ES2477118T3 - Método para inhibir la replicaci�n viral in vivo - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su utilización en un método de tratamiento de la infección de la hepatitis C en un individuo

Description

M�todo para inhibir la replicaci�n viral in vivo
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se dirige a una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su utilización en un método para el tratamiento de la infección de la hepatitis C en un individuo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones virales se encuentran entre las principales causas de muerte, con millones de fallecimientos cada año atribuibles directamente a varios virus, incluyendo la hepatitis y el VIH.
La hepatitis es una enfermedad del hígado humano. Se manifiesta con la inflamación del hígado y est� causada generalmente por infecciones virales. Varios virus tales como la hepatitis A, B, C, D, E y G son conocidos por provocar la hepatitis viral. Entre ellos, los más graves son el VHB y el VHC.
El virus de la hepatitis C (VHC) es una pandemia con más de 170 millones de personas infectadas en todo el mundo. Entre las enfermedades virales, est� 5 veces más generalizada que el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH – 1), y aproximadamente 10.000 estadounidenses fallecerán este año por cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC) resultante de la infección crónica por VHC (Sun CA, Wu DM, Lin CC, LU SN, You SL, Wang LY, Wu MH, Chen CJ. 2003. Incidence and cofactors of hepatitis C virus – related hepatocellular carcinoma: a prospective study of 12,008 men in Taiwan. Am J Epidemiol 157: 674 – 682; Herrine SK. 2002. Approach to the patient with chronic hepatitis C virus infection. Ann Intern Med 136: 747 – 757; Hoofnagle JH. 2002. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology 36: S21 – S29; Lauer GM, Walker BD. 2001 Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 345: 41 – 52; Liang TJ, Rehermann B, Seeff LB, Hoofnagle JH. 2001. Pathogenesis, natural history, treatment, and prevention of hepatitis C. Ann Intern Med 132: 236 – 305). Es más, la prevalencia del VHC continúa aumentando en EE.UU, Europa Occidental y Asia a pesar de la institución de programas de cribado de donantes de sangre. La progresión a la enfermedad crónica sucede en la mayoría de los pacientes infectados por el VHC. Además, el VHC causa, anualmente, CHC en el 1 -4 % de todos los individuos con infección crónica. Además, el CHC puede ocurrir incluso en aquellos que no tienen cirrosis (Shiratori Y, Shiina S, Teratani T, Imamura M, Obi S, Sato S, Koike Y, Yoshida H, Omata M. 2003. Interferon theraphy alter tumor ablation improves prognosis in patients with hepatocellular carcinoma associated with hepatitis C virus. Ann Int Med 138: 299 – 306; Smith MW, Yue ZN, Geiss GK, Sadovnikova NY, Carter VS, Boix L, Lazaro CA, Rosenberg GB, Bumgarner RE, Fausto N, Bruix J, Katze MG. 2003. Identification of novel tumor markers in hepatitis C virus – associated hepatocellular carcinoma. Cancer Res
63: 859 – 864; Yoshizawa H. 2002. Hepatocellular carcinoma associated with hepatitis C virus infection in Japan: projection to other countries in the foreseeable future. Oncology 62 (Supl 1): 8 – 17; Colombo M. 1999. Natural history and pathogenesis of hepatitis C virus related hepatocellular carcinoma. J Hepatology 31 (Supl 1): 25 – 30). Dado la prevalencia actual de la infección por VHC entre personas de 30 a 50 años, se estima que se dupliquen las tasas de incidencia y mortalidad por VHC en los Estados Unidos durante los próximos 10 – 20 años (El – Serag HB. 2002. Hepatocellular carcinoma and hepatitis C in the United States. Hepatology 36: S74 – S83). Se estima que hay 500 millones de personas infectadas en todo el mundo. No se dispone en la actualidad de una inmunizaci�n efectiva, y la hepatitis C sólo puede controlarse por otras medidas preventivas, tales como la mejora de la higiene y las condiciones sanitarias, y la interrupción de la vía de transmisión.
En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz para el CHC, excepto la resecci�n quirúrgica (Ryder SD. 2003. Guidelines for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) in adults. Gut 52 (Supl III): iii1 – iii8; El – Serag HB. 2002. Hepatocellular carcinoma and hepatitis C in the United States. Hepatology 36: S74 – S83; El – Serag HB. 2001. Global epidemiology of hepatocellular carcinoma. Clin Liver Dis 5: 87 – 107; DiMaio M, DeMaio E, Perrone F, Pegnata S, Daniele B. 2002. Hepatocellular carcinoma: systemic treatments. J Clin Gastroenterol 35 (Supl. 2): S109 – S114; Curley SA, Izzo F, Ellis LM, Vauthey JN, Vallone P. 2000. Radiofrequency ablation of hepatocellular cancer in 110 patients with cirrhosis. Ann Surg 232: 381 – 391; Watkins KT, Curley Sa. 2000. Liver and bile ducts. In Clinical Oncology, 2� ed. Editores MD Abeloff, JO Armitage, AS Lichter, JE Niederhuber. Nueva York: Churchill Livingstone, pág. 1681 – 1748). Sin embargo, sólo < 5 % de los pacientes con CHC son candidatos para la cirugía y sólo ~ 1 % se sometió a resecci�n. Incluso entre los que se sometieron a resecci�n, la recidiva del CHC es común, especialmente en aquellos infectados con el VHC.
La terapia de privación de amino�cidos es un medio eficaz para el tratamiento de algunos c�nceres. Aunque las células normales no requieren arginina, muchas líneas celulares cancerígenas son auxotr�ficas para estos amino�cidos. De este modo, los c�nceres, que se incluyen pero no se limitan al CHC, pueden eliminarse de manera selectiva mediante la terapia de privación de arginina (Ensor CM, Holtsberg FW, Bomalaski JS, Clark MA. 2002.
Pegylated arginine deiminase (ADI-SS PEG 200OO mw) inhibits human melanomas and hepatocellular carcinomas in vitro and in vivo. Cancer Res 62: 5443 -5440; Takaku, H, Misawa, S, Hayashi H and Miyazaki K. (1993). Chemical modification by polyethylene glycol of the anti-tumor enzyme arginine deiminase from Mycoplasma arginini. Jpn. J. Cancer Res. 84:1195-1200; Takaku H, Takase M, Abe S, Hayashi H y Miyazaki K. (1992). In vivo anti-tumor activity of arginine deiminase purified from Mycoplasma arginini. Int. J. Cancer 51 :244-249; Sugimura K, Ohno T, Kussyama T, Azuma I. 1992. High sensitivity of human melanoma cell lines to the growth inhibitory activity of Mycoplasma
arginini deiminase in vitro. Melanoma Res. 2:191-196). High sensitivity of human melanoma cell lines to the growth inhibitory activity of Mycoplasma arginini deiminase in vitro. Melanoma Res. 2: 191 -196). Esta terapia se tolera bien a pesar de que la arginina no es un amino�cido esencial en los seres humanos (Rose WC. 1949. Amino acid requirements of man. Fed Proc 8: 546 -452, Snyderman, S., E., Boyer, A., y L.E. Holt 1959. The arginine requirement of the infant. J. Dis. Child. 97: 192, y para la revision véase Rodgers QR. 1994. Species variation in arginine requirements. In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Nisek -from Ammonia to Cancer and Gene Expression. Publicación especial 86 -Abril 1994, Agriculture Experiment Station, Universidad de Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, pág. 9 -21, ya que puede sintetizarse a partir de la citrulina. La ADI convierte la arginina extracellular en citrulina que puede absorberse por las líneas normales y convertirse en arginina intracelular aunque no mediante las células cancerosas, en especial las células de CHC, ya que que carecen de la enzima limitante argininosuccinato sintetasa (Ensor CM, Holtsberg FW, Bomalaski JS, Clark MA. 2002. Pegylated arginine deiminase (ADI-SS PEG 2O00 mw) inhibits human melanomas and hepatocellular carcinomas in vitro and in vivo.
Cancer Res 62: 5443 -5440). Esta incapacidad para expresar la argininosuccinato sintetasa ha sido recientemente confirmada por otros (Shen LJ, Lin WC, Beloussow K, Shen WC. 2003. Resistance to the anti-proliferative activity of recombinant arginine deiminase in cell culture correlates with the endogenous enzyme, argininosuccinate synthetase. Cancer Lett 191: 165 -170). Se ha ampliado este studio de la deficiencia de la argininosuccinato sintetasa a otros tumores (Dillon B J, Prieto NG, Curley S A, Ensor CM, Holtsberg FW, Bomalaski JS, Clark MA. 2003. The method incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer (en prensa). Los resultados preliminares de los ensayos cl�nicos en humanos de la ADI – SS PEG 20.000 mw indican que este tratamiento es seguro y efectivo como tratamiento contra el cáncer.
La infección por el virus de la hepatitis B puede dar lugar a un amplio espectro de lesiones hepáticas. Además, la infección de la hepatitis B crónica se ha relacionado con el desarrollo posterior del carcinoma hepatocelular, principal causa de muerte. La prevención actual de la infección por VHB es una vacuna contra la hepatitis B que sea segura y eficaz. No obstante, la vacuna no es eficaz en el tratamiento de los individuos ya infectados (es decir; portadores y pacientes).
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad mortal, los casos de los que se han informado han aumentado dramáticamente en los últimos años. El virus del SIDA se identificó por primera vez en 1983. Se conoce por varios nombres y acr�nimos. Es el tercer virus linfotr�pico T (HTLV – III) conocido, tiene la capacidad para replicarse en las células del sistema inmune provocando una severa destrucción celular. El virus del SIDA es un retrovirus, un virus que utiliza la transcriptasa inversa durante la replicaci�n. En particular, este retrovirus es conocido también como virus asociado a linfadenopat�a (VAL), virus del SIDA (ARV) y, más recientemente, como virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Se han descrito hasta la fecha dos familias distintas de VIH, concretamente VIH – 1 y VIH – 2. El acr�nimo “VIH” se utiliza en la presente para referirse genéricamente a los virus de inmunodeficiencia humana.
El virus del herpes simple (VHS) tipo 1 y tipo 2 es un virus persistente que infecta en general a los humanos; provoca numerosas enfermedades humanas que son inquietantes. El VHS tipo 1 provoca una “boquera” (herpes labial recidivante), y el VHS tipo 2 provoca herpes genital, que se ha convertido en una importante enfermedad venérea en numerosas partes del mundo. En este momento no existe un tratamiento completamente satisfactorio para el herpes genital. Además, aunque no es frecuente, el VHS puede provocar asimismo encefalitis, una infección potencialmente mortal del cerebro. (The Merck Manual, Holvey, Ed., 1972; Whitley, Herpes Simplex Viruses, In: Virology, 2� Ed., Raven Press (1990)). Un trastorno más grave causado por el VHS es la queratitis dendr�tica, una infección ocular que puede dar lugar a una lesión ramificada de la córnea, la cual a su vez puede conducir a formación de tejido cicatrizal permanente y pérdida de la visión. Las infecciones oculares con VHS son una causa importante de ceguera. El VHS es también un virus difícil, si no imposible de curar.
Terapias antivirales
Hay numerosos problemas con las terapias antivirales actuales. En primer lugar, existen relativamente pocos fármacos antivirales eficaces. Muchos de los antivirales existentes provocan efectos secundarios no deseables o adversos. La mayoría de las terapias eficaces (vacunación) son altamente específicas para una sola cepa del virus. Con frecuencia, el virus muta de tal manera que se hace resistente bien al fármaco, bien a la vacuna.
Muchos de los tratamientos actuales contra las infecciones virales giran en torno al interfer�n – α (IFN – α). Se cree que el IFN – α se une a los receptores celulares e inicia una respuesta intracelular que incluye enzimas implicadas en la síntesis proteica. Esto da lugar en última instancia a una actividad / respuesta antiviral. Sin embargo, los datos de diversos ensayos cl�nicos han demostrado que aproximadamente el 40 % de los pacientes tratados con IFN – α respondieron inicialmente a la terapia, pero el 70 % de estos recayeron tras finalizar el tratamiento. (Damen, M., y Bresters, D., en H. W. (ed): Curr. Stud. Hematol. Blood Transf., Darger Publishers 1998, Basilea). En general, se observ� una respuesta y un efecto terapéutico a largo plazo entre el 10 – 30 % de los pacientes. (Houghton, M., en Fields, B. N. et al., Fields Virology, Raven Publishers 1996, Filadelfia). Además se observaron numerosos efectos secundarios, tales como fiebre severa, fatiga, dolores musculares y de cabeza, incluso depresión, pérdida de peso y diarrea. (Damen, M., y Bresters, D., en H. W. (ed): Curr. Stud. Hematol. Blood Transf., Darger Publishers 1998,
Basilea).
