CN105801870B - 一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法及所得产品和应用 - Google Patents

一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法及所得产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚唾液酸‑透明质酸复合凝胶的制备方法及所得产品和应用，制备方法是：在碱性水溶液环境下，使聚唾液酸与交联剂进行连接，得到活化的聚唾液酸；将活化的聚唾液酸加入到透明质酸溶液中，在酸性环境下，使聚唾液酸接枝到透明质酸上，得到产品。本发明反应过程可控，副反应少，所得产品兼具透明质酸优异的生物相容性和聚唾液酸的非免疫原性，可用于多肽或蛋白药物的包埋缓释，也可用于对注射用交联透明质酸凝胶颗粒进行包裹，降低术后炎症反应，缓解皮肤红肿，减缓使用者的痛苦，此外还能提高产品稳定性，延长降解时间，延长半衰期。

Description

一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法及所得产品和 应用
技术领域
本发明涉及一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法及所得聚唾液酸-透明质酸复合凝胶和该复合凝胶的应用，属高分子材料技术领域。
背景技术
随着生物医学工程的发展，许多新型生物合成材料以其性能的多样性、加工的容易性优点在诱导组织再生、皮肤填充、药物缓释等领域得到广泛的研究和应用，其中又以具有良好生物相容性的多糖类进行接枝交联改造作为生物材料成为当前研究热点。
聚唾液酸（Polysialic acid, PSA）是由N-乙酰神经氨酸（唾液酸的一种）以α-2,8糖苷键连接的电负性、同型聚合物；在人体内，聚唾液酸存在于神经粘附分子（NCAM）上，起细胞相互作用调节子作用，且PSA还结合到成纤维细胞生长因子（FGF2）和脑源性神经营养因子（BDNF）上，能够防止被蛋白质水解。聚唾液酸具有非免疫原性、生物相容性和生物可降解性，是一种优良的生物材料。例如，聚唾液酸能够诱导和支持神经原细胞再生，可以加速神经创伤的愈合，也用作神经细胞组织工程材料和蛋白药物修饰材料。
另外，透明质酸（Hyaluronan，HA)是一种存在于高等动物机体内多种组织器官中的天然大分子多聚糖，主要成分是葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖，具有良好的生物相容性、高粘弹性，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。由于HA无种属及脏器异性，在植入体内时显示优良的机体生物相容性，是一种理想的天热生物医药材料。但是，透明质酸属于糖胺多糖（GAGs），在体内易被酶降解。为了延长HA在体内的存留时间，往往对HA进行修饰、枝接和交联改造，使其具有更优异的理化特征，同时还保留透明质酸原有良好生物相容性。目前交联透明质酸已经在微整型、隆胸、药物释放等领域广泛应用，但是，在使用过程中发现交联透明质酸存在一定的缺陷，例如：交联透明质酸一般是使用化学交联剂如1,4-丁二醇二缩水甘油（BDDE）、二乙烯基砜(DVS)、碳二亚胺(EDC)等进行交联制得的，交联后的透明质酸可能还有末端未反应基团裸露在凝胶颗粒表面，这会造成部分使用者手术后出现红肿现象，而这一缺陷降低了使用者的接受度，增加了使用者的痛苦。目前，还没有很好的解决办法。
发明内容
针对交联透明质酸在使用过程中存在的不足，本发明提供了一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法及所得产品，该方法简单可行、容易操作，所得聚唾液酸-透明质酸复合凝胶兼具透明质酸优异的生物相容性和聚唾液酸的非免疫原性和抗蛋白酶特性。
本发明还提供了按照上述方法所得的复合凝胶产品作为药物载体的应用，能将药物准确的送达规定的位点；或者是在含交联透明质酸的注射美容产品中的应用，它可以作为注射用交联透明质酸凝胶颗粒外保护层（也可称之为包裹材料），以缓解交联透明质酸在体内造成的红肿，又可以延长透明质酸的降解时间，具有很好的应用前景。
