CN113462736A - 从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法及胶原蛋白 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法及胶原蛋白，制备方法以三月龄SPF猪皮为原料，用脱脂剂脱脂后，采用酶解法提取猪皮胶原蛋白并去除端肽，利用盐洗和超滤纯化胶原蛋白，冷冻干燥后获得高纯度海绵状去端肽胶原蛋白。本申请所述的制备方法工艺过程简单、高效，经蛋白质凝胶电泳及LC‑MS/MS检测，获得的胶原蛋白产物不包含胶原蛋白端肽，且结构完整，生物活性保持完好，可直接用于医用及组织工程材料。
Description
技术领域
本申请涉及生物医用材料制备领域，尤其涉及一种从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法及胶原蛋白。
背景技术
人体皮肤的营养成分中超过70％为胶原蛋白，以细纤维的形式为皮肤提供弹性和紧致度，同时为表皮提供水分，使皮肤看起来光滑饱满，胶原蛋白的流失是引起皮肤老化的主要原因。因此，作为皮肤组织的主要组分，Ⅰ型胶原蛋白是纠正面部软组织缺陷的较为理想的材料。目前，胶原蛋白作为中国食品药品监督管理局CFDA批准的注射填充剂之一在整形美容外科中占有重要位置。相较于玻尿酸，胶原蛋白的三维结构具有更强的机械强度和稳定性。同时，近年来对胶原蛋白功能性研究证实，胶原蛋白可刺激真皮层纤维母细胞产生新的胶原蛋白，形成新的组织，产生修复和再生作用。因此，作为天然医美产品，胶原蛋白的抗衰老的作用机制更多样且作用效果更持久。由于胶原蛋白在生物进化上高度保守，因此动物来源的胶原蛋白与人体胶原蛋白具有高度的同源性，同型胶原在氨基酸的种类、数目和排列顺序上基本相同，因此，动物来源的胶原蛋白免疫原性极低，具有高度的安全性和生物相容性。基于此，注射类胶原蛋白产品有望成为继玻尿酸之后微整形行业新的增长点，市场开发潜力巨大。
目前，在胶原蛋白的制备过程中，还存在溶剂残留问题、耗时过长问题、胶原蛋白活性成分产率低问题、胶原蛋白物理性质不佳问题。同时，由于动物源胶原蛋白的两端端肽与人源胶原蛋白端肽差异较大，是胶原蛋白产品无法彻底克服引起免疫源性反应的根源。
发明内容
本申请的目的是，克服现有技术的不足，提供一种温和的、耗时短的、产量高的从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法，并且获得相应的胶原蛋白。
为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，提供一种从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
获取猪皮并进行脱脂处理；
制备成均质脱脂猪皮之后用蛋白提取液除去水溶性杂蛋白；
用胃蛋白酶和盐酸/乙酸提取猪皮中的胶原蛋白，获取提取液；
对所述提取液进行中性低温盐析，获取沉淀；
对所述沉淀进行精制处理之后，获得去端肽胶原蛋白。
优选地，所述猪皮来源于SPF级动物；所述猪皮来源于三月龄的猪。
具体地，所述脱脂处理包括：
配制脱脂剂；
将所述猪皮和脱脂剂按照固液体积比1：10进行混合之后搅拌脱脂；
去上清。
可选择地，所述脱脂剂选用0.1mol/L的NaOH、0.6％的SDS或2％的Na2CO3；脱脂的搅拌时间为2～8h。
优选地，进行所述脱脂处理之前，包括：去除所述猪皮表面脂肪，切成边长为毫米尺寸的小块。
优选地，制备所述均质脱脂猪皮用的溶液为磷酸缓冲液或10％的NaCl溶液；所述蛋白提取液为磷酸缓冲液或10％的NaCl溶液。
进一步优选地，所述胃蛋白酶的添加量为所述均质脱脂猪皮质量的1/100～1/20质量比；所述盐酸/乙酸的使用浓度为0.5mol/L，添加量为所述均质脱脂猪皮体积的10倍体积比；所述胶原蛋白的提取温度为4℃，提取时间为24～48h。
进一步地，所述中性低温盐析的过程如下：将所述提取液调整至pH＝7.0,在4℃的条件下静置8h以上。
优选地，所述精制过程包括以下步骤至少之一：
对所述沉淀进行洗涤，洗涤液选用磷酸缓冲液；
对所述沉淀进行复溶之后，进行超滤分离；
对所述沉淀进行复溶之后，进行冷冻干燥。
可选择地，所述超滤分离所要求的截流分子量为3kD、10kD或50kD。
第二方面，提供一种胶原蛋白，所述胶原蛋白不含I型胶原蛋白的N端端肽和C端端肽，其采用如前所述的从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法获得。
与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
本申请的脱脂处理选择NaOH、SDS和Na2CO3中的一种作为脱脂剂，条件温和，产品无有机溶剂残留问题；
