CN110564802A - 一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 - Google Patents
一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110564802A CN110564802A CN201910943003.1A CN201910943003A CN110564802A CN 110564802 A CN110564802 A CN 110564802A CN 201910943003 A CN201910943003 A CN 201910943003A CN 110564802 A CN110564802 A CN 110564802A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tendon
- collagen
- yak
- achilles tendon
- enzymolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 91
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 91
- 210000001361 achilles tendon Anatomy 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims abstract description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 6
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 210000000459 calcaneus Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 claims description 3
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 claims 9
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PUOUNCZTFHFSAR-UHFFFAOYSA-N CC(O[S+]=S)=O Chemical compound CC(O[S+]=S)=O PUOUNCZTFHFSAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910001919 chlorite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052619 chlorite group Inorganic materials 0.000 description 1
- QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N chlorous acid Chemical compound OCl=O QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000001724 microfibril Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XHFLOLLMZOTPSM-UHFFFAOYSA-M sodium;hydrogen carbonate;hydrate Chemical compound [OH-].[Na+].OC(O)=O XHFLOLLMZOTPSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：(1)耗牛跟腱预处理：将新鲜的耗牛跟腱切成片状，放入食盐水中浸泡，温水中浸泡，盐酸浸泡，取出清洗，自然风干，加入胰蛋白酶，微波处理后灭酶，再加入胃蛋白酶，超声波处理，离心过滤，收集滤液，滤液经盐析透析后，冷冻干燥，得到所述耗牛跟腱骨胶原蛋白。本申请通过酶解前的脱脂脱钙处理，提高酶的活性，并结合微波和超声波辅助酶解，提高了骨胶原蛋白的溶解度，进而提高骨胶原蛋白的提取率；另外，在提取过程中不添加任何有机溶剂，产品中会有有机溶剂残留，保证了骨胶原蛋白的品质和产量，且提取工艺简单，操作简便，能耗低，节约了提取成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法。
背景技术
胶原蛋白是一类蛋白质家族，具有其特殊的三股螺旋结构，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。根据它们在体内的分布和功能特点，可以将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分子，Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是畜产品加工废弃物(皮、骨)含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80％-90％左右，在医学上的应用最为广泛。胶原蛋白具有特殊的三股螺旋结构，其生物相容性好，可生物降解，无毒，在医学、生物学、组织工程等方面显示出巨大的潜力。1976年，胶原蛋白产品在美国通过一系列的审批后被批准上市，调查报告显示，从1993-2000年短短的几年中，全球胶原蛋白年销售额从12亿增加到了40亿。目前胶原蛋白在很多领域的应用都相当广泛，特别是医药、保健、食品以及护肤品等行业。
骨胶原又叫构造蛋白质，占人体蛋白总量的30％～40％，它分布在人体肌肉连接的肌腱中、关节连接的软骨组织和结缔组织及皮肤的真皮层中，是组成人体关节软骨、骺软骨、骨小梁、肌肉、皮肤的重要成分，骨骼有机物中有70％～86％是骨胶原，它能促进钙、磷等无机质在骨上的沉积，因而能起到修复骨组织、改善骨质疏松症状、促进身体健康的作用，对于保持骨骼的韧性、人体运动的协调性及皮肤的弹性有很大帮助。
我国是一个畜牧生产和消费大国，中国畜牧信息资料网显示，肉类总产量连续20年居世界第一，与此同时，鲜骨产量每年达到2000万吨。牛骨约占其体重的20％-30％，富含蛋白质、钙、磷等多种营养物质，是一种营养价值极高的肉类加工副产品，更是提取胶原蛋白的首选原料。目前，国内外常用的胶原蛋白提取方法主要有热水提取法、酸提取法、碱提取和酶解法。热水提取法得率较低；酸法水解彻底，色氨酸被完全破坏，丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏；碱性条件下提取胶原，易引起蛋白质变性；酶解法提取胶原蛋白，不仅可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率，而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，能够保持其优良的物理和生化特性。牛跟腱胶原这一资源在我国非常丰富，除了传统的食用外，对其开发利用效率较低。目前，关于从牛跟腱中提取胶原蛋白的相关公开文献有一些，例如：
