KR101638226B1 - 아르기닌 디이미나아제를 사용한 치료 방법 - Google Patents

아르기닌 디이미나아제를 사용한 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대체로 아르기닌 디이미나아제, 구체적으로 PEG화된 아르기닌 디이미나아제로 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

아르기닌 디이미나아제를 사용한 치료 방법{METHODS OF TREATMENT WITH ARGININE DEIMINASE}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2012년 4월 4일 출원된 미국 가출원 제61/620,368호의 우선권을 주장하며, 이를 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다.
서열목록에 대한 진술
본원과 관련된 서열 목록은 종이 복사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공하였으며, 본 명세서에 참조하여 포함시켰다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일명은 POLA_001_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 8 KB이고, 2012년 5월 30일에 생성시켰고, EFS-웹을 통해 전자 제출하였다.
기술분야
본 발명은 대체로 아르기닌 디이미나아제(ADI), 구체적으로는 PEG화 ADI(ADI-PEG)를 이용한 암의 치료 방법에 관한 것이다.
아미노산 결핍 요법은 일부 암 형태의 치료에 효과적일 수 있다. 지금까지, 아스파라긴의 순환 농도를 낮추어 단백질 합성을 억제하는 아스파라기나아제를 활용하는 이러한 접근법과 관련된 하나의 공지된 임상예가 존재한다. 이러한 치료는 급성 림프아구성 백혈병에 특히 효과적이다(Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004). 급성 림프아구성 백혈병 세포는 성장과 증식에 아미노산 아스파라긴을 필요로 한다. 대조적으로, 대부분의 정상 인간 세포는 아스파라긴을 합성할 수 있고 아스파라긴 고갈에 의해 영향받지 않는다. 따라서, 아스파라기나아제를 사용한 혈청 아스파라긴 저하는 정상 세포, 조직 및 숙주에 해를 가하지 않고 암 세포를 선택적으로 죽일 수 있다. 이.콜라이(E. coli) 유래 아스파라기나아제가 인간 사용에 대해 승인받았다. 그러나, 아스파라기나아제는 오직 미생물에서 발견되고, 이는 인간에서 고도로 면역원성을 가지며 또한 주사 후 혈청 반감기가 짧다(Avramis 2005). 아스파라기나아제를 보다 효과적인 약물로 만들기 위해서, 이러한 단점은 이 효소의 항원성 및 관련 알레르기 반응을 감소시키도록 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이.콜라이 유래 아스파라기나아제를 제제화시켜 최소화시켰다. 또한, PEG는 아스파라기나아제의 순환 반감기를 지속시켜서, 치료 빈도 및 치료 총 비용을 절감시킨다. PEG 제제화된 아스파라기나아제는 그 사용이 승인받았고 상품명 Oncaspar®(Oncaspar®2011, Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004, Fu 2007, Zeidan 2008)로 시판되고 있다.
아르기닌은 인간과 마우스에 대해 다른 비필수 아미노산이다(Rogers 1994). 인간에서, 아르기닌은 크렙스(Krebs)(우레아) 회로 효소 아르기니노숙시네이트 신써타아제 (ASS, L-시트룰린:L-아스파테이트 리가아제[AMP-형성], EC 6.3.4.5) 및 아르기니노숙시네이트 리아제(ASL, L-아르기니노숙시네이트 아르기닌-리아제, EC 4.3.2.) (Haines 2011, Wu 2009, Morris 2006, Husson 2003, Tapiero 2002, Rogers 1994)를 통한 2단계로 시트룰린으로부터 합성될 수 있다. ASS는 시트룰린 및 아스파르트산의 아르기니노숙시네이트로의 전환을 촉매하고, 이어 ASL에 의해 아르기닌 및 푸마르산으로 전환된다(도 1). 인간에서 아르기닌 결핍 다이어트는 고암모니아혈증, 오로트산뇨증을 일으키거나, 성인에서 전신 일산화질소(NO) 합성률을 변화시키지 않는다(Tapiero 2002, Castillo 1995, Rogers 1994, Carey 1987, Barbul 1986, Snyderman 1959, Rose 1949). 미숙아가 아르기닌을 필요로하는 것으로 보이지만(Wu 2004), 아르기닌 농도는 유아, 아동 및 청소년 중에서 그 나이와 관련있지는 않다(Lucke 2007). 1992년, Takaku 및 Sugimura는 각각 인간 흑색종 및 간세포 암종(HCC) 세포주가 성장에 아르기닌을 필요로 한다고 보고하였다. 다른 연구들은 PEG화 ADI가 적은 부작용으로 흑색종 및 간세포암의 치료에 효과적이라고 보여주었다.
암은 우선적으로 3종류의 요법: 수술, 방사선 및 화학요법의 조합 또는 그 중 하나로 치료된다. 수술, 방사선 및 색전술 등의 국소 요법으로 치료할 수 없는 암의 경우, 전신 화학요법만이 유일한 치료 선택이 된다. 그러나, 전통적인 화학요법은 정상 세포와 암 세포를 구별할 수 없어서 심각한 독성 및 제한적인 효능을 야기한다. 새로운 세대의 전신 요법은 정상 세포와 암 세포 간 차이를 이용해 선택적으로 암 세포를 죽이도록 디자인된 표적화 요법이다. 본 발명은 암 치료의 이러한 장점 및 다른 장점을 제공한다.
참조문헌: Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44:367-393; Barbul A. 1986. J Parenteral Enteral Nutr 10:227-238; Carey GP, et al. 1987. J Nutr 117:1734-1739; Castillo L, et al. 1995. Am J Physiol 268 (Endocrinol Metab 31):E360-367; Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984; Haines RJ, et al. 2011. Int J Biochem Mol Biol 2:8-23; Husson A, et al. 2003. Eur J Biochem 270:1887-1899; Lucke T, et al. 2007. Clin Chem Lab Med 45:1525-1530; Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S-512S; Rogers QR. 1994. In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Visek - from Ammonia to 암 and Gene Expression. Special Publication 86 - April, 1994, Agriculture Experiment Station, University of Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, pp. 9-21; Tapiero H, et al. 2002. Biomed Pharmacother 56:439- 445, 2002; Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125: 117-127; Wu G, et al. 2009. Amino acids 37:153-168; Wu G, et al. 2004. J Nutr Biochem 15:442-451; Zeidan A, et al. 2008. Expert Opin Biol Ther 9:111-119.)
본 발명의 일 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 백혈병을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 백혈병은 급성 골수성 백혈병 또는 재발성 급성 골수성 백혈병이다. 추가 구체예에서, 백혈병은 림프성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병이 아니다. 그러나, 추가 구체예에서, 백혈병은 림프성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화되고; 여기서 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되며, 백혈병은 감소된 ASS 발현을 보인다.
