CN113072834A - 一种用于3d打印的胶原蛋白生物墨水及3d打印方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于3D打印生物墨水技术领域，具体涉及一种用于3D打印的胶原蛋白生物墨水、制备方法及利用该生物墨水3D打印生物组织/器官的方法。本发明提供了一种由ColMA与LAP组成的可用于生物组织/器官3D打印的生物墨水，所述生物墨水在蓝光照射下可以快速固化成型，打印性能出色。本发明还提供了一种胶原蛋白生物墨水简便的3D打印方法，采用本发明所述方法打印获得的生物组织/器官，不仅具有较好的机械强度，还能保持胶原蛋白的生物活性。本发明提供的可用于光固化式3D打印的胶原蛋白生物墨水，在制备具有优良生物活性和机械性能的生物组织/器官的增材制造领域具有广泛的应用前景。

Description

一种用于3D打印的胶原蛋白生物墨水及3D打印方法
本申请要求申请日为2020年1月3日、申请号为2020100036085、发明名称为“一种用于3D打印的胶原蛋白生物墨水及3D打印方法”的在先申请的优先权，该在先申请的全部内容均已在本申请中体现。
技术领域
本发明属于3D打印生物墨水技术领域，具体涉及一种用于3D打印的胶原蛋白生物墨水及3D打印生物材料的方法。
技术背景
3D打印技术是基于精准化、快速化的一门增材制造技术，通过将生物材料任意地与化学品或细胞等组合，逐层进行打印，得到具有精确结构和相关生物学功能的3D模型。生物3D打印是通过加入包括生物材料、生长因子、细胞等的活性材料，重建人体组织和器官的跨学科、跨领域的新型再生医学工程技术。其中，光固化生物3D打印技术是将紫外光通过数字微镜装置选择性地投射到生物墨水表面，被照射的区域材料开始固化，通过成形平台的上下运动，逐层固化得到三维结构，该方法利用数字光投射器对生物墨水的整个面进行固化，该操作相对简单，利于控制，且打印效率和打印精度较高，在疾病模型、药物缓释、组织工程与再生医学等生物医学领域引起人们广泛重视。
光固化式生物3D打印技术虽然在生物医学领域应用广泛，但是迄今为止，打印制造具有生物活性的器官或组织仍然是巨大挑战，而研发适用于光固化式3D打印的生物墨水是其中的关键。可用于光固化式3D打印医用材料的生物墨水要求严苛，应该具备如下特性：1)可打印性：生物墨水能够在空间和时间维度上精准把控增材成型的性能，快速固化成型，该性能直接关系到3D打印产品是否能取得期望的结构与尺寸精度；2)打印出的生物医用材料应具有良好的生物相容性：要求打印出的生物医用材料能够与组织器官共存且不引起宿主任何不良的局部或系统反应，并且作为植入材料需要与宿主产生积极的相互作用，以达到调控宿主细胞、组织和器官活性与功能的目的；3)打印出的生物医用材料的力学性能稳定：打印出的生物医用材料具有一定的力学强度，能够一定程度上抵抗外界作用力，维持打印物的形貌结构；4)打印出的生物医用材料具备可降解特性：打印出的生物医用材料植入体内后随细胞的增殖及ECM的产生而逐渐降解，且降解速率与细胞产生ECM替换植入材料的速率，及新组织生成的速率相匹配；5)打印出的生物医用材料具备良好的仿生功能：向打印出的生物医用材料中加入细胞活性配体或将仿生组分加到生物打印构建体中可显著改善内源和外源细胞黏附、迁移、增殖和功能表达等。但是，目前应用于光固化3D打印技术的生物墨水主要为热塑性可降解聚酯塑料的合成材料(PLA、PLGA、PCL，PEG)以及它们的共聚物，这些材料为主的生物墨水缺乏生物相容性和仿生功能，并不能为活性细胞的生长提供适宜的环境，因此不能用于制备具有生物相容性和仿生功能的医用组织/器官。
胶原蛋白是人体含量最高的蛋白质，是细胞外基质的主要组成成分，它形成一个分子支架，保护和支撑人体的不同组织和器官。目前已经发现29种不同类型的胶原蛋白。胶原蛋白都具有特征性的三重螺旋结构，它是胶原理化特性和生物功能的基础。胶原的特殊结构赋予它高拉伸强度、低免疫原性、合适的生物降解性能等优良性质。胶原蛋白生物材料作为人工器官骨架或创伤敷料时可以促进细胞生长、促进细胞粘附、与新生细胞和组织协同修复创伤等。牦牛胶原蛋白是从牦牛组织中提取获得的胶原蛋白，与人胶原蛋白具有类似的热变温度和微观结构，具有良好的生物活性。牦牛是我国西北独有的珍贵资源，全球95％的牦牛生活在我国的青藏高原。牦牛生活在高原雪山相对封闭的自然环境，被感染各类病毒的风险较小，重金属残留、药物残留的风险也很小，是一种高度安全的胶原蛋白原料。研究发现，相比于地方黄牛，牦牛生长周期长达6年，蛋白质含量高、脂肪含量低，是优良的胶原蛋白原料。