1、专利申请CN201710556237.1，公开了一种牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法，具体通过以下步骤实现的：将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块腱，碳酸氢钠水溶液浸泡、清洗，晾干得纯牛跟；将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的肉豆蔻酸溶液中浸泡，清洗，晾干；将液氮中加入晾干的牛跟腱，研磨成粉末，得牛跟腱粉末；取牛跟腱粉末，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入胃蛋白酶,角鲨烯，搅拌均匀后，酶解，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，振荡反应，得酶解液；将酶解液盐析透析后，得牛跟腱Ⅰ型胶原。本发明提供的制备方法简单，对设备要求低；所得产品为高纯度的具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原，不会对神经组织产生机械性损伤，生物相容性好。
2、专利申请CN201710223675.6，公开了一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其包括前处理、抽提、沉淀、盐析、纯化、干燥及保存胶原的步骤。本发明的牛跟腱胶原蛋白的提取方法利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从牦牛跟腱中分离纯化I型胶原蛋白，该方法具有高效性，高选择性和易放大性。
3、专利申请CN201611010806.4，公开了一种从牛跟腱中提取胶原的方法。该方法包括以下步骤，先对牛跟腱进行切片；再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％-0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4-15℃下保持12-24h；然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1-2mol/L的盐溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4-7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。采用本发明提供的从牛跟腱中提取胶原的方法获得胶原三股螺旋结构完整性好，纯度高，并且该方法简单，无需高端设备，提取成本低。
4、专利申请CN201310200479.9，公开了一种从牛跟腱中提取胶原的方法，该方法首先将牛跟腱冷冻后切块，再次冷冻后粉碎并装填在可控温层析柱内，向可控温层析柱内连续注入提取液，层析柱夹套内循环水的温度与连续注入的提取液温度一致，从层析柱出口收集提取液。酶解后进行层析分离，层析方式为亲和层析，亲和层析介质的配基一种多肽。淋洗出未结合的蛋白质，洗脱出可以与层析介质结合的蛋白即为高纯胶原。该方法具有操作简单，制备出的胶原纯度高和随机降解率低等优点。
但是，以上公开的专利申请文献，存在的问题和缺点为：酶解效率低，酶解时间长，酶添加量多，操作复杂，能耗较大，且提取过程用到乙醇等有机溶剂，产品中会有有机溶剂残留，而且清洗不方便，洗脱难度大，且提取率较低。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法。本申请通过酶解前的脱脂脱钙处理，提高酶的活性，并结合微波和超声波辅助酶解，提高了骨胶原蛋白的溶解度，进而提高骨胶原蛋白的提取率；另外，在提取过程中不添加任何有机溶剂，产品中会有有机溶剂残留，所用盐酸溶液浓度较低，不会影响到骨胶原蛋白，保证了骨胶原蛋白的品质和产量，且提取工艺简单，操作简便，能耗低，节约了提取成本。
为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：
一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)耗牛跟腱预处理：将新鲜的耗牛跟腱切成5～10mm厚的片状，然后放入0.7～0.9mol/L的食盐水中，搅拌浸泡处理23～25h，然后放入42～46℃温水中浸泡12～15h，每30～40min换一次清水，加入3.9～4.1％的盐酸浸泡10～12h，每隔100～110min更换一次盐酸溶液，取出用饮用水清洗5～6次，自然风干；
(2)酶解：向步骤(1)处理好的牛跟腱中加入胰蛋白酶，微波处理后在65～70℃下灭酶，再加入胃蛋白酶，超声波处理，获得酶解液；
(3)离心：将步骤(2)的酶解液进行离心过滤，收集滤液，滤液经盐析透析后，冷冻干燥，得到所述耗牛跟腱骨胶原蛋白。
进一步地，在步骤(1)，所述耗牛跟腱是生长在新疆草原、呼伦贝尔草原、内蒙古草原、西藏草原或祁连山草原的成熟耗牛的跟腱。
进一步地，在步骤(2)，所述胰蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.1～0.4％。
进一步地，在步骤(2)，所述胰蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.8～7.0，反应温度为56～62℃，酶解时间为3～5h。
进一步地，在步骤(2)，所述微波处理的频率为0.2～0.5KHz，功率为350～450W，时间为100～120min。
进一步地，在步骤(2)，所述胃蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.4～0.6％。
进一步地，在步骤(2)，所述胃蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.8～7.0，反应温度18～20℃，酶解时间4～5h。
进一步地，在步骤(2)，所述超声波处理的频率为38～42Hz，功率为200～300W，时间为7.8～8.3h。
进一步地，在步骤(2)，进行超声波处理时，在提取的7.8～8.3h时间里超声波采取运行29～31min暂停28～30min的方式。
进一步地，在步骤(3)，所述离心过滤的转速为7800～8100r/min，时间为13～16min；所述冷冻干燥是将物料置于1～3℃下进行冷冻干燥至物料含水量低于12％。
