CN101002945A - 一种用于肿瘤治疗的新型复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明通过将特异修饰试剂定点连接到抗肿瘤蛋白质，既克服其所固有的抗原性高，半衰期短的缺陷，又可以克服非特异修饰方法造成的产物修饰位点不一致、组成不均一，活性明显降低以及产品质量难以控制的缺点，使其可以用于肿瘤治疗和制备抗肿瘤药物。

Description

一种用于肿瘤治疗的新型复合物
技术领域
本发明涉及一种具有生物活性和代谢稳定性的重组精氨酸脱亚胺酶的制备方法。本发明还提供含有这种精氨酸脱亚胺酶的药物复合物、组合物以及含有这种精氨酸脱亚胺酶和药物组合的试剂盒。本发明还提供使用本发明中的精氨酸脱亚胺酶、药物组合来预防、诊断、治疗肿瘤的方法。
背景技术
肝癌和恶性黑色素瘤是在确诊后一年内造成大多数患者死亡的致命疾病。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，因其发展迅速、治疗棘手、疗效欠佳、生存期短，素有“癌中之王”之称。据最近的调查资料表明，我国肝癌年死亡率为20.4人/10万，占全部恶性肿瘤的18.8％，已由上世纪70年代的第三位上升到第二位，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌。而黑色素瘤也是一种急、恶性肿瘤，在美国恶性黑色素瘤是发病率增长最快的恶性肿瘤。同时皮肤恶性黑色素瘤虽然只占全部皮肤恶性肿瘤的5％，而因皮肤恶性肿瘤死亡的患者恶性黑色素瘤超过75％。2003年大约有6万美国人被诊断为黑色素瘤，其中1万例是致死性的。如果不能早期治疗，黑色素瘤会发展成为恶性肿瘤，以一种其他肿瘤所没有的效率扩散到全身。
使用特异性从血液中清除某些必需氨基酸的方法可用于治疗某些癌症。这种治疗方法中，比较著名的例子是使用L-天冬酰胺酶降低天冬酰胺在血液中的浓度来治疗急性成淋巴细胞白血病。较为常用的L-天冬酰胺酶分离自大肠杆菌，但是由于其固有的抗原性和较短的循环半衰期，这种酶的应用受到很大限制，参见Y.K.Park等，Anticancer Res.，1：373-376(1981)。已经发现，用聚乙二醇修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶的半衰期得到明显加长，同时抗原性大大下降，参见Park，Anticancer Res.，同上；Y Kamisald等，JPharmacol.Exp.Ther.，216：410-414(1981)；和Y.Kamisaki等，Gann.，73：470-474(1982)。虽然去除某些必需氨基酸的确能够在一定程度上治疗某些肿瘤，但是由于必需氨基酸同样是正常细胞生长所必需，因此，血液中某些必需氨基酸的减少会引起一些严重的副作用。
已有研究显示，某些肿瘤细胞具有不同于普通细胞的代谢方式，他们对氨基酸种类的需求也不同于正常细胞。基于这种理论发现，通过降解血液中某些非必需氨基酸，如精氨酸，能够在对正常细胞影响很小的情况下控制某些肿瘤，比如肝癌和恶性黑色素瘤。其中一种来自于恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)的精氨酸脱亚胺酶(Arginine Deiminase，ADI)就能够在体外抑制并杀死肿瘤细胞。但是由于来自于恶臭假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶具有的固有缺陷：在pH中性环境下活性很低和在血液中会被快速清除，而限制了它在肿瘤治疗中的应用。另一种来源于精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶(分子量46,000道尔顿)，被证实在中性pH条件下能够保持活性，能够在动物实验模型中抑制肿瘤的生长，参见Takaku等，Int.J.Cancer，51：244-249(1992)和美国专利5,474,928，其所公开的内容在此引入作为参考。但是，作为一种来自于微生物的异源蛋白质，这种酶在实验动物体内同样存在抗原性强、循环半衰期短、容易降解的问题。已有报道显示通过交联聚乙二醇到这种蛋白质上能够明显增加这种蛋白质的循环半衰期，降低其抗原性，治疗肿瘤。参见C.M.Ensor等，Cancer Research，62：5443-5550(2002)。虽然聚乙二醇交联使得精氨酸脱亚胺酶能够被用于临床肿瘤治疗，参见P.A.Ascierto等，J.Clin.Oncol.，22：1815-1822和23：7660-7668(2005)，但是已使用的交联方式是多位点，不均一的修饰，会造成修饰后蛋白质形状不一致，制备质量不可控，给不同批次修饰后蛋白产物的药效，药代评估带来困难，同时可能会造成病人临床治疗用药效果因药物本身固有的不均一性而产生难以解释的差异，可能会严重影响对不同肿瘤病人有针对性治疗方案的制定。
发明概述
多肽和蛋白质类作为药物相比于化学药具有毒副作用小，不产生耐药性等优点。为了达到最高的体内活性，提高生物利用度，减少药物体内降解，通常蛋白药物都采用静脉给药方式。但是对于分子量小的蛋白来说，通常静脉给药以后的体内半衰期都很短。除了体内的蛋白降解过程以外，一个重要的方面是小分子蛋白能够通过肾过滤的途径从体内很快的被消除。在血液中，水力半径超过白蛋白或是分子量大于约66,000道尔顿(66kDa)的蛋白通常可以稳定的保留在循环系统中。但是小分子却会通过肾小球过滤被很快的从血液中消除。所以，为了维持小分子量蛋白在血液中的有效治疗浓度，需要进行频繁的静脉给药。这种治疗方式虽然能达到治疗的目的，但是却给病人带来了严重的不便与痛苦，而且提高了用药成本，而且对某些药物长期的使用有可能产生一些副作用，例如免疫反应。
作为蛋白药物的精氨酸脱亚胺酶同样存在半衰期短，体内清除率高的缺点，而且由于其来源于致病微生物，因此更具有很强的抗原性，在人体内会引发很强的免疫反应。本发明的主要目的就在于降低精氨酸脱亚胺酶的抗原性，改善该蛋白的体内代谢特征，使其具有更高的稳定性和较长的体内半衰期，从而达到可以用于临床肿瘤治疗，降低患者经济负担和生理痛苦之目的。
用高分子聚合物对蛋白进行修饰，它是改变和控制药物的动力学特性如半衰期、生物学特性、毒理特性的常用方法。用来修饰蛋白的高分子聚合物具有较好水溶性、较好生物相容性、弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是应用最为普遍的一种蛋白修饰分子。聚乙二醇分子具有双亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂具有无毒、无免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性质，是被包括美国FDA和中国SFDA在内的很多国家或地区的药品管理机构所批准的可用于药物制备的高分子。将蛋白质与亲水性的高分子如聚乙二醇偶联，可增加蛋白稳定性、减少非特异性吸附和抗原性，偶联物达到一定分子量时，可大大降低肾脏的排除效率，是延长蛋白质药物体内半衰期的有效方法(Frokjaer S.etal.Nat.Rev.Drug Discov.2005 Apr；4(4)：298-306；Harris JM.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2003 Mar；2(3)：214-21)。最初的聚乙二醇修饰都是以氨基作为反应位点，主要包括蛋白的N端α-氨基和赖氨酸残基侧链上的ε-氨基。这一类反应的产物是一个蛋白分子与一个或多个PEG分子非特异偶联。对于赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的修饰也往往因为反应位点不专一而产生修饰后的同分异构体。目前，针对N端α-氨基和赖氨酸侧链ε-氨基的等电点差异，又新开发出了只针对蛋白N端修饰的聚乙二醇修饰试剂，使得修饰产物修饰位点一致、组成均一。另一种可用于聚乙二醇修饰的蛋白位点是半胱氨酸的巯基。由于巯基在蛋白中的数目小于氨基，所以这类修饰的位点更加特异。利用基因工程技术，现在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作为特异的修饰位点。但是此类引入半胱氨酸作为修饰位点也是有一定的局限性，因为对于不含半胱氨酸的蛋白或多肽可能造成分子间交联，丧失活性；而对某些本身带有半胱氨酸的蛋白或多肽则可能会造成二硫键的错配导致无法复性。另外蛋白的羧基也是一种常用的修饰位点(Veronese FM et al.DrugDiscov.Today.2005 Nov 1；10(21)：1451-8.)。聚乙二醇修饰技术已经成功地运用在许多蛋白类药物上，比较成功的包括：PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase)(Graham ML Adv.Drug Deliv.Rev.55，1293-1302；AVRAMISVASSILIOS I et al.WO9939732 and US6689762)、PEG-腺酐脱氨酶(PEG-adenosine deaminase)(Levy Y et al.J.Pediatr.113，312-317；Davis S et al.ClinExp.Immunol.46：649-652；Hershfield MS et al.N Engl J Med 316：589-596)、PEG-干扰素(PEG-interferon α2a，PEG-interferon α2b等)(Bailon P etal.C.Bioconjug.Chem.12，195-202，Wang YS et al.Adv.Drug Deliv.Rev.54，547-570，Meng Xiantai et al.WO2005077421，Van Vlasselaer Peter et al.WO2004076474，Ballon Pascal Sebastlan et al.US2004030101，KarasiewiczRobert et al.EP0593 868)等等。
其他代表性的高分子修饰剂有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。