Terapia del VHC
La terapia estándar actual para la infección por VHC es el interfer�n – α (IFN) pegilado (PEG) y la ribavirina. Aunque esta terapia puede dar como resultado la respuesta antiviral sostenida, un número significativo de pacientes no responde a esta terapia o se excluyen de este tratamiento (Falck -Ytter Y, Kale H, Mullen KD, Sarbah SA, Sorescu L, McCullough AJ. 2002. Surprisingly small effect of antiviral treatment in patients with hepatitis C. Ann Intern Med
136: 288 -292; Fried MW. 2002. Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology 36: S237 -S244; Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Goncales FL Jr, Haussinger K, Diago M, Carosi G, Dhumeaux K, Craxi A, Lin A, Hoffman J, Yu J. 2002. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med 347: 975 -982.; Herrine SK. 2002. Approach to the patient with chronic hepatitis C virus infection. Ann Intern Med 136:747-757; Lauer GM, Walker BD. 2001. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 345: 41 -52; Liang TJ, Rehermann B, Seeff LB, Hoofnagle JH. 2001. Pathogenesis, natural history, treatment and prevention of hepatitis C. Ann Intern Med 132: 296 -305; Manns MP, McHutchinson JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, Goodman ZD, Koury K, Ling M-H, Albrecht JK. 2001. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet
358: 958 -965). Por ejemplo, estudios recientes de IFN – α – 2a PEG (PegasysTN) más ribavirina, e IFN – α -2b PEG (Pegintron TN) más ribavirina demostraron que ~ el 56 % de los pacientes tuvieron una respuesta viral sostenida (Dantzler TD, Lawitz EJ. 2003. Treatment of chronic hepatitis C in nonresponders to previous therapy. Curr Gastroenterol Rep 5: 78 -85; Masci P, Bukowski RM, Patten PA, Osborn BL, Borden EC. 2003. New and modified interferon alfas: preclinical and clinical data. Curr Oncol Rep 5: 108 -113; Chandler G, Sulkowski MS, Jenckes MW, Torbenson MS, Herlong HF, Bass EB, Gebo KA. 2002. Treatment of chronic hepatitis C: a systematic review. Hepatology 36: S135 -S144; DiBisceglie AM, Hoofnagle JH. 2002. Optimal therapy of hepatitis C. Hepatology 36: S121 -127; Fried MW. 2002. Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology 36: S237 -S244; Lindsay KL. 2002. Introduction to therapy of hepatitis C. Hepatology 36: S114 -S120. Lόpez -Guerrero JA, Carrasco L. 1998. Effect of nitric oxide on poliovirus infection of two human cell lines. J Virol 72: 2538 -2540; Wedemeyer H, Wiegand J, Cornberg M, Manns MP.; Polyethylene glycol -interferon: Current status in hepatitis C virus therapy, J Gastroenterol Hepatol. 2002 Dec; 17 Supl 3: S344 -S350; Manns MP, McHutchinson JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, Goodman ZD, Koury K, Ling M -H, Albrecht JK. 2001. Peginterferon alfa 2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet 358: 958 -965). Sin embargo, para los genotipos de VHC 1a y 1b, los genotipos más comunes en los EE.UU y en Europa Occidental, la respuesta fue sólo ~ 46 %. Los genotipos VHC 2 y 3 tuvieron una mejor respuesta (76 % -82 %). Además, la tasa de respuesta de ~ 50 % es sólo para pacientes estudiados en los ensayos cl�nicos; no representa a toda la población de pacientes y es, por lo tanto, prejuiciosa ((Dantzler TD, Lawitz EJ. 2003. Treatment of chronic hepatitis C in nonresponders to previous therapy. Curr Gastroenterol Rep 5: 78 -85; Masci P, Bukowski RM, Patten PA, Osborn BL, Borden EC. 2003. New and modified interferon alfas: preclinical and clinical data. Curr Oncol Rep 5: 108 -113; Chandler G, Sulkowski MS, Jenckes MW, Torbenson MS, Herlong HF, Bass EB, Gebo KA. 2002. Treatment of chronic hepatitis C: a systematic review. Hepatology 36 -.S135 -S144; DiBisceglie AM, Hoofnagle JH. 2002. Optimal therapy of hepatitis C. Hepatology 36: S 121 -127; Fried MW. 2002. Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology 36: S237 -S244; Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Goncales FL Jr, Haussinger K, Diago M, Carosi G, Dhumeaux K, Craxi A, Lin A, Hoffman J, Yu J. 2002. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med 347: 975 -982; Lindsay KL. 2002. Introduction to therapy of hepatitis C. Hepatology 36:S 114-S 120. Lόpez -Guerrero JA, Carrasco L. 1998. Effect of nitric oxide on poliovirus infection of two human cell lines. J Virol 72: 2538 -2540; Wedemeyer 2002, Manns MP, McHutchinson JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, Goodman ZD, Koury K, Ling M -H, Albrecht JK. 2001. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet 358: 958 -965). Por ejemplo, un estudio a gran escala en los EE.UU excluyó a 404 de los 1337 (o ~ 30 %) pacientes potenciales debido a los criterios de selección (McHutchinson JG, Gordon SC, Schiff ER, Shiffman ML, Lee WM, Rustgi VK, et al. 1998. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. N Engl J Med 339: 1485 -1492). Otros estudios a gran escala no logran describir sus criterios de cribado o el porcentaje de pacientes inscritos. Un estudio reciente realizado en los EE.UU por un gran hospital universitario, se�al� que el 72 % de todos los pacientes con VHC no fueron tratados con el IFN por motivos tales como contraindicaciones m�dicas o psiquiátricas, abuso activo de sustancias o alcohol, falta de adhesión a los procedimientos de evaluación, enzimas hepáticas normales o incluso la preferencia del paciente por no tratarse (Falck -Ytter Y, Kale H, Mullen KD, Sarbah SA, Sorescu L, McCullough AJ. 2002. Surprisingly small effect of antiviral treatment in patients with hepatitis C. Ann Intern Med 136: 288 -292). Otros han confirmado resultados similares (Diamond C, Lee JH. 2002. Use of antiviral therapy in patients with hepatitis C. Annals Intern Med 137: 1012). De este modo, una parte significativa de la población infectada por VHC no recibe el “mejor plan” de tratamiento actual debido a la diversidad de contraindicaciones m�dicas o psqui�tricas. Incluso en los estudios que utilizan los “mejores” pacientes en los EE.UU y en Europa Occidental, sólo ~ el 50 % consigue una respuesta viral sostenida.
El IFN – α también tiene efectos secundarios significativos que se producen con la misma frecuencia en las versiones formuladas tanto de PEG como en las que no tienen PEG (Masci P, Bulowski RM, Patten PA, Osborn BL, Borden EC. 2003. New and modified interferon alfas: preclinical and clinical data. Curr Oncol Rep 5: 108 – 113; Fried
MW. 2002. Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology 36: S237 – S244; Wedemeyer 2002, Herrine SK. 2002. Approach to the patient with chronic hepatitis C virus infection. Ann Intern Med 136: 747 – 757; Lauer GM, Walker BD. 2001. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 345: 41 – 52; Liang TJ, Rehermann B, Seeff LB, Hoofnagle JH. 2001. Pathogenesis, natural history, treatment, and prevention of hepatitis C. Ann Intern Med 132: 296 – 305). Estos efectos secundarios incluyen una enfermedad similar a la gripe con fiebre, escalofríos, mialgias y malestar general hasta en el 82 % de los pacientes estudiados, con complicaciones neuropsqui�tricas tales como depresión, irritabilidad y depresión, y ansiedad en ~ 20 % de los pacientes. La supresión de la médula ósea con granulocitopenia, anemia o trombocitopenia ocurre en ~ 5 %, as� como la alopecia. Estos efectos secundarios son con frecuencia tan graves que el tratamiento adicional con IFN alfa se interrumpe, lo que limita aún más la utilidad de la terapia con IFN. Por lo tanto, se necesitan nuevos tratamientos para el VHC.
Terapia del VIH
Se han aprobado varios fármacos para el tratamiento del VIH, incluyendo la azodivudina (AZT), didanosina (didesoxiinosina, ddI), d4T, zalcitabina (didesoxicitosina, ddC), nevirapina, lamivudina (epivir, 3TC), saquinavir (Invirase), rinotavir (Norvir), indinavir (Crixivan), y delavirdina (Rescriptor). Véanse M. I. Johnston & D. F. Hoth, Science, 260 (5112), 1286 – 1293 (1993) y D. D. Richman, Science, 272 (5270), 1886 – 1888 (1996). La ribavirina ha sido un tratamiento alternativo para el VHC. La ribavirina es un antiviral con una amplia gama de actividades virales diana. La ribavirina es un análogo de la guanosina que alberga una base modificada (1 – β – D – ribo – furanosil – 1, 2, 4 – trizol – 3 – carboxamida), y se ha propuesto para inhibir la enzima celular inosina monofosfato deshidrogenasa, dando lugar a una disminución de la guanosina trifosfato. Damen, M., y Bresters, D., en H. W. (ed): Curr. Stud. Hematol. Blood Transf., Darger Publishers 1998, Basilea. Sin embargo, la ribavirina provocar� efectos secundarios. Christie, J. M. y Chapman, R. W., Hosp Med. 60, 357 (1999). En particular, la ribavirina se acumula en los eritrocitos de los pacientes y puede causar anemia hemol�tica.
Se ha probado una vacuna contra el SIDA (vacuna de Salk) y se han descubierto varias proteínas que son quimiocinas de CD8 que actúan como supresoras del VIH. Además de los análogos de nucle�sidos sint�nticos anteriores, proteínas y anticuerpos, se ha descubierto que varias plantas y sustancias derivadas de las plantas tienen actividad antiVIH in vitro. Sin embargo, el virus del VIH ni se destruye con facilidad, ni existe un buen mecanismo para mantener las células huésped replicadas en el virus.
Utilizaci�n de la privación de arginina in vitro
Diversos estudios realizados en los últimos 30 años han demostrado que la arginina extracelular es necesaria para la replicaci�n viral in vitro. Hist�ricamente esto se ha conseguido produciendo un medio de cultivo tisular deficiente en arginina y dializando el suero utilizado como suplemento para conseguir el medio sin arginina. Utilizando esta metodología para conseguir la privación de arginina, se da lugar a la inhibición de la replicaci�n de un gran número de diversas familias de virus, incluyendo: adenovirus (Rouse HC, Bonifas VH, Schlesinger RW. 1963. Dependence of adenovirus replication on arginine and inhibition of plaque formation by pleuropneumonia -like organisms. Virology
20: 357 -365), virus del herpes (Tankersley RW Jr. 1964. Amino acid requirements of herpes simplex virus in human cells. J Bacteriol 87: 608 -613), SV 40 (Goldblum N, Ravid Z, Becker Y. 1968. Effect of withdrawal of arginine and other amino acids on the synthesis of tumour and viral antigens of SV40 virus. J Gen Virol 3: 143 -146), citomegalovirus (Minamishima Y, Benyesh-Melnick M. 1969. Arginine -dependent events in cytomegalovirus infection. Bacteriol Proc 170: 334 -339), virus sincitial respiratorio (Levine S, Buthala D, Hamilton RD. 1971. Late stage synchronization of respiratory syncytial virus replication. Virology 45: 390 -400), poliomavirus (Winters AL, Consigli RA, Rogers OR 1972. A non-functional arginine biosynthetic pathway in polyoma – infected mouse embryo cells. Biochem Biophys Res Comm 47: 1045 -1051), virus de la enfermedad de Newcastle (Ilnuma M, Maemo K, Matsumoto T. 1973. Studies on the assembly of Newcastle disease virus: an arginine -dependent step in virus replication. Virology 51: 205 -215), virus del sarampión (Romano N, Scarlata G. 1973. Amino acid requirements of measles virus in HeLa cells. Arch Gesamte Virus Forschung 43: 359 -366), gripe (Lisok TP, Sominina AA. 1977. Improved methods of influenza virus propagation. I. Enhancement of virus reproduction in cell cultures. Acta Virol 21: 234 -240), y tal vez aún más relevante, vaccinia virus (Holterman OA. 1969. Amino acid requirements for the propagation of vaccinia virus in Earle's L cells. J Gen Virol 4: 585 -591, Singer SH, Fitzgerald EA, Barile MF, Kirschstein RL. 1970. Effect of mycoplasmas on vaccinia virus growth: requirement of arginine. Proc Soc Exp Biol Med 133: 1439 -1442, Obert G, Tripier F, Guir J. 1971. Arginine requirement for late mRNA transcription of vaccinia virus in KB cells. Biochem Biophys Res Comm 44: 362 -367, Archard LC, Williamson JD. 1971. The effect of arginine deprivation on the replication of vaccinia virus. J Gen Virol 12:249-258.) y viruela del conejo (Cooke BC, Williamson JD. 1973. Enhanced utilization of citrulline in rabbitpox virus-infected mouse sarcoma 180 cells. J Gen Virol 21: 339 -348). El vaccinia virus es el miembro protot�pico de los géneros Orthopoxvirus que incluye viruela (virus vari�lico). Se observa la inhibición de la replicaci�n viral in vitro, a pesar de que no est�n afectadas la síntesis prot�ica y la replicaci�n de las células infectadas.
Se conocen las enzimas que degradan arginina e incluyen arginina deiminasa (ADI). No obstante, un problema asociado con el uso terapéutico de dicha proteína heter�loga es su antigenicidad. La modificación química de la arginina deiminasa de Mycoplasma arginini, a través del grupo de enlace de cloruro cian�rico con polietilenglicol fue descrita por Takaku, H, Misawa, S, Hayashi H and Miyazaki K. (1993). Chemical modification by polyethylene glycol
of the anti – tumor enzyme arginine deiminase from Mycoplasma arginini. Jpn. J. Cancer Res. 84: 1195 -1200. Sin embargo, la proteína modificada era tóxica cuando se metaboliz� debido a la liberación de cianuro del grupo de enlace de cloruro cian�rico.
Hay una necesidad de métodos para inhibir la replicaci�n viral que no tiene problemas asociados con la técnica anterior. La presente divulgación se dirige a estos, as� como a otros fines importantes.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones. La presente invención se dirige a la arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su utilización en un método para el tratamiento de la infección de la hepatitis C en un individuo. La presente divulgación se dirige a los métodos que modulan simultáneamente la replicaci�n viral y el tratamiento contra el cáncer, incluyendo, por ejemplo, sarcomas, hematomas y melanomas. La presente divulgación se dirige también a métodos para determinar la susceptibilidad de un individuo a la terapia de privación de arginina durante una infección viral, métodos para mejorar la función hepática, y similares. Estos y otros aspectos de la presente divulgación se esclarecerán en la siguiente descripción detallada de la invención.
DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Visi�n general
La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado en el que la ADI modificada con polietilenglicol inhibe la replicaci�n viral. La ADI puede unirse covalentemente al polietilenglicol con o sin un grupo de enlace, aunque algunas realizaciones utilizan un grupo de enlace. El PEG – 20.000, por ejemplo, exhibe niveles de actividad enzim�tica útiles, antigenicidad, semivida en la circulación, eficacia, y relativa facilidad de fabricación.
No se conoce el mecanismo por el cual la reducción de arginina extracelular inhibe la replicaci�n viral. Los herbívoros al igual que los seres humanos, los ratones (a diferencia de los carnívoros que tienen un requisito absoluto para la arginina) para la revision véase Rodgers QR. 1994. Species variation in arginine requirements. In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Nisek -from Ammonia to Cancer and Gene Expression.
Publicaci�n especial 86 -Abril 1994, Agriculture Experiment Station, Universidad de Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, pág. 9 – 21) y la mayoría de las células no requieren arginina para el crecimiento ya que pueden sintetizarse a partir de la citrulina utilizando dos enzimas intracelulares (argininosuccinato sintasa y argininosuccinato liasa). De este modo, la eliminación de la dosis de arginina extracelular no afecta a los niveles intracelulares de arginina provista de citrulina disponible en las células. Ya que la replicaci�n viral es un proceso intracelular, es inesperado que la disminución en arginina extracelular pueda exhibir replicaci�n viral.