由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：
(1)由于耗牛跟腱含有钙，钙会降低酶活性从而影响胶原蛋白提取率；同时耗牛跟腱中还含有脂类物质，其在酶解过程中会生成难溶的脂酸钙沉积在耗牛跟腱的表面，影响酶解反应的进行，并且会影响胶原蛋白的色泽和透明度。本申请在耗牛跟腱骨胶原蛋白提取之前，先对耗牛跟腱进行预处理脱脂脱钙，采用盐酸浸泡方式进行脱钙处理，为后续酶解处理做好准备，降低钙对酶活性的影响，从而提高骨胶原蛋白的提取率；同时通过热水浸泡处理，脱除了牛跟腱中的脂类物质，使得酶解过程不会受到脂类物质的影响，提高了骨胶原蛋白的提取率。
(2)本申请通过酶解前的脱脂脱钙处理，提高酶的活性，并结合微波和超声波辅助酶解，提高了骨胶原蛋白的溶解度，进而提高骨胶原蛋白的提取率；另外，在提取过程中不添加任何有机溶剂，产品中会有有机溶剂残留，所用盐酸溶液浓度较低，不会影响到骨胶原蛋白，保证了骨胶原蛋白的品质和产量，且提取工艺简单，操作简便，能耗低，节约了提取成本。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)耗牛跟腱预处理：将新鲜的耗牛跟腱切成5～10mm厚的片状，然后放入0.7～0.9mol/L的食盐水中，搅拌浸泡处理23～25h，然后放入42～46℃温水中浸泡12～15h，每30～40min换一次清水，加入3.9～4.1％的盐酸浸泡10～12h，每隔100～110min更换一次盐酸溶液，取出用饮用水清洗5～6次，自然风干；所述耗牛跟腱是生长在新疆草原、呼伦贝尔草原、内蒙古草原、西藏草原或祁连山草原的成熟耗牛的跟腱；
(2)酶解：向步骤(1)处理好的牛跟腱中加入胰蛋白酶，微波处理后在65～70℃下灭酶，再加入胃蛋白酶，超声波处理，获得酶解液；
所述胰蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.1～0.4％；所述胰蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.8～7.0，反应温度为56～62℃，酶解时间为3～5h；
所述微波处理的频率为0.2～0.5KHz，功率为350～450W，时间为100～120min；
所述胃蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.4～0.6％；所述胃蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.8～7.0，反应温度18～20℃，酶解时间4～5h；
所述超声波处理的频率为38～42Hz，功率为200～300W，时间为7.8～8.3h；进行超声波处理时，在提取的7.8～8.3h时间里超声波采取运行29～31min暂停28～30min的方式；
(3)离心：将步骤(2)的酶解液进行离心过滤，收集滤液，滤液经盐析透析后，冷冻干燥，得到所述耗牛跟腱骨胶原蛋白；
所述离心过滤的转速为7800～8100r/min，时间为13～16min；所述冷冻干燥是将物料置于1～3℃下进行冷冻干燥至物料含水量低于12％。
实施例2
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，所述胰蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.25％；所述胰蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.9，反应温度为60℃，酶解时间为4h，其他条件不变。
实施例3
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，所述微波处理的频率为0.35KHz，功率为400W，时间为110min，其他条件不变。
实施例4
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，所述胃蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.5％；所述胃蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.9，反应温度19℃，酶解时间4.5h，其他条件不变。
实施例5
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，所述超声波处理的频率为40Hz，功率为250W，时间为8.0h；进行超声波处理时，在提取的8.0h时间里超声波采取运行30min暂停29min的方式，其他条件不变。
实施例6
与实施例1不同之处在于：在步骤(3)，所述离心过滤的转速为8000r/min，时间为15min；所述冷冻干燥是将物料置于2℃下进行冷冻干燥至物料含水量低于12％，其他条件不变。
对比例1
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，进行酶解处理时，只采用胃蛋白酶进行酶解处理，其他条件不变。
对比例2
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，进行酶解处理时，不进行微波处理，其他条件不变。
对比例3
与实施例1不同之处在于：在步骤(2)，进行酶解处理时，不进行超声波处理，其他条件不变。
对比例4
按照专利申请CN201710556237.1中的实施例进行提取。
对比例5
按照专利申请CN201710223675.6中的实施例进行提取。
对比例6
按照专利申请CN201611010806.4中的实施例进行提取。
对比例7
按照专利申请CN201310200479.9中的实施例进行提取。
为了进一步说明本发明能够达到所述技术效果，做以下实验：
采用本申请实施例1～6和对比例1～7种的方法进行牛跟腱骨胶原蛋白的提取，各个方法处理牛跟腱的重量相同，记录各方法所需的成本和骨胶原蛋白提取率。实验结果如下表1所示。
表1
由表1实验数据可知，本申请方法与现有技术相比，提取相同重量的骨胶原蛋白所需成本较低，且提取率较高。
综上所述，本申请通过酶解前的脱脂脱钙处理，提高酶的活性，并结合微波和超声波辅助酶解，提高了骨胶原蛋白的溶解度，进而提高骨胶原蛋白的提取率；另外，在提取过程中不添加任何有机溶剂，产品中会有有机溶剂残留，所用盐酸溶液浓度较低，不会影响到骨胶原蛋白，保证了骨胶原蛋白的品质和产量，且提取工艺简单，操作简便，能耗低，节约了提取成本。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)耗牛跟腱预处理：将新鲜的耗牛跟腱切成5～10mm厚的片状，然后放入0.7～0.9mol/L的食盐水中，搅拌浸泡处理23～25h，然后放入42～46℃温水中浸泡12～15h，每30～40min换一次清水，加入3.9～4.1％的盐酸浸泡10～12h，每隔100～110min更换一次盐酸溶液，取出用饮用水清洗5～6次，自然风干；