将血液蛋白或其片段作为载体，与药用蛋白偶联或融合表达，从而起到增加蛋白分子量的目的，是另一种延长药用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fc片段和目的蛋白偶联以延长其半衰期，此方法已被用于Notchl受体蛋白(Kitajewsky Jan et al.WO2005111072)、促红细胞生成素(EPO)(GilliesStephen D et al.WO2005063808)、人生长激素(Kim Young Min et al.WO2005047337)等蛋白上。血浆白蛋白也是一种常用的偶联载体，可以运用在抗生素类、消炎类、抗氧化物等蛋白上(Ezrin Alan M et al.WO0117568，Otagiri Masaki et al.EP1571212)。
对于某些血液载体蛋白除了在体外将其与药物蛋白偶联在一起外，还可以先将蛋白药物在体外进行修饰，使之具有化学反应的活性或是对体内其他分子具有较高的亲和力，能够在进入体内以后和血液成分进行反应，形成半衰期较长的大分子或是复合物。一个实例是将此技术运用于抗病毒的小肽分子anti-RSV上，将其修饰上带有马来酰亚胺的活性基团，它可以和血液蛋白或是细胞表面蛋白中的巯基反应(Bridon Dominique P et al.WO0069902)；另一个实例是利用酰化反应，在蛋白表面地氨基酸残基上引入脂肪酸，增加蛋白对体内白蛋白的亲和力，使得蛋白进入血液后可以和白蛋白形成较大的复合物，从而达到延长半衰期的目的，这一方法曾用于长效胰岛素上(Kurtzhals P et al.Biochem.J.(1995)312，725-731；Frokjaer Set al.Nat Rev Drug Discov.2005 Apr；4(4)：298-306)。
另一种延长蛋白体内半衰期的方法是将蛋白做成缓释剂型。将蛋白药物放入一种药用载体中，这种载体可以是化学大分子，也可以是一种具有缓慢、持续释放蛋白能力的物理装置，使得蛋白从载体中缓慢释放，在体内维持一种稳定的药物浓度。常用的方法有水凝胶、微胶囊、微球、脂质体、微型渗透泵等(Peppas NA et al.Eur.J.Pharm.Biopharm.50，27-46(2000)；Packhaeuser CB et al.Eur.J.Pharm.Biopharm.58，445-455(2004)；MetselaarJM et al.Mini Rev.Med.Chem.4，319-329(2002))。脂质体是一种具有双层膜结构的空球形态的超显微粒子。该双层膜由双亲性分子多为磷脂构成并有水性的内腔。将亲水性的蛋白药物包裹在脂质体的内腔中，在体内缓慢释放，可以维持血液中的蛋白浓度，达到增加半衰期的作用。一些实例包括用在神经生长因子(Hou Xinpu et al.CN1616087)、血红蛋白(Farmer Martha Cet al.US4911929)等蛋白上。微型渗透泵是一种利用半透膜内外渗透压差别来控制内容物缓慢释放的物理装置，已被广泛应用于各种化学、生物药物在动物实验模型中的缓释研究。
发明详述：
本发明中提到的精氨酸脱亚胺酶，除了特别说明以外，其来源可以是各种具有精氨酸脱亚胺酶的微生物，其中的优选方案是野生型人型支原体精氨酸脱亚胺酶，如SEQ ID No.1所示。发明中提到的精氨酸脱亚胺酶，除特殊说明以外，包括野生型的精氨酸脱亚胺酶，即自然存在的形式，或是其具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物等或是它们的组合。精氨酸脱亚胺酶的来源可以是大肠肝菌中发酵纯化(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)或动物细胞表达的，也可以是从酵母(如SEQ ID No.2所示)发酵而来的。其中来源于动物细胞表达的野生型的人型支原体精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；来源于酵母表达的重组人型支原体精氨酸脱亚胺酶具有SEQ ID No.2的序列，或是在此序列的N端有10个氨基酸以内的增加或缺失；来源于大肠肝菌表达的重组人型支原体精氨酸脱亚胺酶具有SEQ ID No.1或者/和SEQ ID No.2的序列。
本发明结合现有的一些主要药物修饰技术，提供一种具有很低抗原性，较长半衰期的精氨酸脱亚胺酶产品，其在保持抑制肿瘤细胞生长活性的同时，与未修饰的精氨酸脱亚胺酶相比，具有很低的免疫原性，更高的体内稳定性和更长的体内维持时间。
“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的直链或支链形式缩聚物的混合物，由一般分子式H(OCH2CH2O)nOH来代表，在此n至少为4。用“聚乙二醇”或“PEG”连同其后面的数字后缀一同来表示它的大约平均分子量。例如，PEG 20,000道尔顿是指均重分子量大约为20,000道尔顿的聚乙二醇；PEG 40,000是指均重分子量大约为40,000道尔顿的聚乙二醇。
本发明基于一个意外的发现，即用聚乙二醇在单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶同样具有治疗某些类型的癌症和抑制癌症转移的显著效果。与多位点修饰以及单位点非特异性修饰相比，单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶不仅保留了低抗原性，较好肿瘤抑制活性的优点，而且同等剂量下具有更高的活性，更好的组成均一性，以及明显优于非特异性修饰精氨酸脱亚胺酶的不同生产批次产品质量重现性，可以被用于临床肿瘤治疗以及制备抗肿瘤药物。
本发明中提到的精氨酸脱亚胺酶的基因可从任何来源得到、克隆或生产，例如微生物、重组生物技术或其任何组合。优选地，精氨酸脱亚胺酶从支原体属的微生物中克隆得到。更优选地，精氨酸脱亚胺酶从精氨酸支原体、人型支原体、关节炎支原体或其任何组合中克隆得到。特别地，本发明中应用的人型支原体精氨酸脱亚胺酶可以具有一个或多个在SEQ IDNo.1中表示的氨基酸序列。
精氨酸脱亚胺酶的突变体指的是通过氨基酸的取代，缺失，增加而得到的蛋白分子。精氨酸脱亚胺酶的片段是指序列属于SEQ ID No.1的任何更小的部分，可以是通过酶切得到的，或是基因工程表达的，或是通过多肽合成的得到的。精氨酸脱亚胺酶的异构体是指具有和野生型精氨酸脱亚胺酶相同的氨基酸序列或分子式，但是却有不一样的构象，包括蛋白二级或三级结构的不同或是局部氨基酸旋光性的改变，异构体的来源可以是天然存在的突变或是通过人为设计而得到的。精氨酸脱亚胺酶的衍生物是指在野生型精氨酸脱亚胺酶的基础上进行修饰的产物，其中的修饰是指在蛋白上共价连接一个或多个其他小分子，例如磷酸分子，糖分子等，或20个氨基酸以内的小肽链，连接位点可以是蛋白内的任意一个氨基酸。在一个优选的方案中，可以是一种N端附加一段含有His-Tag(组氨酸标签)的肽链修饰的精氨酸脱亚胺酶，这样的组氨酸标签可以是由3-10个组氨酸组成，其中优选具有SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的序列及在此基础上的衍生序列。精氨酸脱亚胺酶具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物的组合是指同时具有两种或两种以上上述特征的变化的产物，例如，但不仅限于，片段的突变体，突变体的修饰产物等。
本发明提供一种具有较长半衰期的精氨酸脱亚胺酶产品。这里的产品由精氨酸脱亚胺酶和另一半非精氨酸脱亚胺酶的修饰组分组成。其中精氨酸脱亚胺酶如上面所定义，修饰组分可以具有任何形式，包括但不仅限于高分子聚合物、蛋白分子、肽段以及其他任何形式的化学物质。精氨酸脱亚胺酶与修饰组分可以通过共价键相连，或是以非共价键相互作用形成稳定的复合物，或是形成一种稳定的组合物。本发明中的此产品的特征是具有精氨酸脱亚胺酶的生物活性，但是具有比原来的精氨酸脱亚胺酶更长的体内代谢半衰期和明显降低的抗原性，能够作为抗肿瘤的药物。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种修饰的精氨酸脱亚胺酶。此处的修饰是指将一个或多个的修饰物通过共价键直接或间接与精氨酸脱亚胺酶相连。其中的修饰物可以是一个生物相容能增加精氨酸脱亚胺酶的血液半衰期的聚合物或蛋白及其片段。修饰物可以是通过化学偶联的方法连接到精氨酸脱亚胺酶上的，也可以是通过融合表达的方式和精氨酸脱亚胺酶连接到一起的。
这里的聚合物是指非肽链的高分子聚合物，可以有它自己的生物活性，也可以没有生物活性。合适的聚合物包括但不仅限于聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚氨基酸、二乙烯基醚与马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基-甲基丙烯酰胺(N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、多聚糖类、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、肝素、肝素片段、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羟乙基天冬酰胺(a，P-Poly(2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide)、聚羧酸脂(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醛共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰马林(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧化物(polyoxiranes)、乙二酸/丙二酸共聚物、聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。在一个优选的方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。
上述的聚烯醇类化合物包括但不仅限于聚乙二醇(包括单甲基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇等等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等以及他们的衍生物如脂类。