본 발명은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물 및 오토파지 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 췌장암 또는 소세포 폐암이다. 이와 관련하여, 오토파지 억제제는 클로로퀸, 3-메틸아데닌, 히드록시클로로퀸, 바필로마이신 A1, 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보시드(AICAR), 오카다산, N6-머캅토퓨린 리보시드, 워트만닌, 및 빈블라스틴으로 이루어진 군에서 선택된다. 당분야에 공지된 다른 오토파지 억제제는 본원의 방법에 사용하는 것이 고려된다. 일정 구체예에서, ADI 및 오토파지 억제제는 부가적으로 또는 상승적으로 작용한다. 다른 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고, 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화되고; 여기서 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되고, 여기서 암은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 일 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 유방암, 난소암, 직결장암, 위암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암, 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고, 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제조화되고, 여기서 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되며, 암은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 일 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 시스플라틴과 조합하여 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 흑색종을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고, 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화되고, 여기서 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되며, 흑색종은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 다른 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 흑색종, 췌장암, 전립선암, 소세포 폐암, 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 간세포암, 및 육종이 아니다. 일 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고, 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화되고, 여기서 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되고, 암은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 다른 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 아르기닌 디이미나아제를 도세탁셀과 조합하여 포함하는 화합물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 비소세포 폐암, 두경부암 또는 전립선암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고, 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화되고, 여기서 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되며, 비소세포 폐암, 두경부암 또는 전립선암은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 다른 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 아르기닌 디이미나아제를 라파마이신과 조합하여 포함하는 화합물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 신장 세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자에 공유 결합되고, 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화되고, 아르기닌 디이미나아제는 약 160 IU/㎡∼약 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되며, 암은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 일정 구체예에서, ADI는 1개 보다 많은 폴리에틸렌 글리콜, 또는 약 9∼약 12개 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 총 중량 평균 분자량이 약 1,000∼약 40,000이고, 총 중량 평균 분자량이 약 10,000∼약 30,000이며, 일정 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 분자량이 20,000이다.
본 발명의 일정 구체예에서, 연결기는 숙신이미드 기이다. 일정 구체예에서, 숙신이미드 기는 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 카르복시메틸레이트, 숙신이미딜 숙신아미드, N-히드록시 숙신이미드 또는 이의 조합이다. 일 구체예에서, 숙신이미드 기는 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트 또는 이의 조합이다.
본원의 일정 구체예에서, ADI는 마이코플라즈마 아르기니니(Mycoplasma arginini)로부터 단리되지 않는다. 다른 구체예에서, ADI는 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis)로부터 단리된다. 일 특정 구체에예서, ADI는 서열번호 1의 위치 112, 374, 405 또는 408에 1 이상의 리신이 없도록 개질되었고, 다른 구체예에서, ADI는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 5±1.5 PEG 분자에 공유 결합되고, 일정 구체예에서, PEG는 직쇄 PEG이다.
본 발명의 일정 구체에예서, ADI는 주당 약 1회 내지 2주 마다 약 1회 투여되고, 특정 구체예에서, ADI는 매주 투여된다.
일 구체예에서, ADI는 약 80 IU/㎡ 내지 약 640 IU/㎡의 용량으로 투여되고, 일 특정 구체예에서, 약 160 IU/㎡의 용량으로 투여된다. 다른 구체예에서, ADI는 약 160 IU/㎡의 용량으로 매주 투여된다.
일 구체예에서, 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 아르기닌 디이미나아제를 포함하는 본원에 기술된 방법에 사용되는 화합물은 약 0.5% 보다 적은 천연 ADI, 약 5% 보다 적은 자유 PEG, 또는 둘 모두를 포함하는 조성물로 제제화된다.
본 발명의 다른 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 GVHD를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 감소된 ASS 발현을 보인다. 일 구체예에서, 암은 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 재발성 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 직결장암, 위암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암, 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된다. 추가 구체예에서, ASS의 발현 감소는 아르기니노숙시네이트 신써타아제 프로모터의 메틸화에 의한다. 다른 구체예에서, ASS의 발현 감소는 DNA 돌연변이 또는 결실에 의한다. 일 특정 구체예에서, ASS의 발현 감소는 "필라델피아 염색체"의 일부분으로서 9q34 유전자좌의 결실 또는 전위에 의한다. 일정 구체예에서, 암은 감소된 ASS의 발현을 보인다.
본 발명의 또 다른 측면은 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 ADI를 포함하는 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 감소된 아르기니노숙시네이트 리아제의 발현을 보인다. 일 구체예에서, 암은 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 재발성 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 직결장암, 위암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암, 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구체예에서, ASL의 발현 감소는 아르기니노숙시네이트 리아제 프로모터의 메틸화에 의한다. 일정 구체예에서, ASL의 발현 감소는 DNA 돌연변이 또는 결실에 의한다. 일 특정 구체예에서, 암은 ASL 음성이다.
본 발명의 일정 구체예에서, ADI-PEG를 사용한 치료는 생체 내에서, NO 합성을 억제하거나, 혈관생성을 억제하거나, 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하거나, 또는 이의 조합이다. 일정 구체예에서, 치료 결과 안정한 질환이 된다. 다른 구체예에서, 치료는 환자에서 무진행 생존 시간을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 혈장 아르기닌은 1개월 이상, 또는 2개월 초과 동안 고갈된다.
일정 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 치료제, 예컨대 제한없이 시클로포스파미드, 젬시타빈, 시스플라틴, 소라페닙, 수니티닙 및 에베롤리무스를 포함하는 치료요법제의 투여를 더 포함한다. 일정 구체예에서, ADI 및 화학요법제는 부가적으로 또는 상승적으로 작용한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 야생형 엠.호미니스 ADI 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 개질된 엠.호미니스 ADI 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 3 및 4는 아르기니노숙시네이트 신써타아제 cDNA를 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 크렙스(우레아) 회로를 통한 아르기닌 대사를 나타낸 도면이다.
도 2는 시험관 내에서 ADI에 의해서 췌장암 세포의 캐스파아제 의존적 아폽토시스 및 오토파지 유도를 도시한 도면이다. 도 2A는 팬-캐스파아제 억제제 ZVAD-fmk("Zvad")와 항온반응 후 세포 사멸을 겪는 세포의 백분율을 나타낸 막대 그래프이다. 도 2B는 PBS 대조군과 비교하여 ADI-PEG와 72시간 항온반응 후 아넥신 V 양성 세포의 백분율을 도시한 막대 그래프이다.
도 3은 히드록시클로로퀸("ChQ") 및/또는 ADI-PEG를 인간 췌장암 세포와 항온반응 후 절단된 캐스파아제 3, p62 및 LC3B의 발현 수준을 도시한 도면이다.
도 4A 및 4B는 ChQ 및/또는 ADI-PEG와 인간 췌장암 세포를 항온반응 후 서브-G0/G1 세포 및 아넥신 V 양성 세포의 백분율을 도시한 도면이다.
도 5는 클로로퀸(CQ)및/또는 ADI-PEG로 처리 후 마우스의 종양 부피를 도시한 도면이다. 인간 췌장암 세포주 MIA PaCa-2의 피하 이종이식편을 무흉선 마우스에서 확립시켰다.