(2)酶解：向步骤(1)处理好的牛跟腱中加入胰蛋白酶，微波处理后在65～70℃下灭酶，再加入胃蛋白酶，超声波处理，获得酶解液；
(3)离心：将步骤(2)的酶解液进行离心过滤，收集滤液，滤液经盐析透析后，冷冻干燥，得到所述耗牛跟腱骨胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(1)，所述耗牛跟腱是生长在新疆草原、呼伦贝尔草原、内蒙古草原、西藏草原或祁连山草原的成熟耗牛的跟腱。
3.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，所述胰蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.1～0.4％。
4.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，所述胰蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.8～7.0，反应温度为56～62℃，酶解时间为3～5h。
5.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，所述微波处理的频率为0.2～0.5KHz，功率为350～450W，时间为100～120min。
6.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，所述胃蛋白酶加入量为耗牛跟腱重量的0.4～0.6％。
7.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，所述胃蛋白酶的酶解条件为：pH值为6.8～7.0，反应温度18～20℃，酶解时间4～5h。
8.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，所述超声波处理的频率为38～42Hz，功率为200～300W，时间为7.8～8.3h。
9.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(2)，进行超声波处理时，在提取的7.8～8.3h时间里超声波采取运行29～31min暂停28～30min的方式。
10.根据权利要求1所述的一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法，其特征在于：在步骤(3)，所述离心过滤的转速为7800～8100r/min，时间为13～16min；所述冷冻干燥是将物料置于1～3℃下进行冷冻干燥至物料含水量低于12％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910943003.1A CN110564802A (zh) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910943003.1A CN110564802A (zh) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110564802A true CN110564802A (zh) | 2019-12-13 |
Family
ID=68783728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910943003.1A Pending CN110564802A (zh) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110564802A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111004320A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途 |
| CN113072834A (zh) * | 2020-01-03 | 2021-07-06 | 兰州大学 | 一种用于3d打印的胶原蛋白生物墨水及3d打印方法 |
| CN113520900A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-22 | 甘肃天际生物科技有限公司 | 一种低致敏、抗衰老的牦牛胶原蛋白组合物及应用 |
| WO2022131896A1 (es) * | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Top Health, S.A.P.I. De C.V. | Proceso para producir estructuras de colágeno humano con características controladas |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105169461A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-23 | 重庆海默尼生物技术有限公司 | 一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法 |
| CN105255983A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-01-20 | 江南大学 | 一种胶原蛋白的提取工艺 |
| CN106701879A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-05-24 | 武汉医佳宝生物材料有限公司 | 一种提取i型胶原蛋白的方法 |
| CN106939325A (zh) * | 2016-01-05 | 2017-07-11 | 许昌学院 | 一种牛骨胶原蛋白的制备方法 |
| CN110079575A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-02 | 大连金荣草生物科技发展有限公司 | 一种提取低分子量鹿筋胶原蛋白的方法 |
| CN110283866A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-09-27 | 金华市铁骑士生物科技有限公司 | 鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法 |
-
2019