上述的聚醚类化合物包括但不仅限于聚烷撑二醇、具有HO((CH2)xO)nH的结构通式、聚丙二醇、聚氧化乙烯HO((CH2)2O)nH、聚乙烯醇(CH2CHOH)n等。
上述的聚氨基酸包括但不仅限于同种氨基酸的聚合物，两种或两种以上的氨基酸的聚合物，例如：聚丙氨酸。
上述的多聚糖类包括但不仅限于葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纤维素及纤维素的衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖等。
本发明的一个具体实施方案涉及精氨酸脱亚胺酶和蛋白或肽链的偶联，其特征为精氨酸脱亚胺酶与一种或多种蛋白或肽链直接或间接相连。其中的蛋白可以是天然存在的或是其片段。这里适合用作修饰载体的蛋白分子优选但不限于天然存在的人血浆蛋白或是其片段，包括但不仅限于甲状腺结合蛋白(thyroxine-binding protein)、转甲状腺蛋白(transthyretin)、al酸性糖蛋白(al-acid glycoprotein)、转铁蛋白(transferrin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、免疫球蛋白、白蛋白等以及它们的片段。片段指的是任何比该蛋白小，并且保持了载体功能的部分。精氨酸脱亚胺酶与载体蛋白直接或间接共价相连。直接连接指的是精氨酸脱亚胺酶的某一个氨基酸和载体蛋白的某一氨基酸直接相连，这样的连接可以通过肽键或二硫键。间接相连指的是精氨酸脱亚胺酶和载体蛋白通过相互之间本来就有的或者通过生物或化学方法赋予的特定的化学基团相连，或这样的连接的组合。
在本发明的一个具体实施方案涉及聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶，其组成为一个精氨酸脱亚胺酶分子与一个聚乙二醇分子偶联。偶联反应的位点是精氨酸脱亚胺酶N端的α-氨基，或是赖氨酸残基侧链上的ε-氨基，或是半胱氨酸的巯基，或是天冬氨酸或谷氨酸的羧基，其中优选但不限于精氨酸脱亚胺酶N端的α-氨基。所有用于偶联的聚乙二醇分子可以是线性的，也可以是分叉的，分子量位于1,000道尔顿到100,000道尔顿之间，优选但不限于5,000道尔顿到40,000道尔顿，更优选但不限于20,000道尔顿到40,000道尔顿的聚乙二醇。一个优选的方案是用聚乙二醇特异的修饰精氨酸脱亚胺酶的N端α氨基，形成单一位点修饰的产物。
本发明的一个具体实施方案涉及具有化学反应活性的精氨酸脱亚胺酶修饰产物，其特征在于它含有化学反应活性基团，具有和血液某些成份反应的能力，与之在体内形成一种稳定的共价键。这样的物质包括但不限于具有一个反应活性的基团，可以和血液成份的氨基、羟基、巯基等反应形成共价键，优选但不限于活性基团是一个马来酰亚胺，它可以和血液蛋白，包括但不限于可移动的血液蛋白，例如白蛋白中的巯基反应。
本发明的一个具体的实施方案涉及一种含有精氨酸脱亚胺酶的复合物，它是由精氨酸脱亚胺酶和其他分子通过非共价键形成的具有特定组成的复合物分子。该复合物具有抑制肿瘤生长的活性，并且在体内有比精氨酸脱亚胺酶更长的半衰期。
本发明的一个具体的实施方案涉及一种含有精氨酸脱亚胺酶的缓释组合物，它是由精氨酸脱亚胺酶或其复合物和药物载体形成的一种稳定组合。该组合物中的精氨酸脱亚胺酶仍然具有生物活性，但是却可以依靠该载体改变药物代谢特征达到延长体内保留时间的目的。其中优选但不限于药物体内缓释技术，使用化学或者物理的缓释物质，其中一个优选的方案中提供一种脂质体包埋的精氨酸脱亚胺酶或其复合物、组合物；另一种优选方案为由微型渗透泵包容的精氨酸脱亚胺酶或其复合物、组合物。
本发明还提供一种含有上述精氨酸脱亚胺酶或其复合物、组合物的药物组合物，它是由上述包含精氨酸脱亚胺酶的药物组合物和适合的药物载体组成的。本发明使用的“适合的药物载体”包括对于以所用剂量和浓度与其接触的细胞或哺乳动物无毒的药用上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂。通常生理学上可接受的载体是含水的pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的例子包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸在内的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(不超过10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性多聚体；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖、二糖、和包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其它糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等成盐反离子；和/或诸如TWEEN、聚乙二醇(PEG)、和PLURONICS等非离子表面活性剂。
本发明提供的上述精氨酸脱亚胺酶或其复合物、组合物的药物组合物一般与可药用载体(赋形剂)组合以形成药物学组合物。可药用载体可含有用于例如，稳定该组合物或增加或减少活性试剂吸收的一种或多种生理学上可接受的化合物。生理学上可接受的化合物可包括，例如，诸如葡萄糖、蔗糖、或葡聚糖的糖类，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽的抗氧化剂、螯合剂、低分子量蛋白、诸如脂类的保护和吸收增强剂、减少活性试剂清除或水解的成分、或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲液。
其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或对于防止微生物生长或作用特别有用的保护剂。各种保护剂是熟知的且包括，例如，苯酚和抗坏血酸。本领域的技术人员可预料到包括生理学上可接受的化合物的可药用载体的选择取决于，例如，活性试剂的给药途径和活性试剂的具体生理-化学特性。
赋形剂优选是无菌的且一般不含不良物质。这些组合物可通过常规的熟知灭菌技术进行灭菌。
本发明还提供一种含有上述精氨酸脱亚胺酶或其复合物、组合物和产品说明书的试剂盒。
本发明还涉及到制备上述精氨酸脱亚胺酶复合物或组合物的方法。特别的，制备精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物。
本发明还提供一种预防、诊断或治疗癌症以及其他精氨酸相关疾病，并抑制肿瘤生长和转移的方法，包括但不限于采用具有低抗原性、高活性、长半衰期的精氨酸脱亚胺酶复合物或组合物作为药物。本方法适合的癌症包括但不仅限于，肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、骨癌、胰腺癌、淋巴癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、白血病、恶性黑色素肿瘤、肉瘤、肾癌、胆癌等。其中优选但不限于使用精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物治疗肿瘤。
本发明还提供将上述精氨酸脱亚胺酶复合物、组合物或二者之组合用于肿瘤以及其他精氨酸相关疾病预防、诊断或治疗的给药方式，包括但不限于静脉注射给药、静脉滴注给药、静脉导管给药、动脉导管给药、肌肉注射给药、腹腔给药、口服、吸入给药、皮下给药、皮肤给药、直肠给药、阴道给药、鼻黏膜给药、口腔黏膜给药、眼部给药或其他给药方式。
本发明还提供一种上述精氨酸脱亚胺酶复合物、组合物或二者之组合用于制备抗肿瘤药物的用途和方法。
我们将聚乙二醇分子定向连接到精氨酸脱亚胺酶的N端氨基酸残基，并纯化制备单一修饰的蛋白产物。通过实验我们发现，单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶具有与多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶相似的低抗原性，在实验动物体内不容易产生免疫反应；同时单一位点修饰的精氨酸脱亚胺酶与多位点修饰产物相比，在同样的摩尔浓度下具有更高的活性；平行使用单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶与多位点修饰的精氨酸脱亚胺酶治疗小鼠肿瘤，单一位点修饰的精氨酸脱亚胺酶表现出更高的抑制肿瘤活性；单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶在高效液相色谱检测中表现出远好于多位点修饰精氨酸脱亚胺酶的均一性和单一物质性；单一位点特异修饰精氨酸脱亚胺酶的方法具有更好的修饰材料利用率，和多位点修饰精氨酸脱亚胺酶相比较，在保证效果的前提下能够用较少的高分子材料制备更多的修饰产物。
实验表明，本发明中的一个产品精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物具有抑制肿瘤细胞增殖和小鼠肿瘤生长的活性，与多位点及非特异单一位点修饰的精氨酸脱亚胺酶相比，活性明显提高，在相同剂量下具有更稳定，更高的酶活性和抑制肿瘤细胞生长的活性；而且具有更好的组分均一性、高纯度、结构均一性以及不同生产批次产品质量的重现性。并且体内药代学研究表明精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇修饰产物能有效的降低精氨酸脱亚胺酶的抗原性并减缓精氨酸脱亚胺酶在体内的代谢，延长体内半衰期。优选方案中的精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物可以被用于临床肿瘤治疗以及制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1一种来源于人型支原体的野生型精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列SEQID No.1。
