ES2805360T3 - Arginina desiminasa con reactividad cruzada reducida hacia anticuerpos para ADI - PEG 20 para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Una composición terapéutica que comprende una arginina desiminasa (ADI) aislada y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la ADI aislada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8 o 14 o una secuencia de al menos 90 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8 o 14.

Description

DESCRIPCIÓN

Arginina desiminasa con reactividad cruzada reducida hacia anticuerpos para ADI - PEG 20 para el tratamiento del cáncer

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad a tenor de 35 U.S.C. § 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos n.° 61/790.833, presentada el 15 de marzo de 2013.

DECLARACIÓN CON RESPECTO AL LISTADO DE SECUENCIAS

El listado de secuencias asociado con la presente solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es POLA_003_01WO_ST25.txt. El archivo de texto es de aproximadamente 117 KB, fue creado el 11 de marzo de 2014 y se presenta electrónicamente a través de EFS-Web.

Antecedentes

Campo técnico

La presente divulgación se refiere en general a proteínas de arginina desiminasa (ADI), incluyendo proteínas ADI que tienen reactividad cruzada reducida con anticuerpos de ADI-PEG 20. Dichas proteínas ADI son útiles para tratar enfermedades dependientes de arginina o relacionadas con arginina, tales como el cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

La terapia de privación de aminoácidos puede ser un tratamiento eficaz de algunas formas de cáncer. Hasta ahora, existe un ejemplo clínico conocido relevante para este enfoque que utiliza asparaginasa para reducir los niveles en circulación de asparagina e inhibir la síntesis de proteínas. Este tratamiento es particularmente eficaz para la leucemia linfoblástica aguda (Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004). Las células de leucemia linfoblástica aguda requieren el aminoácido asparagina para crecimiento y proliferación. Por el contrario, la mayoría de las células humanas normales son capaces de sintetizar asparagina y no se ven afectadas por el agotamiento de asparagina. Por lo tanto, la disminución de asparagina sérica con asparaginasa puede destruir selectivamente las células cancerosas sin dañar las células normales, los tejidos y al hospedador. Una forma de asparaginasa procedente de E. coli ha sido aprobada para uso humano. Sin embargo, la asparaginasa se encuentra solo en microbios; lo que la hace muy inmunogénica en seres humanos y también tiene una semivida corta en suero después de la inyección (Avramis 2005). Para hacer que la asparaginasa sea un fármaco más eficaz, estos inconvenientes se minimizaron formulando la asparaginasa procedente de E. coli con polietilenglicol (PEG) para reducir la inmunogenicidad de esta enzima y las reacciones alérgicas asociadas. Además, el PEG prolonga en gran medida la semivida en circulación de la asparaginasa, lo que reduce tanto la frecuencia del tratamiento como el coste total de la terapia. La asparaginasa formulada con PEG está aprobada para su uso y se comercializa con el nombre comercial Oncaspar® (Oncaspar® 2011, Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004, Fu 2007, Zeidan 2008).

La arginina es otro aminoácido no esencial para seres humanos y ratones (para revisión, véase Rogers 1994). En seres humanos, se puede sintetizar arginina a partir de citrulina en dos etapas a través de las enzimas del ciclo de Krebs (urea) argininosuccinato sintetasa (ASS, L-citrulina: L-aspartato ligasa [formación de AMP], EC 6.3.4.5) y argininosuccinato liasa (ASL, L-argininosuccinato arginina-liasa, EC 4.3.2.) (Haines 2011, Wu 2009, Morris 2006, Husson 2003, Tapiero 2002, Rogers 1994). ASS cataliza la conversión de citrulina y ácido aspártico en argininosuccinato, que después se convierte en arginina y ácido fumárico por ASL. Una dieta deficiente en arginina en seres humanos no induce hiperamonemia, aciduria orótica, ni alterar la tasa de síntesis de óxido nítrico (NO) en todo el cuerpo en seres humanos adultos (Tapiero 2002, Castillo 1995, Rogers 1994, Carey 1987, Barbul 1986, Snyderman 1959, Rose 1949). Aunque los recién nacidos prematuros parecen necesitar arginina (Wu 2004), los niveles de arginina no se correlacionan con la edad entre los bebés, niños y adultos jóvenes (Lücke 2007). En 1992, Takaku y Sugimura informaron por separado de que las líneas celulares de melanomas humanos y carcinoma hepatocelular (CHC) parecen necesitar arginina para su crecimiento. Otros estudios mostraron que la ADI pegilada fue eficaz para el tratamiento de melanomas y hepatomas con pocos efectos adversos.

El tratamiento con ADI-PEG 20 requiere múltiples dosis durante un periodo de tiempo. Después de varios tratamientos, se pueden desarrollar anticuerpos anti-ADI-PEG 20 que pueden limitar su eficacia continua. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de ADI que haya reducido la reactividad cruzada con anticuerpos anti-ADI-PEG20 para su uso en el tratamiento con el fin de mejorar y extender la eficacia de la terapia de agotamiento de arginina. La presente invención proporciona esta y otras ventajas para el tratamiento de cánceres.

Bibliografía: Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44: 367-393; Barbul A. 1986. J Parenteral Enteral Nutr 10: 227-238; Carey GP, et al. 1987. J Nutr 117: 1734-1739; Castillo L, et al. 1995. Am J Physiol 268 (Endocrinol Metab 31): E360-367; Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8: 1977-1984; Haines RJ, et al. 2011. Int J Biochem Mol Biol 2: 8-23; Husson A, et al. 2003. Eur J Biochem 270: 1887-1899; Lücke T, et al. 2007. Clin Chem Lab Med 45: 1525-1530; Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83 (Supl): 598S-512S; Rogers QR. 1994. en Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Visek - from Ammonia to Cancer and Gene Expression. Publicación especial 86 - abril de 1994, Estación Experimental de Agricultura, Universidad de Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, págs. 9-21; Tapiero H, et al. 2002. Biomed Pharmacother 56: 439-445, 2002; Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125: 117-127; Wu G, et al. 2009. Amino Acids 37: 153-168; Wu G, et al. 2004. J Nutr Biochem 15: 442-451; Zeidan A, et al. 2008. Expert Opin Biol Ther 9: 111-119).

El documento WO 01/83774 A2 analiza una arginina desiminasa que se ha indicado que está genéticamente modificada para fabricación y procesamiento más eficaces, así como métodos para tratar el cáncer y otras patologías usando la arginina desiminasa modificada.

El documento WO 98/51784 A1 analiza la arginina desiminasa modificada con polietilenglicol, métodos de tratamiento del cáncer y métodos de tratamiento y/o inhibición de la metástasis.

El documento US 2009/238813 A1 analiza la obtención por ingeniería genética de una enzima humana con actividad hidrolítica de arginina, que se ha indicado que es adecuada para terapia humana.

Breve sumario

En un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición terapéutica como se indica en la reivindicación 1.

La presente divulgación también proporciona una arginina desiminasa aislada, en donde la arginina desiminasa aislada tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente. También se incluyen composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden una arginina desiminasa aislada o un fragmento de la misma que tiene actividad ADI y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinados ejemplos, la composición es estéril y/o sustancialmente exenta de pirógenos tales como endotoxinas. En un ejemplo, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente no es de M. hominis. En otro ejemplo, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente es de un organismo enumerado en la tabla 1. En determinados ejemplos, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente tiene una o más propiedades similares o mejores que las de ADI-PEG 20. A este respecto, la o las propiedades incluyen, pero sin limitación, Kcat, Km, pH óptimo, estabilidad, estabilidad proteolítica in vivo o ninguna necesidad de iones o cofactores que no están ya presentes en la sangre, o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente, tiene al menos 20 cambios de restos de superficie en comparación con arginina desiminasa de M. hominis. En otro ejemplo, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con los anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente tiene entre 20 y 135 cambios de restos de superficie, entre 40 y 100 cambios de restos de superficie, entre 30 y 60 cambios de restos de superficie, entre 80 y 100 cambios de restos de superficie o entre 100 y 120 cambios de restos de superficie, en comparación con arginina desiminasa de M. hominis.

En otro ejemplo, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente es de M. arginini, M. arthritidis, M. phocicerebrale, M. gateae, M. phocidae, M. columbinum, M. iowae, M. crocodyli, M. alligatoris, H. orenii o M. bovis. La arginina desiminasa ilustrativa que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 2-32.

En otro ejemplo, la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente se ha modificado para eliminar al menos un sitio de pegilación. En otro ejemplo de la arginina desiminasa que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente, al menos un resto de lisina se ha modificado por una sustitución de aminoácidos. A este respecto, en determinados ejemplos, al menos 5 restos de lisina, al menos 10 restos de lisina o al menos 20 restos de lisina se han modificados por una sustitución de aminoácidos.

En otro ejemplo, la arginina desiminasa que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente se une covalentemente a través de un conector a una molécula de PEG. A este respecto, la arginina desiminasa que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente puede unirse covalentemente a una o más moléculas de PEG, tal como a aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o aproximadamente 2 a aproximadamente 8 moléculas de PEG. Las moléculas de PEG pueden ser moléculas de PEG de cadena lineal o cadena ramificada y pueden tener un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000 o un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 30.000. En los ejemplos en los que el PEG está unido covalentemente a la ADIr de la presente divulgación, a través de un conector, el conector puede comprender un grupo succinilo, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un hidrato de carbono, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina, un grupo metileno o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo, la fuente del grupo succinilo es succinato de succinimidilo.

También se desvela un polinucleótido que codifica una arginina desiminasa aislada descrita en el presente documento, vectores que comprenden el polinucleótido y células hospedadoras aisladas que comprenden los vectores.

También se desvela una composición que comprende la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente como se describe en el presente documento y un vehículo fisiológicamente aceptable. En determinados ejemplos, las composiciones pueden comprender además un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, docetaxel, carboplatino, ciclofosfamida, gemcitabina, cisplatino, sorafenib, sunitinib y everolimus.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición terapéutica del primer aspecto, para su uso en un método terapéutico según lo indicado por la reivindicación 13.

La presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente como se describe en el presente documento y un vehículo fisiológicamente aceptable, de este modo tratando, aliviando los síntomas o inhibiendo la progresión del cáncer. En determinados ejemplos, se ha determinado que el paciente que lo necesita tiene anticuerpos anti-ADI-PEG 20. En otro ejemplo, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en carcinoma hepatocelular, melanoma, incluyendo melanoma metastásico, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón microcítico, mesotelioma, leucemia linfocítica, leucemia mielógena crónica, linfoma, hepatoma, sarcoma, leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo y cáncer de estómago.

La presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende ADI-PEG 20 y, después de un periodo de tiempo, administrar al paciente una composición que comprende la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente como se describe en el presente documento y un vehículo fisiológicamente aceptable, de este modo tratando, aliviando los síntomas o inhibiendo la progresión del cáncer. A este respecto, el periodo de tiempo puede determinarse, por ejemplo, detectando un nivel predeterminado de anticuerpos anti-ADI-PEG 20 en el paciente y/o midiendo u observando de otro modo la actividad de ADI en el paciente, en donde la composición que comprende la arginina desiminasa aislada que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente se administra después de la detección del nivel predeterminado de dichos anticuerpos anti-ADI-PEG 20 y/o medición u observación de un nivel predeterminado de actividad de ADI en el paciente.

También se incluyen proteínas aisladas de arginina desiminasa descritas en el presente documento para su uso en la preparación o fabricación de un medicamento para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer.

Las realizaciones preferidas de la invención, en cualquiera de sus diversos aspectos, son como se describe a continuación o como se define en las reivindicaciones subordinadas.

Descripción detallada

Los ejemplos de la presente divulgación se refieren a enzimas ADI seleccionadas, que en algunos ejemplos se modifican por ingeniería genética para tener un pequeño número de restos de lisina de superficie y se conjugan con PEG a través de un conector estable. Las enzimas ADI seleccionadas se eligen entre una gran cantidad de enzimas ADI, de diferentes organismos, en función de sus propiedades beneficiosas. Estas propiedades incluyen la capacidad de la enzima para establecer y mantener bajas concentraciones de arginina en sangre humana a través de conversión por ADI de arginina a citrulina y amoníaco. Además, las moléculas de ADI seleccionadas tienen reactividad cruzada reducida frente a anticuerpos anti-ADI-PEG 20 en comparación con ADI-PEG 20, resultando dichos anticuerpos posiblemente del tratamiento previo de un paciente con ADI-PEG 20.