Aunque no se desea estar ligado por la teoría, un posible mecanismo por el que la dismunici�n de la arginina extracelular puede exhibir replicaci�n viral es inhibir la síntesis de óxido nítrico. El óxido nítrico se sintetiza a partir de la arginina extracelular, as�, la eliminación de este grupo de arginina inhibe eficazmente la producción de este importante metabolito. A pesar de que se piensa que el óxido nítrico es protector contra algunas infecciones virales (Akaike T, Maeda H. 2000. Nitric oxide and virus infection. Immunology 101: 300 – 308), se ha demostrado que la inhibición de la síntesis de óxido nítrico bloquea la replicaci�n del virus de la coriomeningitis linfoc�tica Campbell JX Samimi A, Chiang CS. 1994. Expression of the inducible nitric oxide synthase. Correlation with neuropathology and clinical features in mice with lymphocytic choriomeningitis. J Immunol 153: 3622 -3629), y el VIH (Blond D, Raoul H, LeGrand R, Dormont D. 2000. Nitric oxide synthesis enhances human immunodeficiency virus replication in primary human macrophages. J Virol 74: 8904 -8912). Se ha demostrado también que la inhibición de la síntesis de óxido nítrico protege a los animales de los efectos letales de la gripe (Akaike T, Noguchi Y, Ijiri S, Setoguchi K, Suga M, Zheng YM, Dietzschold B, Maeda H. 1996. Pathogenesis of influenza virus -induced pneumonia: involvement of both nitric oxide and oxygen radicals. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2448 -2453; Karupiali G, Chen J-H, Mahalingam S, Nathan CF, MacMicking JD. 1998. Rapid interferon γ -dependent clearance of influenza A virus and protection from consolidating pneumonitis in nitric oxide synthase 2-deficient mice. J Exp Med 188: 1541 -1546), poliovirus (Lόpez -Guerrero JA, Carrasco L. 1998. Effect of nitric oxide on poliovirus infection of two human cell lines. J Virol 72: 2538 2540), virus de la rabia (Ubol S, Sukwattanapan C, Maneerat Y.2001. Inducible nitric oxide synthase delays death of rabies virus -infected mice. J Med Microbiol 50: 238 -42) y flavivirus (Kreil TR, Eibl MM. 1996. Nitric oxide and viral infection: no antiviral activity against a flavivirus in vitro, and evidence for contribution to pathogenesis in experimental infection in vivo. Virology 219: 304 -306). Sin embargo, estos inhibidores de la síntesis de óxido nítrico utilizados anteriormente han sido limitados por sus toxicidades (insuficiencia hepática, convulsiones y muerte) tanto en aminales como en seres humanos. De este modo, no est� claro que la inhibición de la replicaci�n viral dé lugar a la eliminación de la arginina de los medios de cultivo (un proceso que elimina claramente la producción de óxido nítrico), es el único mecanismo por el cual se produce la inhibición de la replicaci�n viral. Esta dualidad de estimulaci�n / inhibición de óxido nítrico e infección v�rica se observa también con el óxido nítrico en otros eventos patológicos (Colasanti M, Suzuki H. 2000. The dual personality of NO. Trends Pharm Sci 21: 249 -252). As�, no debe suponerse que la inhibición del óxido nítrico derogue todas las secuelas de un evento infeccioso (Bogdan C. 2001. Nitric oxide and the immune system. Nature Immunology 2: 907 -916). No obstante, a diferencia de los inhibidores de síntesis de óxido nítrico utilizados en el pasado, la ADI – PEG 20 parece ser segura y efectiva en la
inhibici�n de la producción de óxido nítrico y puede utilizarse para ayudar a esclarecer el papel de este biomediador en la protección contra la infección viral.
Definiciones
Durante la presente divulgación, pueden utilizarse las siguientes abreviaturas: PEG, polietilenglicol; ADI, arginina deiminasa, SS, succinimidil succinato; SSA, succinimidil succinamida; SPA, succinimidil propionato; y NHS, N – hidroxi – succinimida.
La ADI modificada covalentemente con polietilenglicol (con o si un grupo de enlace) puede denominarse de aquí en adelante como “ADI – PEG”, o “PEG – ADI).
“Polietilenglicol” o “PEG” se refiere a mezclas de pol�meros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena lineal o ramificada, representadas por la fórmula general H (OCH2CH2)nOH, donde n es al menos 4. El “polietilenglicol” o “PEG” se utiliza en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular medio del peso del mismo. Por ejemplo, PEG – 5,000 (PEG5) se refiere a las moléculas de polietilenglicol que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 5.000; PEG – 12.000 (PEG12) se refiere a las moléculas de polietilenglicol que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 12.000; y PEG – 20.000 (PEG20) se refiere a las moléculas de polietilenglicol que tienen un peso molecular medio de aproximadamente 20.000.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “individuo” se refiere a un animal, en algunas realizaciones a un mamífero, y en algunas realizaciones a un ser humano. El término “individuo” incluye muestras biológicas tomadas de dichos animales.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “enfermedad viral” se refiere a las enfermedades o trastornos causados por un virus. Las enfermedades virales incluyen sin limitación virus que infectan a animales o mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los virus humanos incluyen virus de las siguientes familias virales: viruela, herpes, adeno, papota, parvo, hepadna, picorna, calici, astro, toga, flavi, corona, paramixo, ortomixo, bunya, arena, rhabdo, filo, boma, reo, y retro.
En una realización, la presente invención proporciona una composición que comprende arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su utilización en un método para el tratamiento de la infección de la hepatitis C en un individuo o para su utilización en el tratamiento de un individuo sospechoso de haber estado expuesto al virus de la hepatitis C. En una subrealizaci�n, ejemplos de virus y enfermedades asociadas, además del VHC, pueden tratarse en la presente invención que incluye sin limitación: variola (viruela), herpesvirus, tales como el virus del herpes simple (herpes labial), varicela – zoster (varicela, culebrillas), virus de Epstein – Barr (mononucleosis, linfoma de Burkitt), HASK (sarcoma de Kaposi), y citomegalovirus (ceguera); adenovirus; hepatitis (A / B / C); poliovirus, rinovirus, rubéola, fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, dengue, encefalitis equina, virus sincitial respiratorio (VSR), virus paragripal, y virus del mosaico del tabaco.
En algunas realizaciones, el virus es uno o más del VIH, gripe, poliovirus, herpes simple, hepatitis B, hepatitis C y otras cepas virales de la hepatitis, sarcoma de Kaposi, rinovirus, virus del Nilo Occidental, viruela y vaccinia virus entre otros.
Tal y como se utiliza en la presente, “modulación” se refiere bien a un aumento (estimulaci�n) o a una disminución (inhibición) en la expresión de un gen. En algunas realizaciones de la presente invención, la inhibición es la forma de modulación de la expresión g�nica.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “inhibir” se refiere a una reducción o disminución en la cantidad o calidad en comparación con una línea de base. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, la inhibición de la replicaci�n viral se refiere a una disminución en la replicaci�n viral en comparación con la línea de base. En algunas realizaciones hay una reducción del 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % y 100 %. Los expertos en la disciplina podrán determinar fácilmente si se ha inhibido o no la replicaci�n viral y hasta qué punto.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “aproximadamente” se refiere a + / -20 %,+ / -15 %,+ / -10 %, o + / 5 % del valor.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “biocompatible” se refiere a materiales o compuestos que en general no son perjudiciales para las funciones biológicas y que no darán lugar a ningún grado de toxicidad inaceptable, incluyendo los estados alérgicos y de la enfermedad.
“Semivida en la circulación” se refiere desde al periodo de tiempo, después de la inyección de la ADI modificada en un paciente, hasta la cantidad de ADI que se ha eliminado hasta la mitad del nivel de suero máximo original. La semivida en la circulación puede determinarse en cualquier especie pertinente, incluyendo seres humanos o ratones. Tal y como se utiliza en la presente, los términos “unido covalentemente”, “unido” y “acoplado” se utilizan de forma
intercambiable y se refieren a una unión covalente que une ADI a la molécula de PEG, ya sea directamente o a través de un ligador.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invención efectiva para proporcionar la respuesta terapéutica deseada. La cantidad terapéuticamente eficaz específica obviamente variar� con factores como la condición particular que est� tratándose, la condición física del paciente, el tipo de mamífero o animal que est� tratándose, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera), las formulaciones específicas empleadas y la estructura de los compuestos o sus derivados. En el contexto de la mejora de la función hepática, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de arginina deiminasa unida a polietilenglicol que mejora la función hepática. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es efectiva para mejorar la escala de Child – Pugh o la escala Mayo del modelo para las enfermedades terminales del hígado (MELD) del individuo. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es efectiva para mejorar la función hepática basada en la comparación de los marcadores de la función hepática que incluyen, sin limitación, niveles de bilirrubina, niveles de creatina, y el cociente internacional normalizado.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “cantidad eficaz para inhibir la replicaci�n viral” se refiere a la cantidad de un compuesto que comprende ADI unida covalentemente a través de un grupo de enlace en polietilenglicol administrado a un individuo que da como resultado un nivel reducido de la replicaci�n viral y de ese modo, una cantidad reducida de virus detectables en el individuo, es decir; una reducción en el título viral o la carga viral. Para determinar una cantidad eficaz para inhibir la replicaci�n viral, la carga viral del individuo puede determinarse antes del tratamiento con un compuesto de la presente invención y después del tratamiento. El nivel de replicaci�n viral puede cuantificarse por cualquier número de metodolog�as rutinarias que incluyen por ejemplo: la cuantificación del número actual de partículas virales en una muestra antes y después de la administración del compuesto, y la cuantificación del nivel de uno o más antigenes virales presentes en la muestra antes y después de la administración del compuesto. En algunas realizaciones “una cantidad eficaz para inhibir la replicaci�n viral” es la cantidad necesaria para disminuir las concentraciones de arginina plasm�tica por debajo de 5 μM. Los métodos de medición de las concentraciones de arginina plasm�tica son ya conocidos en la materia.
Los ensayos para la replicaci�n viral proporcionan asimismo la capacidad para determinar la eficacia de los inhibidores virales y son ya conocidos por los expertos en la materia. Dichos ensayos pueden llevarse a cabo in vivo
o in vitro. El VHC es conocido por ocurrir en chimpancés donde la infección se asemeja a la observada en los seres humanos. También ha habido informes de infección experimental en tupayas, estrechamente relacionados con los primates, y en ratones inmunodeficientes. (Xie, Z. C et al., Virology, 244, 513 (1998); R. F. et al., Antiviral Chem. Chemother. 10, 99, (1999)).
La inhibición de la replicaci�n viral contribuye a una reducción en la gravedad de la infección viral o de los síntomas de la infección viral.
Tal y como se utiliza la presente, “cantidad profil�cticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invención eficaz para proporcionar la respuesta profiláctica deseada. La cantidad profil�cticamente eficaz específica obviamente variar� con factores como el virus en particular, la condición física del paciente, el tipo de mamífero o el animal que est� tratándose, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera), las formulaciones específicas empleadas y la estructura de los compuestos o sus derivados.
Tal y como se utiliza en la presente “terapia de combinación” significa que al individuo que necesita un tratamiento, se le administra otro fármaco para la enfermedad junto con PEG – ADI. Esta terapia de combinación puede ser una terapia secuencial en la que se trata primero al individuo con uno o más fármacos y después el otro, o se le administran de manera simultánea dos o más fármacos.
Tal y como se utiliza en la presente, la frase “terapia de privación de arginina” se refiere a un régimen de tratamiento que involucra la utilización de un agente que reduce, minimiza o suprime los niveles de arginina en el paciente. La terapia de privación de arginina se realiza a menudo utilizando ADI. La terapia de privación de arginina y los agentes utilizados en la terapia de privación de arginina se describen con detalle en la Solicitud de U. S. con N� de serie 09 / 023.809, presentada el 13 de febrero de 1998, la Patente de U.S. 6.183.738, publicada el 6 de febrero de 2001; y la Solicitud en trámite de U. S. con N� de serie 09 / 504.280, presentada el 15 de febrero de 2000.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “un individuo sospechoso de haber estado expuesto a uno o más virus” se refiere a un individuo que no ha sido diagnosticado como positivo por uno o más virus aunque posiblemente ha estado expuesto a uno o más virus debido a la reciente elevada actividad de riesgo o actividad que los puso en contacto con los virus. Por ejemplo, un individuo sospechoso de haber estado expuesto al VIH se refiere a un individuo que se ha pinchado con una aguja que ha estado en contacto con una muestra que contiene VIH o con un individuo infectado por el VIH. Ejemplos de tales muestras incluyen, sin limitación, muestras de laboratorio o de investigación, o muestras de sangre, semen, secreciones corporales, y similares de los pacientes. Los individuos sospechosos de estar expuestos al VHC incluyen individuos que han recibido transfusiones de sangre con sangre de calidad desconocida. La sangre que se transfunde puede que no haya sido analizada o que los resultados de la
prueba indiquen que la sangre que no contiene VHC no sea fiable o sea dudosa. En algunas realizaciones, un individuo sospechoso de estar infectado con un virus incluye individuos que han estado expuestos al virus a través de otro individuo incluyendo por ejemplo, las relaciones sexuales, el contacto con fluidos corporales de otro individuo, compartir agujas hipodérmicas, y similares. El individuo en el que se origin� el virus puede o no puede que haya analizado la presencia y / o ausencia del virus. El término “un individuo sospechoso de haber estado expuesto a uno o más virus” incluye asimismo individuos que han sido diagnosticados como positivos por un virus aunque también est�n infectados con al menos un virus. Por ejemplo, los infectados a menudo con el VIH son también positivos para una o más formas de hepatitis. Tales individuos pueden clasificarse como “alto riesgo” para uno o más virus.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “inhibir selectivamente” se refiere a la inhibición selectiva de la replicaci�n viral y es, en algunas realizaciones, el índice de CC50 / EC50 % de los niveles de ARNm viral. Un SI > 10 se considera que refleja una inhibición selectiva de replicaci�n viral.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “muestra” se refiere al material biológico de un paciente. La muestra evaluada por la presente invención no se limita a ningún tipo en particular. Las muestras incluyen como ejemplos no limitantes, unicelulares, multicelulares, tejidos, tumores, fluidos biológicos, moléculas biológicas, o sobrenadantes o extractos de cualquiera de los anteriores. Los ejemplos incluyen tejido extraído por biopsia, tejido eliminado durante la resecci�n, sangre, orina, tejido linfático, líquido cefalorraqu�deo, mucosas, y muestras de excrementos. La muestra utilizada variar� en función del formato del ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tumores, tejidos, células o extractos para ser analizadas. Los métodos de preparación de muestras son ya conocidos en la disciplina y pueden adaptarse fácilmente a fin de obtener una muestra compatible con el método utilizado.
ADI
La arginina deiminasa cataliza la conversión de arginina a citrulina, y puede utilizarse para eliminar la arginina. En la presente invención, el gen de la arginina deiminasa puede derivarse, clonarse o producirse a partir de cualquier fuente, incluyendo, por ejemplo, microorganismos, biotecnolog�a recombinante o cualquier combinación de los mismos. La arginina deiminasa puede clonarse a partir del microorganismo del género Mycoplasma. En algunas realizaciones, la arginina deimina se clona a partir de Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arthritidis o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa utilizada en la presente invención puede tener una o más secuencias de amino�cidos de las SECs ID N� 1 – 10 y 13 – 21.
La arginina deiminasa nativa puede encontrarse en microorganismos, es antig�nica y puede eliminarse rápidamente de la circulación de un paciente. Estos problemas pueden superarse mediante la modificación covalente de la arginina deiminasa con polietilenglicol (PEG). La arginina deiminasa modificada covalentemente con polietilenglicol (con o sin grupo de enlace) puede referirse de aquí en adelante como “ADI – PEG”. Cuando se compara con la arginina deiminasa nativa, la ADI – PEG conserva la mayor parte de su actividad enzim�tica, es mucho menos antig�nica, tiene una enorme semivida en la circulación prolongada, y es mucho más eficaz en el tratamiento de tumores.