图2一种大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达的人型支原体野生型精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列SEQ ID No.2。
图3一种大肠杆菌表达的人型支原体精氨酸脱亚胺酶衍生物氨基酸序列SEQ ID No.3。
图4一种大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达的人型支原体野生型精氨酸脱亚胺酶衍生物氨基酸序列SEQ ID No.4。
图5精氨酸脱亚胺酶(ADI)N端单一位点聚乙二醇偶联物在实验动物体内的低抗原性。选用9只平均体重25克左右的健康昆明种小鼠，分为三组，分别尾静脉注射精氨酸脱亚胺酶、精氨酸脱亚胺酶N端20kDa聚乙二醇单一位点特异修饰的偶联物和多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶聚乙二醇偶联物，剂量为15mg/kg体重。
图6精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物保持其完整的生物化学活性。在100微升磷酸盐缓冲溶液中(PBS)加入终浓度为10微克/毫升的精氨酸脱亚胺酶，再加入精氨酸脱亚胺酶底物L-精氨酸至终浓度10微摩尔。将反应混和体系置于37℃恒温水浴中孵育10分钟，取出后按照生产厂商提供的说明书使用检测试剂盒检测L-精氨酸的浓度变化。
图7精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物保持其完整的抑制肿瘤细胞增殖的活性。将小鼠的恶性黑色素瘤细胞(B16/F10)在含10％的血清的DMEM培养基中培养至对数生长期。然后不加血清饥饿细胞12小时。在肿瘤细胞中加入含10％胎牛血清的正常培养基和双抗。加药组分别加入精氨酸脱亚胺酶和修饰后的精氨酸脱亚胺酶(其中包括单一位点特异性修饰精氨酸脱亚胺酶和多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶)，浓度为10μg/ml，对照组加入等体积的生理盐水。
图8精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物在小鼠肿瘤模型治疗中的活性。选用平均体重20克左右的C57小鼠，分别腋下接入B16/F10恶性黑色素瘤细胞，每只接入细胞数2×106个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(精氨酸脱亚胺酶5mg/kg体重(1.7U/只)，每天给药)，单位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶和多位点非特异修饰精氨酸脱亚胺酶为给药组，给药时间间隔分别为每三天给药和每七天给药。A，尾静脉给药组；B，皮下给药组。
图9精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物明显延长患肿瘤小鼠的生存时间。选用平均体重20克左右的C57小鼠，分别腋下接入B16/F10恶性黑色素瘤细胞，每只接入细胞数2×106个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(化学抑制肿瘤药，每天给药)，单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶给药组(给药时间间隔为每七天给药)。
具体实施方式
实施例1：精氨酸脱亚胺酶N端与聚乙二醇的偶联。
将重组精氨酸脱亚胺酶透析到pH7.0的10mM磷酸盐缓冲溶液中。用紫外分光光度计280nm波长测量蛋白浓度，将浓度调节到4mg/ml。与20kD或者40kD聚乙二醇偶联时，取10ml上述蛋白溶液(含蛋白40mg)，加入20kD聚乙二醇固体40mg或40kD聚乙二醇固体80mg，并室温搅拌，直到完全溶解，使得聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶的摩尔比为2∶1。加入还原剂NaBCNH3，终浓度为20mM，并最后调节溶液的pH值为7。室温静置10小时。这时大部分的精氨酸脱亚胺酶被单PEG化修饰，少量会被多位点修饰。这时可将溶液稀释降低离子强度后，直接上柱纯化，或是稀释十倍以后4度冰箱短期存放。
实施例2：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物用阴离子交换柱纯化。
20kDa或40kD聚乙二醇精氨酸脱亚胺酶偶联物用阴离子交换柱层析(Bio-Rad公司)纯化。将反应后的混合液调节pH为7。层析住用含有10mMTris，pH值为7.0的平衡缓冲液平衡后上样。上样后，先用平衡液冲3个柱体积，再用含有10mM Tris，0-1M氯化钠，pH7.0的洗脱缓冲液梯度洗脱，未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以不会挂柱，在穿透和冲洗的过程中出现，洗脱出峰的顺序由先到后为多位点修饰的精氨酸脱亚胺酶，特异单一位点修饰的精氨酸脱亚胺酶，未修饰的精氨酸脱亚胺酶。根据280nm的紫外检测可以收集不同组分的峰。
实施例3：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物在血液中的半衰期明显增加。
测量精氨酸脱亚胺酶和聚乙二醇精氨酸脱亚胺酶在小鼠体内的半衰期来检验聚乙二醇修饰后的长效效益。选用6只平均体重25克左右的健康昆明种小鼠，分为两组，分别尾静脉注射精氨酸脱亚胺酶和20kD聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶，剂量为15mg/kg体重。按照2，10，30分钟，1，2，4，8，16，24，48，72，96，120，144，168小时的时间间隔尾静脉取血。血浆零下80度保存。取血后用夹心法ELISA分别测精氨酸脱亚胺酶和聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶的浓度。体内药代动力学显示20kD聚乙二醇修饰后，精氨酸脱亚胺酶在体内的半衰期从平均4小时增加到平均72小时。
实施例4：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物在实验动物体内的低抗原性。
测量精氨酸脱亚胺酶、单一位点特异修饰聚乙二醇精氨酸脱亚胺酶和多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶在小鼠体内的引发的免疫反应来检验单一位点聚乙二醇修饰后精氨酸脱亚胺酶抗原性的下降(图5)。选用9只平均体重25克左右的健康昆明种小鼠，分为三组，分别尾静脉注射精氨酸脱亚胺酶、20kD单一位点聚乙二醇特异N端修饰的精氨酸脱亚胺酶和多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶，剂量为15mg/kg体重。按照1、7、14、21天的时间间隔尾静脉取血。血浆零下80度保存。取血后用夹心法ELISA分别测不同实验组小鼠血液中特异针对精氨酸脱亚胺酶抗体的滴度。免疫学结果显示20kD聚乙二醇修饰后，单一位点N端特异修饰的精氨酸脱亚胺酶在小鼠体内引发的特异抗体的滴度比未修饰的野生型精氨酸脱亚胺酶低上万倍，仅仅比多位点非特异修饰的精氨酸脱亚胺酶高2-3倍。
实施例5：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物保持其完整的生物化学活性。
特异性单一位点聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶被用于检测修饰是否造成酶活下降(图6)。在100ml磷酸盐缓冲溶液中(PBS)加入终浓度为10μg/ml的精氨酸脱亚胺酶，再加入精氨酸脱亚胺酶底物L-精氨酸至终浓度10μM。将反应混和体系置于37℃恒温水浴中孵育10分钟，取出后按照生产厂商提供的说明书使用检测试剂盒检测L-精氨酸的浓度变化。结果显示，未修饰和单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶的活性均为17U/mg，单一位点20kDa聚乙二醇修饰没有明显影响酶的活性。我们同时使用多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶作为对照，发现多位点修饰的精氨酸脱亚胺酶活性明显下降，同等摩尔浓度下活性仅仅为氨酸脱亚胺酶N端单位点聚乙二醇偶联物的50-60％。
实施例6：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物抑制肿瘤细胞增殖的活性。
实验观察了20kDa聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶抑制小鼠B16/F10恶性黑色素瘤细胞增殖的活性(图7)。将小鼠的恶性黑色素瘤细胞(B16/F10)在含10％的血清的DMEM培养基中培养至对数生长期。然后不加血清饥饿细胞12小时。在肿瘤细胞中加入含10％胎牛血清的正常培养基和双抗。对于加药组分别加入精氨酸脱亚胺酶和修饰后的精氨酸脱亚胺酶(其中包括单一位点特异性修饰精氨酸脱亚胺酶和多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶)，浓度为10ug/ml，对照组加入等体积的生理盐水。37℃培养24小时以后，在细胞培养孔中加入终浓度0.25mg/ml MTT，然后再在37℃培养箱中静置6小时，最后用DMSO溶解。最后在显微镜下，取相同视野大小数细胞数，同一块培养皿，选取三个不同视野，最后算出抑制率。结果显示精氨酸脱亚胺酶对细胞增殖的抑制率为40％，单一位点特异修饰后的精氨酸脱亚胺酶对细胞增殖的抑制效果没有变化。但是多位点修饰的精氨酸脱亚胺酶活性只有单位点修饰产物的70％左右。表明经过聚乙二醇特异修饰后的精氨酸脱亚胺酶完全保持了酶的生物活性，并且与多位点修饰产物相比较具有更好的体外抑制肿瘤细胞生长的活性。
实施例7：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物在小鼠肿瘤模型治疗中的活性。
