CN105936671A

CN105936671A - 一种乙烯基胶原蛋白的制备方法

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Publication number: CN105936671A
Application number: CN201610395101.2A
Authority: CN
Inventors: 徐娜; 王学川; 任龙芳; 马向东; 强涛涛; 石叶叶; 董佳琳
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2016-09-14

Abstract

本发明公开了一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，先对胶原蛋白进行溶解；随后对胶原蛋白进行接枝改性。本发明采用甲基丙烯酸酐接枝改性胶原蛋白，操作简单，反应时间短，反应条件更为温和；本发明所使用的仪器及药品，设备要求低，成本低，可操作性强；本发明乙烯基胶原蛋白，为胶原蛋白自身成膜交联，以及与其他可反应高分子材料接枝交联等奠定了基础。

Description

一种乙烯基胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种乙烯基胶原蛋白的制备方法。

背景技术

胶原蛋白也称胶原，是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占蛋白质总量的25％～30％。胶原蛋白因其优良的低免疫活性、生物相容性和可生物降解等特性而得到广泛地应用，但未改性的胶原蛋白往往存在热稳定性差、降解速率过快和机械强度低等缺点，不能满足众多使用环境的需求。随着功能化需求越来越多样性，胶原蛋白的改性成为研究的热点。通过对胶原蛋白改性，来提高胶原蛋白的热稳定性和机械性能，降低胶原蛋白的降解速率。

目前，胶原蛋白的改性大致分为交联改性、改变活性基团改性和引入聚合物改性。交联改性分为物理改性和化学改性。物理交联法主要有光氧化法、热脱氢及紫外辐射法。通过物理改性方法改性的胶原蛋白可有效避免外源性有毒害化学物质进入胶原内，缺点是难以获得均匀一致的交联产物。陈以会等用N-羟基琥珀酰亚胺己二酸酯(NHS-AA)对胶原蛋白溶液进行改性；A.Sionkowska等以胶原蛋白为基质，添加羟基磷灰石制备出三维立体结构复合多孔支架；周磊等用γ-硫代丁内酯对胶原蛋白进行硫代交联改性；严霞波等用乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)对明胶进行酰化改性，提高明胶蛋白的溶胀性；李季衡等用戊二醛对1％的胶原溶液进行改性，改善其动态热变性；隋智慧等用丙烯酸酯类单体对从铬革屑中提取的胶原蛋白进行接枝改性，提高其与聚乙烯醇的共混能力；张昭环等在硫氰酸钠的浓水溶液中对胶原蛋白进行丙烯腈接枝聚合改性；丁志文等研究了聚氨酯改性胶原蛋白的机理、合成及在皮革化工材料中的应用。兰云军等以双氰胺、甲醛、硫代硫酸钠和胶原蛋白为原料，合成出双氰胺改性胶原蛋白复鞣填充剂。然而上述改性方法，在胶原蛋白的热稳定性、物理机械性能等方面改善效果并不令人满意，且改性步骤复杂，改性时间长。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，解决了现有接枝方法改性后胶原蛋白的热稳定性及物理机械性能差的问题。

本发明所采用的技术方案为，一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，称取胶原蛋白置于磷酸缓冲溶液中搅拌，使其充分溶解，得胶原蛋白溶液；

步骤2，在30～80℃温度下水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到步骤1所得溶液中，搅拌1～6h，得改性后的胶原蛋白溶液；

步骤3，将步骤2处理后的胶原蛋白溶液透析、冻干后，即得。

本发明的特征还在于，

步骤1中，磷酸缓冲溶液的pH为7.4，胶原蛋白与磷酸缓冲溶液的质量体积比为1:8～1:12(g/mL)。

步骤1中，搅拌过程在70℃±2℃条件下，搅拌0.5～1h。

步骤2中，甲基丙烯酸酐的质量浓度为94％，滴加速度为1mL/min。

步骤2中，甲基丙烯酸酐与胶原蛋白的体积质量比为0.1:5～2.4:5(mL/g)。

步骤3中，透析、冻干过程为：将步骤2所得溶液倒入透析袋中，用去离子水作为透析液，在40℃±2℃的温度下，透析24h，随后在-20℃的温度下预冷冻，再继续冷冻直至干燥。

本发明的有益效果是，采用甲基丙烯酸酐与胶原蛋白直接接枝反应，操作简单，反应时间短，反应条件温和；本发明所使用的仪器及药品，设备要求低，成本低，可连续化操作；本发明乙烯基胶原蛋白，可以广泛应用于新材料、化妆品、涂料及生化工程中。