目前以胶原蛋白为原料用于组织/器官的增材制造已经有了一些尝试，但是仍然存在诸多问题：①大多数生物墨水的制备都是在胶原蛋白变性的基础上通过甲基丙烯酸酐修饰获得，导致获得的生物墨水及3D打印制备的生物材料缺乏生物活性，无法实现细胞黏附、迁移、增殖等功能。例如，中国专利CN109337436A以甲基丙烯酰化明胶为原料制备了3D打印的生物墨水，虽然该生物墨水可用于制备机械强度良好的医用材料，但是该方法采用变性的胶原(明胶)为原料，丧失了胶原蛋白原有的高生物活性，无法用于打印优良生物功能的医用组织/器官；同样，中国专利CN110330797A通过光交联制备了机械强度较好的医用材料，也是利用甲基丙烯酰化改性的明胶，而不是使用具有完整三螺旋结构、未变性的胶原蛋白，也无法用于打印优良生物功能的医用组织/器官。②以未变性的胶原蛋白为生物墨水时，打印获得的医用材料机械强度较差，无法精确打印出结构稳定的医用组织/器官。例如，中国专利CN108003360A通过甲基丙烯酸酐与Ⅱ型胶原溶液反应，得到了可光交联Ⅱ型胶原，加入光引发剂，在紫外光照下获得了生物相容性良好的水凝胶。该方法虽然保持了胶原蛋白的生物活性，但制备的水凝胶力学强度较差，仍然无法实现生物组织/器官的增材制造。③为了增加医用材料的力学强度，在打印方法中往往需要进行化学交联剂的二重交联，这会导致化学交联试剂的毒性残留风险，安全性较差，制备过程也比较复杂，例如，文献(Materials Science and Engineering:C,2020,107:110290)报道了一种光交联后继续化学交联的二重交联方法。综上，虽然胶原蛋白在3D打印医用组织或器官支架方面极具应用前景，但是目前仍然缺乏适合光固化式3D打印的胶原蛋白生物墨水，因此，开发以胶原蛋白为主要成分的可用于光固化式3D打印的生物墨水是本领域迫切需要解决的一个技术难题。
发明人发现，当采用甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白原液后，再添加特定的光引发剂LAP，即可获得保持胶原蛋白生物活性的3D打印生物墨水；并且，该胶原蛋白生物墨水在蓝光照射下可以快速固化成型，符合光固化生物3D打印的特性要求。本发明还提供了一种胶原蛋白生物墨水简便的3D打印方法，采用本发明所述方法打印获得的生物组织/器官，不仅具有较好的机械强度，还能保持胶原蛋白的生物活性，且该方法仅需光照二次固化即可，不需要额外的化学试剂交联，安全性较高。本发明研发的可用于光固化式3D打印的胶原蛋白生物墨水，在制备优良生物活性和机械性能的生物组织/器官的增材制造领域有广泛的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于3D打印的胶原蛋白生物墨水，所述胶原蛋白生物墨水包括ColMA和光引发剂LAP，其中，所述ColMA为甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白。
优选地，所述的胶原蛋白为牦牛胶原蛋白。
优选地，所述ColMA的制备方法包括以下步骤：
(1)提取胶原蛋白原液；
(2)用NaCl和MOPS的缓冲液调步骤(1)所述胶原蛋白原液的pH为6-8，在氮气保护下加入甲基丙烯酸酐溶液，冰浴下反应，得反应产物；
(3)将步骤(2)所得的反应产物用10-30mM的HCl和NaCl混合溶液透析4-8次；再用10-30mM的HCl溶液透析3-6次，获得ColMA溶液。
优选地，所述步骤(1)中胶原蛋白原液的浓度为1-10mg/mL。
优选地，所述步骤(1)中胶原蛋白原液的浓度为1-6mg/mL。
优选地，所述步骤(1)中胶原蛋白原液的提取方法包括以下步骤：
预处理：将牦牛肌腱组织清洗、粉碎，得原料组织粉末；
脱脂：将原料组织粉末用正丁醇溶液脱脂2-4次，每次6-12hrs；
脱钙：将脱脂后的原料组织粉末用盐酸溶液脱钙1-2次；
去除杂蛋白和内毒素：除去盐酸溶液，将脱钙后的原料组织粉末用0.01-2.0M的氢氧化钠溶液浸泡处理2-24hrs；