本发明首次提出了将聚唾液酸与透明质酸制成复合凝胶的方案，目前还未见聚唾液酸与透明质酸复合凝胶的相关报道。该方案简单易行，适合工业化生产应用，具体如下：
一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）在碱性水溶液环境下，聚唾液酸的羟基和交联剂发生反应，使聚唾液酸与交联剂进行连接，得到活化的聚唾液酸；
（2）将活化的聚唾液酸加入到透明质酸溶液中，在酸性环境下，透明质酸的羟基与连接在聚唾液酸上的交联剂进行反应，使聚唾液酸接枝到透明质酸上，得到聚唾液酸-透明质酸复合凝胶（也可称PSA-HA复合凝胶）。
上述制备方法中，要将聚唾液酸接枝到透明质酸上，因为聚唾液酸电负性很大，所以直接与透明质酸进行连接制备过程难以控制、副反应较多，所得产品组分混杂，性能受到影响。本发明以交联剂为桥梁，先将聚唾液酸的羟基与交联剂反应，使聚唾液酸上先连接活性基团，完成聚唾液酸的活化，然后再将活化的聚唾液酸与透明质酸反应，使透明质酸的羟基也与交联剂反应，通过交联剂将聚唾液酸接枝到透明质酸上。该方法反应过程可控、副反应少，所得产品成分稳定，性能好。本发明所得聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的结构式可表示为HA-O-交联剂-O-PSA。
上述制备方法中，所用的聚唾液酸的分子量为10 kDa～100 kDa，所用的透明质酸的分子量为1000 kDa～3000kDa。
本发明中，交联剂相当于聚唾液酸和透明质酸连接的桥梁，任何能和透明质酸和聚唾液酸的羟基进行反应，实现聚唾液酸和透明质酸的链接的交联剂都可以用于本发明。在本发明的具体实施方式中，列举了一个效果较好的交联剂——环氧氯丙烷。
当交联剂为环氧氯丙烷时，在碱性条件下，交联剂脱去-Cl，连接到聚唾液酸上的羟基上。然后在酸性条件下，活化的聚唾液酸上的交联剂的环氧基打开，与透明质酸上的羟基进行反应，得到聚唾液酸-透明质酸复合凝胶。反应方程式如下：
。
当交联剂为环氧氯丙烷时，所得的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的结构式可表示为：
。
当交联剂为环氧氯丙烷时，交联剂在步骤（1）反应体系中的体积浓度为2%～10%（v/v）时所得产品效果更好。
上述步骤（1）中，聚唾液酸的活化需要在合适的碱性环境下进行，否则会影响活化聚唾液酸的环氧基团稳定性。优选反应时的pH>8.0，例如8.5～14.0，8.5～11.0。
上述步骤（1）中，碱性环境可以由加入碱性缓冲溶液的方式实现，还可以由加入碱或碱溶液的方式实现。所用的碱性缓冲溶液可以是碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，所用的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾或它们的水溶液。在本发明具体实施方式中，采用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和质量体积浓度为0.2～2%（g/ml）的碱水溶液配合的方式控制碱性环境。
上述步骤（1）中，先将聚唾液酸溶解于水中，再加入交联剂，然后调节溶液至碱性进行反应。
上述步骤（1）中，经试验验证，在聚唾液酸和交联剂的碱性水溶液中，聚唾液酸在步骤（1）反应体系中的质量体积浓度为5～25%（g/ml）时既便于操作，又保证了设备的高利用率。
上述步骤（1）中，交联剂在步骤（1）反应体系中的体积浓度为2%～10%（v/v）时，所得产品效果更好。
上述步骤（1）中，反应温度为30～45℃，反应时间为3～6h。
上述步骤（1）中，反应完后，对反应液进行后处理，方法为：除去多余的交联剂，剩余的反应液加入乙醇水溶液进行沉析，所得沉析物用乙醇水溶液进行多次沉析纯化，得活化的聚唾液酸。所得活化的聚唾液酸为固体粉末。
上述步骤（1）的反应液后处理过程中，当交联剂为环氧氯丙烷时，因为环氧氯丙烷为易挥发的液体，因此可以采用搅拌抽真空的方式将交联剂除去。当交联剂为其他成分时，根据交联剂的性能还可以采用其他的方式除去，例如透析、水洗等。
