CN108912284B

CN108912284B - 一种具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN108912284B
Application number: CN201810791331.XA
Authority: CN
Inventors: 张军涛; 汪海波; 未本美; 许承志; 何浪; 徐玉玲
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN108912284A

Abstract

本发明公开了一种具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白及其制备方法。该制备方法包括：(1)用酸性溶剂溶解天然胶原，得到天然胶原溶液；(2)将步骤(1)得到的天然胶原溶液用磷酸盐缓冲溶液进行第一次透析，除去醋酸分子；(3)将溶有N‑羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐的磷酸盐缓冲溶液滴加到步骤(2)所得溶液中，混合均匀后进行反应；(4)将步骤(3)反应后的溶液进行第二次透析、冻干后，得到具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白。本发明通过简单、温和的反应条件实现对天然胶原的丙烯酸共价键接枝；调控接枝改性天然胶原的接枝率，获得具有纤维化能力的接枝改性天然胶原。

Description

一种具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，更具体地，涉及一种具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是脊椎动物体内广泛的存在的一种结构蛋白，具有由3条肽链螺旋缠绕形成的三螺旋结构，分子链长约300nm，粒径1.5nm，分子量约30万Da。胶原蛋白因其具有的低免疫活性、生物相容性好、可生物降解等优良生物学性能而被广泛应用于生物材料领域。但是天然胶原固有的机械性能、物性、成胶能力和生物稳定性仍不能完全满足实践应用的性能需求。而与此同时，飞速发展的临床医学、组织工程和医学美容等领域对胶原基材料的性能指标和功能多样化提出了更高要求。因此，通过胶原结构和功能改性不断提升其性能成为胶原材料领域发展的必由之路。近年来，该领域的热点研究集中在以下几个方向：(1)交联改性，利用简单的化学反应(酰胺化、醛类交联)或物理手段(紫外、高温、辐照)实现胶原分子内或分子间的共价键结合，虽可提高胶原基材料的力学性能和生物稳定性，但难以实现材料构造和性能的多样化。(2)直接共混改性，将天然胶原与其它功能性组分掺杂，在提高胶原材料自身性能的同时赋予其额外的新颖功能，从而实现胶原产品功能的多样化。尽管共混改性具有诸多优点，但在共混模式下，胶原和聚合物之间的非共价键结合方式并不牢固，且二者在物性、成胶性能等方面往往存在较大差异，导致该类产品在实践应用中会因相分离现象而影响产品效果。(3)侧链接枝改性，通过共价键将不同的分子接枝到胶原侧链活性基团(氨基、羧基等)上，在提高胶原材料自身性能的同时赋予其接枝分子的独特性质，且牢固稳定的共价键连接方式有效避免了相分离问题。然而，现有侧链接枝改性过程中往往会因反应条件苛刻，如高温、强酸碱等，导致胶原三螺旋结构被破坏，或者因接枝率过高导致胶原失去纤维化能力，从而使得接枝改性胶原的性能不能令人满意。

胶原在生物医学材料领域具有广泛的应用前景，但是作为蛋白质，其机械性能较差，功能多样性缺失，因此优化接枝改性方法，提升胶原的机械性能和功能多样化具有极大的实际意义。而现有胶原改性技术仍存在诸多不足之处，特别是接枝改性操作往往导致胶原丧失纤维化能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种温和、简便、有效的具有纤维化能力的丙烯酸接枝改性天然胶原的制备方法，这种方法能在保持天然胶原纤维化性能的基础上，在天然胶原侧链氨基上共价键接枝丙烯酸基团，实现接枝改性天然胶原之间、接枝改性天然胶原和其他可反应高分子材料之间的交联，从而有效提升接枝改性天然胶原基材料的生物学性能。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白的制备方法，该制备方法包括：

(1)用酸性溶剂溶解天然胶原，得到天然胶原溶液；

(2)将步骤(1)得到的天然胶原溶液用磷酸盐缓冲溶液进行第一次透析，除去醋酸分子；

(3)将溶有N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐的磷酸盐缓冲溶液滴加到步骤(2)所得溶液中，混合均匀后进行反应；

(4)将步骤(3)反应后的溶液进行第二次透析、冷冻干燥后，得到具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白。

作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述酸性溶剂为醋酸水溶液或盐酸水溶液；所述酸性溶剂中酸的浓度为0.1～1mol/L。

作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述天然胶原溶液中天然胶原的浓度为1～10mg/mL；所述天然胶原为具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原；所述天然胶原从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤或跟腱组织中提取并分离纯化。

作为本发明优选的实施方式，步骤(2)中，所述第一次透析采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0。

作为本发明优选的实施方式，步骤(3)中，反应的温度为4～20℃，反应的时间为12～48h。

作为本发明优选的实施方式，步骤(3)中，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐与天然胶原溶液中的天然胶原的质量比为0.1～2：1，更优选为0.5～2：1。

作为本发明优选的实施方式，步骤(4)中，第二次透析采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋，以去离子水为透析液。

作为本发明优选的实施方式，步骤(4)中，冷冻干燥的步骤为将透析后的溶液置于冷冻干燥机中，抽真空，使5分钟内系统绝对压力降低至15～20Pa，继续冷冻干燥36～60小时。

作为本发明优选的实施方式，溶解的温度、第一次透析的温度和第二次透析的温度均为4～20℃。

作为本发明优选的实施方式，在进行第一次透析前，还包括将天然胶原溶液进行离心脱气。

本发明的第二方面提供由所述的制备方法制得的具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白。

“纤维化”是天然胶原固有分子行为，同时也是改进和提升天然胶原基材料性能的又一有力手段。研究表明，在生物体内，纤维重组是天然胶原形成机体组织、实现生物功能的基础。胶原纤维(而非胶原单分子)及其构筑的微环境是细胞感受器和细胞因子识别、锚定的结构基础，并影响细胞的迁移、增殖和信号传导，具有与体内一致构造的纤维态胶原材料具有更好的生物相容性、生物稳定性和细胞响应性。