도 6은 클로로퀸 및/또는 ADI-PEG로 처리 후 MIA PaCa-2 종양의 조직병리학을 도시한 도면이다. 제1 컬럼은 H&E 염색을 도시한 도면이고, 제2 컬럼은 활성 캐스파아제 3의 염색을 도시한 도면이며, 제3 컬럼은 TUNEL 어세이를 통한 DNA 단편화를 염색한 도면이다. 제4 컬럼은 p62를 염색한 도면이다.
도 7은 소세포 폐암 인간 종양 및 세포주에서 ASS의 발현을 도시한 도면이다. 항-ASS 항체 195-21-1을 사용해 정상 피부(도 7A), 결장 암종(도 7B), 및 소세포 폐암(도 7C)에서의 ASS 단백질 발현을 검출하였다. 도 7D는 웨스턴 블랏을 통해 양성 대조군 SW1222 결장암 세포와 비교한 소세포 폐암 세포주에서의 ASS 단백질 발현을 도시한 도면이다. 도 7E는 qRT-PCR을 통해 결정한 mRNA 발현과 웨스턴 블랏으로 측정한 ASS 단백질 발현의 상관도를 도시한 도면이다.
도 8은 ADI-PEG 20에 의한 ASS-음성 소세포 폐암 세포의 시험관 내 증식 억제를 보여주는 도면이다. 부착(도 8A) 및 미부착(도 8B) 세포를 120시간 동안 ADI-PEG 20으로 처리하고 부착 세포에 대해서는 MTS 어세이를 이용하거나 또는 미부착 세포에 대해서는 BCA 총 단백질 어세이를 통해 증식을 분석하였다.
도 9는 ASS-음성 SK-LC-13 소세포 폐암 세포에서 아폽토시스 및 오토파지를 ADI가 유도하는 것을 보여주는 도면이다. 아폽토시스를 보여주는 서브-G1 DNA 함량의 형광발광-활성화 세포 분류 분석법을 위해, 세포를 대조군 배지(도 9A), 25 nM 토포테칸(도 9B), 1.0 mIU ml-1 ADI-PEG 20(도 9C), 및 10 mIU ml-1 ADI-PEG 20(도 9D)에서 72시간 동안 항온반응시킨 후 DNA를 프로피듐 요오다이드(PI)로 염색하였다. 도 9E는 ADK-PEG 20 또는 클로로퀸("CQ")-양성 대조군과 24시간 항온반응시킨 후 LC3-I 및 LC3-II 단백질 농도를 도시한 도면이다. 도 9F는 SK-LC-13 세포에서 웨스턴 블랏에 의해 검출한 활성 캐스파아제 3을 도시한 도면이다(도 9F).
도 10은 siRNA를 사용한 ASS 발현의 침묵화를 도시한 도면이다. 도 10A는 ASS siRNA로 처리한 SW1222 세포에서 RT-PCR을 통해 결정한 ASS mRNA 발현의 관련 발현을 도시한 도면이다. 도 10B는 ASS SiRNA로 처리한 SW1222 세포에서 웨스턴 블랏으로 평가한 ASS 단백질의 관련 발현을 도시한 도면이다. 도 10C는 MTS 증식 어세이를 통해 측정한 ADI-PEG 20 처리 세포의 증식을 도시한 도면이다.
도 11은 20,000 m.w.의 PEG로 제제화한 ADI(ADI-PEG 20)에 의한 BALB/c-누드 마우스에서 중간 크기의 SK-LC-13 소세포 폐암의 상정 억제를 도시한 도면이다. 마우스 당 1 IU(도 11A), 마우스 당 2 IU(도 11 B), 및 마우스 당 5 IU(도 11C)의 용량으로 PBS 비히클(폐돼 원), 또는 ADI-PEG의 20단기 20일 과정(5일 마다 투약)(폐쇄 사각), 또는 ADI-PEG 20의 장기 투약(그룹 종료까지 5일 마다)(개방 사각)을 받은 마우스 유래의 종양 부피에 대한 성장 그래프를 도시하였다. 33일경 대조군의 종결 시 종양 부피를 도 11D에 도시하였다. ADI-PEG 20(도 11E), 아르기닌(도 11F), 및 시트룰린(도 11G)의 혈청 농도는 실험 0일, 12일, 및 40일에 도시하였다. 연장 투약을 오직 20일에 개시하였으므로, 단기 및 장기 투약 코호트에서 값이 동일하였다.
도 12는 BALB/c 누드 마우스의 ASS 양성 NCI-H69 소세포 폐암 이종이식편의 종양 부피의 성장 그래프를 도시한 도면이다. 마우스들은 마우스 당 PBS 비히클 또는 2 IU ADI-PEG 20을 투약받았다(흑색 화살표).
도 13은 BALB/c-누드 마우스의 거대 SK-LC-13 소세포 폐암 이종이식편의 억제를 도시한 도면이다. 마우스 당 1 IU(도 13A), 마우스 당 2 IU(도 13B), 및 마우스 당 5 IU(도 13C)의 용량으로 PBS 비히클(원), ADI-PEG 20의 단기 20일 과정(흑색 화살표)(사각), 또는 ADI-PEG 20의 장기 투약(회색 화살표)(삼각)을 받을 마우스 유래의 종양 부피에 대한 성장 그래프를 도시한다. 32일경 대조군 종결 시 종양 부피는 도 13D에 도시하였다.
도 14는 ADI-PEG 20 및 오토파지 억제제 클로로퀸을 사용한 개별 치료에 대한 상대적인 세포 생존능을 도시한 도면이다.
도 15는 ADI-PEG 20과 시스플라틴의 조합이 ASS 결핍 흑색종 세포에서 항-종양 활성을 강화시킨다는 결과를 검증한 이종이식편의 그래프를 도시한다.
도 16은 ADI-PEG 20과 라파마이신 조합이 이종이식된 Caki-1 신장 세포 암종 세포주에 대해 항종양 활성을 강화시킨다는 결과를 검증한 이종이식편의 그래프를 도시한다.
본 발명은 대체로 ADI, 구체적으로 ADI-PEG를 이용해 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
정상 세포는 성장에 아르기닌을 필요로 하지 않는데, 이들 정상 세포가 ASS 및 ASL에 의해 촉매되는 2 단계 과정으로 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성할 수 있기 때문이다(도 1 참조). 대조적으로, 일부 암은 ASS를 발현하지 않는다. 일부 암들은 ASL을 발현하지 않고, 다른 암들은 ASS 및/또는 ASL의 발현을 저하시키거나, 또는 발현시키지 않는 듯 하다. 따라서, 이들 암은 아르기닌에 대해 영양요구성이다. 이러한 대사적 차이는 이러한 형태의 암을 치료하기 위한 안전하고 효율적인 요법을 개발하는데 활용될 수 있다. ADI는 아르기닌 디히드롤라아제 경로를 통한 아르기닌의 시트룰린으로의 전환을 촉매하게 되고, 따라서 아르기닌을 제거하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 실시는 반대로 구체적으로 표시하지 않으면, 당분야의 숙련가의 범주 내에서 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적 방법을 적용하며, 이들 대부분은 이하에 예시 목적으로 기술되어 있다. 이러한 기술들은 이하 문헌에 충분히 설명되어 있다. 다음의 문헌들을 참조한다: Current Protocols in Protein Science, Current Protocols in Molecular Biology 또는 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II(D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) 및 다른 유사 문헌들 참조.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는, 단수형은 달리 명시하지 않으면 복수 참조를 포함한다.