En determinados ejemplos, las enzimas en esta divulgación están pegiladas para proporcionar protección contra el aclaramiento renal y la proteólisis, así como inmunogenicidad o antigenicidad reducida. Para aumentar la eficacia de la pegilación, pueden introducirse por ingeniería genética modificaciones en las enzimas para reducir el número de restos de lisina de superficie y, por lo tanto, limitar el número de sitios de unión a PEG disponibles. Esto proporciona pegilación más completa y uniforme en los restos de unión a lisina restantes.

El conector de PEG seleccionado para unir metoxi-PEG a ADI se elige para proporcionar un enlace químicamente estable. Se espera que esto aumente la vida bioactiva de la molécula. Un conector químicamente estable también eliminará la hidrólisis y reducirá una respuesta inmunitaria que podría producirse ante un conector despegilado unido a la superficie de la enzima.

Estas especificaciones acumuladas dan lugar a una o más moléculas que eliminan eficazmente arginina de la sangre de un paciente y no se neutralizan o eliminan por anticuerpos anti-ADI-PEG 20 de la terapia de agotamiento de arginina previa. Las moléculas se pegilan para retardar la neutralización y eliminación debido a su propia inmunogenicidad. Estos factores permitirán su uso en lugar de ADI-PEG 20 o además de ADI-PEG 20 (p. ej., como fármaco de seguimiento) para extender la terapia de agotamiento de arginina y, por lo tanto, aumentar la eficacia del tratamiento de agotamiento de arginina como un producto terapéutico antineoplásico.

Las células normales no requieren arginina para crecer, ya que pueden sintetizar arginina a partir de citrulina en un proceso de dos etapas catalizado por ASS y ASL. Por el contrario, determinados cánceres no expresan ASS. Determinados cánceres no expresan ASL, y otros cánceres pueden tener expresión disminuida de o pueden no expresar ASS y/o ASL. Por lo tanto, estos cánceres son auxótrofos para arginina. Esta diferencia metabólica puede aprovecharse para desarrollar una terapia segura y eficaz para tratar estas formas de cáncer. La ADI cataliza la conversión de arginina a citrulina a través de la ruta de arginina dihidrolasa y, por tanto, puede usarse para eliminar arginina.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, p. ej., Current Protocols in Protein Science, Current Protocols in Molecular Biology o Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) y otras referencias similares.

Como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido indique claramente otra cosa.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprenden" o variantes, tales como "comprende" o "comprender", implica la inclusión de un elemento o integrante o grupo de elementos o integrantes citados, pero no la exclusión de ningún otro elemento o integrante o grupo de elementos o integrantes.

Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta en 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

Por "estadísticamente significativo", se entiende que era improbable que el resultado se produjera por casualidad. La significación estadística se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica. Las medidas de significación utilizadas habitualmente incluyen el valor de p, que es la frecuencia o probabilidad con la que se produciría el acontecimiento observado, si la hipótesis nula fuera cierta. Si el valor de p obtenido es menor que el nivel de significación, entonces la hipótesis nula es rechazada. En casos sencillos, el nivel de significación se define en un valor de p de 0,05 o menos.

En la presente memoria descriptiva, cada realización debe aplicarse realizando los cambios necesarios a todas las demás realizaciones, salvo que se indique expresamente otra cosa.

Pueden usarse técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante o como se realiza habitualmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Estas técnicas y procedimientos y otros relacionados pueden realizarse en general según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la terminología utilizada en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son los bien conocidos y habitualmente usados en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para tecnología recombinante, síntesis biológicas moleculares, microbiológicas, químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica y tratamiento de pacientes.

"Paciente" o "sujeto" se refiere a un animal, en determinadas realizaciones, un mamífero y, en una realización específica, un ser humano.

"Biocompatible" se refiere a materiales o compuestos que en general no son perjudiciales para las funciones biológicas y que no darán lugar a ningún grado de toxicidad inaceptable, incluyendo estados alérgenos y patológicos.

La expresión "secuencia de referencia" se refiere en general a una secuencia codificante de ácido nucleico, o secuencia de aminoácidos, con la que se compara otra secuencia. Todas las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas descritas en el presente documento se incluyen como secuencias de referencia, incluyendo las descritas por nombre y las descritas en las tablas y el listado de secuencias.

A lo largo de la presente divulgación, se pueden usar las siguientes abreviaturas: PEG, polietilenglicol; ADI, arginina desiminasa; SS, succinato de succinimidilo; SSA, succinimidil succinimida; SPA, propionato de succinimidilo; NHS, N-hidroxi-succinimida; ASS1 o ASS, argininosuccinato sintetasa; ASL, argininosuccinato liasa.

En la presente divulgación, un polinucleótido que codifica ADI se puede obtener, clonar, aislar, sintetizar o producir a partir de cualquier fuente, incluyendo, por ejemplo, microorganismos, biotecnología recombinante o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, puede clonarse arginina desiminasa de microorganismos de los géneros Mycoplasma, Clostridium, Bacillus, Borrelia, Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus y/o Giardia. En determinados ejemplos, se clona arginina desiminasa a partir de Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arginini, Steptococcus pyogenes, Steptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Giardia intestinalis, Clostridium perfringens, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus sake o cualquier combinación de los mismos. En otros ejemplos, la arginina desiminasa se clona a partir de una especie enumerada en la tabla 1. En particular, la ADI utilizada en la presente divulgación puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-32, o una variante o fragmento o extensión de la misma que tiene actividad ADI (p. ej., capaz de metabolizar arginina en citrulina y amoníaco). Algunas de las secuencias proporcionadas en el listado de secuencias no representan secuencias de proteínas ADI de longitud completa. Por tanto, en determinados ejemplos, se pueden añadir restos de aminoácidos adicionales a uno de los extremos de las secuencias proporcionadas en el presente documento para preparar una proteína de longitud completa que tenga actividad ADI. El experto en la materia puede determinar los aminoácidos específicos para añadir en función de alineamientos de secuencias de ADI conocidas. Dichas moléculas de ADI pueden sintetizarse usando técnicas conocidas. Se proporcionan ADI(r) "extendidas" ilustrativas, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 26-32.

En determinados ejemplos, las enzimas ADI como se describen en el presente documento se comparan con la molécula de referencia ADI-PEG 20 procedente de M. hominis. Como se usa en el presente documento, "ADI-PEG 20" se refiere a la molécula de ADI conocida en la técnica y descrita, por ejemplo, en el documento US6183738; el documento US6635462; Ascierto PA, et al. (2005) Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma: results from phase I and II studies. J Clin Oncol 23 (30): 7660-7668; Izzo F, et al. (2004) Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: results from phase I/II studies. J Clin Oncol 22 (10): 1815-1822; Holtsberg FW, et al. (2002), Poly(ethylene glycol) (PEG) conjugated arginine deiminase: effects of PEG formulations on its pharmacological properties. J Control Release 80 (1-3): 259-271; Kelly et al., (2012) British Journal of Cancer 106, 324 - 332. Como reconocería el experto en la materia, esta molécula es una enzima ADI pegilada (PEG 20.000) procedente de M. hominis y tiene dos sustituciones (K112E; P210S) en relación con la enzima ADI de M. hominis de tipo silvestre.

Las enzimas arginina desiminasa como se describen en el presente documento se cribaron a partir de una gran cantidad de enzimas ADI y tienen un nivel reducido de reactividad con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 de pacientes. Los anticuerpos anti-ADI-PEG 20 pueden aparecer en sujetos tratados con a DI-PEG 20 y pueden medirse usando metodologías conocidas. La reactividad frente a anticuerpos anti-ADI-PEG 20 se puede determinar, por ejemplo, usando ELISA u otros ensayos similares conocidos por el experto en la materia.

A este respecto, se puede utilizar ADI-PEG 20 como una comparación para evaluar el nivel de reactividad cruzada con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente. Un nivel de reactividad cruzada que es de manera estadísticamente significativa menor que el de ADI-PEG 20 con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente puede ser útil en el presente documento. En determinados ejemplos, las enzimas arginina desiminasa como se describe en el presente documento tienen baja o ninguna reactividad cruzada con anticuerpos anti-ADI-PEG 20. En otro ejemplo, cualquier reducción de la reactividad con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 en comparación con la reactividad con ADI-PEG 20 puede ser beneficiosa ya que una enzima ADI de este tipo mejoraría las opciones de tratamiento para pacientes que necesiten terapia de agotamiento de arginina. Por tanto, las enzimas arginina desiminasa como se describe en el presente documento tienen reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente en comparación con la reactividad de ADI-PEG 20 con dichos anticuerpos.

Se usa "ADIr" en el presente documento para hacer referencia a una enzima ADI de la presente divulgación que tiene reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 en comparación con la reactividad de ADI-PEG 20 con dichos anticuerpos. La nomenclatura "ADIr" se usa para distinguir las moléculas identificadas en el presente documento de ADI y ADI-PEG 20 como se conoce en la técnica.

Las enzimas ADIr de la presente divulgación tienen características o propiedades similares o mejores que las de ADI-PEG 20, para reducir y mantener bajos niveles de arginina en sangre para tratamiento eficaz contra el cáncer. Dichas propiedades incluyen Kcat, Km, pH óptimo, estabilidad, estabilidad proteolítica in vivo y falta de necesidad de iones o cofactores que no estén ya presentes en la sangre, o cualquier combinación de los mismos. En determinados ejemplos, una ADIr como se describe en el presente documento tiene propiedades que son aproximadamente o al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayores, que propiedades similares de ADI-PEG 20. En otros ejemplos, una ADIr descrita en el presente documento tiene propiedades que son aproximadamente o al menos aproximadamente 100 %, 105 %, 110 %, 120 %, 140 %, 150 %, 160 %, 180 %, 200 %, 220 %, 240 %, 250 %, 260 %, 280 %, 300 %, 320 %, 340, 350 %, 360 %, 400 %, 420 %, 450 %, 460 %, 500 %, 520 %, 550 % o mayor que la propiedad específica de ADI-PEG 20 que se compara.

Por tanto, en determinados ejemplos, una ADIr tiene una Kcat que es aproximadamente o al menos aproximadamente 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de la Kcat de ADI-PEG 20, o mejor. En determinados ejemplos, una ADIr tiene una Kcat que es aproximadamente o al menos aproximadamente 100 %, 105 %, 110 %, 120 %, 125 %, 140 %, 150 %, 160 %, 180 %, 200 %, 220 %, 240 %, 250 %, 260 %, 280 %, 300 %, 320 %, 340, 350 %, 360 %, 400 %, 420 %, 450 %, 460 %, 500 %, 520 %, 550 % o más, veces la Kcat de ADI-PEG 20. En determinados ejemplos, la Kcat de las enzimas ADIr descritas en el presente documento, o composiciones que las comprenden, es de aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 15 s-1 y, en un ejemplo adicional, es de aproximadamente 1 s-1 a aproximadamente 12 s-1, de aproximadamente 1 s-1 a aproximadamente 10 s-1, de aproximadamente 1,5 s-1 a aproximadamente 9 s-1, de aproximadamente 2 s-1 a aproximadamente 8 s-1 o de aproximadamente 2,5 s-1 a aproximadamente 7 s-1. En determinados ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 2,5 s-1 a aproximadamente 7,5 s-1. En algunos ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 2,5 s-1, aproximadamente 3 s-1, aproximadamente 3,5 s-1, aproximadamente 4 s-1, aproximadamente 4,5 s-1, aproximadamente 5 s-1, aproximadamente 5,5 s-1, aproximadamente 6 s-1, aproximadamente 6,5 s-1 aproximadamente 7 s-1, aproximadamente 7,2 s-1, aproximadamente 7,5 s-1, aproximadamente 8 s-1, aproximadamente 10 s-1, aproximadamente 15 s-1, aproximadamente 20 s-1, aproximadamente 25 s-1, aproximadamente 30 s-1, aproximadamente 35 s-1, aproximadamente 40 s-1, aproximadamente 45 s-1, aproximadamente 50 s-1, aproximadamente 55 s-1, aproximadamente 60 s-1, aproximadamente 65 s-1, aproximadamente 70 s-1, aproximadamente 75 s-1, aproximadamente 80 s-1, aproximadamente 85 s-1, aproximadamente 90 s-1, aproximadamente 95 s-1 o aproximadamente 100 s-1.