Han llegado a asociarse ciertas desventajas con el aislamiento de la arginina deiminasa de los organismos. Aunque es eficaz eliminar las células tumorales in vitro, la arginina deiminasa aislada de Pseudomonas pudita no logr� exhibir eficacia in vivo debido a que tenía poca actividad enzim�tica en un pH neutro y se elimin� rápidamente de la circulación de los animales experimentales. La arginina deiminasa derivada de Mycoplasma arginini (SEC ID N� 5) es descrita, por ejemplo, por TaKase H, Takase M, Abe S, Hayashi H and Miyazaki K (1992). In vivo anti – tumor activity of arginine deiminase purified from Mycoplasma arginini. Int. J. Cancer 51: 244 – 249, y la Patente U.S N�
5.474.928. Un problema asociado con el uso terapéutico de tal proteína heter�loga es su antigenicidad. La modificación química de la arginina deiminasa de Mycoplasma arginini, a través del grupo de enlace de cloruro cian�rico con polietilenglicos fue descrita por Takaku H, Misawa S, Hayashi H y Miyazaki K. (1993). Chemical modification by polyethylene glycol of the anti – tumor enzyme arginine deiminase from Mycoplasma arginini. Jpn. J. Cancer Res. 84: 1195 – 1200. La proteína modificada era tóxica cuando se metaboliz� debido a la liberación de cianuro del grupo de enlace de cloruro cian�rico.
La producción de arginina deiminasa a través de las técnicas de ADN recombinante también proporciona ciertas desventajas. Por ejemplo, la arginina deiminasa producida en Escherichia coli es enzim�ticamente inactiva y, de este modo, debe desnaturalizarse y a continuación renaturalizarse correctamente para que se vuelva enzim�ticamente activa. El método usual de renaturalizaci�n de la arginina deiminasa producida en E. coli es aislar la enzima inactiva, disolverla en clorhidrato de guanidinio y renaturalizarla mediante la rápida dilución en un tampón de baja fuerza iónica. Este último paso requiere volúmenes muy grandes de tampón por lo que la fabricación de arginina deiminasa es cara y requiere mucho tiempo. Sin embargo, la tecnología recombinante tiene ciertas ventajas. Por ejemplo, los organismos más flexibles para la fermentación pueden utilizarse como huéspedes. Además, estos huéspedes de fermentación son en general mucho menos patog�nicos y pueden obtenerse grandes cantidades de arginina deiminasa. Se ha demostrado que E. coli puede producir grandes cantidades de arginina deiminasa de Mycoplasma. La modificación química y genética de la enzima de arginina deiminasa puede afectar a sus actividades biológicas.
Por ejemplo, se ha demostrado que la arginina deiminasa es en general antig�nica y se elimina rápidamente de la circulación de un paciente. Sin embargo, se ha demostrado también que la formulación de arginina deiminasa con polietilenglicol reduce la antigenicidad e incrementa la semivida en la circulación de la enzima. Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 – 186 (1984); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252: 3582 – 3586 (1977). En particular, la arginina deiminasa puede modificarse covalentemente con polietilenglicol. La arginina deiminasa covalentemente modificada con polietilenglicol (con o sin grupo de enlace) puede referirse de aquí en adelante como “ADI – PEG”. En la Solicitud de Patente U. S Número de serie 09 / 023.809, Clark describe modificaciones mejoradas de arginina deiminasa de Mycoplasma hominis (SEC ID N� 1), Mycoplasma arginini (SEC ID N� 5), y Mycoplasma arthritidis (SEC ID N� 7) con polietilenglicol. Cuando se compara con la arginina deiminasa nativa, la ADI – PEG conserva la mayor parte de su actividad enzim�tica, es mucho menos antig�nica, tiene una enorme semivida en la circulación prolongada, y es mucho más eficaz en el tratamiento de tumores. Para fines de la invención, la modificación de cualquier arginina deiminasa con polietilenglicol puede referirse como pegilaci�n.
Ha de entenderse que la arginina deiminasa derivada de otros organismos puede tener también pegilaci�n en sitios correspondientes a la posición 112 de la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis. Por ejemplo, la arginina deiminasa de Streptococcus pyrogenes tiene lisina en la posición 104, la arginina deiminasa de Mycoplasma pneumoniae tiene lisina en la posición 106, y la arginina deiminasa de Giardia intestinalis tiene lisina en la posición
114. Además, la arginina deiminasa de algunos organismos puede tener lisinas que corresponden a la misma posición general como la posición 112 de la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis. La posición de la lisina en la arginina deiminasa de dichos organismos puede indicarse de la siguiente manera:
Tabla 1: Sitios de pegilaci�n de la arginina deiminasa de varios organismos
Organismos que producen arginina deiminasa
Posición de la lisina en arginina deiminasa
Mycoplasma hominis (SEC ID N� 1)
112
Mycoplasma arginini (SEC ID N� 5)
111
Clostridium perfringens (SEC ID N� 18)
105
Bacillus licheniformis (SEC ID N� 19)
97, 108
Borrelta burgdorferi (SEC ID N� 15)
102, 111
Borrelia afzelii (SEC ID N� 16)
101
Enterococcus faecalis (SEC ID N� 20)
102, 110
Streptococcus pyogenes (SEC ID N� 13)
104
Stretopcoccus pneumoniae (SEC ID N� 14)
103
Lactobacillus sakei (SEC ID N� 21)
97, 106
Giardia intestinalis (SEC ID N� 17)
114, 116
Actualmente se cree que el acoplamiento de polietilenglicol a dichas lisinas o combinaciones de las mismas puede inactivar la enzima. Actualmente se cree que las sustituciones de amino�cidos en dichas lisinas puede dar lugar a una proteína que pierde menos de su actividad enzim�tica tras las pegilaci�n.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona varias sustituciones de amino�cidos en la cadena polipept�dica de la arginina deiminasa. Estas sustituciones de amino�cidos proporcionan arginina deiminasa modificada que pierde menos actividad tras la pegilaci�n, es decir; tras la pegilaci�n, la reducción de la actividad enzim�tica que sigue a la pegilaci�n en las argininas deiminasas modificadas es menor que la reducción de la actividad enzim�tica que sigue la pegilaci�n en las argininas deiminasas no modificadas. Mediante la eliminación de los sitios de pegilaci�n en o adyacentes a la región catalítica de la enzima, puede lograrse la pegilaci�n óptima sin la pérdida tradicional de actividad. Como se analizó anteriormente, la arginina deiminasa de ciertos organismos tiene sitios de pegilaci�n ubicados en varias posiciones en la cadena pept�dica. Aunque no se limite a la presente invención, actualmente se cree que la arginina deiminasa puede tener el amino�cido de lisina posicionado en o adyacente a la región catalítica de la enzima y que la pegilaci�n de esos sitios puede inactivar la enzima. Eliminando al menos uno de estos sitios de pegilaci�n, la pegilaci�n puede lograrse y se conserva más actividad enzim�tica. De acuerdo con la invención, en algunas realizaciones, la lisina se sustituye con ácido glut�mico, valina, ácido asp�rtico, alanina, isoleucina, leucina o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones de la invención, la arginina deiminasa modificada de Mycoplasma hominis tiene una sustitución de amino�cidos en Lys112, Lys374, Lys405, Lys408
o combinaciones o subcombinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa modificada de Mycoplasma hominis tiene una sustitución de amino�cidos en Lys112 en Glu112, Lys374 en Glu374, Lys405 en Glu405,
Lys408
en Glu408 o combinaciones o subcombinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa modificada de Mycoplasma hominis tiene lisina en la posición 112 sustituida con ácido glut�mico (SEC ID N� 2).
La presente invención, proporciona de este modo sustituciones de amino�cidos en la cadena polipept�dica de la arginina deiminasa. Dichas sustituciones de amino�cidos pueden eliminar las características estructurales problem�ticas en la cadena pept�dica de la arginina deiminasa. Dichas sustituciones de amino�cidos proporcionan la renaturalizaci�n mejorada de la arginina deiminasa modificada. Estas sustituciones de amino�cidos hacen posible la rápida renaturalizaci�n de la arginina deiminasa modificada utilizando cantidades reducidas de tampón. Estas
sustituciones de amino�cidos pueden asimismo proporcionar rendimientos mejorados de arginina deiminasa modificada renaturalizada. En algunas realizaciones de la invención, la arginina deiminasa modificada tiene una única sustitución de amino�cidos en Pro210. Como se mencion� anteriormente, la arginina derivada de Mycoplasma hominis tiene el amino�cido de prolina ubicado en la posición 210. Aunque no se limite a la presente invención, actualmente se cree que la presencia del amino�cido de prolina en la posición 210 da lugar a una curva o una vuelta en la cadena polipept�dica normal que aumenta la dificultad de renaturalizaci�n (es decir; repliegue) de la arginina deiminasa. Las sustituciones de prolina en la posición 210 pueden hacer posible la rápida renaturalizaci�n de la arginina deiminasa modificada utilizando cantidades reducidas de tampón. Las sustituciones de prolina en la posición 210 pueden asimismo proporcionar rendimientos mejorados de arginina deiminasa modificada renaturalizada. En algunas realizaciones, la prolina en la posición 210 se sustituye con serina (SEC ID N� 3). Se debe entender que de acuerdo con este aspecto de la invención, pueden realizarse otras sustituciones en la posición
210. Ejemplos de sustituciones incluyen Pro210 en Thr210, Pro210 en Arg210, Pro210 en Asn210, Pro210 en Gln210 o Pro210 en Met210. Eliminando estas características estructurales asociadas con el amino�cido de la posición 210 de la arginina deiminasa de tipo salvaje, puede lograse el repliegue apropiado de la enzima.
En algunas realizaciones de la invención, la arginina deiminasa modificada tiene múltiples sustituciones de amino�cidos. La arginina deiminasa modificada puede tener al menos una sustitución de amino�cidos que elimina los sitios de pegilaci�n en o adyacentes a una región catalítica de la enzima. La arginina deiminasa modificada puede asimismo tener al menos una sustitución de amino�cidos que elimina aquellas características estructurales que interfieren con la renaturalizaci�n de la enzima. Las sustituciones de amino�cidos pueden, de ese modo, proporcionar una arginina deiminasa modificada de la invención. Las sustituciones de amino�cidos pueden proporcionar la pegilaci�n de la arginina deiminasa modificada sin pérdida de la actividad enzim�tica. Las sustituciones de amino�cidos pueden proporcionar arginina deiminasa modificada que puede renaturalizarse rápidamente utilizando cantidades reducidas de tampón. Las sustituciones de amino�cidos pueden asimismo proporcionar rendimientos mejorados de arginina deiminasa modificada renaturalizada. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa modificada derivada de Mycoplasma hominis incluye la prolina en la posición 210 sustituida con serina y la lisina en la posición 112 sustituida con ácido glut�mico (SEC ID N� 4). Como se analizó anteriormente, no obstante, debe entenderse que la arginina deiminasa modificada puede incluir otras sustituciones. En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras pueden realizarse en las posiciones 112 y / o 210 de la arginina deiminasa de tipo salvaje.
La arginina deiminasa modificada se expres� en las células JM101 descritas anteriormente por Takaku et al., supra. La arginina deiminasa modificada incluyó ácido glut�mico en la posición 112 y serina en la posición 210. En algunas realizaciones, la secuencia de amino�cidos de la arginina deiminasa modificada de Mycoplasma hominis es una secuencia de la SEC ID N� 4.
En algunas realizaciones, la arginina deiminasa se deriva de la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma arginini, Giardia intestinales, Clostridium prefringens, Bacillus licheniformis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Enterococcus faecalis, Stretopcoccus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus sakei o Giardia intestinalis.
En algunas realizaciones, la arginina deiminasa se deriva de la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis (SEC ID N� 1). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa comprende la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina en comparación con la SEC ID N� 1. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina comprende la sustitución o deleci�n del residuo de prolina en o correspondiente al residuo 210 de la SEC ID N� 1. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina comprende la sustitución del residuo de prolina en o correspondiente al residuo 210 de la SEC ID N� 1 con Ser, Thr, Arg, Asn, Gln,
o Met. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina comprende la sustitución del residuo de prolina en o correspondiente al residuo 210 de la SEC ID N� 1 con Ser.
En algunas realizaciones de la presente invención, la arginina deiminasa est� modificada y comprende al menos una sustitución o deleci�n de un amino�cido, en el que la arginina deiminasa modificada tiene un número reducido de sitios de pegilaci�n en o adyacentes a una región catalítica en comparación con la SEC ID N� 1. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de lisina comprende la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de lisina en o correspondiente a los residuos 112, 374, 405 o 408 de la SEC ID N� 1. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de lisina comprende la sustitución de al menos un residuo de lisina en o correspondiente a los residuos 112, 374, 405 o 408 de la SEC ID N� 1 con Glu, Val, Asp, Ala, Ile, o Leu. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de lisina comprende la sustitución del residuo de lisina en o correspondiente al residuo 112 de la SEC ID N� 1 con Glu, Val, Asp, Ala, Ile, o Leu. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de lisina comprende la sustitución del residuo de lisina en o correspondiente al residuo 112 de la SEC ID N� 1 con Glu. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa modificada comprende además la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina.
En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina comprende la sustitución del residuo de prolina en o correspondiente al residuo 210 de la SEC ID N� 1 con Ser, Thr, Arg, Asn, Gln, o Met. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa comprende arginina deiminasa modificada para estar libre de, al
menos, un sitio de pegilaci�n en o adyacente a una región catalítica, en comparación con la SEC ID N� 1; en el que dicha arginina deiminasa modificada comprende al menos una sustitución o deleci�n de amino�cidos en o correspondiente a los residuos 112, 374, 405 o 408 de la SEC ID N� 1. En algunas realizaciones, al menos la sustitución o deleci�n de amino�cidos comprende la sustitución del residuo de lisina en o correspondiente al residuo 112 de la SEC ID N� 1 con Glu, Val, Asp, Ala, Ile, o Leu. En algunas realizaciones, al menos una sustitución o deleci�n de amino�cidos comprende además la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina comprende la sustitución o deleci�n del residuo de prolina en o correspondiente al residuo 210 de la SEC ID N� 1. En algunas realizaciones, la sustitución o deleci�n de al menos un residuo de prolina comprende la sustitución del residuo de prolina en o correspondiente al residuo 210 de la SEC ID N� 1 con Ser, Thr, Arg, Asn, Gln, o Met.