胶原蛋白原液的提取：除去氢氧化钠溶液，用醋酸-胃蛋白酶溶液提取胶原蛋白，盐析纯化，依次用醋酸溶液、超纯水进行透析6-8次，即得胶原蛋白原液。
优选地，所述步骤(2)中胶原蛋白与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:60-100。
本发明的另一目的在于提供一种用胶原蛋白生物墨水3D打印生物材料的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将ColMA溶液与LAP溶液混合后加入到光固化3D打印机中；
(2)在波长为405nm的蓝光照射下固化打印成型，固化时间为3-20s；
(3)将成型后的生物材料再用波长为405nm蓝光进行二次固化，固化时间为5-30s，即可获得光固化3D打印的生物材料。
优选地，所述ColMA溶液与LAP溶液的浓度比为1:0.3-5。
优选地，所述ColMA溶液的终浓度为1-10mg/mL。
优选地，所述ColMA溶液的终浓度为1-6mg/mL。
优选地，所述LAP溶液的终浓度为2-5mg/ml。
本发明的有益效果是：①本发明通过用甲基丙烯酸酐直接与胶原蛋白原液反应，获得了甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，再加入光引发剂LAP溶液，制备获得了可用于3D打印的胶原蛋白生物墨水，制备方法简便温和；②本发明提供的胶原蛋白生物墨水保持了胶原蛋白原有的三螺旋结构，并且在蓝光照射下快速固化成型，符合光固化3D打印的特性要求；③本发明还提供了一种胶原蛋白生物墨水简便的3D打印方法，采用本发明所述方法打印获得的生物组织/器官，不仅具有较好的机械强度，还能保持胶原蛋白的生物活性，且该方法仅需光照二次固化即可，不需要额外的化学试剂交联，安全性较高；④本发明提供的可用于光固化式3D打印的胶原蛋白生物墨水，在制备具有优良生物活性和机械性能的生物组织/器官的增材制造领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1不同实施例打印的医用假体耳朵；
图2未经MA修饰的胶原蛋白的质谱图；
图3经MA修饰后的胶原蛋白的质谱图；
图4经MA修饰前后的胶原蛋白的圆二色谱图；
图5经MA修饰前后的胶原蛋白的热变曲线。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
本发明提供的胶原蛋白生物墨水可用于光固化式3D打印，并获得优良生物活性和机械性能的医用组织/器官。本发明以下实施例中以结构精细且复杂的医用假体耳朵为例，进行了阐述和说明，在本发明提供的生物墨水能够打印出结构精细且复杂的医用假体耳朵的基础上，本发明提供的生物墨水能够广谱的适用于其他结构简单的医用组织/器官的打印。
本发明实施例中仅以牦牛胶原蛋白原液为原料，用于3D打印生物墨水的制备，但本发明所述并不局限于牦牛胶原蛋白原液，任何其他途径获得的胶原蛋白溶液均可，包括Ⅰ型胶原蛋白溶液、Ⅱ型胶原蛋白溶液等。
实施例1胶原蛋白原液的制备
将牦牛肌腱组织进行清洗，去除异物，粉碎成小块；用10％正丁醇将粉碎后的小块进行脱脂，取沉淀，水洗至中性；将沉淀用0.5M的盐酸溶液进行脱钙，脱钙结束，取沉淀，水洗至中性；将组织沉淀浸泡于0.1M的氢氧化钠溶液中，25℃搅拌处理4h，取沉淀，水洗至中性；用含1g/L胃蛋白酶的0.5M醋酸溶液提取胶原蛋白，得到粗的胶原蛋白提取液；调pH至中性，进行酶灭活；8-14kDa透析袋透析，最终分别得到浓度为6mg/mL的胶原蛋白原液。
实施例2胶原蛋白生物墨水的3D打印方法一
2.1甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白
取实施例1制备的胶原蛋白原液，稀释至浓度为1.5mg/mL，加入150mM的NaCl和MOPS混合缓冲溶液，调pH为7，氮气保护下，每200mL胶原蛋白原液中加入甲基丙烯酸酐1mL，冰浴下反应，得反应产物；
上述所得的反应产物用15mM的HCl和NaCl混合溶液透析，更换透析液重复透析6次，接着用15mM的HCl溶液进行透析，更换透析液重复透析5次，获得甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，置于-20℃备用。