Por tanto, en determinados ejemplos, una ADIr tiene una Km que es aproximadamente o al menos aproximadamente 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de la Km de ADI-PEG 20, o mejor. Por tanto, en determinados ejemplos, una ADIr tiene una Km que es aproximadamente o al menos aproximadamente 100 %, 105 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 180 %, 200 %, 220 %, 240 % o 250 % de la Km de ADI-PEG 20. En un ejemplo, una ADIr, o una formulación pegilada de la misma, tiene una Km de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 50 pM, o de aproximadamente 1,6 pM a aproximadamente 48 pM, o de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 15 pM y, en un ejemplo adicional, es de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 12 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 9 pM, de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 8 pM o de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 7 pM. En determinados ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 6,5 pM. En algunos ejemplos, la ADIr o la formulación pegilada de la misma tiene una Km de aproximadamente 1,5 pM, aproximadamente 1,6 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 2,5 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 3,5 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 4,5 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 5,5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 6,5 pM , aproximadamente 7 pM, aproximadamente 8 pM, aproximadamente 9 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 12 pM, aproximadamente 14 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 16 pM, aproximadamente 18 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 22 pM, aproximadamente 24 pM, aproximadamente 25 pM, aproximadamente 26 pM, aproximadamente 28 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 32 pM, aproximadamente 34 pM, aproximadamente 35 pM, aproximadamente 36 pM, aproximadamente 38 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 42 pM, aproximadamente 44 pM, aproximadamente 45 pM, aproximadamente 46 pM, aproximadamente 48 pM o aproximadamente 50 pM.

En determinados ejemplos, una ADIr actúa a un pH cercano al pH fisiológico de la sangre humana. Por tanto, en un ejemplo, una ADIr actúa a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10,8, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. En un ejemplo, una ADIr tiene buena actividad enzimática a aproximadamente pH 7,4.

En determinados ejemplos, una ADIr tiene estabilidad durante almacenamiento a largo plazo y estabilidad frente a temperatura y proteolítica durante el tratamiento en el cuerpo humano. En ejemplos adicionales, una ADIr no necesita iones o cofactores para su actividad que no estén ya presentes en la sangre.

En determinados ejemplos, una ADIr descrita en el presente documento tiene en general una secuencia de aminoácidos suficientemente diferente de M. hominis para que haya cambios de restos de superficie que reduzcan o eliminen sitios antigénicos para anticuerpos anti-ADI-PEG 20. En un ejemplo, no habrá reactividad cruzada entre la molécula de ADIr seleccionada y los anticuerpos anti-ADI-PEG 20 existentes en un sujeto, y se generará una respuesta inmunitaria completamente nueva en un sujeto en lugar de una maduración de la respuesta existente a ADI de M. hominis. Por tanto, en un ejemplo, una ADIr como se describe en el presente documento tiene una identidad de secuencia de 20 % a 85 % para ADI de M. hominis como se expone en la SEQ ID NO: 1. En determinados ejemplos, una ADIr como se describe en el presente documento tiene un porcentaje de identidad de secuencia aún menor con ADI de M. hominis, tal como 10 % o 15 % de identidad. En otro ejemplo, una ADIr como se describe en el presente documento tiene 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 % o incluso 83 % de identidad con ADI de M. hominis y todavía tiene reactividad cruzada reducida hacia anticuerpos anti-ADI-PEG 20.

En un ejemplo, una ADIr como se describe en el presente documento tiene de aproximadamente 25 a 140 cambios de restos de superficie en comparación con ADI de M. hominis. Se pueden identificar restos de superficie a partir de la estructura cristalina de ADI de M. hominis y se pueden determinar restos de superficie para ADI de otros organismos mediante homología de secuencia. Una ADIr como se describe en el presente documento puede tener aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 o aproximadamente 140 cambios de restos de superficie en comparación con ADI de M. hominis (véase SEQ ID NO: 1).

En otro ejemplo, una ADIr como se describe en el presente documento tiene de aproximadamente 25 a 140 cambios de restos en comparación con ADI de M. hominis. No es necesario que dichos cambios de restos sean solo de restos de aminoácidos de superficie. Dichos cambios (o adiciones o supresiones) de restos pueden estar en cualquier extremo de la molécula o en cualquier resto de la ADI, de modo que la ADI modificada tenga la actividad de ADI deseada como se describe en el presente documento. Se pueden identificar restos para cambiar a partir de la estructura cristalina de ADI de M. hominis y se pueden determinar restos para ADI de otros organismos mediante homología de secuencia. Una ADIr como se describe en el presente documento puede tener aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 o aproximadamente 140 cambios de restos de aminoácidos en comparación con ADI de M. hominis (véase SEQ ID NO: 1).

De una gran cantidad de enzimas ADI, la tabla 1 enumera 24 enzimas ADIr con su porcentaje de identidad de secuencia en relación con ADI de M. hominis. Según la bibliografía, las secuencias de aminoácidos de ADI de M. hominis, M. arginini y M. arthritidis están estrechamente relacionadas y estas enzimas tienen buenas propiedades catalíticas. Más recientemente, se han descubierto enzimas ADI adicionales que tienen secuencias estrechamente relacionadas con estas tres. Se han identificado enzimas de ADI de Mycoplasma con relaciones más distantes, aunque se sabe menos acerca de ellas. Y existen enzimas ADI con relaciones aún más distantes de fuentes bacterianas y de otro tipo.

En determinados ejemplos, las enzimas ADIr identificadas en el presente documento a partir de varias especies seleccionadas, tienen restos de lisina de superficie (en determinados ejemplos, hasta 30 o más). Sin embargo, en determinados ejemplos, una enzima ADIr puede tener muchos menos restos de lisina de superficie, tales como solo 2 restos de lisina como en el caso de ADI de Mycobacterium bovis, o incluso no tener restos de lisina (véase, p. ej., ADI de Mycobacterium sp. MCS; n.° de GenBank ABG10381). Por lo tanto, las enzimas ADIr identificadas en el presente documento que tienen reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20, tienen aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 o más restos de lisina superficial.

Los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido" se usan indistintamente y significan un polímero de aminoácidos no limitado a ninguna longitud particular. Los términos no excluyen modificaciones tales como miristoilación, sulfatación, glucosilación, fosforilación y adición o supresión de secuencias señal. Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una o más cadenas de aminoácidos, en donde cada cadena comprende aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos y en donde dicho polipéptido o proteína puede comprender múltiples cadenas unidas de manera no covalente y/o de manera covalente mediante enlaces peptídicos, que tienen la secuencia de proteínas nativas, es decir, proteínas producidas por células de origen natural y específicamente no recombinantes o células modificadas por ingeniería genética o recombinantes, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen supresiones de, adiciones a y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan específicamente las proteínas ADIr de la presente divulgación o secuencias que tienen supresiones de, adiciones a y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de las proteínas ADIr. En determinados ejemplos, el polipéptido es un polipéptido "recombinante", producido por una célula recombinante que comprende una o más moléculas de ADN recombinante, que normalmente están formadas por secuencias polinucleotídicas heterólogas o combinaciones de secuencias polinucleotídicas que de otro modo no se encontrarían en la célula.

La expresión "proteína aislada" a la que se hace referencia en el presente documento significa que una proteína objeto (1) está exenta de al menos algunas otras proteínas con las que se encontraría normalmente en la naturaleza, (2) está esencialmente exenta de otras proteínas de la misma fuente, p. ej., de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono y otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) no está asociada (por interacción covalente o no covalente) con partes de una proteína con la que la "proteína aislada" está asociada en la naturaleza, (6) está asociada operativamente (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza o (7) no aparece en la naturaleza. Dicha proteína aislada puede estar codificada por ADN genómico, ADNc, ARNm u otro a Rn , puede ser de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. En determinados ejemplos, la proteína aislada está sustancialmente exenta de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación u otros).

El término "variante" incluye un polipéptido que difiere de un polipéptido de referencia desvelado de manera específica en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO: 1-32) en una o más sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones. Los polipéptidos variantes son biológicamente activos, es decir, continúan poseyendo la actividad enzimática o de unión de un polipéptido de referencia. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, el polimorfismo genético y/o de la manipulación humana.

En muchos casos, una variante biológicamente activa contendrá una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la materia de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambien sustancialmente. Como se ha descrito anteriormente, se pueden realizar modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente divulgación y aún obtener una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables.

Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden realizar determinadas sustituciones de secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica, y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que se pueden realizar diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones desveladas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos, sin pérdida apreciable de su utilidad.

Al realizar dichos cambios, puede tenerse en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. Se entiende en general en la técnica la importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobia y de carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o una puntuación hidropática similar y aún dar lugar a una proteína con actividad biológica similar, es decir, obtener aún una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén en un intervalo de ±2, se prefieren en particular los que estén en un intervalo de ±1 y se prefieren más en particular los que estén en un intervalo de ±0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente basándose en la hidrofilia. La patente de los Estados Unidos n.° 4.554.101, indica que la mayor hidrofilia promedio local de una proteína, regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de los Estados Unidos n.° 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (­ 0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y obtener aún una proteína biológicamente equivalente y, en particular, una inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia estén en un intervalo de ±2, se prefieren en particular los que estén en un intervalo de ±1 y se prefieren más en particular los que estén en un intervalo de ±0,5.

Como se ha destacado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan, por lo tanto, en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Los expertos en la materia conocen bien sustituciones ilustrativas que toman en consideración varias de las características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos basándose en la similitud de la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos de grupos de cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Una variante puede también, o como alternativa, contener cambios no conservadores. En un ejemplo preferido, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia nativa por sustitución, supresión o adición de menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 aminoácidos o incluso 1 aminoácido. Las variantes pueden también (o como alternativa) modificarse mediante, por ejemplo, la supresión o adición de aminoácidos que tienen influencia mínima sobre la inmunogenicidad, estructura secundaria, actividad enzimática y/o naturaleza hidropática del polipéptido.

En general, las variantes presentarán aproximadamente o al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de similitud o identidad de secuencia u homología de secuencia con una secuencia polipeptídica de referencia (p. ej., SEQ ID NO: 1-32). Por otra parte, se contemplan secuencias que difieren de las secuencias nativas u originales por la adición (p. ej., adición C-terminal, adición N-terminal, ambas), supresión, truncamiento, inserción o sustitución de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos pero que conservan las propiedades o actividades de una secuencia polipeptídica original o de referencia.

En algunos ejemplos, los polipéptidos variantes difieren de la secuencia de referencia en al menos uno pero en menos de 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 restos de aminoácidos. En otros ejemplos, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia de referencia en aproximadamente o al menos 0,5 % o 1 % pero menos de 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los restos. (Si esta comparación requiere alineación, las secuencias deben alinearse para máxima similitud. Las secuencias "en bucle" por eliminaciones o inserciones, o emparejamientos erróneos, se consideran diferencias).

La expresión "fragmento polipeptídico" se refiere a un polipéptido que tiene una supresión aminoterminal, una supresión carboxiterminal y/o una supresión o sustitución interna de un polipéptido de origen natural o producido de manera recombinante. En determinados ejemplos, un fragmento polipeptídico puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 400 aminoácidos de longitud. Se apreciará que, en determinados ejemplos, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos de longitud. Los fragmentos polipeptídicos particularmente útiles incluyen dominios funcionales, incluyendo los dominios ADI catalíticos de la ADIr descrita en el presente documento. En el caso de una ADIr, los fragmentos útiles incluyen, pero sin limitación, el dominio catalítico y el dominio a-helicoidal.

