮，用pH2-4的缓冲液，料液的质量体积比为1g∶5-15ml，在4～24℃条件下浸泡4-6小时后机械匀浆成浆状，温度控制在25-40℃，然后使用同样的缓冲液，将料液的质量体积比增加到1g∶20～40ml，在30～40℃下酸提取3-9小时，在4-24℃下离心分离，收集上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使最终质量分数达到20-30％，盐析3-12小时，得到的沉淀用浓度为0.1-1M乙酸溶解后，相对于0.01-0.1M的乙酸溶液进行透析，每间隔6-12h换液并逐渐降低乙酸浓度，2-4次后用双蒸水代替，再进行2-4次，最终蛋白溶液pH至5～7时，冻干，得到酸溶性天然活性胶原蛋白；

动物皮的脱脂处理为现有技术，本发明不再赘述；

所说的动物皮选自新鲜的牛、猪或羊的皮；

所说的动物皮最好切割成0.1-0.3cm³小块；

所说的缓冲液选自乙酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，缓冲液的离子强度为0.2M～0.6M；

上清液盐析，所加的(NH₄)₂SO₄最终质量分数为20-30％；

酸提料液混合物离心分离的时间为20-60min，转速为8000-14000rpm；

(2)将步骤(1)离心分离获得的沉降物，加入胃蛋白酶，酶料质量比为：1∶100～300，在30-40℃条件下，酶解3-8小时，然后加入4-10M NaOH溶液，调pH至8-12，4-24℃离心分离，上清液静置灭酶2-8小时后，加入Tris至0.01-0.1M，用酸性物质4-6M HCl溶液调pH至7-8，然后加入(NH₄)₂SO₄，使最终质量分数达到20-30％，盐析3-12小时，得到的沉淀用0.1-1M乙酸溶解后，相对于0.01-0.1M的乙酸溶液进行透析，每间隔6-12h换液并逐渐降低乙酸浓度，2-4次后用水代替，再进行2-4次，最终蛋白溶液pH至5～7时，冻干，得到胃蛋白酶可溶性活性胶原蛋白；

上清液盐析，所加的(NH₄)₂SO₄的最终质量分数为15-25％；

盐析后混合物离心分离的时间为10-20min，转速为8000-12000rpm；

所说的胃蛋白酶，可采用市售产品，如GENVIEW公司生产的胃蛋白酶(纯度＞85％，1∶3000，活性单位3000-3500u/mg)；

本发明所说的“天然活性胶原蛋白”，指保持天然三螺旋结构的胶原蛋白。与之相对应的是天然三螺旋结构完全或部分丧失的胶原蛋白，即非活性胶原蛋白或水解胶原蛋白。

本发明采用可控酸酶法制备天然活性胶原蛋白，回收率较高，产品得率达到55％以上，而且纯度较高，达到90％以上，耗时少，并可以一批原料同时制备得到符合不同用途的活性胶原蛋白。

聚丙烯酰胺凝胶电泳、示差扫描量热仪、圆二色谱测试结果表明，提取得到的酸溶性胶原蛋白和胃蛋白酶可溶性胶原蛋白都保持了天然胶原蛋白的三螺旋结构；圆二色谱图表明两者都具有很好的胶原蛋白三螺旋结构特征，即197nm处的负峰和220nm处的正峰。

附图说明

图1、实验得到的胶原蛋白的SDS-PAGE图谱(12％分离胶、5％浓缩胶)。

图2、胃蛋白酶可溶性胶原蛋白(PSC)的DSC曲线。

图3、酸溶性胶原蛋白(ASC)的DSC曲线。

图4、酸溶性胶原蛋白(ASC)和胃蛋白酶可溶性胶原蛋白(PSC)的圆二色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1以牛皮为原料，可控酸酶法提取活性胶原蛋白

(1)选用经检疫合格的新鲜牛皮，室温下去除表皮层和毛发，切割处理成0.15cm³左右的小块状；丙酮脱脂30min，然后用乙醚脱脂12h，再换丙酮脱脂30min(其中料液的质量体积比为1g∶3ml)；将脱脂后的牛皮用去离子水清洗至无残留丙酮和乙醚后，加入质量分数为5％的NaCl溶液，料液质量体积比为1g∶15ml，时间为18h，去除非胶原蛋白，然后用去离子水冲洗。