本申请的胶原蛋白提取过程选用高活力胃蛋白酶对胶原蛋白进行酶解，并严格控制酶解时间，在大幅提高了胶原蛋白的提取效率的同时，去除具有免疫原性的端肽，保证了产品的安全性。
本申请的方法胶原蛋白产率高、胶原蛋白活性保持好，成品的胶原蛋白纯度高，可直接用于医用及组织工程材料。
附图说明
图1为利用本申请的从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法制备的去端肽胶原蛋白产品图。
图2为图1的去端肽胶原蛋白产品的蛋白质凝胶电泳分析图。
图3为图1的去端肽胶原蛋白产品的LC-MS/MS结果分析图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。
胶原蛋白是人体最重要的结构蛋白，广泛分布于骨、皮肤、肌腱等结缔组织中，具有支撑、保护的功能，在组织再生修复和愈合过程中也有重要作用；胶原分子含三条肽链，三条肽链互相盘绕形成右手复合螺旋即胶原三螺旋，只有具备完整三螺旋结构的胶原才具备生物活性；去除了端肽区域的胶原蛋白，称为去端肽胶原蛋白。在胶原蛋白提取过程中，通过水解或去除端肽使其失活，可显著去除胶原蛋白的免疫原性根源，有效降低其抗原性、提高生物相容性和可降解性；去端肽活性胶原能在肌肤表面形成致密的胶原网状结构，有效连接受损的胶原纤维，填充细胞外间质的空隙，从而促进细胞迁移和增殖，加速创口的闭合和修复。
实施例1
一种从SPF(Specific pathogen Free，无特定病原体)猪皮中获得的高纯度去端肽胶原蛋白及其制备方法猪皮中制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：取三月龄SPF猪皮去除表面脂肪，切成5×5mm小块。按固液比1:10加入0.6％SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠)，室温搅拌提取6h，离心后将猪皮按固液比1:1加入pH7.4的PBS(phosphate buffer sal ine，磷酸缓冲液)溶液，充分均质；然后补加PBS至固液比1:5，搅拌提取3h，除去水溶性杂蛋白，离心后，沉淀加入20倍体积的0.5mol/L HCl(盐酸)和1/50(w/w)胃蛋白酶，10℃酶解24h，离心后收集上清，用NaOH调至pH7.0，4℃静置过夜，离心后将沉淀PBS洗两次后，用0.5mol/L HCl充分溶解，经10kD超滤分离后，冷冻干燥后获得高纯度去端肽胶原蛋白。
本实施例中，均质猪皮所用的溶液与除去水溶性杂蛋白的溶液一致，都采用pH7.4的PBS溶液。另一种可能的实现方式是，均质猪皮所用的溶液与除去水溶性杂蛋白的溶液都采用10％的NaCl溶液。
实施例2
一种从SPF猪皮中制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：取三月龄SPF猪皮去除表面脂肪，切成5×5mm小块。按固液比1:10加入0.1mol/L NaOH，室温搅拌提取3h，离心后将猪皮按固液比1:1加入10％NaCl溶液，充分均质；然后补加PBS至固液比1:10，搅拌提取3h，除去水溶性杂蛋白，离心后，沉淀加入10倍体积的0.5mol/L HCl(盐酸)和1/20(w/w)胃蛋白酶，4℃酶解48h，离心后收集上清，用NaOH调至pH7.0，4℃静置过夜，离心后将沉淀PBS洗两次后，用0.5mol/L HCl充分溶解，经50kD超滤分离后，冷冻干燥后获得高纯度去端肽胶原蛋白。
本实施例中，均质猪皮所用的溶液与除去水溶性杂蛋白的溶液不一致，均质猪皮所用的溶液与除去水溶性杂蛋白的溶液从PBS和10％的NaCl溶液中择一选用。
实施例3
一种从SPF猪皮中获得的高纯度去端肽胶原蛋白及其制备方法猪皮中制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：取三月龄SPF猪皮去除表面脂肪，切成5×5mm小块。按固液比1:10加入0.6％SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠)，室温搅拌提取6h，离心后将猪皮按固液比1:1加入pH7.4的PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲液)溶液，充分均质；然后补加PBS至固液比1:5，搅拌提取3h，除去水溶性杂蛋白，离心后，沉淀加入20倍体积的0.5mol/L CH3COOH(乙酸)和1/50(w/w)胃蛋白酶，10℃酶解24h，离心后收集上清，用NaOH调至pH7.0，4℃静置过夜，离心后将沉淀PBS洗两次后，用0.5mol/L HCl充分溶解，经10kD超滤分离后，冷冻干燥后获得高纯度去端肽胶原蛋白。
本实施例中，与实施例1相比较，采用CH3COOH替换HCl，对均质猪皮的酶解效果上没有明显差异。