Muchos PEG activados utilizados para conjugación con ADI se unen covalentemente a restos de lisina. Habitualmente, hay muchas menos moléculas de PEG unidas a ADI que restos de lisina. Tanto el número como la distribución de las uniones pueden ser heterogéneos entre moléculas. Cualquier resto de lisina particular se modificará solo en una pequeña fracción de las moléculas de ADI. Esta heterogeneidad de modificación de sitio y baja ocupación de PEG puede dar lugar a problemas tanto con la caracterización del fármaco como con la eficacia del blindaje de PEG en sitios antigénicos. Por lo tanto, en determinados ejemplos, las enzimas ADIr seleccionadas, como se describen en el presente documento, se modifican mediante reemplazo de lisina con otros tipos de restos para reducir la cantidad de restos de lisina. Esto produce una proteína pegilada de manera más uniforme y aumenta la ocupación de PEG en los restos de lisina restantes. Los restos de lisina específicos que se han elegido cambiar a otros restos se seleccionarán para conservar la actividad enzimática. Se espera que esta pegilación más uniforme proporcione mayor protección contra la proteólisis en sangre y mayor blindaje de sitios antigénicos frente a anticuerpos del paciente.

En determinados ejemplos, la ADIr de la presente divulgación puede modificarse como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.635.462. En particular, las modificaciones de uno o más de los restos de aminoácidos de origen natural de una ADIr pueden proporcionar una enzima que se renaturaliza y formula más fácilmente, mejorando de este modo la fabricación de ADIr y composiciones terapéuticas que la comprendan. En un ejemplo, la ADIr de la presente divulgación se modifica para eliminar uno o más restos de lisina (p. ej., la lisina puede sustituirse con otro aminoácido o análogos del mismo, o un aminoácido no natural). En particular, en un ejemplo, la ADIr se modifica para que esté exenta de lisina en una posición equivalente a 112, 374, 405 o 408 de la SEQ ID NO: 1 (ADI de M. hominis) o una combinación de una o más de estas posiciones. En un ejemplo adicional, la ADIr se modifica para que esté exenta de una o más lisinas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más restos de lisina, si estuvieran presentes, pueden sustituirse con otro aminoácido o análogos del mismo, o un aminoácido no natural. En un ejemplo, una ADIr tiene 5 lisinas sustituidas, por ejemplo, en una posición equivalente a la posición 7, 88, 137, 209 y 380 de la SEQ ID NO: 1. En otro ejemplo, una ADIr tiene 10 lisinas sustituidas, por ejemplo, en posiciones equivalentes a las posiciones 7, 9, 59, 88, 115, 116, 137, 178, 209 y 380 de la SEQ ID NO: 1. En otro ejemplo más, una ADIr tiene 15 lisinas sustituidas, por ejemplo, en posiciones equivalentes a las posiciones 7, 9, 59, 66, 88, 91, 93, 115, 116, 137, 141, 178, 209, 279 y en la posición 380 de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una ADIr comprende 21 lisinas sustituidas, por ejemplo, en posiciones equivalentes a las posiciones 7, 9, 56, 59, 66, 88, 91, 93, 96, 115, 116, 137, 141, 178, 209, 254, 279, 325, 326, 380 y 406 de la SEQ ID NO: 1.

Se puede encontrar una ADIr nativa en microorganismos y esta es inmunogénica y se elimina rápidamente de la circulación en un paciente. Estos problemas pueden superarse modificando una ADIr. Por tanto, la presente divulgación proporciona ADIr modificada por un agente modificador, incluyendo, pero sin limitación, polímeros de macromoléculas, proteínas, péptidos, polisacáridos u otros compuestos. La arginina desiminasa como se describe en el presente documento y el agente modificador pueden unirse mediante enlaces covalentes o interacción no covalente para formar un conjugado estable o una composición estable para lograr un efecto deseado. En determinados ejemplos, la ADIr modificada conserva la actividad biológica de una ADIr sin modificar y tiene una semivida más larga in vivo y menor antigenicidad que la ADIr sin modificar. En determinados ejemplos, la ADIr modificada conserva al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de la actividad biológica de ADIr sin modificar. En general, la ADIr modificada conserva suficiente actividad biológica para uso terapéutico.

En un ejemplo, un agente modificador puede ser un polímero o una proteína o un fragmento de los mismos que es biocompatible y puede aumentar la semivida de ADIr en la sangre. El agente modificador puede acoplarse químicamente a ADIr o, cuando corresponda, unirse a ADIr a través de expresión de proteína de fusión.

Los polímeros de macromoléculas pueden incluir un polímero de macromoléculas no peptídicas, que en determinados ejemplos, puede tener su propia bioactividad. Los polímeros adecuados incluyen, pero sin limitación, compuestos de polienol, compuestos de poliéter, polivinilpirrolidona, poliaminoácidos, copolímero de éter divinílico y anhídrido maleico, N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, polisacárido, poliol polioxietilado, heparina o su fragmento, poli-alquil-etilenglicol y sus derivados, copolímeros de poli-alquil-etilenglicol y sus derivados, poli(éter viniletílico), a,P-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida], policarboxilatos, polioxietilen-oximetilenos, poliacriloil morfolinas, copolímero de compuestos amino y oxiolefina, ácido polihialurónico, polioxiranos, copolímero de ácido etanodioico y ácido malónico, poli(1,3-dioxolano), copolímero de etileno e hidracida maleica, ácido polisiálico, ciclodextrina, etc. En determinados ejemplos, el polímero es polietilenglicol.

Los compuestos de polienol como se usan en el presente documento incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (incluyendo monometoxi polietilenglicol, monohidroxil polietilenglicol), alcohol polivinílico, alcohol polialílico, polibutenol y similares, y sus derivados, tales como lípidos.

Los compuestos de poliéter incluyen, pero sin limitación, polialquilenglicol (HO((CH2)xO)nH), polipropilenglicol, polioxirehileno (HO((CH2)2O)nH), alcohol polivinílico ((CH2CHOH)n).

Los poliaminoácidos incluyen, pero sin limitación, polímeros de un tipo de aminoácido o copolímeros de dos o más tipos de aminoácidos, por ejemplo, polialanina o polilisina, o copolímeros de bloque de los mismos.

Los polisacáridos incluyen, pero sin limitación, glucosano y sus derivados, por ejemplo, sulfato de dextrano, celulosa y sus derivados (incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa), almidón y sus derivados, polisacarosa, etc.

En un ejemplo específico, ADIr se modifica mediante acoplamiento con proteínas o péptidos, en donde una o más proteínas o péptidos están directa o indirectamente unidos a ADIr. Las proteínas pueden ser proteínas existentes en la naturaleza o sus fragmentos, incluyendo, pero sin limitación, proteínas séricas humanas existentes en la naturaleza o sus fragmentos, tales como proteína de unión a tiroxina, transtiretina, a1-glucoproteína ácida, transferrina, fibrinógeno, inmunoglobulina, regiones Fc de Ig, albúmina y fragmentos de los mismos. Por "fragmento" se entiende cualquier parte de una proteína que es más pequeña que la proteína completa pero que conserva la función deseada de la proteína. La ADIr como se describe en el presente documento puede estar unida directa o indirectamente a una proteína a través de un enlace covalente. La unión directa significa que un aminoácido de ADIr está unido directamente con un aminoácido de la proteína modificadora, a través de un enlace peptídico o un enlace disulfuro. La unión indirecta se refiere a los enlaces entre una ADIr y una proteína modificadora, a través de grupos químicos originalmente existentes entre ellas o grupos químicos específicos añadidos por medios biológicos o químicos, o la combinación de los enlaces mencionados anteriormente.

En un ejemplo en particular, la ADIr se modifica mediante unión covalente con PEG. La ADIr modificada de manera covalente con PEG (con o sin un conector) puede denominarse en lo sucesivo en el presente documento "ADIr-PEG". Cuando se compara con ADIr sin modificar, ADIr-PEG conserva la mayor parte de su actividad enzimática, es mucho menos inmunogénica o antigénica, tiene una semivida en circulación muy extendida y es mucho más eficaz en el tratamiento de tumores.

"Polietilenglicol" o "PEG" se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena ramificada o lineal, representados por la fórmula general H(OCH2CH2)nOH, en donde n es al menos 4. "PoNetilenglicol" o "PEG" se usa en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular promedio en peso aproximado del mismo. Por ejemplo, PEG5.000 se refiere a PEG que tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 5.000; PEG12.000 se refiere a PEG que tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 12.000; y PEG20.000 se refiere a PEG que tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 20.000.

En un ejemplo, el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 50.000; en un ejemplo de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 40.000 y en otro ejemplo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 30.000; en determinados ejemplos de aproximadamente 8.000 a aproximadamente 30.000; en otros ejemplos de aproximadamente 11.000 a aproximadamente 30.000; en ejemplos adicionales, de aproximadamente 12.000 a aproximadamente 28.000; en otros ejemplos más, de aproximadamente 16.000 a aproximadamente 24.000; y en otros ejemplos, de aproximadamente 18.000 a aproximadamente 22.000; en otro ejemplo, de 19.000 a aproximadamente 21.000 y en un ejemplo, el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 20.000. En general, el PEG con un peso molecular de 30.000 o más es difícil de disolver y los rendimientos del producto formulado pueden reducirse. El PEG puede ser una cadena ramificada o lineal. En general, el aumento del peso molecular del PEG disminuye la inmunogenicidad de la ADIr. El PEG que tiene un peso molecular descrito en este ejemplo puede usarse junto con ADIr y, opcionalmente, un conector biocompatible, para tratar el cáncer, incluyendo, por ejemplo, leucemia mieloide aguda, tal como leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo, cáncer de estómago y cáncer de esófago.

En otro ejemplo, el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 50.000; en determinados ejemplos de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 30.000; en otros ejemplos de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 20.000; en un ejemplo de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 12.000; en otros ejemplos de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 10.000; en ejemplos adicionales de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 8.000; más ejemplos adicionales de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 6.000; y aproximadamente 5.000 en otro ejemplo. El PEG puede ser una cadena lineal o ramificada y en determinados ejemplos es una cadena lineal. El PEG que tiene un peso molecular descrito en este ejemplo puede usarse junto con ADIr y, opcionalmente, un conector biocompatible, para tratar la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) o cáncer.

Aunque ADIr-PEG es la ADIr modificada ilustrativa descrita en el presente documento, como reconocería el experto en la materia, ADIr puede modificarse con otros polímeros o moléculas adecuadas para el efecto deseado, en particular reducir la antigenicidad y aumentar la semivida en suero.

ADIr puede unirse covalentemente a un agente modificador, tal como PEG, con o sin un conector, aunque un ejemplo preferido utiliza un conector.

El conector utilizado para unir covalentemente ADIr a un agente modificador, p. ej., PEG, puede ser cualquier conector biocompatible. Como se ha analizado anteriormente, "biocompatible" indica que el compuesto o grupo no es tóxico y puede utilizarse in vitro o in vivo sin provocar lesiones, malestar, enfermedad o muerte. Un agente modificador, tal como PEG, puede estar unido al conector, por ejemplo, a través de un enlace de éter, un enlace de tiol o un enlace de amida. El grupo conector incluye, por ejemplo, un grupo succinilo, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un hidrato de carbono, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina, un grupo metileno y combinaciones de los mismos. En un ejemplo, la fuente del conector biocompatible es succinato de succinimidilo (SS). Otras fuentes adecuadas de conector pueden incluir un grupo oxicarbonilimidazol (incluyendo, por ejemplo, carbonilimidazol (CDI)), un grupo nitrofenilo (incluyendo, por ejemplo, carbonato de nitrofenilo (NCP) o carbonato de triclorofenilo (TCP)), un grupo trisilato, un grupo aldehído, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona o una amina primaria. En otro ejemplo, el conector se obtiene de SS, SPA, SCM o NHS; en determinados ejemplos, se utilizan SS, SPA o NHS y, en otros ejemplos, se utilizan SS o SPA. Por tanto, en determinados ejemplos, pueden formarse conectores potenciales a partir de metoxi-PEG succinimidil succinato (SS), metoxi-PEG succinimidil glutarato (SG), metoxi-PEG succinimidil carbonato (SC), metoxi-PEG succinimidil carboximetil éster (SCM), metoxi-PEG2 N-hidroxi succinimida (NHS), metoxi-PEG succinimidil butanoato (SBA), metoxi-PEG succinimidil propionato (SPA), metoxi-PEG succinimidil glutaramida y metoxi-PEG succinimidil succinamida.