本发明的优点和积极效果：

本发明通过简单、温和的反应条件实现对天然胶原的丙烯酸共价键接枝，调控接枝改性天然胶原的接枝率，获得了具有纤维化能力的接枝改性天然胶原。

本发明采用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐在碱性、低温条件下与天然胶原蛋白直接反应获得丙烯酸接枝的改性天然胶原，该产物不仅具有侧链丙烯酰结构，而且仍然具有纤维化能力。因此，这种接枝改性天然胶原形成的产品中，不仅可以通过交联技术实现天然胶原接枝侧链上双键之间的交联，而且能通过适宜温度下的自组装实现接枝改性天然胶原的纤维化，形成同时具有天然胶原纤维和交联结构的天然胶原基产品。此外，天然胶原侧链双键官能团可与大量有机官能团反应，如巯基等，从而实现天然胶原侧链的进一步改造。所得产品在生物医学材料领域具有广泛应用。

N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯中丙烯酸的羧基通过N-羟基琥珀酰亚胺进行了活化，而活化后的羧基反应活性远远高于未活化的羧基。而丙烯酸酐自身的反应活性较高。在碱性条件下，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸或丙烯酸酐中的羧基可直接与天然胶原中赖氨酸残基中伯氨基发生反应形成酰胺键，从而避免了天然胶原自身侧链氨基和羧基之间的交联反应。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1示出了实施例1-4中不同比例的N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯和天然胶原反应体系获得的接枝改性天然胶原的接枝率曲线；

图2示出了实施例1-4中具有不同接枝率接枝改性天然胶原的纤维化动力学曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

实施例1：

称取适量草鱼皮天然胶原样品，用0.5mol/L醋酸配制成天然胶原浓度为1mg/mL的样品50mL。再将配置好的天然胶原溶液置于离心管中，在10000r/min、4℃条件下离心脱气7min后装入截留分子量为12000道尔顿透析袋中，以pH为8.4的磷酸盐缓冲溶液为透析液，透析48小时，每隔3h更换一次透析液，得到透析后的天然胶原溶液。将N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯溶于磷酸盐缓冲溶液配制N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯浓度为5mg/mL的溶液，并取1mL加入到50mL的天然胶原溶液中，其中，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯与天然胶原溶液中天然胶原的质量比为1:10，摇匀后，4℃反应48h。之后，将反应完的体系转入截留分子量为12000道尔顿的透析袋，以去离子水为透析液，在4℃条件下透析48h，每隔3～4h更换一次透析液。经透析后的溶液置于冷冻干燥机中，抽真空，在5分钟内系统绝对压力降低至20Pa，继续冷冻干燥48小时后得到具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白。

实施例2-4：

步骤参见实施例1，与实施例1不同的是，加入的溶有N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的磷酸盐缓冲溶液中N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的浓度分别为25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯与天然胶原溶液中天然胶原的质量比分别为1:2、1:1、2:1。

测试结果：

图1直观的反映了不同比例的N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯和天然胶原反应体系获得的接枝改性天然胶原的接枝率。

图1A通过三硝基苯磺酸比色法测定的天然胶原中游离氨基的数量，天然胶原样品中游离氨基酸量越多，则在346nm处的吸收峰越强，以天然胶原的游离氨基数量为100％，则可推算接枝改性天然胶原中游离氨基的接枝率。

如图1B所示，随着N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯和天然胶原的质量比依次由0上升至0.1、0.5、1、2，所得接枝改性天然胶原的接枝率分别为0％、19％、31％、54％、68％。天然胶原的接枝率可以通过三硝基苯磺酸比色法测定，随着加入N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的量的增加，天然胶原侧链接枝率增大。

图2采用浊度法测定了不同接枝率天然胶原的纤维化动力学行为，随着天然胶原侧链氨基接枝数量增加，接枝改性天然胶原的纤维化能力持续下降，当接枝率达到68％时，接枝改性天然胶原丧失纤维化能力。

N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐用量与天然胶原接枝丙烯酸数量有直接关系，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐用量过多，在胶原表面接枝的丙烯酸分子就多，过多的占用天然胶原中的氨基官能团会使得天然胶原丧失纤维化能力；而N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐用量过少，天然胶原表面接枝的丙烯酸数量就少，会影响接枝改性天然胶原的后续交联作用。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims

1.一种具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：

(1)用酸性溶剂溶解天然胶原，得到天然胶原溶液；

(4)将步骤(3)反应后的溶液进行第二次透析、冷冻干燥后，得到具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白；

所述天然胶原为具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原；

其中，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0；

步骤(3)中，反应的温度为4～20℃，反应的时间为12～48h；

步骤(3)中，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐与天然胶原溶液中的天然胶原的质量比为0.1-2：1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)中，

所述酸性溶剂为醋酸水溶液或盐酸水溶液；

所述酸性溶剂中酸的浓度为0.1～1mol/L。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)中，

所述天然胶原溶液中天然胶原的浓度为1～10mg/mL；

所述天然胶原从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤或跟腱组织中提取并分离纯化。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(2)中，

所述第一次透析采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯或丙烯酸酐与天然胶原溶液中的天然胶原的质量比为0.5～2：1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(4)中，第二次透析采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋，以去离子水为透析液。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，溶解的温度、第一次透析的温度和第二次透析的温度均为4～20℃。

8.由权利要求1-7中任意一项所述的制备方法制得的具有纤维化性能的丙烯酸接枝天然胶原蛋白。