En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis comprende una sustitución de lisina en el residuo 112 de la SEC ID N� 1 con ácido glut�mico (SEC ID N� 2). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis comprende una sustitución de prolina en el residuo 210 de la SEC ID N� 1 con serina (SEC ID N� 3). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma hominis comprende una sustitución de lisina en el residuo 112 de la SEC ID N� 1 con ácido glut�mico y una sustitución de prolina en el residuo 210 de la SEC ID N� 1 con serina (SEC ID N� 4). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma arginini comprende una sustitución de lisina en el residuo 111 de la SEC ID N� 5 con ácido glut�mico (SEC ID N� 6). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma arthritidis comprende sustituciones de lisina en los residuos 111 y 112 de la SEC ID N� 7 con ácido glut�mico (SEC ID N� 8). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma arthritidis comprende una sustitución de lisina en el residuo 111 de la SEC ID N� 7 con ácido glut�mico (SEC ID N� 9). En algunas realizaciones, la arginina deiminasa de Mycoplasma arthritidis comprende una sustitución de lisina en el residuo 112 de la SEC ID N� 7 con ácido glut�mico (SEC ID N� 10).
Tales modificaciones y / o sustituciones, as� como las secuencias nucle�tidas y polipept�dicas, se describen en la Patente U.S. N� 6.183.738, publicada el 6 de febrero de 2001, y Solicitud en trámite con el número de serie 09 / 564.559, presentada el 4 de mayo de 2000.
Polietilenglicol
Existen numerosos polietilenglicoles disponibles que difieren en su peso molecular y en su grupo de enlace. Estos PEGs pueden tener efectos que varían en la antigenicidad, inmunogenicidad y la semivida en la circulación de una proteína (Zalipsky S y Lee C. Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications. P�gs. 347 – 370, Plenum Pres, Nueva York, 1992; Monfardi C et al. Bioconjugate Chem. 6, 62 – 69, 1995; Delgado C; Francis GE; Fisher D. The uses and properties of PEG – linked proteins. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys., 9: 249 – 304, 1992).
En algunas realizaciones de la presente invención, cada molécula de polietilenglicol tiene un peso molecular medio de entre 10.000 a 50.000; de 12.000 a 40.000, de 15.000 a 30.000, y 20.000. En general, el polietilenglicol con un peso molecular de 30.000 es más difícil de disolver, y los rendimientos del producto formulado se reducen en gran medida.
El polietilenglicol puede ser una cadena lineal o ramificada. En algunas realizaciones, el polietilenglicol es una cadena lineal. Un aumento del peso molecular del polietilenglicol tiende a disminuir la inmunogenicidad de la ADI. Los polietilenglicoles que tienen pesos moleculares descritos en la presente invención pueden utilizarse en conjunto con ADI, y, de manera opcional, con un grupo de enlace biocompatible para tratar las enfermedades virales.
Pegilaci�n
ADI puede unirse covalentemente a PEG mediante un grupo de enlace biocompatible, utilizando métodos conocidos en la disciplina, como los descritos, por ejemplo, por Park et al., Anticancer Re., 1: 373 – 376 (1981); y Zaplilsky and Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, de. Plenum Press, NY, Capítulo 21 (1992).
El grupo enlace utilizado para unir covalentemente PEG a ADI puede ser cualquier grupo de enlace compatible. En algunas realizaciones, el grupo de enlace es un grupo de enlace biocompatible. Como se ha mencionado anteriormente, “biocompatible” indica que el compuesto o grupo no es tóxico y puede utilizarse in vitro o in vivo sin causar daño, enfermedad, trastorno o muerte. PEG puede unirse al grupo de enlace, por ejemplo, mediante un enlace éter, un enlace éster, un enlace tiol o un enlace amida. Los grupos de enlace apropiados incluyen, por ejemplo, un grupo éster, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un carbohidrato, un grupo succinimida (incluyendo, por ejemplo, succinimidil succinato (SS), succinimidil propionato (SPA), succinimidil carboximetilato (SCM), succinimidil succinamida (SSA) o succinimida N – hidroxi (NHS)), un grupo ep�xido, un grupo oxicarbonilimidazol (incluyendo, por ejemplo, carbonildimidazol (CDI)), un grupo nitrofenil (incluyendo, por ejemplo, nitrofenil carbonato (NPC) o triclorofenil carbonato (TPC)), un grupo trisilato, un grupo aldeh�do, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo ciste�na, un grupo histidina o una amina primaria. En algunas realizaciones, el grupo de enlace es un grupo éster y / o un grupo succinimida. En algunas realizaciones, el grupo de enlace es SS, SPA, SCM, SSA o NHS.
En la presente invención, los grupos de enlace particulares no parecen influenciar la semivida en la circulación de PEG – ADI o su actividad enzim�tica específica. Sin embargo, si se utiliza un grupo de enlace, en algunas realizaciones es importante utilizar un grupo de enlace biocompatible. El PEG que se une a la proteína puede ser monocatenario, como SS – PEG, SPA – PEG y SC – PEG, o puede utilizarse una cadena ramificada de PEG, como PEG2 – NHS.
De manera alternativa, ADI puede acoplarse directamente a PEG (es decir, sin un grupo de enlace) mediante un grupo amino, un grupo sulfidral, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo. En algunas realizaciones, PEG se acopla a residuos de lisina en ADI.
ADI – PEG
La unión de PEG a ADI incrementa la semivida en la circulación de ADI. El número de moléculas de PEG en ADI parece estar relacionado con la semivida en la circulación de la enzima, mientras que la cantidad de actividad enzim�tica retenida parece estar relacionada al peso molecular medio del PEG utilizado. Incrementar el número de unidades de PEG en ADI disminuye la actividad enzim�tica de la enzima. También, se sabe que algunas formulaciones de PEG son difíciles de producir y producen cantidades relativamente pequeñas de producto. Por tanto, para conseguir un producto eficaz, es necesario lograr un balance entre semivida en la circulación, antigenicidad, eficacia de producción y actividad enzim�tica.
Generalmente, PEG se une a una amina primaria de ADI. La selección del sitio de unión de polietilenglicol en la arginina deiminasa se determina por el papel de cada sitio en el dominio activo de la proteína, como los expertos en la disciplina deberían saber. PEG puede unirse a las aminas primarias de la arginina deiminasa sin pérdida sustancial de actividad enzim�tica. Por ejemplo, el ADI clonado a partir de Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritidis y Mycoplasma hominis tiene unas 17 lisinas que pueden modificarse mediante este procedimiento. En otras palabras, las 17 lisinas son posibles puntos en los que puede unirse ADI a PEG mediante grupo de enlace biocompatible, como SS, SPA, SCM, SSA y / o NHS. PEG también puede unirse a otros sitios en ADI, como resultar� evidente para los expertos en la disciplina a tenor de la presente divulgación.
Pueden unirse de 1 a 30 moléculas de PEG a ADI covalentemente. En algunas realizaciones, ADI se modifica con 7 a 15 moléculas de PEG, de 9 a 12 moléculas de PEG. En otras palabras, del 30 % al 70 % de los grupos amino primarios en arginina deiminasa se modifican con PEG, del 40 % al 60 %, del 45 % al 55 % y el 50 % de los grupos amino primarios en arginina deiminasa se modifican con PEG. En algunas realizaciones, cuando PEG est� unido covalentemente al extremo terminal de ADI, solo se utiliza 1 molécula de PEG. Incrementar el número de unidades de PEG en ADI incrementa la semivida en la circulación de la enzima. Sin embargo, incrementar el número de unidades de PEG en ADI disminuye la actividad específica de la enzima. Por tanto, para conseguir un producto eficaz, es necesario lograr un balance entre ambos, como resultar� evidente para los expertos en la disciplina a tenor de la presente divulgación.
En algunas realizaciones de la presente invención, los grupos de enlace se unen a una amina primaria de arginina deiminasa mediante un grupo maleimida. Una vez unidos a la arginina deiminasa, SS – PEG tiene un enlace éster próximo al PEG, que puede volver este sitio sensible al suero esterasa, que puede librerar PED a partir de ADI en el cuerpo. SPA – PEG y PEG2 – NHS no tiene un enlace éster, de manera que no son sensibles al suero esterasa.
Las fórmulas estructurales de ciertos grupos de enlace útiles para la presente invención se establecen a continuación.
M�todos de tratamiento
En algunas realizaciones, la presente invención describe un compuesto que comprende ADI unido covalentemente mediante un grupo de enlace a polietilenglicol, en el que cada molécula de polietilenglicol tiene un peso molecular medio de 10.000 a 30.000 para su uso en el tratamiento de la infección por hepatitis C en un individuo. En algunas realizaciones, ADI se modifica con moléculas de polietilenglicol, cada molécula tiene un peso molecular medio de
20.000. En algunas realizaciones, el grupo de enlace se selecciona del grupo formado por un grupo succinimida, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un cabohidrato, un grupo tirosina, un grupo ciste�na, un grupo histidina y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el grupo de enlace es succinato succinimidil. En algunas realizaciones, se unen de 7 a 15 moléculas de polietilenglicol a arginina deiminasa. En algunas realizaciones, se unen de 9 a 12 moléculas de polietilenglicol a arginina deiminasa. En algunas realizaciones, la arginina deiminasa deriva de un microorganismo del género Mycoplasma. En algunas realizaciones, la deiminasa arginima deriva de Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma hominis y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los métodos comprenden, además, la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti viral adicional antes, durante, o después de la administración de la arginina deiminasa.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de uno de los compuestos de la presente invención es una cantidad que es efectiva para inhibir la replicaci�n viral. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis que pueden aumentarse poco a poco hasta conseguir el efecto óptimo. Generalmente, una dosis terapéutica de compuestos de la presente invención puede ser de 1 a 200 mg / kg dos veces por semana hasta una vez cada dos semanas. Por ejemplo, la dosis puede ser de 1 mg / kg una vez a la semana en forma de una inyección intravenosa de 2 ml hasta 20 mg / kg una vez cada tres días. Los compuestos pueden administrarse en una dosis, de manera continuada o intermitente durante el curso del tratamiento. ADI – PEG puede administrarse varias veces al día, una vez al día, una vez a la semana o una vez cada dos semanas.
En algunas realizaciones, ADI – PEG se administra en una dosis semanal de, al menos, 40 UI / m2, al menos, 80 UI / m2, al menos, 160 UI / m2 o, al menos, 200 UI / m2. En algunas realizaciones, la dosis administrada reduce los niveles en plasma de arginina a menos de 10 �M, 5 �M, 1 �M o 100 �M. En algunas realizaciones, ADI – PEG20 se administra en una dosis semanas de 160 UI / m2 dando como resultado un nivel de plasma en el paciente inferior a 5 �M.
La presente invención describe una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su uso en un método para el tratamiento de la infección por hepatitis C en un individuo, en el que se ha identificado que el individuo ha sido infectado por uno o más virus. En algunas realizaciones, el virus es un virus humano. En algunas realizaciones, el individuo est� infectado por uno o más virus diferentes. En algunas realizaciones, los dos o más virus son VIH o VHC. En algunas realizaciones, la presencia y / o identidad de un virus infeccioso es desconocida antes o durante el tiempo de administración. En algunas realizaciones, los métodos comprenden, además, la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti viral adicional antes, durante o después de la administración de la arginina deiminasa.
La presente invención describe, además, una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su uso en el tratamiento de un individuo sospechoso de haber estado expuesto al virus de la hepatitis C. Como se ha mencionado anteriormente, algunos individuos que no han sido diagnosticados como infectados por uno o más virus se han puesto en una situación en la que es posible que hayan sido expuestos al virus. El tratamiento de individuos sospechosos de estar expuestos a uno o más virus también incluye la administración de terapéuticos adicionales como se ha descrito anteriormente. El curso del tratamiento profiláctico puede llevarse a cabo junto a un control periódico para las indicaciones de infección viral. En algunas realizaciones, tras el comienzo del tratamiento según la presente invención, el individuo es diagnosticado como positivo para uno o más virus.
En algunas realizaciones, la presente invención describe una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su uso en un método para el tratamiento de la infección por hepatitis C en un individuo, en el que el individuo est� en riesgo por uno o más virus. Los métodos comprenden la administración al individuo de una cantidad efectiva de una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para inhibir la replicaci�n viral.
En algunas realizaciones, la presente invención describe una composición como la definida en las reivindicaciones, para su uso en el tratamiento de la infección por hepatitis C en un individuo. Los métodos comprenden la administración al individuo de una cantidad efectiva de una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para inhibir la replicaci�n viral.
En algunas realizaciones, la composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol es efectiva a una concentración inferior a 0,1 mM para inhibir la replicaci�n viral en, al menos, el 50 % de más del 50 % de las células de un ensayo in vitro para medir la replicaci�n viral. En algunas realizaciones, la composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol es efectiva a una concentración inferior a 0,05 mM para inhibir la replicaci�n viral en, al menos, el 50 % de más del 50% de las células en un ensayo in vitro para medir la replicaci�n viral. En algunas realizaciones, la composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol es efectiva a una concentración inferior a 0,01 mM para inhibir la replicaci�n viral en, al menos, el 50 % de más del 50% de las células en un ensayo in vitro para medir la replicaci�n viral.
En algunas realizaciones, la presente invención describe una composición, como se define en las reivindicaciones, para su uso en métodos para tratar concurrentemente un tumor y la infección por hepatitis C en un individuo. El método comprende la administración al individuo de una cantidad terapéutica o profil�cticamente efectiva de una arginina deiminasa unida covalentemente mediante un grupo de enlace a polietilenglicol. En algunas realizaciones, el tumor se selecciona del grupo formado por melanoma, sarcoma y hepatoma. En algunas realizaciones, el tumor es hepatoma y el virus es VHC. En algunas realizaciones, se desconoce la presencia y / o identidad del tumor durante el tratamiento. En algunas realizaciones, se desconoce la presencia y / o la identidad del virus durante el tratamiento. En algunas realizaciones, los métodos comprende, además, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti viral adicional antes, durante, o después de la administración de la arginina deiminasa.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe métodos para modular los niveles de óxido nítrico en un individuo, comprendiendo la administración a dicho individuo de una cantidad terapéutica o profil�cticamente efectiva de una arginina deiminasa unida a polietilenglicol. En algunas realizaciones de la divulgación, la modulación es la inhibición de los niveles de óxido nítrico. Los métodos pueden comprender, además, la administración de una cantidad terapéutica o profil�cticamente efectiva de un agente antiviral adicional antes, durante, o después de la administración de la arginina deiminasa. En algunas realizaciones, el individuo ha sido identificado como infectado con uno o más virus.
En algunas realizaciones, la presente invención describe métodos para determinar la sensibilidad de replicaci�n de la hepatitis C para modular los niveles de arginina que comprenden poner en contacto una muestra con el virus de la hepatitis C con una composición que comprende arginina deiminasa unida a polietilenglicol y medir los niveles de ARN v�rico o productos de ARN v�rico. Los métodos para medir los niveles de ARN v�rico o productos del mismo son bien conocidos por los expertos en la disciplina. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe métodos para inhibir selectivamente la replicaci�n viral en un individuo infectado con uno o más virus. Los métodos comprenden la administración al individuo de una cantidad terapéutica o profil�cticamente efectiva de una composición que comprende una arginina deiminasa unida a
polietilenglicol. En algunas realizaciones, el SI es superior a 10, superior a 15, superior a 20 o superior a 25.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe métodos para mejorar la función hepática en un individuo que incluyen la administración a dicho individuo de una cantidad terapéutica o profil�cticamente efectiva de una composición que incluye arginina deiminasa unida a polietilenglicol.