附图说明

图1为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中胶原蛋白改性后¹H-NMR图；

图2为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中胶原蛋白未改性¹H-NMR图；

图3为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中胶原蛋白改性前后红外光谱图；

图4为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中胶原蛋白分子量对改性胶原蛋白取代度影响；

图5为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中甲基丙烯酸酐的用量对改性胶原蛋白取代度的影响；

图6为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中反应时间对改性胶原蛋白取代度的影响；

图7为本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法中反应温度对改性胶原蛋白取代度的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，称取胶原蛋白(重均分子质量为4825、145508或181266)与磷酸缓冲溶液(pH为7.4)混合，在70℃±2℃的温度下搅拌0.5～1h，使之充分溶解，得胶原蛋白溶液。其中，胶原蛋白与磷酸缓冲溶液的质量体积比为1:8～1:12(g/mL)。

步骤2，将步骤1溶解后的胶原蛋白置于30～80℃温度下水浴环境中，以1mL/min的速率向其中加入质量浓度为94％的甲基丙烯酸酐，搅拌反应1～6h，得改性后胶原蛋白溶液；其中，甲基丙烯酸酐与胶原蛋白的体积质量比为0.1:5～2.4:5(mL/g)。

步骤3，将步骤2改性后胶原蛋白溶液置于适宜的分子量大小(500D或3500D)的透析袋中，用去离子水作为透析液，在40℃±2℃温度下透析24h，经透析后的胶原蛋白溶液放置在冷冻干燥机中，-20℃预冷冻，然后冷冻干燥，即得。

以下从原理方面对本发明进行说明：

1)胶原蛋白的溶解

胶原蛋白与磷酸缓冲溶液的质量体积比为1:8～1:12(g/mL)，置于70℃±2℃温度下搅拌0.5～1h。其中，磷酸缓冲溶液的pH为7.4，主要目的是将胶原蛋白充分溶解，提供相对稳定的pH环境。

2)甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白

甲基丙烯酸酐在加热的条件下可以和胶原蛋白中的赖氨酸残基中伯氨 -NH₂发生反应生成酰胺键，使甲基丙烯酸酐中的C＝C引入到胶原蛋白结构中。在反应过程中磷酸缓冲溶液主要是用来溶解胶原蛋白，提供一个相对温和的反应环境。甲基丙烯酸酐用量的多少直接关系到接枝后C＝C双键数目的多少，甲基丙烯酸酐用量太少，在胶原蛋白表面接枝形成的C＝C双键数目就少，不会再胶原蛋白间形成交联作用。一般情况下反应时间和反应温度之间是有交互作用的，温度高分子运动加快，反应效率提升，反应时间缩短；温度低分子运动减慢，反应效率降低，反应时间增长。

实施例1

步骤1，称取重均分子质量为181266的胶原蛋白5g与50mL磷酸缓冲溶液(pH为7.4)混合，在70℃的温度下搅拌0.5h，使之充分溶解。

步骤2，将步骤1的胶原蛋白溶液置于40℃温度下水浴环境中，以1mL/min的速率向其中加入甲基丙烯酸酐0.1mL，搅拌反应2h，得不同取代度的乙烯基胶原蛋白(CMA)溶液。

步骤3，将步骤2的CMA溶液置于适宜的分子量大小为3500D的透析袋中，用去离子水作为透析液，在40℃温度下透析24h，经透析后的胶原蛋白溶液放置在冷冻干燥机中，-20℃预冷冻，然后冷冻干燥，待用。

实施例2～实施例9

参见实施例1，与实施例1不同的是，步骤2中，甲基丙烯酸酐的加入量依次为0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL和2.4mL。

实施例10

步骤2，将步骤1的胶原蛋白溶液置于50℃温度下水浴环境中，以1mL/min的速率向其中加入甲基丙烯酸酐1.5mL，搅拌反应时间为1h，得不同取代度的乙烯基胶原蛋白(CMA)溶液。

步骤3，将步骤2改性后胶原蛋白溶液置于适宜的分子量大小3500D的透析袋中，用去离子水作为透析液，在40℃温度下透析24h，经透析后的胶原蛋白溶液放置在冷冻干燥机中，-20℃预冷冻，然后冷冻干燥，待用。