본 명세서 전반에서, 문맥에서 달리 요구하지 않으면, "포함하다" 또는 이의 활용형 예컨대" 포함하는" 등의 단어는 언급된 성분 또는 정수 또는 성분이나 정수 군을 포함하는 것을 의미하나 임의의 다른 성분이나 정수 또는 성분이나 정수의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는다.
본 명세서의 각 구체예는 분명하게 달리 언급하지 않으면 모든 다른 구체예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용하고자 한다.
표준 기술을 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들면, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명서에 따라 수행하거나 또는 당분야에서 통상적으로 수행하는 바에 따르거나 또는 본원에 기술된 대로 수행할 수 있다. 이들 및 관련 기술과 과정들은 대체로 당분야에 충분히 공지된 통상의 방법에 따르고, 본 명세서 전반에 인용하고 참조한 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조 문헌에 기술된 대로 수행할 수 있다. 특별한 정의가 제공되지 않으면, 본원에 기술된 분자 생물학, 분석 화학, 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학의 실험 과정 및 기술과 관련되어 사용되는 명명법은 당문야에 공지이고 통상적으로 사용되는 바와 같다. 표준 기술은 재조합 기술, 분자 생물학, 미생물학, 화학 합성, 약학 제조, 제제, 및 전달, 및 환자 치료에 대해 사용될 수 있다.
"환자"는 동물, 일정 구체예에서는 포유동물, 특정 구체예에서는 인간을 의미한다.
"생체적합성"은 대체로 생물학적 기능에 손상을 주지 않고, 알레르기 유발 및 질환 상태를 포함한, 허용되지 않는 정도의 독성을 일으키지 않는 물질 또는 화합물을 의미한다.
본원 전반에서, 다음의 약어들을 사용한다: PEG, 폴리에틸렌 글리콜; ADI, 아르기닌 디이미나아제; SS, 숙신이미딜 숙시네이트; SSA, 숙신이미딜 숙신아미드; SPA, 숙신이미딜 프로피오네이트; NHS, N-히드록시-숙신이미드; ASS1 or ASS, 아르기니노숙시네이트 신써타아제; ASL, 아르기니노숙시네이트 리아제.
본 발명에서, ADI 유전자는, 예를 들면 미생물, 재조합 생명공학기술 또는 이의 임의 조합을 포함하는, 임의 공급원으로 부터 유도, 클로닝 또는 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 아르기닌 디이미나아제는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 속, 클로스트리듐(Clostridium) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 지아르디아(Giardia) 속의 미생물로부터 클로닝될 수 있다. 일정 구체예에서, 아르기닌 디이미나아제는 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 마이코플라즈미 아르기니니(Mycoplasma arginini), 스트렙토코커스 파이오제네스(Steptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(Steptococcus pneumoniae), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 아프젤리이(Borrelia afzelii), 지아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 또는 이의 조합으로부터 클로닝될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용되는 ADI는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열, 또는 ADI 활성을 갖는 이의 변이체(예를 면, 아르기닌을 시트룰린 및 암모니아로 대사할 수 있음). 또는 ADI 활성을 갖는 이의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 일정 구체예에서, ADI는 마이코플라즈마 속의 미생물로부터 클로닝된다. 추가 구체예에서, ADI는 마이코플라즈마 호미니스, 마이코플라즈마 아르트리티데스, 또는 이의 임의 조합으로부터 클로닝되고, 마이코플라즈마 아르기니니로부터 유래되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에서 사용되는 ADI는 서열번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 ADI 활성을 갖는 이의 변이체(예를 들면, 아르기닌을 시트룰린 및 암모니아로 대사할 수 있음), 또는 ADI 활성을 갖는 이의 단편을 가질 수 있다.
천연 ADI는 미생물에서 발견될 수 있으며 항원성이고 환자의 순환계에서 신속하게 제거된다. 이러한 문제점들은 ADI를 개질시켜 극복할 수 있다. 따라서, 본 발명은 제한없이, 거대분자, 중합체, 단백질, 펩티드, 다당류, 또는 다른 화합물을 포함하는 개질제를 통해 개질된 ADI를 제공한다. 아르기닌 디이미나아제 및 개질제는 목적하는 효과를 달성하기 위하 안정한 접합체 또는 안정한 조성물을 형성하도록 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 통해 연결될 수 있다. 일정 구체예에서, 개질된 ADI는 생물학적 활성을 유지하고 생체내 반감기가 증가되었으며 미개질 ADI 보다 항원성이 낮다. 일정 구체예에서, 개질된 ADI는 미개질 ADI의 생물학적 활성의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 보유한다.
일 구체예에서, 개질제는 혈액 내에서 ADI의 반감기를 증가시킬 수 있고 생체적합성인 중합체 또는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 개질제는 ADI에 화학적으로 커플링되거나, 또는 적용가능한 경우, 융합 단백질 발현을 통해 ADI에 연결될 수 있다.
거대분자 중합체는 일정 구체예에서, 그 자신의 생활성을 가질 수 있는, 비펩티드 거대분자 중합체를 포함할 수 있다. 적합한 중합체는 제한없이, 폴리에놀 화합물, 폴리에테르 화합물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아미노산, 디비닐 에테르 및 말레산 무수물의 공중합체, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 다당류, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린 또는 이의 단편, 폴리-알킬-에틸렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리-알킬-에틸렌 글리콜의 공중합체 및 이의 유도체, 폴리(비닐 에틸에테르), a,P-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파트아미드], 폴리카르복실레이트, 폴리옥시에틸렌-옥시메틸렌, 폴리아크릴오일 모르폴린, 아미노 화합물 및 옥시올레핀의 공중합체, 폴리히아루론산, 폴리옥시란,에탄디오산 및 말론산의 공중합체, 폴리(1,3-디옥솔란), 에틸렌 및 말레산 히드라지드 공중합체, 폴리시알산, 시클로덱스트린 등을 포함한다. 일정 구체예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
본원에서 사용되는 폴리에톨 화합물은 제한없이, 폴리에틸렌 글리콜(모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜, 모노히드록실 폴리에틸렌 글리콜 포함), 폴리비닐 알콜, 폴리알릴 알콜, 폴리부테놀 등, 및 이들의 유도체, 예컨대 지질을 포함한다.
폴리에테르 화합물은 제한없이, 폴리알킬렌 글리콜(HO((CH2)xO)nH), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시레힐렌(HO((CH2)2O)nH), 폴리비닐 알콜((CH2CHOH)n)을 포함한다.