实验观察了20kDa聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶对小鼠B16/F10恶性黑色素瘤的体内抑制活性(图8A、B)。实验材料选用平均体重20g左右的C57小鼠，分别腋下接入B16/F10恶性黑色素瘤细胞，每只接入细胞数2×106个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(精氨酸脱亚胺酶5mg/kg(1.7U/只)体重，每天给药)，单位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶和多位点非特异修饰精氨酸脱亚胺酶为给药组，给药时间间隔分别为每三天给药和每七天给药。将已接种肿瘤的小鼠随机分组后开始给药；给药方式有两种，分别为尾静脉注射(图8A)和背颈部皮下(图8B)给药。给药周期为14天，第15天处死小鼠，称瘤重。以抑瘤率来评价药效，计算方法为：抑瘤率＝(阴性对照组瘤重-给药组瘤重)/阴性对照组瘤重×100％。实验结果：尾静脉给药组每三天，每七天给药的抑瘤率分别为：40％和30％；皮下给药组每三天，每七天给药的抑瘤率分别为：35％和30％。综合比较单位点特异修饰和多位点非特异修饰的精氨酸脱亚胺酶抑瘤活性，单位点修饰的精氨酸脱亚胺酶在相同的实验条件下，抑瘤效率比多位点非特异修饰精氨酸脱亚胺酶的抑瘤效率高10％，试验表明未修饰的精氨酸脱亚胺酶没有明显的抑制肿瘤活性；而特异修饰后的精氨酸脱亚胺酶不仅具有体内的抑瘤活性，而且药效优于多位点非特异性修饰的精氨酸脱亚胺酶，并且在延长给药间隔的情况下仍能保持抑制肿瘤生长的效果。
实施例8：精氨酸脱亚胺酶N端单一位点聚乙二醇偶联物明显延长患肿瘤小鼠生存时间。
实验观察了40kD聚乙二醇单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶对患恶性黑色素瘤B16/F10的C57小鼠生存时间的治疗效果(图9)。实验材料选用平均体重20g左右的C57小鼠，分别腋下接入B16/F10恶性黑色素瘤细胞，每只接入细胞数2×106个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(化学抑制肿瘤药，每天给药)，单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶给药组(给药时间间隔为每七天给药)。将已接种肿瘤的小鼠随机分组后，待肿瘤直径生长到平均2厘米开始给药；给药方式为背颈部皮下给药。给药周期为16天，期间各组实验小鼠相继死亡。以各组小鼠平均生存时间来评价治疗效果，实验结果：生理盐水对照组小鼠平均生存时间为15天，阳性对照化学药组小鼠平均生存时间为19天，单一位点特异修饰的精氨酸脱亚胺酶组小鼠平均生存时间为22天。
序列表
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>409
<212>PRT
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<400>1
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1               5                   10                  15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
            20                  25                  30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile
    50                  55                  60
Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65                  70                  75                  80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu
                85                  90                  95
Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys
            100                 105                 110
Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu
        115                 120                 125
Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu
    130                 135                 140
Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp
145                 150                 155                 160
Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr
                165                 170                 175
Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn
            180                 185                 190
His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys
        195                 200                 205
Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu
    210                 215                 220
Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu
225                 230                 235                 240
Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val
                245                 250                 255
Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp
            260                 265                 270
Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn
        275                 280                 285
Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu
    290                 295                 300
Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser
305                 310                 315                 320
Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala
                325                 330                 335
Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr
            340                 345                 350
Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys
        355                 360                 365
Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His
    370                 375                 380
Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met
385                 390                 395                 400
Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
                405
<210>2
<211>408
<212>PRT
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<400> 2
Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu Ile
1               5                   10                  15
Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile Asp
            20                  25                  30
Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu
        35                  40                  45
Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile Met
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala Glu
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu Thr
                85                  90                  95
Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys Ala
            100                 105                 110
Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu Phe
        115                 120                 125
Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu Asn
    130                 135                 140
Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro
145                 150                 155                 160
Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr Ile
                165                 170                 175
Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn His
            180                 185                 190
Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys Met
        195                 200                 205
Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu Val
    210                 215                 220
Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu Ala
225                 230                 235                 240
Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val Ala
                245                 250                 255
Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu
            260                 265                 270
Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn Asp
        275                 280                 285
Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu Pro
    290                 295                 300
Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser Ile
305                 310                 315                 320
Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala Thr
                325                 330                 335
Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu
            340                 345                 350
Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys Thr
        355                 360                 365
Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His Gly
    370                 375                 380
Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met Pro
385                 390                 395                 400
Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
                405
<210>3
<211>417
<212>PRT
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<400>3
Met Gly Gly Ser His His His His His Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe
1               5                   10                  15
Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu
            20                  25                  30
Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys
    50                  55                  60
Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val
65                  70                  75                  80
Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys
                85                  90                  95
Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro
            100                 105                 110
Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser
        115                 120                 125
Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys
    130                 135                 140
Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met
145                 150                 155                 160
Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly
                165                 170                 175
Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu
            180                 185                 190
Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro
        195                 200                 205
Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val
    210                 215                 220
Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr
225                 230                 235                 240
Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys
                245                 250                 255
Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr
            260                 265                 270
Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys
        275                 280                 285
Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr
    290                 295                 300
Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu
305                 310                 315                 320
Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu
                325                 330                 335
Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu
            340                 345                 350
Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val
        355                 360                 365
Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala
    370                 375                 380
Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met
385                 390                 395                 400
Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys
                405                 410                 415
Trp
<210>4
<211>416
<212>PRT
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<400>4
Gly Gly Ser His His His His His Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn
1               5                   10                  15
Gly Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val
            20                  25                  30
His Glu Pro Gly Arg Glu Ile Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu
    50                  55                  60
His Gln Ser Phe Val Lys Ile Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val
65                  70                  75                  80
Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val
            100                 105                 110
Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys
        115                 120                 125
Pro Thr His Glu Met Val Glu Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr
    130                 135                 140
Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro
145                 150                 155                 160
Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val
                165                 170                 175
Thr Ile His Phe Met Arg Tyr Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe
            180                 185                 190
Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp
        195                 200                 205
Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe
    210                 215                 220
Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp
225                 230                 235                 240
Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu
                245                 250                 255
Val Glu Phe Lys Arg Ile Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn
            260                 265                 270
Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp
    290                 295                 300
Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro
305                 310                 315                 320
Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile
                325                 330                 335
Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr
            340                 345                 350
Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile
        355                 360                 365
Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly
    370                 375                 380
Ile Thr Val Leu Pro Phe His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly
385                 390                 395                 400
Asn Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
                405                 410                 415

Claims (47)

1.一种修饰物与精氨酸脱亚胺酶(Arginine Deiminase)形成的复合物，所述复合物能够延长精氨酸脱亚胺酶在体内的半衰期。
2.权利要求1的复合物，所述修饰物与精氨酸脱亚胺酶共价连接。
3.权利要求2的复合物，所述修饰物选自高分子聚合物、蛋白及其片段、肽链、小分子或其他化合物。
4.权利要求3的复合物，所述高分子聚合物选自聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚氨基酸、二乙烯基醚与马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基-甲基丙烯酰胺(N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、多聚糖类、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、肝素、肝素片段、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羟乙基天冬酰胺(a，P-Poly[(2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide])、聚羧酸脂(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醛共聚物(polyoxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰吗啉(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物与氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧化物(polyoxiranes)、乙二酸和丙二酸的共聚物、聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、或环糊精。