Como alternativa, ADIr puede acoplarse directamente a un agente modificador, tal como PEG (es decir, sin un conector) a través de un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo.

ADIr puede unirse covalentemente a PEG, a través de un conector biocompatible, usando métodos conocidos en la técnica, como se ha descrito, por ejemplo, en Park et al., Anticancer Res., 1: 373-376 (1981); y Zaplipsky y Lee, ^{Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, ed., Plenum Press,} Ny, ^Capítulo 21 (1992).

La unión de PEG a ADIr aumenta la semivida en circulación de ADIr. En general, el PEG se une a una amina primaria de ADIr. La selección del sitio de unión de PEG u otro agente modificador, en la ADIr está determinada por la función de cada uno de los sitios dentro del dominio activo de la proteína, como conocería un experto en la materia. El PEG puede unirse a las aminas primarias de ADIr sin pérdida sustancial de actividad enzimática. Por ejemplo, los restos de lisina presentes en ADIr son todos posibles puntos en los que la ADIr como se describe en el presente documento se puede unir a PEG a través de un conector biocompatible, tal como SS, SPA, SCM, SSA y/o NHS. PEG también puede unirse a otros sitios en ADIr, como resultaría evidente para un experto en la materia a la vista de la presente divulgación.

De 1 a aproximadamente 30 moléculas de PEG pueden unirse covalentemente a ADIr. En determinados ejemplos, la ADIr se modifica con una molécula de PEG. En otros ejemplos, la ADIr se modifica con más de una molécula de PEG. En un ejemplo, la ADIr se modifica con aproximadamente 1 a aproximadamente 10 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 moléculas de PEG, y en un ejemplo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 o aproximadamente 9 a aproximadamente 12 moléculas de PEG. En otro ejemplo, la ADIr se modifica con 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 moléculas de PEG. En un ejemplo específico, la ADIr se modifica con 4,5 - 5,5 moléculas de PEG por cada ADIr. En otro ejemplo, la ADIr se modifica con 5 ± 1,5 moléculas de PEG.

En otro ejemplo, aproximadamente 15 % a aproximadamente 70 % de los grupos amino primarios en ADIr se modifican con PEG, en un ejemplo aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 % o en determinado ejemplo aproximadamente 30 % a aproximadamente 55 % o 45 % a aproximadamente 50 %, y en otro ejemplo aproximadamente 50 % de los grupos amino primarios en arginina desiminasa se modifican con PEG. Cuando el PEG está unido covalentemente al extremo terminal de ADIr, puede ser deseable tener solo 1 molécula de PEG utilizada. Aumentar el número de unidades de PEG en ADIr aumenta la semivida en circulación de la enzima. Sin embargo, aumentar el número de unidades de PEG en ADIr disminuye la actividad específica de la enzima. Por tanto, es necesario lograr un equilibrio entre los dos, como resultaría evidente para un experto en la materia a la vista de la presente divulgación.

En la presente divulgación, una característica común de los conectores biocompatibles es que se unen a una amina primaria de arginina desiminasa a través de un grupo succinimida. Una vez acoplado con ADIr, SS-PEG tiene un enlace éster al lado del PEG, que puede hacer que este sitio sea sensible a la esterasa sérica, que puede liberar PEG de ADIr en el cuerpo. SPA-PEg y PEG2-NHS no tienen un enlace éster, por lo que no son sensibles a la esterasa sérica.

En determinados ejemplos, se utiliza un conector biocompatible. El PEG que se une a la proteína puede ser una cadena lineal, como con SS-PEG, SPA-PEG y SC-PEG, o se puede usar una cadena ramificada de PEG, como con PEG2-NHS.

En determinados ejemplos, se modifican sitios de pegilación asociados con ADIr ubicados en o adyacentes a la región catalítica de la enzima. A efectos de la presente divulgación, la expresión "sitio de pegilación" puede definirse como cualquier sitio o posición de ADI o una ADIr que puede modificarse covalentemente con polietilenglicol. Un "sitio de pegilación" se puede considerar ubicado en o adyacente a la región catalítica de la enzima donde la pegilación del sitio da lugar a una reducción significativa de la actividad catalítica de la enzima. La pegilación de dichos sitios ha dado lugar tradicionalmente a la inactivación de la enzima. Por ejemplo, la ADI de Mycoplasma hominis tiene una lisina en la posición 112 que puede considerarse que está en o adyacente a la región catalítica de la enzima. La unión de PEG a esta lisina en la posición 112 puede inactivar la enzima. Además, la ADI de Mycoplasma hominis tiene una cisteína en la posición 397 que puede considerarse que está en o adyacente a la región catalítica de la enzima. Las sustituciones de aminoácidos para cisteína en la posición 397 pueden inactivar la enzima. En particular, la sustitución con alanina, histidina, arginina, serina, lisina o tirosina de cisteína en la posición 397 puede dar lugar a una pérdida de toda la actividad enzimática detectable. La ADI de Mycoplasma hominis también tiene tres lisinas ubicadas cerca de esta cisteína conservada, en particular, Lys374, Lys405 y Lys408. La unión de PEG a Lys374, Lys405, Lys408 o combinaciones de las mismas puede inactivar la enzima.

Debe entenderse que ADIr procedente de otros organismos también puede tener sitios de pegilación correspondientes a la posición 112 de ADI de Mycoplasma hominis. Además, la ADI de algunos organismos puede tener lisinas correspondientes a la misma ubicación general que la posición 112 de la ADI de Mycoplasma hominis. La ubicación de lisina en la ADI de dichos organismos es conocida por la persona experta y se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.635.462.

Por tanto, la presente divulgación proporciona determinadas sustituciones de aminoácidos en la cadena polipeptídica de ADIr. Estas sustituciones de aminoácidos proporcionan ADIr modificada que pierde menos actividad cuando es modificada por un agente modificador, p. ej., tras la pegilación. Al eliminar sitios de pegilación, u otros sitios de modificación conocidos, en o adyacentes a la región catalítica de la enzima, se puede lograr modificación óptima, p. ej., pegilación, sin pérdida de actividad.

Debe entenderse que otros ejemplos de la presente divulgación se basan en el entendimiento de que determinadas características estructurales de arginina desiminasa pueden prevenir o interferir con la renaturalización adecuada y rápida cuando se produce mediante tecnología recombinante. En particular, estas características estructurales obstaculizan o impiden que la enzima asuma una conformación activa durante la producción recombinante. A efectos de la presente divulgación, la expresión "conformación activa" puede definirse como una estructura tridimensional que posibilita la actividad enzimática por arginina desiminasa sin modificar o modificada. La conformación activa puede, en particular, ser necesaria para catalizar la conversión de arginina en citrulina. La expresión "característica estructural" puede definirse como cualquier rasgo, cualidad o propiedad de la cadena polipeptídica resultante de un aminoácido o combinación de aminoácidos en particular. Por ejemplo, la arginina desiminasa puede contener un aminoácido que da lugar a un doblez o pliegue en la cadena peptídica normal y, por tanto, obstaculiza que la enzima asuma una conformación activa durante la renaturalización de la enzima. En particular, la arginina desiminasa de Mycoplasma hominis tiene una prolina en la posición 210 que puede dar lugar a un doblez o pliegue en la cadena peptídica, haciendo más difícil renaturalizar la enzima durante la producción recombinante. Debe entenderse que la arginina desiminasa procedente de otros organismos también puede tener sitios correspondientes a la posición 210 de la arginina desiminasa de Mycoplasma hominis.

La presente divulgación proporciona de nuevo, por tanto, determinadas sustituciones de aminoácidos en la cadena polipeptídica de arginina desiminasas de tipo silvestre. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden eliminar las características estructurales problemáticas en la cadena peptídica de la arginina desiminasa. Dichas sustituciones de aminoácidos proporcionan mejor renaturalización de la arginina desiminasa modificada. Estas sustituciones de aminoácidos hacen posible la renaturalización rápida de arginina desiminasas modificadas utilizando cantidades reducidas de tampón. Estas sustituciones de aminoácidos también pueden proporcionar mayores rendimientos de arginina desiminasa modificada renaturalizada. En un ejemplo, la arginina desiminasa modificada tiene una sustitución de aminoácidos en P210 o el resto equivalente. Como se ha mencionado anteriormente, la arginina desiminasa procedente de Mycoplasma hominis tiene el aminoácido prolina ubicado en la posición 210. Actualmente se cree que la presencia del aminoácido prolina en la posición 210 da lugar a un doblez o pliegue en la cadena polipeptídica normal que aumenta la dificultad de renaturalizar (es decir, replegar) la arginina desiminasa. Las sustituciones de prolina en la posición 210 hacen posible la renaturalización rápida de arginina desiminasa modificada utilizando cantidades reducidas de tampón. Las sustituciones de prolina en la posición 210 también pueden proporcionar mayores rendimientos de arginina desiminasa modificada renaturalizada. En un ejemplo, la prolina en la posición 210 se sustituye con serina. Debe entenderse que de acuerdo con este aspecto de la divulgación, se pueden realizar otras sustituciones en la posición 210. Los ejemplos de otras sustituciones incluyen Pro210 a Thr210, Pro210 a Arg210, Pro210 a Asn210, Pro210 a Gln210 o Pro210 a Met210. Al eliminar esas características estructurales asociadas con el aminoácido de la posición 210 de la arginina desiminasa de tipo silvestre, se puede lograr el replegamiento adecuado de la enzima.

Los métodos de la presente divulgación pueden implicar in vitro o in vivo aplicaciones. En el caso de aplicaciones in vitro, incluyendo aplicaciones de cultivo celular, los compuestos descritos en el presente documento pueden añadirse a las células en cultivos y después incubarse. Los compuestos de la presente divulgación también se pueden usar para facilitar la producción de anticuerpos monoclonales y/o policlonales, usando técnicas de producción de anticuerpos bien conocidas en este campo. Los anticuerpos monoclonales y/o policlonales se pueden usar después en una amplia variedad de aplicaciones de diagnóstico, como resultaría evidente para un experto en la materia.

Los medios de administración in vivo de los compuestos de la presente divulgación variarán dependiendo de la aplicación prevista. La administración de las composiciones de ADIr descritas en el presente documento, en forma pura o en una composición farmacéutica adecuada, puede realizarse mediante cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes que sirven para utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar combinando ADIr, p. ej., ADIr-PEG, ADIr-PEG 20, con un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable adecuado, y pueden formularse en preparaciones en formas sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Además, otros principios farmacéuticamente activos (incluyendo otros agentes antineoplásicos como se describen en otra parte del presente documento) y/o excipientes adecuados tales como sales, tampones y estabilizadores pueden estar presentes, pero no necesariamente lo están, dentro de la composición. La administración puede realizarse mediante diversas vías diferentes, incluyendo la oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica. Los modos de administración dependen de la naturaleza de la afección que se va a tratar o prevenir. Por tanto, ADIr-PEG, p. ej., ADIr-PEG 20, puede administrarse por vía oral, por vía intranasal, por vía intraperitoneal, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intralinfática, por vía intratumoral, por vía intramuscular, por vía intersticial, por vía intraarterial, por vía subcutánea, por vía intraocular, intrasinovial, transepitelial y por vía transdérmica. Una cantidad que, después de la administración, reduzca, inhiba, prevenga o retrase la progresión y/o metástasis de un cáncer se considera eficaz. En determinado ejemplo, las composiciones de ADIr en el presente documento aumentan la mediana del tiempo de supervivencia de los pacientes en una cantidad estadísticamente significativa. En un ejemplo, los tratamientos con ADIr descritos en el presente documento aumentan la mediana del tiempo de supervivencia de un paciente en 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 40 semanas o más. En determinados ejemplos, los tratamientos con ADIr aumentan la mediana del tiempo supervivencia de un paciente en 1 año, 2 años, 3 años o más. En un ejemplo, los tratamientos con ADIr descritos en el presente documento aumentan la supervivencia sin progresión en 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas o más. En determinados ejemplos, los tratamientos con ADIr descritos en el presente documento aumentan la supervivencia sin progresión en 1 año, 2 años, 3 años o más.