폴리아미노산은 제한없이, 1 유형의 아미노산의 중합체 또는 2 또는 그 이상의 유형의 아미노산의 공중합체, 예를 들면 폴리알라닌 또는 폴리리신, 또는 이의 블록 공중합체를 포함한다.
다당류는 제한없이 글루코산 및 이의 유도체, 예를 들면 덱스트란 설페이트, 셀룰로스 및 이의 유도체(메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스 포함), 전분 및 이의 유도체, 폴리수크로스 등을 포함한다.
본 발명의 일 특정 구체예에서, ADI는 단백질 또는 펩티드와 커플링되어 개질되고, 여기서 1 이상의 단백질 또는 펩티드가 ADI에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 단백질은 제한없이 천연 존재 인간 혈청 단백질 또는 이의 단편, 예컨대 타이록신-결합 단백질, 트랜스 타이레틴, a1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐, 면역글루불린, Ig Gc 영역, 알부민, 및 이의 단편을 포함하는, 천연 존재 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. "단편"은 목적하는 단백질 기능을 보유하는 전체 단백질 보다 작은 단백질의 일부분을 의미한다. ADI는 공유 결합을 통해 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 직접 연결은 ADI의 한 아미노산이 펩티드 결합 또는 이황화 브릿지를 통해, 개질 단백질의 한 아미노산에 직접 연결된다. 간접 연결은 그들 사이에 고유하게 존재하는 화학기 또는 생물학적 또는 화학적 수단을 통해 부가된 특이적 화학기 또는 상기 언급된 연결들의 조합을 통한, ADI와 개질 단백질 간 연결을 의미한다.
일 특정 구체예에서, ADI는 PEG와의 공유 부착을 통해 개질된다. PEG로 공유 개질(연결기를 갖거나 또는 갖지 않음)된 ADI는 이하에서 "ADI-PEG"라 한다. 천연 ADI와 비교하여, ADI-PEG는 그 효소 활성 대부분을 보유하고, 상당히 덜 항원성이며, 순환 반감기가 상당히 연장되었고, 종양 치료에 훨씨 효과적이다.
"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 화학식 H(OCH2CH2)nOH(여기서 n은 4 이상임)로 표시되는, 분지형 또는 직쇄형인, 산화에틸렌 및 물의 축합 중합체의 혼합물을 의미한다. "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 그 근사치 중량 평균 분자량을 표시하는데 숫자 접미사를 조합하여 사용한다. 예를 들면, PEG 5,000은 총 중량 평균 분자량이 약 5,000인 PEG를 의미하고, PEG 12,000은 총 중량 평균 분자량이 약 12,000인 PEG를 의미하며, PEG 20,000은 총 중량 평균 분자량이 약 20,000인 PEG를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, PEG는 총 중량 평균 분자량이 약 1,000∼약 50,000이고; 일 구체예에서 약 3,000∼약 40,000이며, 다른 구체예에서 약 5,000∼약 30,000이고; 일정 구체예에서 약 8,000∼약 30,000이며; 다른 구체예에서 약 11,000∼약 30,000이고; 추가 구체예에서, 약 12,000∼약 28,000이고; 또 다른 구체예에서, 약 16,000∼약 24,000이고; 다른 구체예에서, 약 18,000∼약 22,000; 다른 구체예에서, 19,000∼약 21,000이며, 일 구체예에서, PEG는 총 중량 평균 분자량이 약 20,000이다. 대체로, 분자량이 30,000 또는 그 이상인 PEG는 용해가 어렵고, 제제화된 산물의 수율이 상당히 저하된다. PEG는 분지형이거나 또는 직쇄형이거나, 또는 일부 구체예에서는 직쇄이다. 대체로, PEG의 분자량 증가는 ADI의 면역원성을 감소시킨다. 이 구체예에서 기술한 분자량을 갖는 PEG는 예를 들면 급성 골수성 백혈병, 예컨대 재발성 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 직결장암, 위암(gastric cancer), 신경교종, 다형성 교모세포종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암, 위암(stomach cancer) 및 식도암을 포함하는, 암을 치료하기 위해, ADI와 함께 사용될 수 있고, 경우에 따라, 생체적합성 연결기와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, PEG는 총 중랑 평균 분자량이 약 1,000∼약 50,000이고; 일정 구체예에서 약 3,000∼약 30,000이며; 다른 구체예에서 약 3,000∼약 20,000이고; 일 구체예에서 약 4,000∼약 12,000이며; 또 다른 구체예에서 약 4,000∼약 10,000이고; 추가 구체예에서 약 4,000∼약 8,000이며; 또 다른 추가 구체예에서 약 4,000∼약 6,000이고; 약 5,000이다. 다른 구체예에서. PEG는 분지형이거나 또는 직쇄형일 수 있고, 일정 구체에예서는 직쇄이다. 이 구체예에서 기술한 분자량을 갖는 PEG는 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 또는 암을 치료하기 위해, ADI, 및 경우에 따라, 생체적합성 연결기와 함께 사용될 수 있다.
ADI-PEG는 본원에서 예시적인 개질 ADI이지만, 당분야의 숙련가가 인식하는 바와 같이, ADI는 목적하는 효과, 구체적으로 면역원성 감소 및 혈청 반감기 증가를 위해 다른 중합체 또는 적절한 분자로 개질될 수 있다.
ADI는 바람직한 구체예에서는 연결기를 사용하지만, 연결기 없이 또는 연결기와, PEG 등과 같은 개질제에 공유 결합될 수 있다.
개질제, 예를 들면 PEG에 ADI를 공유 부착하기 위해 사용되는 연결기는 임의의 생체적합성 연결기일 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, "생체적합성"은 화합물이나 기가 무독성이고 손상, 고통, 질환 또는 사망을 야기하지 않고 생체내 또는 시험관 내에서 이용할 수 있다. 개질제, 예컨대 PEG는 예를 들면 에테르 결합, 에스테르 결합, 티올 결합 또는 아미드 결합을 통해, 연결기에 결합될 수 있다. 적절한 생체적합성 연결기는 예를 들면 에스테르 기, 아미드 기, 이미드 기, 카바메이트 기, 카르복실 기, 히드록실 기, 탄수화물, 숙신이미드 기(예를 들면, 숙신이미딜 숙시네이트(SS), 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트(SCM), 숙신이미딜 숙신아미드(SSA) 또는 N-히드록시 숙신이미드(NHS) 포함), 에폭시드 기, 옥시카르보닐이미다졸 기(예를 들면, 카르보닐디미나졸(CDI) 포함), 니트로 페닐 기(예를 들면, 니트로페닐 카르보네이트(NPC) 또는 트리클로로페닐 카르보네이트(TPC) 포함), 트리실레이트 기, 알데히드 기, 이소시아네이트 기, 비닐설폰 기, 타이로신 기, 시스테인 기, 히스티딘 기 또는 1차 아민을 포함한다. 일 구체예에서, 생체적합성 연결기는 에스테르 기 및/또는 숙신이미드 기이다. 다른 구체예에서, 연결기는 SS, SPA, SCM, SSA 또는 NHS이고; 일정 구체예에서, SS, SPA 또는 NHS가 보다 바람직하다. 다른 구체예에서, SS 또는 SPA가 가장 바람직하다.