上述步骤（1）的反应液后处理过程中，所用的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为2：1～5：1。
聚唾液酸活化后，更易于接枝到透明质酸上，步骤（2）中，先将透明质酸配成水溶液，然后将活化的聚唾液酸加入到该水溶液中，然后调节溶液至酸性进行反应即可。
上述步骤（2）中，反应需要在合适的酸性环境下进行，优选反应时的pH范围为4～7。超出此范围会影响聚唾液酸与透明质酸的枝接率。
上述步骤（2）中，酸性环境可以由加入酸性缓冲溶液的方式实现，还可以由加入酸溶液的方式实现。所用的酸性缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH5-7）、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液(pH3-5)。当采用缓冲液调节pH时，为了操作方便，也可以直接将透明质酸用酸性缓冲溶液溶解，然后加入聚唾液酸直接进行反应。
上述步骤（2）中，活化的聚唾液酸按照：聚唾液酸与透明质酸的质量比为1：1～4：1的比例添加时所得产品的性能更佳。超出此范围会使聚唾液酸与透明质酸枝接率下降。
上述步骤（2）中，透明质酸溶液的质量体积浓度为1%～5%（g/ml）。
上步骤（2）中，反应温度为25～35℃，反应时间为12～96h。
上述步骤（2）中，反应完后，对反应液进行后处理，方法为：反应后将反应液减压浓缩，浓缩后的反应液透析除去小分子交联剂和未接枝到透明质酸上的聚唾液酸，透析后的产品即为聚唾液酸-透明质酸复合凝胶。将该聚唾液酸-透明质酸复合凝胶经过进一步的冷冻干燥，可以得到聚唾液酸-透明质酸复合凝胶冻干粉。
上述步骤（2）反应液后处理过程中，将反应液浓缩至原来体积的1/3～1/5。
上述步骤（2）反应液后处理过程中，浓缩后的反应液加入透析袋中进行透析，透析袋的截留分子量为50万Da。
本发明得到的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶兼具透明质酸优异的生物相容性和聚唾液酸的非免疫原性和抗蛋白酶特性，具有很好的应用前景。因此，按照上述方法得到的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶也在本发明保护范围之内。
本发明所得的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶中，所含聚唾液酸的含量为20～55wt%。
进一步的，为了满足不同的使用情况，本发明所得复合凝胶根据使用需要可以按照常规方法制成冻干粉、水凝胶等各种不同的剂型。
本发明还提供了上述聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的两个新应用，其一是聚唾液酸-透明质酸复合凝胶作为药物载体的应用，其所负载的药物为蛋白药物或多肽药物。该复合凝胶具有聚唾液酸的非免疫原性和抗蛋白酶特性，是一种很好的药物载体。
进一步的，作为药物载体时，主要是作为药物包埋剂，起到包埋缓释的作用。
使用该聚唾液酸-透明质酸复合凝胶负载蛋白或多肽药物的通用方法为包埋药物或将复合凝胶制成纳米颗粒吸附药物。
本发明聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的另一个应用为：作为一种成分用于含交联透明质酸的注射美容产品中，作用是缓解注射交联透明质酸后造成的皮肤红肿。
上述应用中，聚唾液酸-透明质酸复合凝胶作为一种缓解交联透明质酸副作用的成分与交联透明质酸混合使用。具体的操作方式是：将注射用交联透明质酸凝胶颗粒加入聚唾液酸-透明质酸复合凝胶溶液中，形成固-液双相凝胶体系。在形成的固-液双相凝胶体系中，注射用交联透明质酸凝胶颗粒与粘稠的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶溶液接触后，聚唾液酸-透明质酸复合凝胶会包覆在注射用交联透明质酸凝胶颗粒的表面，将颗粒表面裸露的基团包裹住，以缓解手术后的红肿，聚唾液酸-透明质酸复合凝胶相当于是交联透明质酸凝胶颗粒的外保护层。