取上述脱脂、去除杂蛋白后的牛皮200g，加入pH3.1，离子强度为0.47M的乙酸-乙酸钠缓冲液2L，浸泡4小时，溶涨后，使用组织捣碎机，以12000rpm的转速，间隔匀浆6次，每次30s，温度控制在30℃以下；

将上述匀浆处理得到的混合物，再加入上述乙酸-乙酸钠缓冲液4L，在组织捣碎机中，10000rpm下混匀30s；在32℃条件下，进行酸提取6小时；然后于4℃条件下，以10000rpm的转速离心30min，收集分离出的上清液；

在酸提取得到的上清液中加入(NH₄)₂SO₄并缓慢搅拌，使最终(NH₄)₂SO₄的质量分数达到28％，盐析6小时；

得到的沉淀用浓度为0.5M乙酸溶解，然后相对于0.1M的乙酸溶液进行透析，每8小时换液并逐渐降低乙酸浓度至0.01M，4次后用双蒸水代替，再透析2次，至最终蛋白溶液pH为7时，冻干，得到酸溶性天然活性胶原蛋白；

(2)将上述酸提取结束后离心得到的沉降物，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与沉降物的质量比例为1∶200，在32℃条件下，酶解6小时；

酶解结束后用4M NaOH调pH至10，于4℃条件下，以10000rpm的转速离心12min，分离出的上清液静置5小时，灭酶，加入Tris至0.05M，用4M HCl调pH至7；

然后于上清液中加入(NH₄)₂SO₄并缓慢搅拌，使最终(NH₄)₂SO₄的质量分数达到20％，盐析6小时，得到的沉淀用0.5M乙酸溶解后，然后相对于0.1M的乙酸溶液进行透析，每8小时换液并逐渐降低乙酸浓度至0.01M，4次后用双蒸水代替，再透析2次，至最终蛋白溶液pH为7时，冻干，得到胃蛋白酶可溶性活性胶原蛋白；

使用该工艺，以脱脂去除杂蛋白的牛皮中含有的胶原蛋白计，可得到5.7％的酸溶性胶原蛋白和50.8％的胃蛋白酶可溶性胶原蛋白，总得率达到了56.5％。

聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。图中，1为胃蛋白酶可溶性胶原蛋白(PSC)，2为酸溶性胶原蛋白(ASC)，α1为胶原蛋白的一条单链，分子量为130KDa；α2为其另一条单链，分子量为110KDa；β为α1和α2构成的二聚体；γ则是胶原蛋白的完整三股螺旋结构，即由三条单链构成，分子量约为300KDa；这张图在表明其纯度的同时，又表明其三螺旋完整结构的保持；

示差扫描量热仪图见图2及图3，这两张图表明无论是ASC还是PSC都具有较高的变性温度，从另一角度证明提取得到的胶原蛋白是活性胶原蛋白。

圆二色谱见图4。图4中，1为胃蛋白酶可溶性胶原蛋白，2为酸溶性胶原蛋白。此圆二色谱图证明了提取得到的ASC和PSC皆具有完整的三螺旋结构，即为活性胶原蛋白。

实施例2：以猪皮为原料，可控酸酶法提取活性胶原蛋白

(1)选用经检疫合格的新鲜猪皮，室温下去除表皮层和毛发，切割处理成0.1cm³左右的小块状；丙酮脱脂30min，然后用乙醚脱脂12h，再换丙酮脱脂30min(其中料液的质量体积比为1g∶3ml)；将脱脂后的猪皮用去离子水清洗至无残留丙酮和乙醚后，加入质量分数为5％的NaCl溶液，料液质量体积比为1g∶15ml，时间为18h，去除非胶原蛋白，然后用去离子水冲洗。

取上述脱脂、去除杂蛋白后的猪皮200g，加入pH3.1，离子强度为0.5M的乙酸-乙酸钠缓冲液2L，浸泡4小时，溶涨后，使用组织捣碎机，以12000rpm的转速，间隔匀浆6次，每次30s，将温度控制在30℃以下。