2.2胶原蛋白生物墨水的制备
临用时，取上述ColMA溶液，加入光引发剂LAP溶液，至ColMA溶液终浓度为1.5mg/mL，LAP终浓度为0.25％m/v，混合均匀，即得胶原蛋白生物墨水。
2.3 3D打印医用假体耳朵
将上述配置好的胶原蛋白生物墨水加入到光固化3D打印机中，用波长405nm的蓝光照射12s，进行光固化3D打印；打印成型后，改用波长405nm的蓝光手电筒为光源，距离5cm，光照20s，进行二次固化，即可获得3D打印的医用假体耳朵，所打印的医用假体耳朵如图1a所示，所制备的胶原蛋白生物墨水固化成型速度快，机械强度强，可以打印出与人体耳朵结构相似的医用假体耳朵。实施例3胶原蛋白生物墨水的3D打印方法二
3.1甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白
取实施例1制备的胶原蛋白原液，稀释至浓度为3mg/mL，加入200mM的NaCl和MOPS混合缓冲溶液，调pH为7，氮气保护下，每200mL胶原蛋白原液中加入甲基丙烯酸酐1mL，冰浴下反应，得反应产物；
上述所得的反应产物用20mM的HCl和NaCl混合溶液透析，更换透析液重复透析6次，接着用20mM的HCl溶液进行透析，更换透析液重复透析5次，获得甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，置于-20℃备用。
3.2胶原蛋白生物墨水的制备
临用时，取上述ColMA溶液，加入光引发剂LAP溶液，至ColMA溶液终浓度为3mg/mL，LAP终浓度为0.4％m/v，混合均匀即得胶原蛋白生物墨水。
3.3 3D打印医用假体耳朵
将上述制备的胶原蛋白生物墨水加入到光固化3D打印机中，用波长405nm的蓝光照射20s进行光固化3D打印；打印成型后，改用波长405nm的蓝光手电筒为光源，距离5cm，光照20s，进行二次固化，即可获得3D打印的医用假体耳朵，所打印的医用假体耳朵如图1b所示，所制备的胶原蛋白生物墨水固化成型速度快，机械强度强，可以打印出与人体耳朵结构相似的医用假体耳朵。
实施例4胶原蛋白生物墨水的3D打印方法三
4.1甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白
取实施例1制备的胶原蛋白原液，加入300mM的NaCl和MOPS混合缓冲溶液，调pH为7，氮气保护下，每200mL胶原蛋白原液中加入甲基丙烯酸酐1mL，冰浴下反应，得反应产物；
上述所得的反应产物用30mM的HCl和NaCl混合溶液透析，更换透析液重复透析6次，接着用30mM的HCl溶液进行透析，更换透析液重复透析5次，获得甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，置于-20℃备用。
4.2胶原蛋白生物墨水的制备
临用时，取上述ColMA溶液，加入光引发剂LAP溶液，至ColMA溶液终浓度为6mg/mL，LAP终浓度为0.3％m/v，混合均匀即得胶原蛋白生物墨水。
4.3 3D打印医用假体耳朵
将上述制备的胶原蛋白生物墨水加入到光固化3D打印机中，用波长405nm的蓝光照射10s进行光固化3D打印；打印成型后，改用波长405nm的蓝光手电筒为光源，距离5cm，光照20s，进行二次固化，即可获得3D打印的医用假体耳朵，所打印的医用假体耳朵如图1c所示，所制备的胶原蛋白生物墨水固化成型速度快，机械强度强，可以作为3D的打印生物墨水。
实施例5胶原蛋白生物墨水的3D打印方法四
5.1甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白
取实施例1制备的胶原蛋白原液，稀释至浓度为1mg/mL，加入100mM的NaCl和MOPS混合缓冲溶液，调pH为7，氮气保护下，每200mL胶原蛋白原液中加入甲基丙烯酸酐1mL，冰浴下反应，得反应产物；
上述所得的反应产物用10mM的HCl和NaCl混合溶液透析，更换透析液重复透析6次，接着用10mM的HCl溶液进行透析，更换透析液重复透析5次，冻干获得甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，置于-20℃备用。