实施例4
一种从SPF猪皮中制备高纯度胶原蛋白的方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：取三月龄SPF猪皮去除表面脂肪，切成5×5mm小块。按固液比1:10加入0.1mol/L NaOH，室温搅拌提取3h，离心后将猪皮按固液比1:1加入10％NaCl溶液，充分均质；然后补加PBS至固液比1:10，搅拌提取3h，除去水溶性杂蛋白，离心后，沉淀加入10倍体积的0.5mol/LCH3COOH(乙酸)和1/20(w/w)胃蛋白酶，4℃酶解48h，离心后收集上清，用NaOH调至pH7.0，4℃静置过夜，离心后将沉淀PBS洗两次后，用0.5mol/L HCl充分溶解，经50kD超滤分离后，冷冻干燥后获得高纯度去端肽胶原蛋白。
本实施例中，与实施例2相比较，采用CH3COOH替换HCl，对均质猪皮的酶解效果上没有明显差异。
上述四个实施例耗时2～3d即可获得去端肽的胶原蛋白。
按照上述实施例的制备方法所获得的胶原蛋白外观纯净无杂质，质地均匀，整体呈海绵状，如图1所示。对所提取的胶原蛋白进行蛋白质凝胶电泳分析，发现电泳结果中并不存在标示猪I型胶原蛋白的N端端肽和C端端肽的小片段，如图2所示。进一步地，对所提取的胶原蛋白进行氨基酸序列分析，具体的方法为利用胰蛋白酶酶切后进行质谱分析，并且将猪I型胶原蛋白α1链的氨基酸序列与本申请的胶原蛋白的氨基酸序列进行比对，结果如图3所示，被标注的序列为本申请的胶原蛋白酶切后的拼接序列，结果表明，本申请的胶原蛋白经过处理已经除去了N端端肽和C端端肽的序列。
综上所述，本申请以三月龄SPF猪皮为原料，用脱脂剂脱脂后，采用酶解法提取猪皮胶原蛋白并去除端肽，利用盐洗和超滤纯化胶原蛋白，冷冻干燥后获得高纯度海绵状去端肽胶原蛋白。本申请所述的制备方法工艺过程简单、高效，经蛋白质凝胶电泳及LC-MS/MS检测，获得的胶原蛋白产物不包含胶原蛋白端肽，且结构完整，生物活性保持完好，可直接用于医用及组织工程材料。
上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取猪皮并进行脱脂处理；
制备成均质脱脂猪皮之后用蛋白提取液除去水溶性杂蛋白；
用胃蛋白酶和盐酸/乙酸提取猪皮中的胶原蛋白，获取提取液；
对所述提取液进行中性低温盐析，获取沉淀；
对所述沉淀进行精制处理之后，获得去端肽胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪皮来源于SPF级动物；所述猪皮来源于三月龄的猪。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱脂处理包括：
配制脱脂剂；
将所述猪皮和脱脂剂按照固液体积比1：10进行混合之后搅拌脱脂；
去上清。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脱脂剂选用0.1mol/L的NaOH、0.6％的SDS或2％的Na2CO3；脱脂的搅拌时间为2～8h。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，进行所述脱脂处理之前，包括：去除所述猪皮表面脂肪，切成边长为毫米尺寸的小块。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述均质脱脂猪皮用的溶液为磷酸缓冲液或10％的NaCl溶液；所述蛋白提取液为磷酸缓冲液或10％的NaCl溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胃蛋白酶的添加量为所述均质脱脂猪皮质量的1/100～1/20质量比；所述盐酸/乙酸的使用浓度为0.5mol/L，添加量为所述均质脱脂猪皮体积的10倍体积比；所述胶原蛋白的提取温度为4℃，提取时间为24～48h。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性低温盐析的过程如下：将所述提取液调整至pH＝7.0,在4℃的条件下静置8h以上。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精制过程包括以下步骤至少之一：
对所述沉淀进行洗涤，洗涤液选用磷酸缓冲液；
对所述沉淀进行复溶之后，进行超滤分离；所述超滤分离所要求的截流分子量为3kD、10kD或50kD；
对所述沉淀进行复溶之后，进行冷冻干燥。
10.一种胶原蛋白，其特征在于，所述胶原蛋白不含I型胶原蛋白的N端端肽和C端端肽，其采用如权利要求1～9任一项所述的从猪皮中获取去端肽胶原蛋白的制备方法获得。
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