다르게, ADI는 아미노 기, 설프히드랄 기, 히드록실 기 또는 카르복실 기를 통해 개질제, 예컨대 PEG(즉, 연결기 없음)에 직접 커플링될 수 있다.
ADI는 예를 들면 [Park et al, Anticancer Res., 1:373-376 (1981)], 및 [Zaplipsky and Lee, Polyethylene glycol Chemistry: Biotechnical 및 Biomedical Applications, J. M. Harris, ed., Plenum Press, NY, Chapter 21 (1992)]에 기술된 바와 같이, 당분야의 공지 방법을 이용해 생체적합성 연결기를 통해 PEG에 공유 결합될 수 있다. 상기 문헌들을 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다.
ADI에 PEG 부착은 ADI의 순환 반감기를 증가시킨다. 대체로, PEG는 ADI의 1차 아민에 부착된다. PEG, 또는 다른 개질제의 ADI 상의 부착 부위 선택은 당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 단백질의 활성 도메인 내 각 부위의 역할에 의해 결정된다. PEG는 실질적인 효소 활성 손실없이 ADI의 1차 아민에 부착될 수 있다. 예를 들면, 마이코플라즈마 아르기니니, 마이코플라즈마 아르트리티데스 및 마이코플라즈마 호미니스에서 클로닝된 ADI는 이러한 과정을 통해 개질될 수 있는 약 17개 리신을 갖는다. 달리 말해서, 17개 리신은 생체적합성 연결기, 예컨대 SS, SPA 및/또는 SSA 및/또는 NHS를 통해 PEG에 부착될 수 있는 가능한 모든 위치이다. PEG는 또한 본원의 관점에서 당분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, ADI의 다른 위치에 부착될 수도 있다.
1개∼약 30개 PEG 분자가 ADI에 공유 결합될 수 있다. 일정 구체예에서, ADI는 1개의 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, ADI는 1개 보다 많은 PEG 분자로 개질된다. 일 구체예에서, ADI는 약 7개∼약 15개 PEG 분자로 개질된다. 일 구체예에서 ADI는 약 9개∼약 12개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, ADI는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 PEG 분자로 개질된다. 일 특정 구체예에서, ADI는 ADI 당 4.5∼5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, ADI는 5±1.5개 PEG 분자로 개질된다.
다른 구체예에서, ADI의 1차 아미노 기 중 약 30%∼약 70%는 PEG로 개질되고, 일 구체예에서는, 약 40%∼약 60%, 또는 일정 구체예에서 약 45%∼약 55%, 다른 구체예에서는 아르기닌 디이미나아제의 1차 아미노 기 중 약 50%가 PEG로 개질된다. PEG가 ADI의 말단에 공유 결합되면, 오직 1개 PEG 분자를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. ADI 상의 PEG 유닛 수 증가는 효소의 순환 반감기를 증가시킨다. 그러나, ADI 상의 PEG 유닛 수 증가는 효소의 비활성을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 관점에서 당분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 둘 간에 균형을 획득할 필요가 있다.
본 발명에서, 생체적합성 연결기의 공통 특징은 이들이 말레이미드 기를 통해 아르기닌 디이미나아제의 1차 아민에 부착된다는 것이다. ADI와 커플링되면, SS-PEG는 PEG 옆에 에스테르 연결부를 갖는데, 이 부위는 혈청 에스터라아제에 감응성이 될 수 있고, 체내 ADI로부터 PEG를 방출시킬 수 있다. SPA-PEG 및 PEG2-NHS는 에스테르 연결부를 갖지 않아서, 혈청 에스터라아제에 감응성이지 않다.
본 발명에서, 특정 연결기는 ADI-PEG의 순환 반감기 또는 그 효소의 비활성에 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 그러나, 일정 구체예에서, 생체적합성 연결기는 본 발명에서 사용된다. 단백질에 부착되는 PEG는 SS-PEG, SPA-PEG 및 SC-PEG처럼, 직쇄이거나, 또는 PEG2-NHS처럼, 분지형 PEG를 사용할 수 있다.
일정 구체예에서, 본원의 ADI는 미국 특허 제6,635,462호에 기술된 바대로 개질될 수 있다. 구체적으로, 특히 마이코플라즈마 호미니스로부터 유래된 ADI의 천연 발생 아미노산 중 1 이상의 개질은 보다 쉽게 재생 및 제제화될 수 있는 효소를 제공하여 ADI 및 이를 포함하는 치료 조성물의 현행 제조 기술을 개선시킬 수 있다. 일 구체예에서, 본원의 ADI는 1 이상의 리신 잔기가 제거되도록 개질된다(예를 들면, 리신이 다른 아미노산으로 치환될 수 있음). 구체적으로, 일 구체예에서, ADI는 서열번호 1의 위치 112, 374, 405 또는 408에 리신이 없도록 개질된다.
일정 구체예에서, 효소의 촉매 영역에 또는 그에 인접한 ADI와 연관된 PEG화 부위가 개질된다. 본 발명의 목적을 위해, "PEG화 부위"라는 어구는 폴리에틸렌 글리콜을 사용해 공유적으로 개질시킬 수 있는 ADI의 임의 부위 또는 위치로 정의될 수 있다. "PEG화 부위"는 그 부위의 PEG화가 효소의 촉매 활성을 상당히 감소시키게 되는, 효소의 촉매 영역에 또는 그에 인접해 위치한다고 생각할 수 있다. 이러한 부위의 PEG화는 전통적으로 효소의 불활성을 일으킨다. 예를 들면, 마이코플라즈마 호미니스 유래 ADI는 효소의 촉매 영역에 또는 그에 인접한 것으로 생각될 수 있는 112 위치의 리신을 갖는다. 이 112 위치의 리신에 PEG 부착은 효소를 불활성화시킬 수 있다. 또한, 마이코플라즈마 호미니스 유래 ADI는 효소의 촉매 영역에 또는 그에 인접하는 것으로 여겨지는 397 위치에 시스테인을 갖는다. 397 위치의 시스테인에 대한 아미노산 치환은 효소를 불활성화시킬 수 있다. 구체적으로, 397 위치의 시스테인을 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 세린, 리신 또는 타이로신으로 치환하는 것은 모든 검출가능한 효소 활성의 손실을 일으킨다. 마이코플라즈마 호미니스 유래의 ADI는 또한 이 보존 시스테인 근처에 위치한 3개 리신, 구체적으로 Lys374, Lys405 및 Lys408을 갖는다. Lys374, Lys405, Lys408 또는 이의 조합에 PEG의 부착은 효소를 불활성화시킬 수 있다.