- 2019-09-30 CN CN201910943003.1A patent/CN110564802A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105169461A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-23 | 重庆海默尼生物技术有限公司 | 一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法 |
| CN105255983A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-01-20 | 江南大学 | 一种胶原蛋白的提取工艺 |
| CN106939325A (zh) * | 2016-01-05 | 2017-07-11 | 许昌学院 | 一种牛骨胶原蛋白的制备方法 |
| CN106701879A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-05-24 | 武汉医佳宝生物材料有限公司 | 一种提取i型胶原蛋白的方法 |
| CN110283866A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-09-27 | 金华市铁骑士生物科技有限公司 | 鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法 |
| CN110079575A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-02 | 大连金荣草生物科技发展有限公司 | 一种提取低分子量鹿筋胶原蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张云凤，等: "超声波-酶法提取牛跟腱胶原蛋白", 《化工技术与开发》 * |
| 罗永康: "《生物活性肽功能与制备》", 31 March 2019, 北京：中国轻工业出版社 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111004320A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | Ⅱ型胶原蛋白的提取方法及用途 |
| CN113072834A (zh) * | 2020-01-03 | 2021-07-06 | 兰州大学 | 一种用于3d打印的胶原蛋白生物墨水及3d打印方法 |
| CN113072834B (zh) * | 2020-01-03 | 2023-01-06 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种用于3d打印的胶原蛋白生物墨水及3d打印方法 |
| WO2022131896A1 (es) * | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Top Health, S.A.P.I. De C.V. | Proceso para producir estructuras de colágeno humano con características controladas |
| CN113520900A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-10-22 | 甘肃天际生物科技有限公司 | 一种低致敏、抗衰老的牦牛胶原蛋白组合物及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110564802A (zh) | 一种耗牛跟腱骨胶原蛋白的提取方法 | |
| CN101570772B (zh) | 一种天然骨胶原的制备方法 | |
| CN102676619B (zh) | 一种海洋鱼类鱼皮的综合利用工艺 | |
| CN107653291A (zh) | 多步酶法协同制备藏牦牛皮胶原蛋白和胶原多肽的方法 | |
| CN101434642B (zh) | 无变性猪皮不溶性胶原粉的制造方法 | |
| CN111944866B (zh) | 连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法 | |
| CN112608968B (zh) | 一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法 | |
| CN105925649B (zh) | 一种低分子量脱脂鱿鱼蛋白功能性活性肽的制备方法 | |
| CN107267587A (zh) | 一种动物软骨生物提取的联产工艺方法 | |
| Suo-Lian et al. | Technology for extracting effective components from fish scale | |
| CN101744090A (zh) | 一种甲鱼小分子多肽的制造方法 | |
| CN107114793A (zh) | 一种综合利用鲟鱼骨制备钙和硫酸软骨素的方法 | |
| CN114957386B (zh) | 一种用鱼鳞生产胶原三肽的方法 | |
| CN112079913A (zh) | 从鲟鱼软骨中提取非变性ii型胶原蛋白的工艺 | |
| CN1784986A (zh) | 一种猪皮本体高效纯化的方法 | |
| CN113151385A (zh) | 一种高效制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 | |
| CN1185960C (zh) | 小肽骨泥的制作方法 | |
| CN113773414B (zh) | 一种提高罗非鱼头骨制备硫酸软骨素提取率的方法 | |
| CN104561203A (zh) | 利用猪肺制备胶原蛋白的方法 | |
| CN105884931A (zh) | 一种生产硫酸软骨素的方法 | |
| CN110818791B (zh) | 一种鱼胶原蛋白的制备方法 | |
| CN113444761A (zh) | 一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN111423525A (zh) | 一种提取硫酸软骨素的方法、硫酸软骨素及其应用 | |
| US20190263891A1 (en) | Process for isolating bioactive biomolecules from animal by-products | |
| CN1584044A (zh) | 鹿角多肽或龟板多肽的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191213 |