实施例11～15

参见实施例10，与实施例10不同的是，步骤2中，搅拌反应时间依次为2h、3h、4h、5h和6h。

实施例16

步骤2，将步骤1的胶原蛋白溶液分别置于30℃水浴温度下，以1mL/min的速率向其中加入甲基丙烯酸酐1.5mL，搅拌反应分别为2h，得不同取代度的乙烯基胶原蛋白(CMA)溶液。

实施例17～21

参见实施例16，与实施例16不同的是，步骤2中，将步骤1的胶原蛋白溶液依次置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴温度下。

实施例22

步骤1，称取重均分子质量为G1是4825、G2是145508、G3是181266的胶原蛋白5g与50mL磷酸缓冲溶液(pH为7.4)混合，在70℃的温度下搅拌0.5h，使之充分溶解。

步骤2，将步骤1的胶原蛋白溶液分别置于50℃水浴温度下，以1mL/min的速率向其中加入甲基丙烯酸酐0.1mL，搅拌反应分别为2h，得不同取代度的乙烯基胶原蛋白(CMA)溶液。

实施例23～30

参见实施例22，与实施例22不同的是，步骤2中，甲基丙烯酸酐的加入量依次为0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL和2.4mL。

利用本发明方法所得胶原蛋白改性前后的试样进行的核磁(¹H-NMR)分析检测如图1、图2，与未改性的(图2)¹H-NMR谱图对比分析得，经改性后(图1)胶原蛋白的¹H-NMR谱图在5.5ppm和5.8ppm处有出峰，这是端烯(C＝CH₂)碳上的氢的同碳耦合峰，说明通过甲基丙烯酸酐对胶原蛋白的改性在胶原蛋白分子链上成功的引入了双键。图3为甲基丙烯酸酐对胶原蛋白改性以后得到的红外谱图，未改性胶原蛋白在1030cm^-1处的峰为脂肪胺的出峰，即赖氨酸残基上伯氨的C-N峰，经过甲基丙烯酸酐对胶原蛋白改性以后得到的红外谱图中此处的C-N峰(1030cm^-1)消失，由此判断甲基丙烯酸酐主要与胶原蛋白中赖氨酸的氨基发生反应，证明胶原蛋白分子链上赖氨酸残基的伯氨参与了反应。

图4为不同分子量的胶原蛋白的取代度与甲基丙烯酸酐加入量的关系，甲基丙烯酸酐(MA)的加入量大于0.6mL时，G1和G3取代度增加缓慢，G2的取代度不再增加。当MA的用量为1.5mL时，G1的取代度最大，即93％；当MA的用量为0.9mL时，G2的取代度最大，即77.2％；当MA的用量为1.8mL时，G3的取代度最大，即83％。分别对G1、G2和G3的分子质量的大小进行检测，G1的重均分子质量(Mw)为4825，G2的Mw是145508，G3的Mw是181266，且G2的分散系数为4.9，G3的分散系数为1.0，这说明G2有很多小分子质量的胶原蛋白存在。所以相对分子质量较小的胶原蛋白的ε-氨基暴露的更多，与MA的反应几率增加，取代度相对比较大。

本发明还研究了甲基丙烯酸酐、反应时间、反应温度对胶原蛋白改性取代度的影响：

甲基丙烯酸酐用量对胶原蛋白改性取代度的影响：如图5所示，随着甲基丙烯酸酐的加入量的增加，改性胶原蛋白的取代度在增加，当甲基丙烯酸酐的量加入到一定程度时，改性胶原蛋白的取代度增加不明显，当甲基丙烯酸酐的用量大于1.5ml时，改性胶原蛋白的取代度不再有明显增加。由改性胶原蛋白取代度公式(1)得出，当甲基丙烯酸酐量为1.5mL时，改性胶原蛋白的取代度为79.766％。这是因为随着甲基丙烯酸酐用量的增加，胶原蛋白上赖氨酸残基上的伯氨在逐步的与甲基丙烯酸酐进行反应，改性胶原蛋白的取代度在逐渐增加，但胶原蛋白上的赖氨酸的数量一定，当甲基丙烯酸酐的数量再继续增加时，赖氨酸残基上的氨已经反应完，所以再继续增加甲基丙烯酸酐的量时，改性胶原蛋白的取代度将不再增加或增加不明显。