将上述匀浆处理得到的混合物，再加入上述乙酸-乙酸钠缓冲液4L，在组织捣碎机中，10000rpm下混匀30s；在32℃条件下，进行酸提取6小时；然后于4℃条件下，以14000rpm的转速离心20min，收集分离出的上清液；

在酸提取得到的上清液中加入(NH₄)₂SO₄并缓慢搅拌，使最终(NH₄)₂SO₄的质量分数达到28％，盐析6小时；

得到的沉淀用浓度为0.5M乙酸溶解，然后相对于0.1M的乙酸溶液进行透析，每8小时换液并逐渐降低乙酸浓度至0.01M，4次后用双蒸水代替，再透析2次，至最终蛋白溶液pH为7时，冻干，得到酸溶性天然活性胶原蛋白；

(2)将上述酸提取结束后离心得到的沉降物，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与沉降物的质量比例为1∶250，32℃条件下，酶解6小时；

酶解结束后用10M NaOH调pH至10，4℃条件下，以10000rpm的转速离心12min，分离出的上清液静置5小时，灭酶，加入Tris至0.05M，用4M HCl调pH至7；

然后于上清液中加入(NH₄)₂SO₄并缓慢搅拌，使最终(NH₄)₂SO₄的质量分数达到20％，盐析6小时，得到的沉淀用0.5M乙酸溶解后，然后相对于0.1M的乙酸溶液进行透析，每8小时换液并逐渐降低乙酸浓度至0.01M，4次后用双蒸水代替，再透析2次，至最终蛋白溶液pH为6时，冻干，得到胃蛋白酶可溶性活性胶原蛋白；

使用该工艺，以脱脂去除杂蛋白的猪皮中含有的胶原蛋白计，总得率达到了55.6％，纯度90％以上。

Claims (8)

1.采用酸酶复合制备天然活性胶原蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)先将脱脂去除非胶原蛋白后的动物皮，用pH2-4的缓冲液浸泡4-6小时后机械匀浆成浆状，温度控制在25-40℃，然后使用上述pH2-4缓冲液，将料液的质量体积比增加到1∶20-40，提取3-9小时后，在4-24℃下离心分离，收集上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使最终质量分数达到20-30％，盐析3-12小时后，4-24℃下离心分离得到的沉淀用0.1-1M乙酸溶解后，相对于0.01-0.1M乙酸溶液进行透析，每间隔6-12h换液并逐渐降低乙酸浓度，2-4次后用双蒸水代替，再进行2-4次，最终蛋白溶液pH至5～7时，冻干，得到酸溶性天然活性胶原蛋白；

(2)将步骤(1)酸提取结束后离心分离得到的沉降物，加入胃蛋白酶，酶料的质量比为1∶100-1∶300，酶解3-8小时，然后加入NaOH溶液，调pH至8-12，4-24℃离心分离，上清液静置灭酶2-8小时后，加入Tris至0.01-0.1M，用HCl调pH至7-8，然后加入(NH₄)₂SO₄，使最终质量分数达到20-30％，盐析3-12小时，得到的沉淀用0.1-1M乙酸溶解后，相对于0.01-0.1M乙酸溶液进行透析，每间隔6-12h换液并逐渐降低乙酸浓度，2-4次后用双蒸水代替，再进行2-4次，最终蛋白溶液pH至5～7时，冻干，得到胃蛋白酶可溶性活性胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，脱脂去除非胶原蛋白后的动物皮与pH2-4的缓冲液料液的质量体积比为1g∶5-15ml，机械匀浆成浆状，温度控制在25-40℃，然后使用同样的缓冲液，将料液的质量体积比增加到1g∶20-40ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的缓冲液选自乙酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，缓冲液的离子强度为0.2M～0.6M。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酸提后离心分离的时间为20-60min，转速为8000-14000rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酸提取温度为30-40℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶解温度为30-40℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，盐析使用的(NH₄)₂SO₄质量分数为20-30％。

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所说的动物皮选自新鲜的牛、猪或羊的皮。

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