本发明还提供了一种双相交联透明质酸的制备方法及所得产品，具体为：将聚唾液酸-透明质酸复合凝胶用无菌注射用水配成溶液，将该溶液与注射用交联透明质酸凝胶颗粒混合均匀，即得双相交联透明质酸，即上述的固-液双相凝胶体系。将该双相交联透明质酸装入可灭菌注射器中、灭菌，即可销售使用。
制备双相交联透明质酸时，将聚唾液酸-透明质酸复合凝胶配成浓度为8～12 mg/ml的溶液。
制备双相交联透明质酸时，聚唾液酸-透明质酸复合凝胶水溶液的用量为交联透明质酸凝胶颗粒质量的8～20wt%。
本发明先在碱性条件下将聚唾液酸与交联剂反应，得到活化的聚唾液酸，然后在酸性条件下将活化的聚唾液酸连接到透明质酸的主链上，再通过透析等后处理对产品进行纯化，使产品中不含有裸露的化学活性基团和未连接的、游离的聚唾液酸，得到聚唾液酸-透明质酸复合凝胶。该方法制备简单，易于操作，反应过程可控，副反应少，先对聚唾液酸进行活化再与透明质酸进行反应，使得聚唾液酸具有活性基团能够与透明质酸结合，能有效取得聚唾液酸修饰透明质酸的效果。
本发明制备的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶兼具透明质酸优异的生物相容性和聚唾液酸的非免疫原性和抗蛋白酶特性，复合凝胶发挥功效的有效时间明显长于单纯透明质酸或者聚唾液酸，可作为药物载体，用于多肽或蛋白药物的包埋缓释；另外，复合凝胶还可用做对注射用交联透明质酸凝胶颗粒进行包裹，将该复合凝胶溶液与交联HA凝胶颗粒混合做成双相体系，由于聚唾液酸的非免疫原性和抗蛋白酶特性，该双相体系可降低术后炎症反应，缓解皮肤红肿，减缓使用者的痛苦，此外还能提高产品稳定性，延长降解时间，延长半衰期。
附图说明
图1本发明所得聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的红外谱图。
图2 HA1和HA2注入兔子皮下0-2周后的肉眼观察图，其中的HA1(1周)指的是一周后HA1-1的情况，其他情况类似。
图3HA1和HA2注入兔子皮下3-4周后的肉眼观察图，其中的HA1（3周）指的是3周后HA1-1的情况，其他情况类似。
图4HA1和HA2注入兔子皮下1-2周的常规组织HE染色图，其中的HA1（1周）指的是一周后HA1-1的情况，其他情况类似。
图5HA1和HA2注入兔子皮下3-4周的常规组织HE染色图，其中的HA1（3周）指的是3周后HA1-1的情况，其他情况类似。
具体实施方式
为了使公众能充分了解本发明的技术实质，申请人将在下面对本发明的具体实施方式详细描述，但申请人对实施例的描述不是对技术方案的限制，任何依据本发明构思作形式而非实质的变化都应当视为本发明的保护范围。
实施例1
取1.5 g PSA（分子量50KDa），溶解于10 ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10）中，加入0.6 ml环氧氯丙烷和1ml氢氧化钠溶液（0.5%质量体积浓度），然后在35℃搅拌反应4 h，反应结束后真空除去多余的环氧氯丙烷，再用水：乙醇（体积比1:4）的混合液沉析，所得沉析物离心、用水：乙醇（体积比1:4）的混合液反复纯化，获得活化的PSA。
以PSA:HA质量比为2:1的比例，将活化的PSA加入到20ml浓度为1.5%（g/ml）的HA溶液中（HA分子量为1500KDa该HA溶液以pH 6.0的磷酸盐缓冲液为溶剂），在30℃搅拌反应56h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，直至溶液中检测不出聚唾液酸，透析后即得纯化的PSA-HA复合凝胶，将该复合凝胶冷冻干燥，得到PSA-HA复合凝胶冻干粉0.55g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为53.6%。
聚唾液酸、透明质酸和制得的PSA-HA复合凝胶的红外谱图如图1所示，从图中可以看出聚唾液酸和透明质酸发生了有效的接枝反应。
实施例2