反应时间对胶原蛋白改性取代度的影响：如图6所示，改性胶原蛋白的取代度随着反应时间的增加是先增加后趋于平衡，当反应进行到2～3h时，改性所得的胶原蛋白的取代度最大，反应上去的甲基丙烯酸酐的量越多。由改性胶原蛋白取代度公式(1)得出，当反应时间为2h时，改性胶原蛋白的取代度为78.787％。当再继续延长时间时改性胶原蛋白的取代度不再增加。说明随着时间的增加反应在逐步的进行，当反应到达2～3h时，胶原蛋白上的氨基已经被完全反应，所以再继续延长时间，改性胶原蛋白的取代度不再继续增加。

反应温度对胶原蛋白改性取代度的影响：如图7所示，随着温度的提升改性胶原蛋白的取代度先增加后降低，当反应温度为50℃时，改性胶原蛋白的取代度最大，再继续逐步升高反应温度时，改性胶原蛋白的取代度不但没有增加反而在减小。这是因为，随着反应温度的增加，分子运动加剧，分子碰撞几率增加，反应效率提高，所以当温度升高到50℃时胶原蛋白的氨基和甲基丙烯酸酐的反应效率最高。由改性胶原蛋白取代度公式(1)得出，当反应温度为50℃时，改性胶原蛋白的取代度为81.289％。

其中，乙烯基化胶原蛋白取代度的测定：乙烯基化胶原蛋白的取代度测定主要使用Habeeb法进行测定。本检测方法采用的标准物为甘氨酸，测量出甘氨酸在不同浓度下的吸光度，绘制甘氨酸标准曲线，从而测得乙烯基化胶原蛋白中的自由氨基浓度，进而得到乙烯基化胶原蛋白的取代度。具体检测方法：将甘氨酸配制成不同的浓度梯度，做甘氨酸的标准曲线。将乙烯基化胶原蛋白配制为0.6～1mg/mL的乙烯基化胶原蛋白溶液然后取1mL待测溶液于5mL棕色容量瓶中，并向棕色容量瓶中加入1mL碳酸氢钠缓冲溶液(pH＝8.4)和1mL0.1％的三硝基苯磺酸(TNBSA)溶液。置于水浴恒温振荡器中，在38℃的条件下振荡培养2小时后，取出。再向棕色容量瓶中加入1mL(10％)的十二烷基硫酸钠水溶液和0.5mL(1mol/L)的盐酸溶液。随后测溶液在345nm下的吸光度。从而得到改性胶原蛋白的氨基含量，根据公式(1)计算得到相应的取代度。

A = \frac{N_{o} - N_{f}}{N_{o}} - - - (1)

式中：A——取代度；

N₀——未改性明胶自由氨基浓度(mmol/L)；

N_f——改性明胶中自由氨基浓度(mmol/L)。

未改性的胶原蛋白往往存在热稳定性差、降解速率过快和机械强度低等缺点，本发明利用甲基丙烯酸酐在加热的条件下可以和胶原蛋白中的赖氨酸残基中伯氨-NH₂发生反应生成酰胺键，使甲基丙烯酸酐中的C＝C引入到胶原蛋白结构中，增大胶原蛋白分子链之间的交联度，提高胶原蛋白的热稳定性。在胶原蛋白的三维结构中引入C＝C双键，增加结构的稳定性，提高胶原蛋白的物理机械强度。通过胶原蛋白溶解、改性、透析冻干三步，改性胶原蛋白，提出一种易操作、时间短的胶原蛋白改性方案，可以广泛应用于新材料、化妆品、涂料及生化工程中。

Claims

1.一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤2，在30～80℃温度下水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到步骤1所得溶液中，搅拌1～6h，得不同取代度的乙烯基胶原蛋白溶液；

步骤3，对步骤2处理后的胶原蛋白透析、冻干后，待用。

2.根据权利要求1所述的一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1中，磷酸缓冲溶液的pH为7.4，胶原蛋白与磷酸缓冲溶液的质量体积比为1:8～1:12。

3.根据权利要求1所述的一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1中，搅拌过程在70℃±2℃条件下，搅拌0.5～1h。

4.根据权利要求1所述的一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2中，甲基丙烯酸酐的质量浓度为94％，滴加速度为1mL/min。

5.根据权利要求1所述的一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2中，甲基丙烯酸酐与胶原蛋白的体积质量比为0.1:5～2.4:5。

6.根据权利要求1所述的一种乙烯基胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3中，透析、冻干过程为：将步骤2所得溶液倒入截留分子量为500或3500的透析袋中，用去离子水作为透析液，在40℃±2℃的温度下，透析24h，随后在-20℃的温度下预冷冻，再继续冷冻直至干燥。