Los expertos en la disciplina determinarán fácilmente la calidad de la función hepática. En algunas realizaciones, la cantidad relativa de uno o más marcadores se compara entre un paciente sano y un paciente con una enfermedad o trastorno hepático.
En algunas realizaciones, la función hepática se establece utilizando la escala de Child – Pugh o la escala Mayo del modelo para las enfermedades terminales del hígado (MELD). La escala de clasificación de la función hepática de Child – Pugh utiliza varios factores para predecir la mortalidad en enfermedades hepáticas. Los factores considerados en la escala Child – Pugh incluyen los niveles de bilirrubina, los niveles de creatina, la relación normalizada internacional (INR; también conocida como tiempo de protrombina (medida de la capacidad de la sangre para coagularse)), la presencia de ascitis en el abdomen y el grado de la encefalopat�a. Los grados se asignan a los niveles de anormalidad de la función hepática; el grado “A” refleja una puntuación de Child – Pugh de 5 – 6 puntos e indica el nivel más bajo de anormalidad hepática. El grado “B” refleja una puntuación de Child – Pugh de 7 – 9 puntos e indica un nivel intermedio de anormalidad hepática. El grado “C” refleja una puntuación de Child – Pugh de 10 – 15 puntos e indica el nivel más alto de anormalidad hepática. La escala de clasificación de la función hepática de MELD toma en consideración los niveles de bilirrubina, los niveles de creatina y la relación normalizada internacional.
En algunas realizaciones, la función hepática del individuo antes de la administración de la arginina deiminasa unida a polietilenglicol es nivel A, nivel B o nivel C en la escala Child – Pugh.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe métodos para identificar un individuo con una o más infecciones virales como susceptible a la terapia por deprivaci�n de arginina. Los métodos comprenden obtener una muestra viral del individuo y comparar la replicaci�n viral en la muestra en presencia y ausencia de una composición con arginina deiminasa unida a polietilenglicol en condiciones apropiadas para la replicaci�n viral. En algunas realizaciones de la divulgación, una inhibición de replicaci�n viral de, al menos, el 40 %, al menos, el 50 %, o, al menos el 80 % en la muestra en contacto con ADI – PEG es indicativa de un individuo que es candidato para la terapia por deprivaci�n de arginina y una inhibición de replicaci�n viral con ADI – PEG inferior al 40 %, inferior al 30 % o inferior al 20 % es indicativa de un individuos que no es candidato para la terapia por deprivaci�n de arginina.
En algunas realizaciones, la presente invención describe una composición, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para el tratamiento de una o más infecciones v�ricas en un individuo. Los métodos comprenden determinar si el individuo es candidato a la terapia por deprivaci�n de arginina como se describe anteriormente y tratar al individuo con la terapia de deprivaci�n de arginina si el individuo es un candidato para dicha terapia y tratar al individuo con un tratamiento anti viral convencional si el individuo no es candidato a la terapia de depravación de arginina.
Los métodos para determinar los medios y las dosis de administración más efectivos son bien conocidos por los expertos en la disciplina. En algunas realizaciones, se utiliza una dosis dos veces por semana durante un período de tiempo de varias semanas. A menudo, los compuestos antivirales se administrarán durante períodos de tiempo extensos y pueden administrarse al individuo de por vida. Los métodos para determinar los medios y las dosis de administración más efectivos son bien conocidos por los expertos en la disciplina. Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples con un nivel de dosis y un patrón seleccionado por el administrador.
La dosis administrada, por supuesto, variar� según factores conocidos, como las características farmacodin�micas del agente en particular y su modo y vía de administración; la edad, salud y / o peso del individuo; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento actual; la frecuencia del tratamiento; los síntomas mostrados por el individuo y el efecto deseado.
Los síntomas o criterios de la respuesta al tratamiento antiviral se centra en el nivel de replicaci�n viral en el caso de la mayoría de las infecciones v�ricas. Las pruebas para los niveles de ARN v�rico circulante y los cambios del mismo son estándares y pueden aplicarse en células y animales, incluyendo animales. En pacientes humanos, pueden llevarse a cabo pruebas para comprobar la actividad hepática. Por ejemplo, una prueba es la prueba de ALT (transaminasa glut�mico -pir�vica s�rica). ALT es una enzima encontrada en el hígado, pero también, en menor grado, en el corazón y otros tejidos, y es útil en el diagnóstico de la función hepática. En el humano adulto normal oscila entre 0 y 48 U / L con una lectura óptima de 24 U / L. La mejora en uno o más de estos criterios señala una dosis o tratamiento efectivo. Los compuestos pueden administrarse en una mezcla con diluyentes, extendedores, excipientes o portadores farmac�uticamente aceptables (colectivamente denominados en la presente como portador farmac�uticamente aceptable) seleccionado respecto a la forma pretendida de administración y según las prácticas farmacéuticas convencionales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, ADI – PEG puede mezclarse con una solución salina
tamponada con fosfato, o con cualquier otra solución apropiada conocida por los expertos en la disciplina, antes de la inyección. La formulación de ADI – PEG puede administrarse como un formulación sólida (liofilizada) o líquida, según se desee.
Las composiciones de la presente invención est�n formuladas según el método de administración que se va a utilizar. En los casos en los que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, son estériles, libres de pir�geno y libres de partículas. En algunas realizaciones, las composiciones son formulaciones isot�nicas. En algunas realizaciones, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir uno o más de cloruro sádico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunas realizaciones, las composiciones se presentan como soluciones isot�nicas como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizantes para las composiciones incluyen gelatina y albúmina en algunas realizaciones.
La presente invención también describe un compuesto que comprende ADI unido covalentemente mediante un grupo de enlace a polietilenglicol para su uso en métodos de tratamiento de infección por hepatitis C en un individuo en el que el individuo ha sido infectado con uno o más virus.
Terapia de combinación
El siguiente párrafo se aplica exclusivamente en la extensión que es un objeto incluido en el alcance de las reivindicaciones. Los compuestos de la presente invención puede combinarse, además, con otros compuestos antivirales para proporcionar una terapia de combinación. Cualquier antiviral conocido puede combinarse con las composiciones de la presente invención, siempre que la combinación no elimine la actividad antiviral del compuesto de ADI – PEG. En el caso del VIH, una terapia de combinación de ADI – PEG con AZT, TC – 3 p inhibidores de proteasa puede ser más efectiva que cualquier agente de manera individual. En el caso de hepatitis, una combinación de ADI – PEG con uno o más de ciclovir, famciclovir o valaciclovir, ribavirin, interfer�n o beta globulina se administra como una terapia de combinación. Para herpes, puede utilizarse interfer�n alfa recombinante como terapia de combinación con ADI – PEG.
Otros agentes antivirales apropiados para su uso en terapia de combinación son ya conocidos por los expertos en la disciplina e incluye, de manera no limitante, uno o más de AZT (Zidovudina, Retrovir), ddI (Didanosina, Videx), 3TC (Lamivudina, Epivir), d4T (Estavudina, Zerit), abacavir (Ziagen), ddC (Zalcitabina, Hivid), Nevirapina (Viramune), Delavirdina (Rescriptor), Indinavir (Crixivan), Ritonavir (Norvir), nelfinavir (Viracept), saquinavir, Lopinavir / Ritonavir (Kaletra), amprenavir (Agenerasa), Atazanavir, tipranavir, inhibidor de fusión T – 20, Interleucina – 2, hidroxiurea, AR177 (Zintevir), sodio de fomivirsen (Vitravene), GEM 132, GEM 91, GEM 92, AMD 3100, n – docosanol (1 – docosanol), PRO2000, T – 1249, T – 20, arbidol, SP – 303 (Virend), hipericina (VIMRxyn), MDL 28574, SC – 48334, ADA, imiquimod (Aldara), ISIS 5320, resiquimod, adefovir dipivoxil (Preveon), DAPD, emtricitabina (Coviracil), entecavir, lamivudina (Zeffix, Epivir -HBV, Heptovir, Heptodin), amantadina (Symmetrel), oseltamivir (Tamiflu), pirodavir, pleconaril (VP-63843), ribavirina (Virazid / Virazide / Virazole), rimantadina (Flumadine), WIN 54954, zanamivir (Relenza), foscarnet (Foscavir), maribavir, ABT-378, mesilato de atevirdina, Calanolida A, capravirina, Efavirenz (Sustiva), emivirina (Coactinon), GW420 867X (también conocido como HBY 1293), HBY 097, L-697,661, lovirida, MIV-150, PETT-5, R165335-TMC125, talviralina, tivirapina, trovirdina, aciclovir (Zovirax), brivudina (Helpin, Zostrex), cidofovir (Vistide; Forvade (t�pico)), HPMPC cíclico, famciclovir (Famvir), fiacitabina, fialuridina, ganciclovir (Cymvene / Cytovene), GW-273175X, idoxuridina (Herpid, Kerecid / Herplex Liquifilm, Idoxene, Virudox, Iduridin, Stoxil), Lobucavir, netivudina (Zonavir), penciclovir (Vectavir / Denavir), sorivudina (Usevir), trifluridina (Viroptic), valaciclovir (Valtrex; Zelitrex), estereato de valomaciclovir (MIV -606), vidarabina (Vira -A), 935U83, abacavir (Ziagen / Trizivir), adefovir, adefovir dipivoxilo (Preveon), alovudina, AzdU, CS-92, DAPD, didanosina (Videx), dOTC, emtricitabina (Coviracil), fozivudina tidoxilo, lamivudina (Epivir/Combivir/Trizivir), lobucavir, lodenosina, estavudina (Zerit), tenofovir (Viread), tenofovir disoproxil fumarato, zalcitabine (Hivid), zidovudina (Retrovir), A-77003, AG7088, amprenavir (Agenerase), BMS-232632, delavirdina (Rescriptor), DMP -323, DMP -450, GW 433 908, indinavir (Crixivan), KNI -272, lasinavir, lopinavir (Kaletra), Mozenavir, nelfinavir (Viracept), PD 178390, ritonavir (Norvir), RPI 312, saquinavir (Invirase / Fortovase), SC -52151, SDZ PRI 053, tipranavir, U -103017, U -96988, Hidroxiurea (Hydrea), AGI549, foscarnet (Foscavir), LiGLA, Aciclovir -Valaciclovir, Famciclovir, Idoxuridina, Ganciclovir, Foscarnet, Cidofovir, y Adefovir, enfuvirtida, Valcyte, clevudina, timalfasina, IL-12, entre otros.
La terapia de combinación puede ser secuencial, que es el tratamiento con un agente primero y, después, el segundo agente, o puede ser el tratamiento con ambos agentes al mismo tiempo. La terapia secuencial puede ser en un tiempo razonable tras el término de la primera terapia antes de empezar la segunda terapia. El tratamiento con ambos agentes al mismo tiempo puede ser en la misma dosis diaria o en dosis separadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tratamiento con un agente se realiza en el día 1 y con el otro en el día 2. El régimen exacto depender� de la enfermedad que se est� tratando, de la severidad de la infección y de la respuesta al tratamiento.
Los medios de administración de los compuestos de la presente invención in vivo variarán dependiendo de la aplicación pretendida. Como resultar� evidente para un experto en la disciplina, la administración de la composición ADI – PEG de la presente invención puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante inhalaci�n o supositorio o en los tejidos mucosos, como mediante un lavado por vía vaginal, rectal, uretral, tejido bucal y sublingual, oral, típica, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intralinf�tica, intratumoral, intramuscular, intersticial, intraarterial,
subcut�nea, intraocular, intrasinovial, transepitelial y transd�rmica. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en forma de dosis oral como tabletas, cápsulas, pastillas, polvos, gránulos, elixires, tintes, suspensiones, jarabes y emulsiones. Los compuestos también pueden administrarse de manera intravenosa (bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, todas ellas utilizando formas de dosis bien conocidas por los expertos en la disciplina farmacéutica.
EJEMPLOS
La invención se demuestra, además, por los siguientes ejemplos, con fines meramente ilustrativos y que no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Producción de ADI recombinante
Los cultivos de Mycoplasma arginini (ATCC 23243), Mycoplasma hominis (ATCC 23114) y Mycoplasma arthritidis (ATCC 23192) se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
La arginina deiminasa se clon� a partir de Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominis y Mycoplasma arthritidis y se expresaron en E. coli como se describió anteriormente por S. Misawa et al., J. Biotechnology, 36: 145 – 155 (1994). La caracterización, mediante métodos conocidos por los expertos en la disciplina, de cada proteína respecto a la actividad enzim�tica específica, Km, Vm�x y pH óptimo revelaron que eran bioqu�micamente indistinguibles unos de otros. El pH óptimo se determin� utilizando un tampón de citrato (pH 5 – 6,5), un tampón de fosfato (pH 6,5 – 7,5) y un tampón de borato (pH 7,5 – 8,5). La Km y la Vm�x se determinaron incubando la enzima con varias concentraciones de arginina y cuantificando la producción de citrulina. La Km de varias enzimas fue de 0,02 a 0,06 μM y la Vm�x fue de 15 – 20 μmol / min / mg, cuyos valores est�n en el error estándar de los demás.
Los genes de arginina deiminasa se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando el siguiente par cebador a partir de la secuencia publicada de M. arginini, como se describe, por ejemplo, en T. Ohno et al., Infect. Immun., 58: 3788 – 3795 (1990):
5' – GCAATCGATGTGTATTGACAGT – 3' (SEC ID N� 11) 5' – TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG – 3' (SEC ID N� 12)
El producto de la reacción en cadena de la polimerasa se clon� como un fragmento Bam H1 – Hind III en el pl�smido de expresión pQE16. El análisis de la secuencia de ADN indicó que este fragmento tenía la misma secuencia para el gen de la arginina deiminasa que el descrito en Ohno et al., Infect. Immun., supra. Los cinco codones TGA del gen ADI que condifican el tript�fano en Mycoplasma se cambiaron por codones TGG mediante mutag�nesis dirigida a oligonucle�tidos antes de la expresión g�nica en E. coli, como se establece, por ejemplo, en J. R. Sayers et al., Biotechniques, 13: 592 – 596 (1992). El ADI recombinante se expres� en cuerpos de inclusión a niveles del 10 % de proteína celular total.