取1.5g聚唾液酸（分子量10kDa）溶解于10 ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5～11）中，然后加入0.8ml环氧氯丙烷和2ml氢氧化钠溶液（0.2%质量体积浓度），在35℃下磁力搅拌4h，然后真空除去多余的环氧氯丙烷，将溶液减压浓缩至原体积的1/4，以水：乙醇（体积比1:4）的混合液进行沉析，所得沉淀采用乙醇水溶液反复沉析纯化，获得活化的聚唾液酸。
以PSA:HA质量比为2:1的比例，将活化的PSA加入到20ml浓度为1.5%（g/ml）的HA溶液中（HA分子量为1000KDa该HA溶液以pH 6.0的磷酸盐缓冲液为溶剂），在30℃搅拌反应56h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，直至溶液中检测不出聚唾液酸，透析后即得纯化的PSA-HA复合凝胶，将该复合凝胶冷冻干燥，得到PSA-HA复合凝胶冻干粉0.53g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为51.6%。
实施例3
取0.5 g聚唾液酸（分子量100kDa）溶解于9 ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10）中，然后加入0.3ml环氧氯丙烷和1ml氢氧化钠溶液（2%质量体积浓度），在45℃下磁力搅拌3h，然后真空除去多余的环氧氯丙烷，将溶液减压浓缩至原体积的1/3，以水：乙醇（体积比1:4）的混合液进行沉析，所得沉淀采用乙醇水溶液反复沉析纯化，获得活化的聚唾液酸。
以PSA:HA质量比为1:1的比例，将活化的PSA加入到30ml浓度为1%（g/ml）的HA溶液中（HA分子量为3000KDa该HA溶液以pH 4.0的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液为溶剂），在25℃搅拌反应96 h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/5，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，直至溶液中检测不出聚唾液酸，透析后即得纯化的PSA-HA复合凝胶，将该复合凝胶冷冻干燥，得到PSA-HA复合凝胶冻干粉0.46g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为28.7%。
实施例4
取1.0 g聚唾液酸（分子量50kDa）溶解于10 ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10）中，然后加入0.23ml环氧氯丙烷和1ml氢氧化钠溶液（1%质量体积浓度），在30℃下磁力搅拌6h，然后真空除去多余的环氧氯丙烷，将溶液减压浓缩至原体积的1/3，以水：乙醇（体积比1:4）的混合液进行沉析，所得沉淀采用乙醇水溶液反复沉析纯化，获得活化的聚唾液酸。
以PSA:HA质量比为4:1的比例，将活化的PSA加入到10ml浓度为3%（g/ml）的HA溶液中（HA分子量为1500KDa该HA溶液以pH 7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂），在25℃搅拌反应12 h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，直至溶液中检测不出聚唾液酸，透析后即得纯化的PSA-HA复合凝胶，将该复合凝胶冷冻干燥，得到PSA-HA复合凝胶冻干粉0.43g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为23.4%。
实施例5
取2.5 g聚唾液酸（分子量23kDa）溶解于10ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10）中，然后加入1.1ml环氧氯丙烷和1ml氢氧化钠溶液（0.2%质量体积浓度），在35℃下磁力搅拌5h，然后真空除去多余的环氧氯丙烷，将溶液减压浓缩至原体积的1/4，以水：乙醇（体积比1:4）的混合液进行沉析，所得沉淀采用乙醇水溶液反复沉析纯化，获得活化的聚唾液酸。