En determinados ejemplos, la cantidad administrada es suficiente para dar lugar a regresión tumoral, según lo indicado por una disminución estadísticamente significativa de la cantidad de tumor viable, por ejemplo, al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más de disminución de la masa tumoral, o por alteración (p. ej., disminución con significación estadística) de las dimensiones de exploración. En determinados ejemplos, la cantidad administrada es suficiente para dar lugar a enfermedad estable. En otros ejemplos, la cantidad administrada es suficiente para dar lugar a reducción clínicamente relevante de los síntomas de una indicación de enfermedad en particular conocida por el médico experto.

En determinados ejemplos, la cantidad administrada es suficiente para inhibir la síntesis de NO, inhibir la angiogénesis y/o es suficiente para inducir apoptosis en células tumorales o cualquier combinación de las mismas. La síntesis de NO, la angiogénesis y la apoptosis pueden medirse utilizando métodos conocidos en la técnica, véase, p. ej., Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (2009 y actualizaciones de la misma); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; y otras referencias similares. En un ejemplo en particular, la cantidad administrada inhibe la síntesis de NO e inhibe el crecimiento de melanoma y complementa, se añade a o actúa de forma sinérgica con otras quimioterapias como se describe en el presente documento, tales como cisplatino. Por consiguiente, un ejemplo de la presente divulgación proporciona un método para tratar el melanoma mediante la administración de ADIr-PEG 20 en combinación con cisplatino, en donde el tratamiento agota el óxido nítrico (NO) endógeno.

La dosificación y duración precisas del tratamiento está en función de la enfermedad que se trate y puede determinarse empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o probando las composiciones en sistemas modelo conocidos en la técnica y extrapolando a partir de ellos. También se pueden realizar ensayos clínicos controlados. Las dosis también pueden variar según la gravedad de la afección que se va a aliviar. Una composición farmacéutica generalmente se formula y administra para ejercer un efecto terapéuticamente útil mientras se minimizan los efectos secundarios indeseables. La composición puede administrarse de una vez o puede dividirse en varias dosis menores para administrar en intervalos de tiempo. Para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual.

Las composiciones de ADIr pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos contra el cáncer conocidos, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también se pueden administrar en combinación con antibióticos.

Las composiciones de ADIr también se pueden administrar solas o en combinación con terapia de ADI-PEG 20. En determinados ejemplos, la ADIr como se describe en el presente documento se usa en pacientes que han sido tratados con ADI-PEG 20 y que han desarrollado anticuerpos anti-ADI-PEG 20. Dichos pacientes ya no se benefician del tratamiento con ADI-PEG 20 ya que la enzima es neutralizada por los anticuerpos. Por tanto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende ADI-PEG 20 y, después de un periodo de tiempo, administrar al paciente una composición que comprende una ADIr como se describe en el presente documento, de este modo tratando, aliviando los síntomas o inhibiendo la progresión del cáncer.

En un ejemplo del método, el periodo de tiempo se determina detectando un nivel predeterminado de anticuerpos anti-ADI-PEG 20 en el paciente, en donde la composición que comprende una ADIr se administra después de la detección del nivel predeterminado de dichos anticuerpos anti-ADI-PEG 20. En determinados ejemplos, se pueden establecer un nivel o niveles umbral o niveles predeterminados de anticuerpos anti-ADI-PEG 20 en pacientes que se van a tratar con ADI-PEG 20 y la ADIr de la presente divulgación. Un "nivel umbral predeterminado" (también denominado "nivel predeterminado" o "valor de corte predeterminado"), o en ocasiones denominado punto de corte predeterminado, de anticuerpos anti-ADI-PEG 20 puede establecerse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando curvas de características operativas del receptor o curvas "ROC". En un ejemplo, incluso niveles muy bajos de anticuerpos anti-ADI-PEG 20 se consideran suficientes para garantizar el cambio de tratamiento de ADI-PEG 20 a una ADIr-PEG de la presente divulgación. En determinados ejemplos, un médico experto puede determinar un nivel adecuado de anti-ADI-PEG 20 que determinará cuándo finalizar el tratamiento con ADI-PEG 20 y comenzar el tratamiento con una ADIr-PEG de la presente divulgación.

En algunos ejemplos, el periodo de tiempo se determina detectando u observando de otro modo la actividad de ADI en el paciente, en donde la composición se administra después de la detección u observación de un nivel predeterminado de actividad de ADI. En ejemplos particulares, la composición se administra después de la detección u observación de un nivel reducido de actividad de ADI en el paciente. La actividad de ADI se puede medir directamente, por ejemplo, ensayando una muestra biológica para determinar al menos un indicador de actividad de ADI, o indirectamente, por ejemplo, observando el efecto deseado o previsto del tratamiento con ADI-PEG 20. En determinados ejemplos, el médico experto puede determinar un nivel adecuado de ADI actividad que determinará cuándo finalizar el tratamiento con ADI- PEG 20 y comenzar el tratamiento con una ADIr-PEG de la presente divulgación.

Las vías típicas para administrar estas y otras composiciones farmacéuticas relacionadas incluyen, por tanto, sin limitación, oral, tópica, transdérmica, inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión.

Las composiciones farmacéuticas según determinados ejemplos se formulan de modo que permitan que los principios activos contenidos en las mismas estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificación individual y un recipiente de una composición de ADIr descrita en el presente documento en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. Procedimientos reales de preparación de dichas formas farmacéuticas son conocidos, o resultarán evidentes, para los expertos en esta materia; por ejemplo, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composición para administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad terapéuticamente eficaz de una ADIr-PEG de la presente divulgación, tal como ADIr-PEG 20, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés de acuerdo con las enseñanzas del presente documento. En determinados ejemplos, las composiciones farmacéuticas o terapéuticas son estériles y/o exentas de pirógenos.

Una composición farmacéutica puede estar en forma de un sólido o líquido. En un ejemplo, el vehículo o los vehículos están en partículas, de modo que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimidos o polvo. El vehículo o los vehículos pueden ser líquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, aceite anoral, líquido inyectable o un aerosol, que es útil en, por ejemplo, administración por inhalación. Cuando está destinada a administración oral, la composición farmacéutica generalmente está en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas semilíquidas, en suspensión y en gel se incluyen en las formas consideradas en el presente documento ya sea como sólido o como líquido.

Como una composición sólida para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en un polvo, gránulo, comprimido formado por compresión, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea o similar. Dicha composición sólida contendrá normalmente uno o más diluyentes inertes o vehículos comestibles. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; emolientes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja; y un agente colorante. Cuando la composición farmacéutica está en forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido tal como polietilenglicol o aceite.

La composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para suministro por inyección, a modo de dos ejemplos. Cuando está destinada a administración oral, la composición preferente contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y un potenciador del aroma. En una composición destinada a administrarse mediante inyección, se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, en determinados ejemplos, solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden actuar como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferente. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.

Una composición farmacéutica líquida destinada a administración parenteral u oral debe contener una cantidad de ADIr como se desvela en el presente documento, tal como ADIr-PEG 20, de modo que se obtenga una dosis adecuada. Normalmente, esta cantidad es al menos 0,01 % de ADIr en la composición. Cuando está destinada a administración oral, esta cantidad puede variar entre 0,1 y aproximadamente 70 % del peso de la composición. Determinadas composiciones farmacéuticas orales contienen entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 75 % de ADIr-PEG. En determinados ejemplos, las composiciones farmacéuticas y preparaciones según la presente invención se preparan de modo que una unidad de dosificación parenteral contenga entre 0,01 y 10 % en peso de ADIr-PEG antes de la dilución.

La composición farmacéutica puede estar destinada a la administración tópica, en cuyo caso el vehículo puede comprender convenientemente una solución, emulsión, pomada o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizantes. Pueden estar presentes agentes espesantes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si está destinada a administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis. La composición farmacéutica puede estar destinada a administración rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio, que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Dichas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.

La composición farmacéutica puede incluir diversos materiales, que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una capa de revestimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la capa de revestimiento son normalmente inertes y se pueden seleccionar entre, por ejemplo, azúcar, goma laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Como alternativa, los principios activos se pueden encerrar en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une a ADIr-PEG y, de este modo, ayuda en la administración del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar con esta función incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales, una o más proteínas o un liposoma. La composición farmacéutica puede consistir esencialmente en unidades de dosificación que pueden administrarse como un aerosol. El término aerosol se utiliza para indicar diversos sistemas que varían desde los de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en envases presurizados. El suministro puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que distribuye los principios activos. Los aerosoles pueden administrarse en sistemas de una sola fase, bifásicos o trifásicos para administrar el principio o los principios activos. El suministro del aerosol incluye el recipiente necesario, activadores, válvulas, recipientes secundarios y similares, que juntos pueden formar un equipo. Un experto habitual en la materia, puede determinar sin experimentación indebida aerosoles preferentes.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante metodología bien conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica destinada a su administración mediante inyección puede prepararse combinando una composición que comprende ADIr-PEG como se describe en el presente documento y, opcionalmente, una o más de sales, tampones y/o estabilizadores, con agua destilada estéril para formar una solución. Se puede añadir un tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interaccionan de manera no covalente con la composición de ADIr-PEG para facilitar la disolución o suspensión homogénea de la ADIr-PEG en el sistema de suministro acuoso.

Las composiciones pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará dependiendo de diversos factores incluyendo la actividad del compuesto específico (p. ej., ADIr-PEG) empleado; la estabilidad metabólica y duración de acción del compuesto; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el momento de administración; la tasa de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la afección particular; y el sujeto que se somete a terapia.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los compuestos de la presente divulgación es una cantidad que es eficaz para inhibir el crecimiento tumoral. En general, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis que pueden aumentarse en pequeños incrementos hasta que se logre el efecto óptimo según las circunstancias. En general, una dosis terapéutica de los compuestos de la presente divulgación puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mg/kg dos veces a la semana a aproximadamente una vez cada dos semanas. Por ejemplo, la dosis puede ser de aproximadamente 1 mg/kg una vez a la semana como una inyección intravenosa de 2 ml a aproximadamente 20 mg/kg una vez cada 3 días. En un ejemplo adicional, la dosis puede ser de aproximadamente 50 UI/m2 a aproximadamente 700 UI/m2, administrada aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana o aproximadamente una vez cada 2 semanas. En determinados ejemplos, la dosis puede ser de aproximadamente 50 UI/m2, 60 UI/m2, 70 UI/m2, 80 UI/m2, 90 UI/m2, 100 UI/m2, 110 UI/m2, 120 UI/m2, 130 UI/m2, 140 UI/m2, 150 UI/m2, 160 UI/m2, 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, 360 UI/m2, 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 620 UI/m2, 630 UI/m2, 640 UI/m2, 650 UI/m2, 660 UI/m2, 670 UI/m2, 680 UI/m2, 690 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2 administrada aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana o aproximadamente una vez cada 2 semanas. En determinados ejemplos, la dosis puede modificarse según lo desee el médico experto.

La dosis óptima con ADIr-SS-PEG5.000 puede ser aproximadamente dos veces a la semana, mientras que la dosis óptima con ADIr-SS-PEG20.000 puede ser de aproximadamente una vez a la semana a aproximadamente una vez cada dos semanas. En determinados ejemplos, la dosis óptima con ADIr-SS-PEG20.000 puede ser aproximadamente dos veces a la semana.