5.权利要求4的复合物，所述聚醚类化合物选自聚烷撑二醇(具有HO((CH2)xO)nH的结构通式的化合物)、聚丙二醇、聚氧化乙烯HO((CH2)2O)nH、聚乙烯醇(CH2CHOH)n或它们的衍生物。
6.权利要求4的复合物，所述聚烯醇类化合物选自聚乙二醇(包括单甲基聚乙二醇，单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或其他聚烯醇类化合物以及他们的衍生物如脂类。
7.权利要求6的复合物，所述聚烯醇类化合物优选聚乙二醇；更优选甲基聚乙二醇。
8.权利要求7中的复合物，其中聚乙二醇可以是线性的也可以是分支的。
9.权利要求7中的复合物，其中聚乙二醇平均分子量是包括5,000道尔顿到100,000道尔顿这两种分子量在内的此区间内任何聚乙二醇平均分子量；其中优选5,000道尔顿到60,000道尔顿；更优选5,000道尔顿到40,000道尔顿；最优选20,000道尔顿到40,000道尔顿。
10.权利要求7的复合物，其特征为一个精氨酸脱亚胺酶分子和一个聚乙二醇分子偶联。
11.权利要求7-10任一的复合物，偶联的位点是精氨酸脱亚胺酶N端氨基酸残基的α氨基、赖氨酸残基侧链的ε氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基、酪氨酸残基侧链的羟基、丝氨酸残基侧链的羟基、苏氨酸残基侧链的羟基中的一种或是他们的组合。
12.权利要求7-11任一的复合物，其特征为一个精氨酸脱亚胺酶分子与一个聚乙二醇分子偶联，反应位点为精氨酸脱亚胺酶N端氨基酸残基的α氨基。
13.权利要求7-11任一的复合物，其特征为精氨酸脱亚胺酶分子与一个聚乙二醇分子偶联，偶联方法为在精氨酸脱亚胺酶分子内部或N末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽链，使得偶联位点为附加的半胱氨酸上的巯基。
14.权利要求7-11任一的复合物，其特征为精氨酸脱亚胺酶分子与一个聚乙二醇分子特定位点偶联，偶联的位点是精氨酸脱亚胺酶天冬氨酸或谷氨酸的羧基。
15.权利要求7-11任一的复合物，其特征为精氨酸脱亚胺酶分子与一个聚乙二醇分子特定位点偶联，偶联的位点是精氨酸脱亚胺酶酪氨酸的羟基、丝氨酸的羟基或者苏氨酸的羟基。
16.权利要求7-15任一中的复合物，其中精氨酸脱亚胺酶被修饰的位点是唯一的、确定的。
17.权利要求3的复合物，所述蛋白选自白蛋白、免疫球蛋白、甲状腺结合蛋白、转甲状腺蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或他们的片段。
18.权利要求17中的精氨酸脱亚胺酶的复合物，所述复合物包括白蛋白偶联的精氨酸脱亚胺酶，其特征为一个精氨酸脱亚胺酶分子和一个或多个白蛋白偶联，该偶联物是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的白蛋白优选人血清白蛋白或其片段。
19.权利要求17中的精氨酸脱亚胺酶的复合物，所述复合物包括免疫球蛋白Fc片段偶联的精氨酸脱亚胺酶，其特征为一个精氨酸脱亚胺酶分子和一个或多个免疫球蛋白Fc片段偶联，该偶联物是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的Fc片段优选人免疫球蛋白IgG中Fc区域的片段。
20.权利要求3中精氨酸脱亚胺酶的复合物，所述复合物包括小分子或是小肽修饰的精氨酸脱亚胺酶，其特征为该复合物具有同体内其他分子或成分反应或结合的活性基团，使得该聚合物可以在体内和体内其他成分形成更大的复合物。
21.权利要求20中的复合物，所述复合物带有具有反应活性的基团，可以和血液成份的氨基、羟基、巯基反应形成共价键。
22.权利要求21中的复合物，所述具有反应活性的基团是马来酰亚胺，它可以和血液中的成分，例如白蛋白中的巯基反应。
23.权利要求20中的复合物，与血液某些成份，例如白蛋白、免疫球蛋白或其他蛋白之间具有较强的亲和力，能相互形成更大的复合物。
24.权利要求3中精氨酸脱亚胺酶的复合物，所述复合物包括小肽或是其他分子修饰的精氨酸脱亚胺酶，包括精氨酸脱亚胺酶被糖基化、磷酸化、酰化的产物，其中修饰的位点是原来蛋白序列中存在的氨基酸残基，或是通过突变产生的氨基酸残基。
25.权利要求1中精氨酸脱亚胺酶的复合物，所述复合物是精氨酸脱亚胺酶和其他载体通过非共价键形成的复合物，其中的载体是蛋白、小分子或是其他具有载体功能的物质。
26.权利要求1-25任一中的复合物与生物相容性载体形成的缓释制剂。
27.权利要求26的缓释制剂，所述的缓释制剂选自微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵或脂质体。
28.权利要求1-27任一的复合物或缓释制剂，其中含有的精氨酸脱亚胺酶来源于人型支原体(Mycoplasma hominis)、支气管型支原体(Mycoplasmaarthritidis)或者精氨酸型支原体(Mycoplasma arginini)；或是通过基因重组技术克隆制备的人型支原体、支气管型支原体或者精氨酸型支原体的精氨酸脱亚胺酶。
29.权利要求1-27任一的复合物或缓释制剂，其中含有的精氨酸脱亚胺酶优选人型支原体精氨酸脱亚胺酶，其野生型具有SEQ ID No.1所示的序列。
30.权利要求1-27中的复合物或缓释制剂，其中含有的精氨酸脱亚胺酶更优选大肠肝菌表达的野生型重组人型支原体精氨酸脱亚胺酶，具有SEQ IDNo.1或者SEQ ID No.2的序列。
31.权利要求1-27任一的复合物，其中含有的精氨酸脱亚胺酶是精氨酸脱亚胺酶具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是他们的组合；优选支原体精氨酸脱亚胺酶具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是他们的组合；更优选人型支原体精氨酸脱亚胺酶具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是他们的组合。
32.权利要求31中的复合物，其中含有的精氨酸脱亚胺酶衍生物是一种N端或C端附加一段长度1-15个氨基酸的肽链，优选在精氨酸脱亚胺酶的N端附加一段含有His-tag的肽链MGGSHHHHH，具有SEQ ID No.3或者SEQ ID No.4的序列。
33.权利要求1-27中的含有精氨酸脱亚胺酶的复合物或缓释制剂与药学上可接受的载体形成的药物组合物。
34.权利要求33所指的药学上可接受的载体选自含水的pH缓冲溶液，包括磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸在内的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(不超过10个残基)多肽；血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白或其他蛋白质；聚乙烯吡咯烷酮或其他亲水性多聚体；甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或其他氨基酸；单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖类；EDTA或其他螯合剂；甘露醇或山梨醇或其他糖醇；钠或其他成盐反离子；TWEEN、聚乙二醇(PEG)、和PLURONICS或其他非离子表面活性剂。
35.一种试剂盒，含有权利要求1-34的包含精氨酸脱亚胺酶的复合物、组合物或缓释制剂和使用说明。
36.制备权利要求7-16中的复合物的方法，其特征是用高分子聚合物与精氨酸脱亚胺酶混合，在适当的溶液、温度、pH、反应摩尔比下反应制备该偶联物。
37.权利要求36中的方法，所用pH包括pH3和pH10以及pH3-10之间的任何pH值。
38.制备权利要求7-16中的复合物的方法，其特征是将偶联产物用离子交换柱纯化。
39.制备权利要求7-16中的复合物的方法，其特征是将偶联产物用分子筛柱层析纯化。
40.权利要求1-35中所述含有精氨酸脱亚胺酶的复合物或组合物或缓释制剂或试剂盒在预防、诊断或治疗肿瘤中的用途。
41.权利要求40中的用途，其中肿瘤选自肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、骨癌、胰腺癌、淋巴癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、白血病、恶性黑色素肿瘤、肉瘤、肾癌、胆癌或其他肿瘤。
42.权利要求1-35中所述含有精氨酸脱亚胺酶的复合物或组合物或缓释制剂或试剂盒在预防、诊断或治疗其他精氨酸相关疾病中的用途。
43.权利要求40-42中的用途，其中给药方式选自静脉注射给药、静脉点滴给药、静脉导管给药、动脉导管给药、肌肉注射给药、口服、吸入给药、皮下给药、皮肤给药、腹腔给药、直肠给药、阴道给药、鼻黏膜给药、口腔黏膜给药、眼部给药或其他给药方式。
44.权利要求1-35的含有精氨酸脱亚胺酶的复合物或组合物或缓释制剂或试剂盒在制备抗肿瘤药物中的用途。
45.权利要求1-35的含有精氨酸脱亚胺酶的复合物或组合物或缓释制剂或试剂盒在制备预防、诊断或治疗其他精氨酸相关疾病的药物中的用途。
46.一种延长精氨酸脱亚胺酶半衰期的方法，所述方法包含将修饰物与精氨酸脱亚胺酶形成复合物的步骤。
47.一种延长精氨酸脱亚胺酶半衰期的方法，所述方法包含将精氨酸脱亚胺酶或含有精氨酸脱亚胺酶的复合物与生物相容的物质形成缓释制剂的步骤。
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