以PSA:HA质量比为3:1的比例，将活化的PSA加入到6ml浓度为5%（g/ml）的HA溶液中（HA分子量为2000KDa该HA溶液以pH 5.0的磷酸盐缓冲液为溶剂），在30℃搅拌反应72 h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，直至溶液中检测不出聚唾液酸，透析后即得纯化的PSA-HA复合凝胶，将该复合凝胶冷冻干燥，得到PSA-HA复合凝胶冻干粉0.50g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为40.3%。
实施例6 活化聚唾液酸的制备
取1.5 g聚唾液酸（分子量23kDa）溶解于10 ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10）中，然后加入0.72ml环氧氯丙烷和2ml氢氧化钠溶液（0.7%质量体积浓度），在40℃下磁力搅拌4h，然后真空除去多余的环氧氯丙烷，将溶液减压浓缩至原体积的1/4，以水：乙醇（体积比1:4）的混合液进行沉析，所得沉淀采用乙醇水溶液反复沉析纯化，获得活化的聚唾液酸。
以PSA:HA质量比为2:1的比例，将活化的PSA加入到20ml浓度为1.5%（g/ml）的HA溶液中（HA分子量为1000KDa该HA溶液以pH 5.0的磷酸缓冲液为溶剂），在30℃搅拌反应56 h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，直至溶液中检测不出聚唾液酸，透析后即得纯化的PSA-HA复合凝胶，将该复合凝胶冷冻干燥，得到PSA-HA复合凝胶冻干粉0.54g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为51.2%。
实施例7 聚唾液酸-透明质酸复合凝胶包埋胰岛素
1、取上述实施例制备的PSA-HA复合凝胶冻干粉，溶于1M Na2SO4溶液中过夜，形成复合凝胶，使终浓度为8.5 mg/ml，调pH为2.0。
2、取胰岛素溶于3ml HCl（0.01M）中，配成浓度为1g/L的溶液。
3、依据PSA-HA与胰岛素的终质量比为2:1将步骤1和2的产品进行混合，磁力搅拌1h后置于Tris-Hcl缓冲液（0.5mM，pH 6.5）中透析48 h，其间更换透析液一次，截留液于20000 r/min离心30 min，沉淀冷冻干燥后得到PSA-HA/胰岛素粉末。
实施例8
1、交联透明质酸凝胶颗粒的制备：向22.5ml纯水中加入0.25ml 2M的NaOH溶液、5μl 1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)，再加入1.0 g透明质酸（福瑞达，1700kDa）。将该混合物在室温搅拌5min，然后静置24h。将所得凝胶在生理盐水中浸泡一周进行溶胀平衡，将交联透明质酸凝胶用样品磨破碎，收集300目-400目之间的凝胶颗粒备用。
2、聚唾液酸-透明质酸复合凝胶包裹注射用透明质酸凝胶颗粒：将实施例1、2、3的PSA-HA复合凝胶分别用无菌注射用水配成10 mg/ml的溶液，分别取4 ml上述三种溶液，每种溶液中分别加入40 mg 上述交联透明质酸凝胶颗粒混合均匀，即可获得双相凝胶体系，也称双相交联透明质酸（HA1），分别将它们装入可灭菌注射器，灭菌备用。
对比例1
以PSA:HA质量比为2:1的比例，将PSA（分子量23KDa）加入到20ml浓度为1.5%（g/ml）的HA溶液中（该HA溶液以pH 6.0的磷酸盐缓冲液为溶剂），然后加入14ml的环氧氯丙烷，在30℃搅拌反应56 h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，透析液冷冻干燥，得到PSA-HA交联复合物。采用间苯二酚法测定其中PSA含量，发现未经活化得到的交联复合物的PSA含量仅有5%。
对比例2
取1.5 g PSA（分子量23KDa），溶解于10 ml水溶液中，加入0.6 ml环氧氯丙烷，用NaOH调整pH至7.5，然后在35℃搅拌反应4 h，反应结束后真空除去多余的环氧氯丙烷，再用水：乙醇（体积比1:4）的混合液沉析，所得沉析物离心、用水：乙醇（体积比1:4）的混合液反复纯化，获得活化的PSA。