ADIr-PEG puede mezclarse con una solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otra solución adecuada conocida por los expertos en la materia, antes de la inyección. En un ejemplo, una composición líquida que comprende ADIr-PEG comprende aproximadamente 10 a aproximadamente 12 mg de ADIr, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg de polietilenglicol, 1,27 mg fosfato de sodio monobásico al 5 %, USP; aproximadamente 3 mg fosfato de sodio dibásico 5 %, USP; 7,6 mg cloruro de sodio 5 %, USP; a un pH de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7; en una cantidad adecuada de agua para inyección (p. ej., aproximadamente 1 ml o aproximadamente 2 ml). En un ejemplo, una composición líquida que comprende una ADIr-PEG comprende histidina - HCI y, en determinados ejemplos, el tampón de composición es de histidina-HCI aproximadamente 0,0035 M a histidina-HCl aproximadamente 0,35 M. En un ejemplo en particular, la composición se formula en un tampón que comprende histidina-HCl 0,035 M a pH 6,8 con cloruro de sodio 0,13 M. En otro ejemplo, la composición se formula en un tampón que comprende tampón de fosfato de sodio 0,02 M a pH 6,8 con cloruro de sodio 0,13 M.

En un ejemplo, una composición que comprende ADIr o ADIr-PEG tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, aproximadamente 6 a aproximadamente 8 o aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. En algunos ejemplos, la composición que comprende ADIr tiene un pH de aproximadamente 6,8 ± 1,0.

En un ejemplo, el PEG libre en una composición que comprende ADIr-PEG está entre 1-10 % y, en un ejemplo adicional, es menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % del PEG total. En determinados ejemplos, la ADIr no modificada en una composición que comprende ADIr-PEG es menos de aproximadamente 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o menos de 0,1 %. En general, las composiciones que comprenden ADIr-PEG tienen impurezas totales menores o iguales a aproximadamente 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1 % o 0,5 %. En un ejemplo, el límite de endotoxina cumple los requisitos establecidos en la USP, es decir, < 50 UE/ml.

En un ejemplo, el sulfhidrilo libre en una composición que comprende ADIr o ADIr-PEG es mayor de aproximadamente 90 %. En algunos ejemplos, el sulfhidrilo libre en una composición que comprende ADIr o ADIr-PEG es aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 % o aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más.

En un ejemplo, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente 0,1 pM o 0,5 pM a aproximadamente 15 pM y, en un ejemplo adicional, es de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 12 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 9 pM, de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 8 pM o de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 7 pM. En determinados ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente 1,0 pM a aproximadamente 10 pM o aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 6,5 pM. En algunos ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente, al menos aproximadamente o menos de aproximadamente 0,1 pM, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 1,0 pM, aproximadamente 1,5 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 2,5 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 3,5 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 4,5 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 5,5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 6,5 pM, o aproximadamente 7 pM, o aproximadamente 8 pM, o aproximadamente 9 pM o aproximadamente 10 pM.

En un ejemplo, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 70 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 60 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 50 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 40 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 30 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 20 s-1, o aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 15 s-1 y, en un ejemplo adicional, es de aproximadamente 0,5 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 1 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 5 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 10 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 20 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 30 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 40 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 50 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 60 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 70 s-1 a aproximadamente 80 s-1, o aproximadamente 1 s-1 a aproximadamente 12 s-1, de aproximadamente 1 s-1 a aproximadamente 10 s-1, de aproximadamente 1,5 s-1 a aproximadamente 9 s-1, de aproximadamente 2 s-1 a aproximadamente 8 s-1 o de aproximadamente 2,5 s-1 a aproximadamente 7 s-1. En determinados ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 2,5 s-1 a aproximadamente 7,5 s-1. En algunos ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente o al menos aproximadamente 2,5 s -1, aproximadamente 3 s-1, aproximadamente 3,5 s-1 aproximadamente 4 s-1, aproximadamente 4,5 s-1, aproximadamente 5 s-1, aproximadamente 5,5 s-1 aproximadamente 6 s-1, aproximadamente 6,5 s-1, aproximadamente 7 s-1, aproximadamente 7,5 s-1 o aproximadamente 8 s-1 aproximadamente 10 s-1, aproximadamente 15 s-1 aproximadamente 20 s-1, aproximadamente 25 s-1, aproximadamente 30 s-1, aproximadamente 35 s-1 aproximadamente 40 s-1, aproximadamente 45 s-1, aproximadamente 50 s-1, aproximadamente 55 s-1 aproximadamente 60 s-1, aproximadamente 65 s-1, aproximadamente 70 s-1, aproximadamente 75 s-1 aproximadamente 80 s-1, aproximadamente 85 s-1, aproximadamente 90 s-1, aproximadamente 95 s-1 o aproximadamente 100 s-1.

En un ejemplo, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una conductividad (también conocida en la técnica como conductancia específica) de aproximadamente 5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm y, en ejemplos adicionales, de aproximadamente 5 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm, aproximadamente 7 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm, aproximadamente 9 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm o aproximadamente 10 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm. En algunos ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una conductividad de aproximadamente 9 mS/cm, aproximadamente 10 mS/cm, aproximadamente 11 mS/cm, aproximadamente 12 mS/cm o aproximadamente 13 mS/cm, aproximadamente 14 mS/cm o aproximadamente 15 mS/cm. En determinados ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una conductividad de aproximadamente 13 mS/cm ± 1,0 mS/cm.

En un ejemplo, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 50 mOsm/kg a aproximadamente 500 mOsm/kg, aproximadamente 100 mOsm/kg a aproximadamente 400 mOsm/kg, aproximadamente 150 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, aproximadamente 200 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg o aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. En determinados ejemplos, la ADIr o ADIr-PEG en una composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 300 ± 30 mOsm/kg.

En un ejemplo, la concentración de proteína es de aproximadamente 11,0 ± 1,0 mg/ml. En determinados ejemplos, la concentración de proteína está entre aproximadamente 8 y aproximadamente 15 mg/ml. En otro ejemplo, la concentración de proteína es de aproximadamente 8, 9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14 o 15 mg/ml.

En un ejemplo, la actividad enzimática específica está entre aproximadamente 5,0 y 90 UI/mg o entre aproximadamente 5 y 55 UI/mg, donde 1 UI se define como la cantidad de enzima que convierte un pmol de arginina en un pmol de citrulina y 1 pmol de amoníaco en un minuto a 37 °C y la potencia es de 100 ± 20 UI/ml. En otro ejemplo, la actividad enzimática específica es de aproximadamente 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21,21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 30,5, 35, 40, 45, 50, 55, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ± 2,0 UI/mg. En un ejemplo en particular, la actividad enzimática específica es 9 ± 2,0 UI/mg.

Las composiciones que comprenden ADIr-PEG de la presente divulgación también se pueden administrar simultáneamente con, antes de o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales, incluyendo ADI-PEG 20. Dicha terapia de combinación puede incluir la administración de una formulación de dosificación farmacéutica individual que contiene un compuesto de la presente divulgación y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de composiciones que comprenden ADIr-PEG (p. ej., ADIr-PEG 20) de la presente divulgación y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, ADIr-PEG como se describe en el presente documento y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación oral tal como un comprimido o una cápsula o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación oral separadas. De manera similar, ADIr-PEG como se describe en el presente documento y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación parenteral individual tal como en una solución salina u otra solución fisiológicamente aceptable o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación parenteral separadas, por las mismas o diferentes vías (p. ej., uno por inyección, uno por vía oral). Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, las composiciones que comprenden ADIr-PEG y uno o más agentes activos adicionales se pueden administrar esencialmente al mismo tiempo, es decir, de manera simultánea o en momentos escalonados por separado, es decir, de manera secuencial y en cualquier orden; se entiende que una terapia de combinación incluye todos estos regímenes.

Por tanto, en determinados ejemplos, también se contempla la administración de las composiciones de ADIr de la presente divulgación en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Dichos agentes terapéuticos pueden estar aceptados en la técnica como un tratamiento convencional para una patología en particular como se describe en el presente documento, tal como un cáncer en particular o EICH. Los agentes terapéuticos ilustrativos contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, FARME, antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos, radioterapia, inhibidores de la autofagia u otros agentes activos y auxiliares.

En determinados ejemplos, las composiciones de ADIr desveladas en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier cantidad de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados de ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina. Los agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen sorafenib y otros inhibidores de proteína cinasa, tales como afatinib, axitinib, bevacizumab, cetuximab, crizotinib, dasatinib, erlotinib, fostamatinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, lenvatinib, mubritinib, nilotinib, panitumumab, pazopanib, pegaptanib, ranibizumab, ruxolitinib, trastuzumab, vandetanib, vemurafenib y sunitinib; sirolimus (rapamicina), everolimus y otros inhibidores de mTOR. También se contemplan para su uso en el presente documento sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En determinados ejemplos, las composiciones de ADIr desveladas en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier cantidad de inhibidores de la autofagia. En algunos ejemplos preferidos, el inhibidor de la autofagia se selecciona del grupo que consiste en: cloroquina, 3-metiladenina, hidroxicloroquina (Plaquenil.TM.), bafilomicina A1, 5-amino-4-imidazol carboxamida ribósido (AICAR), ácido okadaico, toxinas de algas supresoras de la autofagia que inhiben proteína fosfatasas de tipo 2A o tipo 1, análogos de AMPc y fármacos que elevan los niveles de AMPc, adenosina, N6-mercaptopurina ribósido, wortmanina y vinblastina. Además, también se pueden utilizar antisentido o ARNip que inhibe la expresión de proteínas esenciales para autofagia, tales como, por ejemplo, ATG5.

En un ejemplo, la combinación de ADIr-PEG con uno o más agentes terapéuticos actúa de manera complementaria, aditiva o sinérgica. A este respecto, se describen en el presente documento agentes complementarios o sinérgicos, que incluyen un agente terapéutico (p. ej., agente quimioterapéutico, inhibidor de la autofagia, inhibidor de mTOR o cualquier otro agente terapéutico utilizado para el tratamiento del cáncer, EICH o enfermedad inflamatoria intestinal como se describe en el presente documento) que es capaz de actuar de manera complementaria o sinérgica con ADIr-PEG como se proporciona en el presente documento, donde dicha complementariedad o sinergia se manifiesta como un efecto detectable que es mayor (es decir, de manera estadísticamente significativa en relación con una condición de control adecuada) en magnitud que el efecto que puede detectarse cuando el agente quimioterapéutico está presente pero la composición de ADIr-PEG está ausente y/o cuando la ADIr-PEG está presente pero el agente quimioterapéutico está ausente. Se conocen en la técnica métodos para medir la sinergia y la complementariedad (véase, p. ej., Cancer Res 15 de enero de 2010, 70; 440).

Las composiciones que comprenden ADIr, y opcionalmente otros agentes terapéuticos, como se describe en el presente documento puede usarse en métodos terapéuticos para tratar el cáncer y métodos para prevenir la metástasis de un cáncer. Por tanto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión o para prevención de diversos cánceres diferentes. En otro ejemplo, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de la EICH. En particular, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer o EICH en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de composición de ADIr como se describe en el presente documento, opcionalmente, después del tratamiento con ADI-PEG 20, en particular donde un paciente desarrolla anticuerpos anti-ADI-PEG 20, de este modo tratando, aliviando los síntomas o inhibiendo la progresión del cáncer o EICH. Por tanto, las composiciones de ADIr descritas en el presente documento pueden administrarse a un individuo aquejado de enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., enfermedad de Crohn; colitis ulcerosa), EICH o un cáncer, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma hepatocelular, leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide aguda recidivante), melanoma, incluyendo melanoma metastásico, sarcomas (incluyendo, pero sin limitación, sarcomas metastásicos, leiomiosarcoma uterino), cáncer de páncreas, cáncer de próstata (tal como, pero sin limitación, cáncer de próstata resistente a hormonas), mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mielógena crónica, linfoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma gástrico), glioma, glioblastoma multiforme, retinoblastoma, neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer de lengua), cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo, de vesícula biliar, colangiocarcinoma y cáncer de estómago.

En otro ejemplo, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADIr, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, como se describe en el presente documento, en donde el cáncer es deficiente en ASS, ASL o ambos. A este respecto, la deficiencia de ASS o ASL puede ser una reducción de la expresión medida por la expresión de ARNm o expresión de proteína, o puede ser una reducción de la actividad de la proteína, y en general comprende una reducción estadísticamente significativa de la expresión o actividad según lo determinado por el experto en la materia. La expresión o actividad reducida de ASS o ASL puede ser una reducción de la expresión o actividad de aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o más, en comparación con la expresión o actividad en una muestra de control adecuada que se sabe que no tiene cáncer. En determinados ejemplos, la expresión o actividad de ASS o ASL se reduce al menos dos veces en comparación con la expresión o actividad en una muestra de control sin cáncer.