다른 유기체에서 유래된 ADI도 역시 마이코플라즈마 호미니스 유래 ADI의 112 위치에 해당하는 PEG화 부위를 가질 수 있는 것으로 이해해야 한다. 예를 들먼, 스트렙토코커스 파이로제네스 유래 ADI는 104 위치에 리신을 가지며, 마이코플라즈미 뉴모니아 유래 ADK는 106 위치에 리신을 가지고, 지아르디아 인테스티날리스 유래 ADI는 마이코플라즈미 호미니스 유래 ADI의 112 위치와 동일한 위치에 상응하는 리신을 가질 수 있다. 이러한 유기체 유래의 ADI에서 리신의 위치는 당분야의 숙련가에게 공지이고 미국 특허 제6,635,462호에 기술되어 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 ADI의 폴리펩티드 사슬 내 일정 아미노산 치환을 제공한다. 이러한 치환은 개질제에 의한 개질시, 예를 들면 PEG화시 덜 활성을 손실한 개질 ADK를 제공한다. 효소의 촉매 영역에 또는 그에 인접한, PEG화 부위, 또는 다른 공지의 개질 부위를 제거하여, 최적의 개질, 예를 들면 PEG화가 활성 손실없이 획득될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예들은 아르기닌 디이미나아제의 일부 구조적 특징이 재조합 기술을 통해 생산시 아르기닌 디이미나아제의 적절하고 신속한 재생을 억제 또는 방해할 수 있다는 이해를 기초로 함을 이해해야 한다. 구체적으로, 이러한 구조적 특징들은 재조합 생산 동안 효소가 활성 입체구조를 취하는 것을 방해하거나 또는 방지한다. 본 발명의 목적을 위해, "활성 입체구조(active conformation)"는 미개질 또는 개질 아르기닌 디이미나아제에 의해 효소 활성이 가능한 3차원 구조로 정의될 수 있다. 활성 입체구조는, 구체적으로 아르기닌의 시트룰린으로의 전환을 촉매하는데 필수적일 수 있다. "구조적 특징"이라는 어구는 특정 아미노산 또는 아미노산의 조합으로 인한 폴리펩티드 사슬의 임의 특성, 품질 또는 특성으로 정의될 수 있다. 예를 들면, 아르기닌 디이미나아제는 정상적인 펩티드 사슬이 구부러지거나 또는 뒤틀리게 되는 아미노산을 포함할 수 있어서 효소의 재생 동안 효소가 활성 입체구조를 취하는 것을 방해하게 된다. 구체적으로 마이코플라즈마 호미니스 유래의 아르기닌 디이미나아제는 펩티드 사슬이 구부러지거나 또는 뒤틀릴 수 있는 210번 위치에 프롤린을 가지고 있어서, 재조합 생산 동안 효소가 재생되는 것을 더 어렵게 한다. 다른 유기체 유래의 아르기닌 디이미나아제가 마이코플라즈마 호미니스 유래의 아르기닌 디이미나아제의 210번 위치에 상응하는 부위를 가질 수도 있다.
따라서 본 발명은 아르기닌 디이미나아제의 폴리펩티드 사슬에 일정 아미노산 치환을 제공한다. 이러한 아미노산 치환은 아르기닌 디이미나아제의 펩티드 사슬 내 문제성 구조적 특징을 제거할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 개질된 아르기닌 디이미나아제의 개선된 재생을 제공한다. 이들 아미노산 치환은 적은양의 완충액을 이용하여 개질 아르기닌 디이미나아제를 가능한 신속하게 재생시킨다. 이들 아미노산 치환은 또한 재생된 개질 아르기닌 디이미나아제의 수율 증가를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 개질된 아르기닌 디이미나아제는 P210에 단일 아미노산 치환을 갖는다. 상기 기술된 바와 같이, 마이코플라즈마 호미니스는 210번 위치에 존재하는 아미노산 프롤린을 갖는다. 본 발명을 제한하지 않고, 210분 위치의 아미노산 프롤린 존재는 아르기닌 디이미나아제의 재생(즉, 리폴딩)의 어려움을 증가시키는 정상 폴리펩티드의 구부러짐이나 뒤틀림을 일으키는 것으려 여겨진다. 위치 210의 프롤린을 치환하면 소량의 완충액을 사용해 개질 아르기닌 디이미나아제의 신속한 재생을 가능하게 할 수 있다. 210번 위치의 프롤린에 대한 치환은 또한 재생된 개질 아르기닌 디이미나아제의 수율 증가를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 210번 위치의 프롤린은 세린으로 치환시킨다. 본 발명의 이러한 측면에 따라서, 210번 위치에 다른 치환을 할 수도 있음을 이해해야 한다. 다른 치환의 예에는 Pro210을 Thr210로 치환, Pro210을 Arg210으로 치환, Pro210을 Asn210으로 치환, Pro210을 Gln210으로 치환 또는 Pro210을 Met210으로 치환을 포함한다. 야생형 아르기닌 디이미나아제의 210번 위치의 아미노산과 관련된 구조적 특징을 제거하여, 효소의 적절한 리폴딩을 성취할 수 있다.
본 발명의 방법은 생체내 또는 시험관 내 용도를 포함할 수 있다. 시험관 내 용도의 경우, 세포 배양 용도를 포함하여, 본원에 기술된 화합물은 배양 세포에 부가되어서 항온반응될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 당분야에 공지된 항체 제조 방법을 이용해, 단일클론 및/또는 다클론 항체의 제조를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 단일클론 및/또는 다클론 항체는 당분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 광범위한 진단 용도에 이용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 생체내 투여 방법은 의도하는 용도에 따라 다양하게 된다. 순수한 형태 또는 적절한 약학 조성물 형태인, 본원에 기술된 ADI의 투여는 유사한 유용도를 제공하기 위해 임의의 허용되는 투여 방식을 통해 수행될 수 있다. 약학 조성물은 적절한 생리적 허용 담체, 희석제 또는 부형제와, ADI, 예를 들면 ADI-PEG, ADI-PEG 20을 배합하여, 제조할 수 있고, 고형, 반고형, 액제 또는 가스형, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 액제, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 미세구 및 에어로졸로 제제화될 수 있다. 또한, 다른 약학적 활성 성분(본원에 기술된 다른 항암제 포함) 및/또는 적합한 부형제 예컨대 염, 완충제 및 안정화제가 필요한 것은 아니지만, 조성물에 존재할 수 있다. 투여는 경우, 비경구, 비내, 정맥내, 피내, 피하 또는 구소를 포함한, 다양한 다른 경로로 수행될 수 있다. 투여 방식은 치료 또는 예방하려는 병태의 성질에 따라 좌우된다. 따라서, ADI-PEG, 예를 들면, ADI-PEG 20은 경구적으로, 비내로, 복강내로, 비경구적으로, 정맥내로, 림프내로, 종양내로, 근육내로, 간질내로, 동맥내로, 피하로, 안내로, 활액내로, 경상피로 그리고, 경피로 투여될 수 있다. 투여 후, 암의 진행 및/또는 전이를 경감, 억제, 예방 또는 지연시키는 양을 유효한 것으로 간주한다. 일정 구체예에서, 본원의 ADI 조성물은 통계적으로 유의한 양에 의해 환자의 중간 생존 시간을 증가시킨다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 ADI 치료는 환자의 중간 생존 시간을 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 15 주, 20 주, 25 주, 30 주, 40 주, 또는 그 이상 증가시킨다. 일정 구체예에서, ADI 치료는 환자의 중간 생존 시간을 1 년, 2 년, 3 년, 또는 그 이상 증가시킨다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 ADI 치료는 무진행 생존(progresison-fres survival)을 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주 또는 그 이상 증가시킨다. 일정 구체예에서, 본원에 기술된 ADI 치료는 무진행 생존을 1 년, 2 년, 3 년, 또는 그 이상 증가시킨다.