Las proteínas de cada una de las tres especies anteriores de Mycoplasma tenían aproximadamente un 95 % de homología y se purificaron fácilmente mediante cromatograf�a en columna. Aproximadamente pueden aislarse 1,2 g de proteína pura a partir de 1 litro de caldo de fermentación. El ADI recombinante es estable durante 2 semanas a 37 �C y durante, al menos, 8 meses cuando se conserva a 4 �C. Como se determina en los métodos conocidos por los expertos en la disciplina, las proteínas tenían una alta afinidad con la arginina (0,04 μM) y un pH fisiológico óptimo de 7,2 a 7,4.
Ejemplo 2: Renaturalizaci�n y purificación del ADI recombinante
Se renaturaliz� la proteína de ADI, con modificaciones menores, como se describe en Misawa et al., J. Biotechnology, 36: 145 – 155 (1994). Se resuspendieron 100 gr de pasta celular en 800 ml de 10 mM K2PO4, pH 7,0, 1 mM EDTA (tampón 1) y las células se rompieron mediante dos pases en un Microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA). Se a�adi� Triton X – 100 para lograr una concentración final 4 % (v / v). El homogenado se agit� durante 30 min a 4 �C, y a continuación se centrifug� durante 30 min a 13.000 g. Se recogió el pellet y se resuspendi� en un litro del tampón 1 con 0,5 % Triton X – 100. La solución se diafiltr� contra 5 volúmenes de tampón de desnaturalización (50 mM Tris Hcl, pH 8,5, 10 mM DTT) utilizando cartuchos de fibra hueca con una tasa de retención de 100 kD (Microgon Inc., Laguna Hills, CA). Se a�adi� Guanidina Hcl para lograr una concentración final de 6 M y la solución se agit� durante 15 min a 4 �C. La solución se diluyó 100 veces en el tampón de renaturalizaci�n 1, 10 mm K2PO4, pH 7,0 y se agit� durante 48 horas a 15 �C, las partículas se eliminaron mediante centrifugaci�n a 15.000 x g.
El sobrenadante resultante se concentr� en una columna preequilibrada Q Sepharose Past Flow (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) en el tampón de renaturalizaci�n. El ADI se eluy� utilizando tampón de renaturalizaci�n con NaCl 0,2 M. El procedimiento de purificación produjo proteína ADI, que era > 95 % pura como se estim� mediante el an�lsis de SDS – PAGE. Se produjeron ocho gr de proteína ADI renaturalizada pura a partir de 1 kg de pasta celular, que corresponde a 200 mg de ADI purificado por litro de fermentación.
La acitividad de ADI se determin� mediante micromodificaci�n del método descrito por Oginsky et al., Meth. Enzymol., (1957) 3: 639 – 642. Se dispusieron diez muestras en Na2PO4 0,1 M, pH 7,0 (tampón de ensayo BUN) en una placa de microlitro de 96 pocillos y se añadieron 40 μl de 0,5 mM de arginina en tampón de ensayo BUN, y la placa se cubrió e incub� a 37 �C durante 15 minutos. Se añadieron veinte μl de reactivo BUN completo (Sigma Diagnostics) y la placa se incub� durante 10 minutos a 100 �C. A continuación, la placa se enfri� a 22 �C y se analizó a 490 nm mediante un lector de placa de microlitro (Molecular Devices, Inc). Una UI es la cantidad de enzima que convierte 1 μmol de L – arginina en L – citrulina por minuto. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando Pierce Coomassie Blue Protein Assay Reagent (Pierce Co., Rockford, IL) con la solución estándar de albúmina de suero bovino. La actividad enzim�tica de las preparaciones de ADI purificada fue de 17 – 25 UI / mg.
Ejemplo 3: Unión de PEG a ADI
PEG se unió covalentemente a ADI en 100 mM de tampón fosfato, pH 7,4. A continuación se mezcl� brevemente ADI en tampón fosfato con un exceso molar 100 de PEG. La reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora y, a continuación, se dializ� extensamente para eliminar el PEG no incorporado.
Se llev� a cabo un primer experimento en el que se evalu� el efecto del grupo de enlace utilizado en las composiciones PEG – ADI. PEG10.000 y ADI se unieron covalentemente mediante cuatro grupos de enlace diferentes: un grupo éster o grupo maleimida, incluyendo SS, SSA, SPA y SSPA, en los que cada molécula de PEG tenía un peso molecular medio de 5.000, 10.000, 12.000, 20.000, 30.000 y 40.000; un grupo epoxi, PEG – epoxi, en el que cada molécula de PEG tenía un peso molecular medio de 5.000; y un grupo PEG ramificado, PEG2 – NHS, en el que cada molécula de PEG tenía un peso molecular medio de 10.000, 20.000 y 40.000.
Se inyectaron cinco UI de las composiciones resultantes en ratones (5 ratones en cada grupo). Para determinar los niveles en suero de arginina, se extrajo sangre de los ratones a través del plexo retro-orbital (100 μl). Inmediatamente después de la colección, se a�adi� un volumen igual del 50 % (v / v) de ácido tricoloac�tico. El precipitado se elimin� mediante centrifugaci�n (13.000 x g durante 30 minutos) y el sobrenadante se elimin� y conserv� congelado a – 70 �C. Las muestras se analizaron utilizando un analizador automático de amino�cidos y reactivos de Beckman Instruments utilizando las instrucciones facilitadas por el fabricante. Los límites de sensibilidad a la citrulina mediante este método fue de, aproximadamente, 2 – 6 μM y la reproductibilidad de las mediciones del 8 %. La cantidad de suero de arginina se determin� mediante un análisis de amino�cidos. El grupo de enlace que unía covalentemente a PEG y ADI no tenía efecto apreciable en la capacidad de ADI para reducir el suero de arginina in vivo.
Se llev� a cabo un segundo experimento en el que se evalu� el efecto del grupo de enlace y el peso molecula de PEG en los niveles de suero de citrulina in vivo. Se dieron a los ratones (5 en cada grupo) varias composiciones de ADI y PEG – ADI en una cantidad de 5,0 UI. Para determinar los niveles de suero de citrulina, se extrajo sangre de los ratones a través del plexo retro-orbital (100 μl). Inmediatamente después de la colección, se a�adi� un volumen igual del 50 % (v / v) de ácido tricoloac�tico. El precipitado se elimin� mediante centrifugaci�n (13.000 x g durante 30 minutos) y el sobrenadante se elimin� y conserv� congelado a – 70 �C. Las muestras se analizaron utilizando un analizador automático de amino�cidos y reactivos de Beckman Instruments utilizando las instrucciones facilitadas por el fabricante. Los límites de sensibilidad a la citrulina mediante este método fue de, aproximadamente, 2 – 6 μM y la reproductibilidad de las mediciones del 8 %. Se determin� la cantidad de citrulina y se aproxim� y expres� el área bajo la curva en días μmol.
Los resultados demostraron que el peso molecular de PEG determina la efectividad de la composición PEG – ADI. La efectividad de las composiciones PEG – ADI no parece basarse en los métodos o medios de unión de PEG a ADI.
Los resultados demostraron que el peso molecular óptimo de PEG es 20.000. Aunque PEG30.000 parece ser superior a PEG20.000 en términos de farmacodinamismo, PEG30.000 es menos soluble, lo que lo hace más complicado para trabajar. El rendimiento, que se bas� en la recuperación de la actividad enzim�tica, fue del 90 % para PEG5.000 y PEG12.000; del 85 % para PEG20.000 y del 40 % para PEG30.000. Además, en algunas realizaciones, PEG20.000 parece ser un buen compromiso entre rendimiento y semivida en la circulación, como se determin� mediante la producción de citrulina.
En un tercer experimento, se determin� la respuesta a la dosis de la reducción de suero de arginina y la producción de citrulina con ADI – SS – PEG5.000 y ADI – SS – PEG20.000. Se inyectaron a los ratones (5 en cada grupo) inyecciones únicas de 0,05 UI, 0,5 UI o 5,0 UI de ADI – SS – PEG5.000 o ADI – SS – PEG20.000. Se colect� el suero en los tiempos indicados, como se describe anteriormente, y se llev� a cabo un análisis de amino�cidos para cuantificar el suero de arginina y de citrulina. Ambas formulaciones indujeron una disminución dependiendo de la dosis en el suero de arginina y un incremento en el suero de citrulina. Sin embargo, los efectos inducidos por ADI – SS – PEG20.000 fueron más pronunciados y de una duración más larga que los efectos inducidos por ADI – SS – PEG5.000.
Ejemplo 4: semivida en la circulación
Se inyect� a los ratones Balb C (5 en cada grupo) una inyección intravenosa simple de 5,0 UI de arginina deiminasa nativa o varias formulaciones de arginina deiminasa modificada con polietilenglicol. Para determinar los niveles de suero de citrulina, se extrajo sangre de los ratones a través del plexo retro-orbital (100 μl). Inmediatamente después de la colección, se a�adi� un volumen igual del 50 % (v / v) de ácido tricoloac�tico. El precipitado se elimin� mediante centrifugaci�n (13.000 x g durante 30 minutos) y el sobrenadante se elimin� y conserv� congelado a – 70 �C. Las muestras se analizaron utilizando un analizador automático de amino�cidos y reactivos de Beckman Instruments utilizando las instrucciones facilitadas por el fabricante. Los límites de sensibilidad a la citrulina mediante este método fue de, aproximadamente, 2 – 6 μM y la reproductibilidad de las mediciones del 8 %.
Se detectaron una disminución dependiendo de la dosis en los niveles de suero de arginina y un aumento en el suero de citrulina a partir de la administración de una única dosis de ADI o ADI – SS – PEG nativo. Sin embargo, la disminución en el suero de arginina y el aumento en el suero de citrulina fue de vida corta, y pronto se volvió normal. La semivida de la reducción de arginina se resume en la Tabla 2, a continuación.
Tabla 2: Semivida de la reducción de suero de Arginina
Compuesto
Semivida en días
ADI nativo
1
ADI – SS – PEG5.000
5
ADI – SS – PEG12.000
15
ADI – SS – PEG20.000
20
ADI – SS – PEG30.000
22
Ejemplo 5: Antigenicidad de PEG – ADI modificado
Para determinar la antigenicidad de ADI, ADI – SS – PEG5.000 y ADI – SS – PEG20.000, se siguieron los procedimientos descritos en, por ejemplo, Park, Anticaner Res. supra y Kamisaki, J. Pharmacol. Exp. Ther. supra. A continuación, se inyectaron a los ratones Balb C (5 en cada grupo) 0,5 UI (100 μg de proteína) de ADI, ADI – SS – PEG5.000 o ADI – SS – PEG20.000 nativo semanalmente durante 12 semanas. Se extrajo sangre de los animales (0,05 ml) a través del plexo retro-orbital al comienzo del experimento y en las semanas 4, 8 y 12. El suero se aisl� y se conserv� a – 70 �C. Se determinaron los títulos de anti – ADI IgG mediante ELISA. Se añadieron cincuenta μg de ADI a cada pocillo de una placa de microt�tulos de 96 pocillos y se incub� a temperatura ambiente durante 4 horas. Las placas se enjuagaron con PBS y se recubrieron con albúmina de suero bovino (1 mg / ml) para bloquear los sitios de unión de proteínas no específicos, y se conserv� toda la noche a 4 �C. Al día siguiente se diluyó el suero de los ratones y se a�adi� a los pocillos. Tras 1 hora, las placas se enjuagaron con PBS y se a�adi� IgG de conejo anti ratón acoplada a peroxidasa a los pocillos. Las placas se incubaron durante 30 min y, a continuación, se midió la absorbancia de UV resultante utilizando un lector de placas de microt�tulos. El título se definió como la dilución más alta del suero que result� del aumento doble a partir de la absorbancia (aproximadamente 0,50 OD).
ADI – SS – PEG5.000 y ADI – SS – PEG20.000 son significativamente menos antig�nicos que el ADI nativo. Por ejemplo, tan solo 4 inyecciones de ADI nativo dieron un título de 106, mientras que cuatro inyecciones de cualquier formulación PEG – ADI no consiguió producir ningún anticuerpo medible. Sin embargo, trae 8 inyecciones, ADI – PEG5.000 tenía un título de 102, mientras que ADI – PEG20.000 no indujo esta cantidad de respuesta inmune hasta pasadas las 12 inyecciones. Los resultados demostraron que unir PEG a ADI debilita la respuesta inmune en la proteína.
Ejemplo 6: Aplicación en humanos
Se incubaron ADI – SS – PEG5.000 y ADI – SS – PEG20.000 ex vivo con suero humano normal y se determinaron los efectos en la concentración de arginina mediante un análisis de amino�cidos, en el que se encontr� que la enzima est� completamente activa y es capaz de degradar toda la arginina detectable con la misma cinética que en los experimentos que incluían ratones. La reacción se llev� a un volumen de 0,1 ml en un período de tiempo de 1 hora a 37 �C.
Adem�s, los niveles de arginina y citrulina del suero humano son idénticos a los encontrados en ratones. Las proteínas de PEG circulan más tiempo en humanos que en ratones. Por ejemplo, la semivida en la circulación de PEG conjugado con adenosina deiminasa, asparaginasa, glucocerbrocidasa, uricasa, hemoglobulina y super�xido dismutasa tienen una semivida en la circulación de 5 a 10 veces más larga que las mismas formulaciones en ratones. Esto ha significado en el pasado que la dosis humana es más a menudo de 1 / 5 a 1 / 10 de la usada en
ratones. Según lo cual, PEG – ADI debería circular incluso más tiempo en humanos de lo que lo hace en ratones.
Ejemplo 7
Se prob� la actividad antiviral de ADI – PEG20 en ARN de VHC estable que replicaba la línea celular AVA5 derivada por transfecci�n de una línea celular de hepatoblastoma humano Huh7 (Blight et al., Efficient Initiation of HCV RNA Replication in Cell Culture, Science 200 290: 1972 – 1974).
Ensayo de replicaci�n in vitro
Se utilizó un ARN de VHC estable que replicaba la línea celular AVA5 derivada por transfecci�n de una línea celular de hepatoblastoma humano Huh7. Se trataron los cultivos divididos de las células de AVA5 una vez al día durante tres días (el medio se cambi� con cada adición de compuesto) con 4 concentraciones del compuesto de ensayo (3 cultivos por concentración). Sirvieron como control un total de 6 cultivos de control no tratados, los cultivos triplicados tratados con 10, 3 y 1 UI / ml de interfer�n alfa (antiviral activo sin toxicidad) y 100, 10 y 1 uM de ribavirina (sin actividad antiviral ni citotoxicidad). Se establecieron los niveles de ARN del VHC y los de ARN de β – actina en las células 24 horas después de la última dosis de compuesto utilizando hibridación Dot Blot. Se utilizaron los niveles de ARN de β – actina para normalizar la cantidad de ARN celular en cada muestra. Los análisis de toxicidad se llevaron a cabo en placas separadas a las utilizadas para los ensayos antivirales. Las células para los análisis de toxicidad se cultivaron y trataron con los compuestos de ensayo con el mismo plan y en condiciones de cultivo idénticas a las utilizadas para las evaluaciones antivirales. Cada compuesto se prob� a 4 concentraciones, cada una en cultivos por triplicado. La absorción de la tinción rojo neutro se utilizó para determinar el nivel relativo de toxicidad tras 24 horas del último tratamiento. Se utilizó la absorbencia de la tinción internalizada a 510 nm (A510) para el análisis cuantitativo. Los valores de los cultivos de ensayo de compararon a los 9 cultivos de células no tratadas conservadas en la misma placa que los cultivos de ensayo. Se calcularon las concentraciones antivirales efectivas en un 50 % y un 90 % (EC50, EC90) y las concentraciones citot�xicas al 50 % (CC50) y se utilizaron para generar los índices de selectividad (S. I.) (CC50 / EC50). Un S. I. de 10 o más se considera como efecto antiviral selectivo.