En determinados ejemplos, la expresión o actividad reducida de ASS o ASL resulta de la metilación del promotor de ASS o ASL o la inhibición del promotor de ASS o ASL. En otro ejemplo, la reducción de la expresión o actividad de ASS o ASL resulta de una mutación de ADN (p. ej., una o más mutaciones puntuales, pequeñas supresiones, inserciones y similares) o una anomalía cromosómica que da lugar a supresión del gen. En un ejemplo, el cáncer es negativo para ASS o ASL, lo que significa que no se observa expresión ni actividad.

La reducción de la expresión o actividad de ASS o ASL se puede medir usando cualquier método conocido en la técnica, tal como, pero sin limitación, PCR cuantitativa, inmunohistoquímica, ensayos de actividad enzimática (p. ej., ensayo para medir la conversión de citrulina en argininosuccinato o la conversión de argininosuccinato en arginina y fumarato) y similares.

Por tanto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADIr como se describe en el presente documento, en donde el cáncer presenta expresión o actividad reducida de ASS o ASL, o ambas, en donde el cáncer incluye, pero sin limitación, carcinoma hepatocelular, leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide aguda recidivante), melanoma, incluyendo melanoma metastásico, sarcomas (incluyendo, pero sin limitación, sarcomas metastásicos, leiomiosarcoma uterino), cáncer de páncreas, cáncer de próstata (tal como, pero sin limitación, cáncer de próstata resistente a hormonas), mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mielógena crónica, linfoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma gástrico), glioma, glioblastoma multiforme, retinoblastoma, neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer de lengua), cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo, de vesícula biliar, colangiocarcinoma y cáncer de estómago.

Diversos estudios en la bibliografía han demostrado que ASS es deficiente en los siguientes tumores: leucemia mielógena aguda (LMA), vejiga, mama, colorrectal, gástrico, glioblastoma, HCC, linfoma, melanoma, mesotelioma, pulmón no microcítico, ovárico, pancreático, próstata, renal, sarcoma y pulmón microcítico. Por consiguiente, el tratamiento de estos cánceres deficientes en ASS se contempla específicamente en el presente documento, con ADIr-PEG solo o en combinación con otros tratamientos, incluyendo el tratamiento primero con ADI-PEG 20.

La presente divulgación proporciona además métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión del cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADIr como se describe en el presente documento (p. ej., ADIr-PEG y en particular ADIr-PEG 20), en combinación con un inhibidor de la autofagia. En un ejemplo, la presente divulgación proporciona métodos tratar el cáncer en un paciente que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende ADIr como se describe en el presente documento en combinación con un inhibidor de la autofagia en donde el cáncer es cáncer de páncreas o de pulmón microcítico.

En determinados ejemplos, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento donde la administración de las composiciones que comprenden ADIr descritas en el presente documento agota la arginina en el plasma durante al menos un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más. En otro ejemplo, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento donde la administración de las composiciones que comprenden ADIr descritas en el presente documento agota la arginina en el plasma durante al menos un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más después de finalizar el tratamiento con ADI-PEG 20 después de la detección de anticuerpos anti-ADI-PEG 20.

Ejemplos

Ejemplo 1

EXPLORACIÓN Y SELECCIÓN DE ENZIMAS ADI QUE TIENEN BAJA REACTIVIDAD CRUZADA CON ANTICUERPOS ANTI-ADI-PEG 20 DEL PACIENTE

Este ejemplo describe la exploración y selección de enzimas ADI que tienen baja reactividad cruzada con anticuerpos anti-ADI-PEG 20 del paciente.

De una gran cantidad de enzimas ADI, la tabla 1 enumera 24 enzimas ADI seleccionadas con respecto a su porcentaje de identidad de secuencia en relación con ADI de M. hominis. Según la bibliografía, las secuencias de aminoácidos de ADI de M. hominis, M. arginini y M. arthritidis están estrechamente relacionadas y estas enzimas tienen buenas propiedades catalíticas. Más recientemente, se han descubierto enzimas ADI adicionales que tienen secuencias estrechamente relacionadas con estas tres. Se han identificado enzimas de ADI de Mycoplasma con relaciones más distantes, aunque se sabe menos acerca de ellas. Existen enzimas ADI con relaciones aún más distantes de fuentes bacterianas y de otro tipo.

Es posible que varias de las secuencias proteicas disponibles en las bases de datos públicas no hayan sido secuencias de ADI de longitud completa. En esos casos, las secuencias disponibles públicamente se ampliaron donde fue necesario para preparar una ADI de longitud completa basada en secuencias de ADI conocidas. En determinados casos, las proteínas ADI se modificaron en otra parte (p. ej., sustitución C251S). Estas secuencias de ADI sintetizadas se proporcionan en las SEQ ID NO: 26-32 y corresponden a las secuencias de ADI extendidas y/o modificadas de Mycoplasma arginini (C251S), Mycoplasma arthritidis (C251S), Mycoplasma phocicerebrale, Mycoplasma gateae, Mycoplasma phocidae, H. orenii y Mycobacterium bovis.

Se caracterizaron varias enzimas ADI de diversos organismos para determinar qué enzimas se esperaría que eliminen y mantengan bajas concentraciones de arginina en la sangre del paciente, incluso en presencia de anticuerpos anti-ADI-PEG 20. La tabla 2 (a continuación) enumera un subconjunto seleccionado de enzimas ADI de la tabla 1 que se estudiaron. Como se detalla a continuación, los datos de estos estudios muestran que la ADI de varias especies que están estrechamente relacionadas con M. hominis, en función de la identidad de secuencia, tienen propiedades catalíticas enzimáticas suficientemente buenas y reactividad cruzada reducida con anticuerpos anti-ADI-PEG 20.

Preparación de ADI. Las enzimas ADI recombinantes se clonaron, expresaron y purificaron para análisis según protocolos convencionales, como se ha descrito, por ejemplo, en Gallego et al., PLOS One, 7 (10): e47886, 2012; Monstadt y Holldorf, Biochem. J. 273: 739-745, 1990; Joo Noh et al., Molecules and Cells. 13: 137-143, 2002; y Sugimura et al., Infection and Immunity. 58: 2510-2515, 1990.

Purificación de anticuerpos humanos anti-ADI-PEG20. El anticuerpo anti-ADI-PEG20 se purificó de muestras de plasma de pacientes que habían recibido ADI-PEG20 durante un estudio clínico. Se agrupó un total de 60 ml de plasma de 8 pacientes diferentes que habían alcanzado un título alto (título >/= 4) contra ADI-PEG20 según lo determinado por un ensayo ELISA. Se usó una purificación de dos etapas, una cromatografía de proteína "A" (GE Healthcare) seguida de una cromatografía de afinidad de ADI. Se obtuvieron ~20 mg de anticuerpo purificado y se almacenaron a -80 °C en alícuotas hasta que se necesitó.

Ensayos de enzimas ADI. La arginina desiminasa (ADI) cataliza la conversión de L-arginina en L-citrulina y amoníaco. La cantidad de L-citrulina se puede detectar mediante un ensayo de puntos finales colorimétrico (véase, por ejemplo, Knipp y Vasak, Analytical Biochem. 286: 257-264, 2000) y se pueden comparar con una curva patrón de cantidades conocidas de L-citrulina para calcular la actividad específica de ADI expresada como UI/mg de proteína. Una UI de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que produce 1 pmol de citrulina por minuto al pH y la temperatura que se prueba. Las condiciones de ensayo convencionales se realizaron a 37 °C en tampón HEPES fisiológico (PHB) HEPES 50 mM, NaCl 160 mM, pH 7,4 (Lang y Zander, Clin Chem Lab Med. 37: 563-571, 1999) más BSA al 0,1 %. Todas las muestras y patrones se procesaron por duplicado o por triplicado cuando las condiciones lo permitieron.

Los valores de Km y Kcat se determinaron usando una variación del ensayo de actividad descrito anteriormente. Al igual que con el ensayo de actividad, todas las reacciones se realizaron a 37 °C en PHB más BSA al 0,1 %. La concentración de enzima, el tiempo de reacción y el intervalo de concentración del sustrato se ajustaron para cada una de las construcciones de ADI o ADIr para compensar sus diferencias de actividad. En general, se utilizó enzima 2 nM, tiempo de reacción de 5 minutos y una arginina 0 - 160 pM como condiciones de partida. Al optimizar las condiciones, se prestó especial atención a la cantidad de sustrato consumido como un porcentaje del sustrato total añadido a la reacción. El límite inferior de detección es 1 pM de citrulina, siendo el límite inferior de cuantificación 2 pM. Se procesó una curva patrón de citrulina en cada placa y se usó para cuantificar la citrulina producida por la reacción enzimática.

También se realizaron ensayos de actividad para evaluar la actividad enzimática en presencia de anti-ADI-PEG20 (perfiles de neutralización de anticuerpos). Estos ensayos se realizaron como se ha descrito anteriormente y en presencia de 800 nM, 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM y 0 nM de anticuerpos anti-ADI-PEG20.

Cálculos. La concentración de citrulina (pM) producida en cada pocillo de reacción se calculó y se promedió utilizando la curva patrón de citrulina. La velocidad de cada reacción se calculó después en pM/min/ADI 50 nM. La actividad específica (UI/mg o pmoles de producto/min/mg de ADI) se calculó multiplicando este valor por el factor "UI" (el factor UI se calculó a partir del peso molecular de la ADI y el volumen de reacción). Los resultados se resumen en la tabla 2 a continuación.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición terapéutica que comprende una arginina desiminasa (ADI) aislada y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la ADI aislada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8 o 14 o una secuencia de al menos 90 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8 o 14.

2. La composición terapéutica de la reivindicación 1, en donde al menos un resto de lisina se ha modificado mediante una sustitución de aminoácidos.

3. La composición terapéutica de la reivindicación 2 en donde:

a) al menos 5 restos de lisina se han modificado por una sustitución de aminoácidos;

b) al menos 10 restos de lisina se han modificado por una sustitución de aminoácidos;

c) al menos 15 restos de lisina se han modificado por una sustitución de aminoácidos; o

d) al menos 20 restos de lisina se han modificado por una sustitución de aminoácidos.

4. La composición terapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la ADI está unida covalentemente a través de un conector a una molécula de PEG.

5. La composición terapéutica de la reivindicación 4 en donde:

a) la ADI está unida covalentemente a más de una molécula de PEG;

b) la ADI está unida covalentemente a 1 a 10 moléculas de PEG;

c) la ADI está unida covalentemente a 2 a 8 moléculas de PEG.

6. La composición terapéutica de la reivindicación 4, en donde las moléculas de PEG son moléculas de PEG de cadena lineal o de cadena ramificada.

7. La composición terapéutica de la reivindicación 4 en donde el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de 1.000 a 40.000, tal como de 10.000 a 30.000.

8. La composición terapéutica de la reivindicación 4 en donde el conector es un grupo succinilo, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un hidrato de carbono, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina, un grupo metileno o cualquier combinación de los mismos.

9. La composición terapéutica de la reivindicación 8 en donde la fuente del grupo succinilo es succinato de succinimidilo.

10. La composición terapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende además un agente quimioterapéutico.

11. La composición terapéutica de la reivindicación 10 en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en docetaxel, carboplatino, ciclofosfamida, gemcitabina, cisplatino, sorafenib, sunitinib y everolimus.

12. La composición terapéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer, comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición terapéutica.

13. La composición terapéutica para su uso según la reivindicación 12, en donde se ha determinado que el paciente que lo necesita tiene anticuerpos anti-ADI-PEG 20.

14. La composición terapéutica para su uso según la reivindicación 12 o 13, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma hepatocelular, melanoma, melanoma metastásico, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón microcítico, mesotelioma, leucemia linfocítica, leucemia mielógena crónica, linfoma, hepatoma, sarcoma, leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo y cáncer de estómago.