5.2胶原蛋白生物墨水的制备
临用时，取上述ColMA溶液，加入光引发剂LAP溶液，至ColMA溶液终浓度为1mg/mL，LAP终浓度为0.25％m/v，混合均匀即得胶原蛋白生物墨水。
5.3 3D打印医用假体耳朵
将上述制备的胶原蛋白生物墨水加入到光固化3D打印机中，用波长405nm的蓝光照射15s进行光固化3D打印；打印成型后，改用波长405nm的蓝光手电筒为光源，距离5cm，光照20s，进行二次固化，即可获得3D打印的医用假体耳朵，所打印的医用假体耳朵如图1d所示，所制备的胶原蛋白生物墨水固化成型速度快，可以作为3D的打印生物墨水。
实施例6胶原蛋白生物墨水的3D打印方法五
6.1甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白
取实施例1制备的胶原蛋白原液，加入300mM的NaCl和MOPS混合缓冲溶液，调pH为7，氮气保护下，每200mL胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐1mL，冰浴下反应，得反应产物；
上述所得的反应产物用30mM的HCl和NaCl混合溶液透析，更换透析液重复透析6次，接着用30mM的HCl溶液进行透析，更换透析液重复透析5次，冻干获得甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，置于-20℃备用。
6.2胶原蛋白生物墨水的制备
临用时，取上述ColMA溶液，加入光引发剂LAP溶液，至ColMA溶液终浓度为6mg/mL，LAP终浓度为0.5％m/v，混合均匀即得胶原蛋白生物墨水。
6.3 3D打印医用假体耳朵
将上述制备的胶原蛋白生物墨水加入到光固化3D打印机中，用波长405nm的蓝光照射11.5s进行光固化3D打印；打印成型后，改用波长405nm的蓝光手电筒为光源，距离5cm，光照20s，进行二次固化，即可获得3D打印的医用假体耳朵，所打印的医用假体耳朵如图1e所示，所制备的胶原蛋白生物墨水固化成型速度快，可以作为3D的打印生物墨水。
实施例7胶原蛋白生物墨水的3D打印方法六
7.1胶原蛋白原液的制备
将牦牛肌腱组织进行清洗，去除异物，粉碎成小块；用10％正丁醇将粉碎后的小块进行脱脂，取沉淀，水洗至中性；将沉淀用0.5M的盐酸溶液进行脱钙，脱钙结束，取沉淀，水洗至中性；将组织沉淀浸泡于0.1M的氢氧化钠溶液中，25℃搅拌处理4h，取沉淀，水洗至中性；用含1g/L胃蛋白酶的0.5M醋酸溶液提取胶原蛋白，得到粗的胶原蛋白提取液；调pH至中性，进行酶灭活；8-14kDa透析袋透析，最终分别得到浓度为10mg/mL的胶原蛋白原液
7.2甲基丙烯酸酐修饰胶原蛋白
取制备的胶原蛋白原液，加入300mM的NaCl和MOPS混合缓冲溶液，调pH为7，氮气保护下，每200mL胶原蛋白溶液中加入甲基丙烯酸酐1mL，冰浴下反应，得反应产物；
上述所得的反应产物用30mM的HCl和NaCl混合溶液透析，更换透析液重复透析6次，接着用30mM的HCl溶液进行透析，更换透析液重复透析5次，冻干获得甲基丙烯酸酐修饰的胶原蛋白ColMA，置于-20℃备用。
7.3胶原蛋白生物墨水的制备
临用时，取上述ColMA溶液，加入光引发剂LAP溶液，至ColMA溶液终浓度为10mg/mL，LAP终浓度为0.5％m/v，混合均匀即得胶原蛋白生物墨水。
7.4 3D打印医用假体耳朵
将上述制备的胶原蛋白生物墨水加入到光固化3D打印机中，用波长405nm的蓝光照射3.7s进行光固化3D打印；打印成型后，改用波长405nm的蓝光手电筒为光源，距离5cm，光照5s，进行二次固化，即可获得3D打印的医用假体耳朵，所打印的医用假体耳朵如图1f所示，所制备的胶原蛋白生物墨水固化成型速度快，可以作为3D的打印生物墨水。
实施例8MA修饰前后胶原蛋白的稳定性
8.1实施例1中胶原蛋白MA修饰度的测定
相对分子质量的计算：根据质谱结果，计算MA修饰前后胶原蛋白的相对分子质量，其中图2为修饰前胶原蛋白的质谱结果，其相对分子质量为91661；图3为修饰后ColMA的质谱结果，其相对分子质量为93961。I型胶原蛋白的单条肽链平均含有约34个赖氨酸，而单个赖氨酸被甲基丙烯酸酐修饰后分子量会增加68。以此推算，胶原蛋白的MA修饰度约为99％。本发明制备的胶原蛋白生物墨水中，胶原蛋白上的赖氨酸残基基本被甲基丙烯酸酐(MA)完全修饰。