Actividad antiviral de ADI – PEG20
Se a�adi� una única dosis de ADI – PEG20 (0,01 UI / ml) a cultivos divididos de estas células cuando la confluencia era del 50 %. Se utilizaron como controles positivos un control de interfer�n alfa (10 UI / ml) y ribarivina (100 μM). Tras 3 días de tratamiento, se aisl� el ARN de los cultivos utilizando técnicas de laboratorio estándares y se analizaron utilizando Dot Blot. La cantidad de ARNm en el VHC se determin� y compar� al ARNm de la actina (que se utiliza como control). Se determin� la cantidad de fármaco (ADI, interfer�n alfa o ribavirina) necesitada para inhibir el 50 % de los niveles de control de VHC en el ARNm. Cualquier dosis de fármaco que causa un 50 % de inhibición en el ARNm de actina se considera como que tiene actividad inhibitoria no específica. Los resultados obtenidos de este experimento se muestra a continuación.
% de inhibición del ARNm de Fármaco % de inhibición del VHC actina
ADI–PEG20 86 % 12 %
Interfer�n alfa 92 % 11 %
Ribavirin 25 % 98 %
Estos datos demuestran que ADI – PEG inhibe la replicaci�n viral de VHC in vitro casi tanto como el interfer�n alfa y mucho más que la ribavirina.
Ejemplo 8
Los cultivos divididos de células AVA5 se trataron con varias concentraciones de PEG – ADI (o con interfer�n alfa o ribavirina en los experimentos de control) durante 3 días. Los niveles de VHC en el ARNm se probaron como antes. La viabilidad celular se determin� utilizando rojo neutro. Se determinaron las concentraciones que inhibían un 50 % (IC50) y un 90 % (IC90) los niveles de VHC en ARNm. La concentración de fármaco que mata al 50 % de las células (CC50) también se determin�. Se utilizaron para generar los índices de selectividad (S. I.) CC50 / EC50. Un S. I. > 10 se considera como inhibidor selectivo de la replicaci�n viral. Los resultados se muestran a continuación.
F�rmaco CC50 IC50 IC90 SI
ADI – PEG20 0,335 UI / ml 0,27 UI / ml 0,188 UI / ml 12
Interfer�n alfa > 10.000 UI / ml 2,1 UI / ml 9,0 UI / ml > 4.762
Ribavirina 74 μM > 10 μM > 10 μM NA
Estos datos confirman que ADI – PEG20 inhibe la replicaci�n del VHC y que este fármaco es selectivo.
Ejemplo 9: Actividad antiviral y NO síntesis en pacientes con tumores
Se prob� ADI – PEG20 por su actividad antitumoral en pacientes con cáncer hepatocelular infectados cr�nicamente con VHC. Se determinaron también los títulos virales de la VHC en el plasma de estos pacientes utilizando ensayos cl�nicos estándares desarrollados por Hoffman La Roche. El plasma se obtuvo antes del tratamiento con ADI – PEG20. A los pacientes se les inyectaron 160 UI / m2 de ADI – PEG20 una vez por semana durante 3 semanas. Una semana después de la tercera inyección con ADI – PEG20, se aisl� el plasma de los pacientes y se volvieron a probar para el título del VHC utilizando el mismo ensayo. Los resultados de este experimento se muestran a continuación.
N�mero de paciente
Título de VHC pre-tratamiento Título de VHC post-tratamiento
1
614.836 485.900
2
1.255.542 254.729
3
328.134 97.535
4
1.466.460 63.902
5
1.187.730 485.190
Estos datos demuestran que el tratamiento con ADI – PEG en humanos infectados cr�nicamente con VHC disminuye los títulos de VHC en su plasma. Además, puesto el interfer�n alfa solo es efectivo ~ 50 % de estos pacientes y que, normalmente, requiere de 3 a 6 meses de tratamiento para lograr una reducción del 50 % en los títulos del VHC, parece que ADI – PEG20 es mucho más efectivo.
Se prob� ADI – SS – PEG20.000 mw en un diseño de 2 etapas en individuos con CHC inoperable según el diseño óptimo estadístico de Richard Simon para el ensayo de 2 etapas (Simon R. 1989. Optimal two – stage designs for phase II clinical trials. Control Clin Trials 10: 1 – 10; Simon RM, Steinberg SM, Hamilton M, Hildesheim A, Khleif S, Kwak LW, Mackall CL, Schlom J, Topalian SL, Berzofsky JA. 2001. Clinical trial designs for the early clinical development of therapeutic cancer vaccines. J Clin Oncol 19: 1848 – 1854). Este ensayo se llev� a cabo bajo la aprobación del Ministerio de Sanidad de Italia en el Pascale National Cancer Institute en Nápoles, Italia, y con la aprobación del consejo de revisión institucional . Todos los sujetos dieron su consentimiento según la Declaración de Helsinki. Se inscribieron en este estudio un total de 18 individuos con CHC inoperable, todos infectados cr�nicamente con VHC (Izzo). Durante este estudio murieron 3 a causa de enfermedad progresiva y no recibieron los 3 ciclos de tratamiento, por lo tanto se excluyeron de otros análisis. Los 15 sujetos restantes recibieron 3 ciclos (cada uno consistía en 4 inyecciones una vez por semana) de ADI – SS – PEG20.000 mw con la Dosis Biológica óptima. La Dosis Biológica óptima se definió como la cantidad de ADI – SS – PEG20.000 mw que reducía la arginina del plasma de un nivel en reposo de ~ 130 μM para disminuir el nivel de detección (< 2 μM) durante, al menos, 7 días (~ 160 UI / M2).
La acción que esta terapia tuvo en los tumores se estableció mediante un escáner TC una vez cada 4 semanas. La respuesta se definió como Enfermedad Progresiva (PD), Enfermedad Estable (SD), Respuesta Parcial (PR) o Respuesta Completa (CR) según los criterios del National Cancer Institute (NCI). Los resultados de este ensayo indicaron en los 15 sujetos con CHC y VHC las siguientes respuestas:
Estado de la enfermedad
Número de sujetos
Respuesta Completa (CR)
2
Respuesta Parcial (PR)
7
Enfermedad Estable (SD)
10
Ninguno de estos sujetos recibió ningún tratamiento antitumoral (o antiviral) ni antes ni durante este estudio. El ensayo cl�nico de laboratorio se llev� a cabo, al menos, dos veces a la semana durante el estudio y las muestras de plasma se colectaron una vez a la semana y se conservaron congeladas a – 70 �C. Fueron estas muestras de plasma congelado las que se utilizaron después para los ensayos para el VHC.
Ensayo de títulos de VHC y serotipo de muestras de plasma humano
Se determinaron los títulos virales de VHC en laboratorio cl�nico de enfermedades infecciosas del hospital utilizando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR), Cobas Amplicor HCV Monitor Test, versión 2.0; Roche Diagnostics (Germer 1999). El genotipo se determin� de manera similar. Los títulos virales se determinaron en muestras de plasma colectadas antes del tratamiento con ADI – SS – PEG20.000 mw y tras 12 semanas de
5 terapia.
SIN síntesis
El tratamiento con ADI – SS – PEG20.000 mw dio como resultado una disminución dependiente de la dosis en la arginina del plasma y una disminución concomitante en SIN síntesis (no se muestran los datos). Aunque este tratamiento disminuyó significativamente los niveles SIN, no hubo efecto medible de este tratamiento en la presión sanguíneo o en el ritmo cardíaco.
La siguiente Tabla 3 enumera el efecto de ADI – SS – PEG20.000 mw en los títulos de Hepatitis C y en los ensayos 15 de la función hepática.
Resultar�n evidentes para los expertos en la disciplina varias modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente, en vista de la precedente descripción. Algunas de estas modificaciones también se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
5 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Clark, Mike A.
<120> Methods for Inhibiting Viral Replication in vivo
<130> PHOE0001-500
<150> US 60/427,497
<151> 2002-11-18
<160> 21
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycoplasma hominus
25 <400> 1
<210> 2
<212> PRT
<213> Mycoplasma hominus
<400> 2
<210> 3
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycoplasma hominus
<400> 3
<210> 4
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycoplasma hominus
<400> 4
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> Mycoplasma arginini
<400> 5
<210> 6
<211> 410
<212> PRT
<213> Mycoplasma arginini
35 <400> 6
<210> 7
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycoplasma arthritidis
<400> 7
<210> 8
<211> 409 15 <212> PRT
<213> Mycoplasma arthritidis
<400> 8
<210> 9
<212> PRT
<213> Mycoplasma arthritidis
<400> 9
55
<210> 10 <211> 409 <212> PRT <213> Mycoplasma arthritidis
<400> 10
65
<210> 10
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycoplasma arthritidis
<400> 10
<210> 11
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleotido
<400> 11 gcaatcgatg tgtatttgac agt 23
<210> 12
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleotido
<400> 12 65 tgaggatcct tactaccact taacatcttt acg 33
<210> 13
<211> 411
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 13
<210> 14
<211> 409
<212>
PRT. 65 <213> Streptococcus pneumoniae
<400> 14
<210> 15
<211> 410
<212>
PRT 55 <213> Borrelia burgdorferi
<400> 15
<210> 16
<211> 409
<212> PRT
<213> Borellia afzellii
<400> 16
<210> 17
<211> 580 35 <212> PRT
<213> Giardia intestinalis
<400> 17
<210> 18
<211> 413
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 18
<210> 19
<211> 413
<212> PRT
<213> Bacillus licheniformis
<400> 19
<210> 20
<211> 408
<212> PRT
<213> Enterococcus faecalis
<400> 20
<210> 21
<211> 409
<212> PRT
<213> Lactobacillus sake
<400> 21

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su utilización en un método de tratamiento de la infección de la hepatitis C en un individuo.
  2. 2.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que el método comprende además el paso de administrar a dicho individuo uno o más compuestos seleccionados del grupo formado por antibióticos, antivirales, antif�ngicos y fármacos antiprotozoarios.
  3. 3.
    La composición para su utilización en la reivindicación 2, en la que uno o más compuestos son otros compuestos antivirales.
  4. 4.
    La composición para su utilización reivindicada en las reivindicaciones 2 o 3, en la que dichos compuestos antivirales son uno o más de azodivudina (AZT), didanosina (didesoxiinosina, ddI), d4T, zalcitabina (didesoxicitosina, ddC), nevirapina, lamivudina (epivir, 3TC), saquinavir (Invirase), rinotavir (Norvir), indinavir (Crixivan), delavirdina (Rescriptor), pegilado (PEG), interfer�n – α (IFN), o ribavirina.
  5. 5.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que dicho compuesto se administra por vía intramuscular, intrad�rmica, o intraperitoneal.
  6. 6.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que dicha composición es eficaz en una concentración menor a 1 mM para inhibir la replicaci�n del virus de la hepatitis C en, al menos, el 50 % de más del 50 % de las células en un ensayo para medir la replicaci�n del virus de la hepatitis C.
  7. 7.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la cantidad de arginina deiminasa unida al polietilenglicol eficaz para inhibir la replicaci�n viral oscila entre 40 UI / m2 y 160 UI / m2 por semana.
  8. 8.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la cantidad de arginina deiminasa unida al polietilenglicol eficaz para inhibir la replicaci�n viral oscila entre 160 UI / m2 por semana.
  9. 9.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la cantidad de arginina deiminasa unida al polietilenglicol eficaz para inhibir la replicaci�n viral disminuye los niveles de arginina plasm�tica a menos de 5 μM.
  10. 10.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la arginina deiminasa est� covalentemente unida al grupo de enlace en polietilenglicol, en el que cada una de las moléculas de polietilenglicol tiene un peso molecular entre 10.000 y 30.000, y en el que el grupo de enlace es succinimidil succinato.
  11. 11.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que las moléculas de 7 a 15 polietilenglicol est�n unidas a la arginina deiminasa.
  12. 12.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que las moléculas de 9 a 12 polietilenglicol est�n unidas a la arginina deiminasa.
  13. 13.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que dicha arginina deiminasa se deriva de un microorganismo del género Mycoplasma, y en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo formado por Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arthritidis y combinaciones de los mismos.
  14. 14.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la arginina deiminasa tiene una secuencia de amino�cidos de las SECs ID N� 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21.
  15. 15.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la arginina deiminasa tiene una secuencia de amino�cidos de las SECs ID N� 1 o 4.
  16. 16.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que el virus de la hepatitis C es VHC1b.
  17. 17.
    Una composición que comprende una arginina deiminasa unida a polietilenglicol para su utilización en el tratamiento de un individuo sospechoso de haber estado expuesto al virus de la hepatitis C.
  18. 18.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que un individuo est� en riesgo por uno o más virus seleccionados del grupo formado por VIH, gripe, polio, herpes simple, hepatitis, sarcoma de Kaposi, rinovirus, virus del Nilo Occidental, viruela y vaccinia virus .
  19. 19.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que se ha identificado un individuo
    de haber sido infectado uno o más virus seleccionados del grupo formado por VIH, gripe, polio, herpes simple, hepatitis, sarcoma de Kaposi, rinovirus, virus del Nilo Occidental, viruela y vaccinia virus .
  20. 20.
    Un método para determinar la sensibilidad de la replicaci�n del virus de la hepatitis C para modular los niveles de la arginina u óxido nítrico que comprende:
    a) poner en contacto una muestra que comprende el virus de la hepatitis C con una composición que comprende arginina deimnasa unida a polietilenglicol; y b) comparar los niveles de la replicaci�n del virus de la hepatitis C en presencia y ausencia de la composición que comprende arginina deiminasa unida a polietilenglicol; en la que disminuyó la replicaci�n del virus de la hepatitis C en muestras en contacto con arginina deiminasa que es indicativa de la sensibilidad del virus de la hepatitis C en arginina u óxido nítrico.
  21. 21.
    La composición para su utilización reivindicada en las reivindicaciones 2 o 3, en la que dicho(s) compuesto(s) se administra(n) de forma simultánea a un individuo con la arginina deiminasa unida a polietilenglicol.
  22. 22.
    La composición para su utilización reivindicada en la reivindicación 1, en la que la composición inhibe de forma selectiva la replicaci�n del virus de la hepatitis C en el individuo.
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