以PSA:HA质量比为2:1的比例，将活化的PSA加入到20ml浓度为1.5%（g/ml）的HA溶液中（该HA溶液以pH 8.0的碳酸钠-碳酸氢钠为溶剂），在30℃搅拌反应56 h，反应后，将反应液减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液用分子截留量50万Da的透析袋进行透析，透析所得产品冷冻干燥，得到PSA-HA复合物。采用间苯二酚法测定产品中PSA含量，结果显示PSA含量仅为10%。
对比例3
按照实施例1的方法制备PSA-HA复合凝胶冻干粉，不同的是：所用的透明质酸的分子量为500kDa，所用的聚唾液酸的分子量为200kDa。所得PSA-HA复合凝胶冻干粉0.44g。采用间苯二酚法测定冻干粉中PSA含量为44.2%。
下面，对实施例7和8的产品进行性能验证，以证明本发明聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的优势。
1药物缓释实验
以pH1.2的盐酸溶液和pH7.4 的PBS缓冲液分别模拟胃液和肠液pH环境，考察PSA-HA/胰岛素在不同pH介质中释放胰岛素的情况。实验时，将PSA-HA/胰岛素分别置于盐酸溶液和PBS缓冲液中即可，检测胰岛素在12h内的释放情况。结果发现，在pH1.2的盐酸溶液中，胰岛素的释药速度大于在pH7.4的PBS缓冲液中的释药速度，盐酸溶液中的胰岛素在6h内逐渐释放率为89%。
2体内降解、炎症反应实验
1）实验动物
清洁级健康成年新西兰大白兔，体重2.5~3.0 kg，年龄9-12个月。
2）实验所用注射产品
试验品为实施例8的双相交联透明质酸（HA1），其中采用实施例1的PSA-HA复合凝胶制得的双相交联透明质酸记为HA1-1，采用实施例2的PSA-HA复合凝胶制得的双相交联透明质酸记为HA1-2，采用实施例3的PSA-HA复合凝胶制得的双相交联透明质酸记为HA1-3.
对照品为商业化的交联透明质酸（HA2，双相，购自山东福瑞达公司）。
3）实验分组及方法
取16只大白兔，平均分为4组，每组4只，各组分别使用试验品和对照品进行试验。试验方法为：将大白兔剃除脊柱两侧各直径5 cm区域兔毛，每只注入2 ml 产品，注射后观察每只兔子的一般状态、食欲以及体重变化等，并分别于注射后1周、2周、3周、4周、5周和6周取注射处皮下层组织，置于福尔马林溶液中固定24h后进行石蜡包埋切片，采用常规的苏木精-伊红染色法 (HE染色)，光镜下观察组织及注射产品降解情况。
4）实验结果
4.1各组大白兔一般状态、食欲以及体重变化情况
大白兔按照标准程序进行喂养和观察，注射试验品和对照品后，大白兔均存活，食欲正常，状态良好，体重变化不大，无不良现象发生。
4.2各组注射产品降解、致炎情况
图2和3为试验品HA1-1与对照品HA2注射入兔子皮肤内后大白兔肉眼观察情况。注入HA1-1的兔子体表无红肿、无渗出，前3周注入HA1-1的兔子还能清晰看见注入处皮肤鼓起，表明材料还未降解，在第4周（第22天）材料开始降解，4周过后有毛发长出，皮肤鼓起处逐渐消失，到第6周（第36天）材料完全降解掉。注入HA2的兔子1周后体表略带红肿，但在第2周后逐渐消失，从第3周（第15天）开始材料逐渐降解，三周后材料已降解较多，降解的速度较HA1-1组的快，第4周（第22天）材料完全降解，在4周过后毛发基本长齐。
注射HA1-2的兔子体表无红肿、无渗出，前2周注入HA1-1的兔子还能清晰看见注入处皮肤鼓起，表明材料还未降解，在第3周（第20天）材料开始降解，到第5周（第32天）材料完全降解掉。
注射HA1-3的兔子体表无红肿、无渗出，前2周注入HA1-1的兔子还能清晰看见注入处皮肤鼓起，表明材料还未降解，在第3周（第17天）材料开始降解，到第4周（第26天）材料完全降解掉。
通过试验表明了PSA-HA复合凝胶作为皮肤填充剂能有效延长HA在体内停留时间，也有一定的抗炎作用。其中实施例1的PSA-HA复合凝胶作用效果最好。