8.2结构测定
圆二色谱图测定：对经甲基丙烯酸酐修饰前的胶原蛋白和修饰后的ColMA进行圆二色谱分析，其中图4a为修饰前胶原蛋白的圆二色谱图，图4b为修饰后的ColMA的圆二色谱图。由图4可知，修饰前后的胶原蛋白始终保持完整的三重螺旋结构，修饰后的ColMA中胶原蛋白的生物活性未被破坏。
8.3稳定性测定
热变曲线测定：对经甲基丙烯酸酐修饰前的胶原蛋白和修饰后的ColMA进行热变曲线分析，其中图5a为修饰前胶原蛋白的热变曲线图，图5b为修饰后的ColMA的热变曲线图。由图5可知，修饰前胶原蛋白的热变温度为41℃，修饰后的ColMA的热变温度为35℃。结果说明，在我们温和条件下，MA修饰前后的胶原蛋白的热稳定性变化不大，修饰后的ColMA仍保持良好的三重螺旋结构稳定性。
本发明上述实施例以胶原蛋白生物墨水3D打印在获得了结构精细且复杂的医用假体耳朵的基础上，也可以用于打印其它结构简单的医用组织/器官。
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于3D打印的胶原蛋白生物墨水，其特征在于，所述胶原蛋白生物墨水包括ColMA和光引发剂LAP，其中，所述ColMA为甲基丙烯酸酐修饰后的胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白生物墨水，其特征在于，所述的胶原蛋白为牦牛胶原蛋白。
3.如权利要求1所述的胶原蛋白生物墨水，其特征在于，所述ColMA的制备方法包括以下步骤：
(1)提取胶原蛋白原液；
(2)用NaCl和MOPS的缓冲液调步骤(1)所述胶原蛋白原液的pH为6-8，在氮气保护下加入甲基丙烯酸酐溶液，冰浴下反应，得反应产物；
(3)将步骤(2)所得的反应产物用10-30mM的HCl和NaCl混合溶液透析4-8次；再用10-30mM的HCl溶液透析3-6次，获得ColMA溶液。
4.如权利要求3所述的胶原蛋白生物墨水，其特征在于，所述步骤(1)中胶原蛋白原液的浓度为1-10mg/mL。
5.如权利要求3所述的胶原蛋白生物墨水，其特征在于，所述步骤(1)中胶原蛋白原液的提取方法包括以下步骤：
预处理：将牦牛肌腱组织清洗、粉碎，得原料组织粉末；
脱脂：将原料组织粉末用正丁醇溶液脱脂2-4次，每次6-12hrs；
脱钙：将脱脂后的原料组织粉末用盐酸溶液脱钙1-2次；
去除杂蛋白和内毒素：除去盐酸溶液，将脱钙后的原料组织粉末用0.01-2.0M的氢氧化钠溶液浸泡处理2-24hrs；
胶原蛋白原液的提取：除去氢氧化钠溶液，用醋酸-胃蛋白酶溶液提取胶原蛋白，盐析纯化，依次用醋酸溶液、超纯水进行透析6-8次，即得胶原蛋白原液。
6.如权利要求3所述的胶原蛋白生物墨水，其特征在于，所述步骤(2)中胶原蛋白与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:60-100。
7.用权利要求1-6任一所述的胶原蛋白生物墨水3D打印生物材料的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将ColMA溶液与LAP溶液混合后加入到光固化3D打印机中；
(2)在波长为405nm的蓝光照射下固化打印成型，固化时间为3-20s；
(3)将成型后的生物材料再用波长为405nm蓝光进行二次固化，固化时间为5-30s，即可获得光固化3D打印的生物材料。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ColMA溶液与LAP溶液的浓度比为1:0.3-5。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ColMA溶液的终浓度为1-10mg/mL。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述LAP溶液的终浓度为2-5mg/ml。
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