HA1-1和HA2的组织切片观察实验结果如图4和5所示，从图中可以看出，HA1-1和HA2注入1周后，在注射处周围都出现明显炎症现象，但在2周后HA1-1材料周围炎症明显消失，部分材料已被组织分散，未见降解，有出现水肿现象，而HA2材料2周后周围还有部分较明显的炎症现象，也存在水肿现象；3周过后注入的HA1-1材料处炎症基本消失，开始出现部分降解，周围已有新生组织生成，而HA2降解得较HA1-1快，很难发现成团未降解的材料；4周过后HA1-1大部分已经降解，HA2材料基本完全降解，新生组织已长好，材料降解速度与细胞增殖速度基本相匹配。HA1-2和HA1-3注入1周后，在注射处周围都出现明显炎症现象，但2周后炎症明显消失，3周过后炎症基本消失，但炎症消失的速度略慢于HA1-1。
通过试验表明了PSA-HA作为皮肤填充剂材料更具有较好的组织相容性，且也有一定的抗炎作用。

Claims (12)

1.一种聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）在碱性水溶液环境下，聚唾液酸的羟基和交联剂发生反应，使聚唾液酸与交联剂进行连接，得到活化的聚唾液酸；
（2）将活化的聚唾液酸加入到透明质酸溶液中，在酸性环境下，透明质酸的羟基与连接在聚唾液酸上的交联剂进行反应，使聚唾液酸接枝到透明质酸上，得到聚唾液酸-透明质酸复合凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：聚唾液酸的分子量为10 kDa～100 kDa，透明质酸的分子量为1000 kDa～3000kDa；交联剂为环氧氯丙烷。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，聚唾液酸与透明质酸的质量比为1：1～4：1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，先将聚唾液酸溶解于水中，再加入交联剂，然后调节溶液至碱性进行反应；步骤（1）中，聚唾液酸和交联剂在pH>8的碱性水溶液中进行反应；步骤（2）中，活化的聚唾液酸和透明质酸在pH为4～7的酸性环境下进行反应。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，在聚唾液酸和交联剂的碱性水溶液中，聚唾液酸的质量体积浓度为5～25%，交联剂的体积浓度为2～10%；步骤（2）中，透明质酸溶液的质量体积浓度为1%～5%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，反应后除去多余的交联剂，剩余的反应液加入乙醇水溶液进行沉析，所得沉析物用乙醇水溶液进行多次沉析纯化，得活化的聚唾液酸；步骤（2）中，反应后将反应液减压浓缩，浓缩后的反应液透析除去小分子交联剂和未交联的聚唾液酸，透析后的产品冷冻干燥，得到聚唾液酸-透明质酸复合凝胶。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，反应温度为30～45℃，反应时间为3～6h；步骤（2）中，反应温度为25～35℃，反应时间为12 h～96 h。
8.按照权利要求1-7中任一项所述的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶的制备方法制得的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶。
9.权利要求8所述的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶作为药物载体的应用。
10.权利要求8所述的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶在含交联透明质酸的注射美容产品中的应用。
11.一种注射用含透明质酸的双相凝胶的制备方法，其特征是：
将权利要求8所述的聚唾液酸-透明质酸复合凝胶用无菌注射用水配成浓度为8～12mg/ml的溶液，将该溶液与注射用交联透明质酸凝胶颗粒混合均匀，即得注射用含透明质酸的双相凝胶；其中，聚唾液酸-透明质酸复合凝胶水溶液的用量为交联透明质酸凝胶颗粒质量的8～20wt%。
12.按照权利要求11所述的注射用含透明质酸的双相凝胶的制备方法制得的注射用含透明质酸的双相凝胶。
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