일정 구체예에서, 투여량은 생존 종양의 양이 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타나는 바와 같이, 예를 들면 종양 질량이 50% 이상 감소하거나, 또는 변경(예를 들면 통계적으로 유의하게 감소) 스캔 치수에 의해 나타나는 바와 같이, 종양 퇴행이 일어나기에 충분하다. 일정 구체예에서, 투여량은 안정한 질환이 되기에 충분하다. 다른 구체예에서, 투여량은 당분야의 임상의에게 공지된 특정 질환 지표의 증상이 임상적으로 관련성있게 감소되기에 충분하다.
일정 구체예에서, 투여량은 NO 합성을 억제하거나, 혈관생성을 억제하고 하거나 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하기에 충분하거나 또는 이의 임의 조합이다. NO 합성, 혈관생성, 및 아폽토시스는 당분야의 공지 방법을 이용해 측정할 수 있고, 예를 들면 다음의 문헌을 참조한다: Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009 및 최신판); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; 및 다른 유사 참조문헌. 일 특정 구체예에서, 투여량은 NO 합성을 억제하고, 흑색종의 성장을 억제하며, 본원에 기술된 다른 화학요법제, 예컨대 시스플라틴과 상승작용한다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 ADI-PEG 20을 시스플라틴과 조합하여 투여하는 흑색종의 치료 방법을 제공하고, 여기서 치료는 내생성 일산화질소(NO)를 고갈시킨다.
상세한 치료 용량 및 기간은 치료하려는 질환에 따르며 공지의 검사 프로토콜을 이용해 이론저긍로 결정하거나 또는 당분야에 공지된 모델 시스템에서 조성물을 검사하고 그로부터 외삽하여 결정할 수 있다. 통제된 임상 시도도 수행할 수 있다. 용량은 또한 경감시키고자 하는 병태의 중증도에 따라 다양할 수 있다. 약학 조성물은 대체로 원치않는 부작용을 최소화하면서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하도록 제제화 및 투여된다. 조성물은 1회 투여되거나, 또는 시간 간격으로 투여하려는 다수의 소량 용량으로 나눌 수 있다. 임의의 특정 피험체의 경우, 특정 용량 계획을 개체 요구에 따라 시간 경과에 따라 조정할 수 있다.
ADI 조성물은 단독으로 또는 다른 공지의 암 치료, 예컨대 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역동 요법 등과 조합하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 조합하여 투여될 수 있다.
따라서, 이들 및 관련 약학 조성물의 전형적인 투여 경로는, 제한없이, 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 구강, 직장, 질내, 및 비내를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입법을 포함한다. 본 발명의 일정 구체예에 따른 약학 조성물은 환자에 조성물 투여시 그에 포함된 활성 성분이 생체이용될 수 있도록 제제화된다. 피험체 또는 환자에 투여되는 조성물은 1 또는 그 이상의 용량 단위 형태일 수 있는데, 예를 들면 정제는 단일 용량 유닛일 수 있고, 본원에 기술된 용기 에어졸 형태의 ADI는 복수의 용량 유닛을 유지할 수 있다. 이러한 투약형을 제조하는 실제 방법은 공지이거나, 또는 당분야의 숙련가에게 자명하다. 예를 들어, 이하 문헌을 참조한다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). 투여되는 조성물은, 임의의 경우에서, 본원의 교시에 따라 목적하는 질병이나 병태의 치료를 위해, 본원에 기술된 ADI-PEG, 예컨대 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 포함한다.
약학 조성물은 고체형이거나 액체형일 수 있다. 일 구체예에서, 담체(들)은 조성물이 예를 들면, 정제형이거나 분말형이도록 미립자이다. 담체(들)은 액체일 수 있는데, 조성물이 예를 들면 경구 오일, 주사형 액체 또는 경구 흡입에 유용한 에어로졸인 경우이다. 경구 투여 목적인 경우, 약학 조성물은 대체로, 고형이거나 액형일 수 있는데, 여기서 반고형, 반액형, 현탁액 및 겔형은 고체 또는 댁체로서 본원에서 고려하는 형태 내에 포함된다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 약학 조성물은 분말, 과립, 압착 정제, 알약, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 등으로 제제화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 1 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유한다. 또한, 다음의 1 이상이 존재할 수 있다: 결합제 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제 예컨대 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스; 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 풍미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 향미제 예컨대 페퍼민트, 메틸살리실레이트 또는 오렌지향; 및 착색제. 약학 조성물이 캡슐, 예를 들면 젤라틴 캡슐인 경우, 상기 유형의 재료 이외에도, 액상 담체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 액체 형태, 예를 들면 엘릭시르, 시럽, 용액제, 에멀션 또는 현탁제의 형태일 수 있다. 액체는 2가지 예로서, 경구 투여용이거나 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 경구 투여 목적인 경우, 바람직한 조성물은, 본 발명의 화합물 이외에도, 1 이상의 풍미제, 보존제, 염료/착색제 및 풍미 강화제를 포함할 수 있다. 주사 투여 목적의 조성물에는, 1 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제가 포함될 수 있다.
용액제, 현탁제 또는 다른 유사 형태의 액상 약학 조성물은 다음의 1 이상의 보조제를 포함할 수 있다: 멸균 희석제 에컨대 주사용 물, 염수 용액, 일정 구체예에서, 생리적 염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유 예컨대 용매나 현탁 매질로 제공될 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질알콜 또는 메틸파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예커대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 또는 등장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 시린지 또는 복수 용량 바이알에 내포될 수 있다. 생리적 염수가 바람직한 보조제이다. 주사용 약학 조성물은 바람직하게는 멸균된다.
비경구 또는 경구 투여 목적의 액상 약학 조성물은 적합한 용량이 달성되도록, 본원에 개시된 ADI, 예컨대 ADI-PEG 20의 양을 포함해야 한다. 경구 투여 목적의 경우, 그 양은 조성물 중량의 0.1∼약 70%로 다양할 수 있다. 일정 경구 약학 조성물은 ADI-PEG를 약 4%∼약 75%로 포함한다. 일정 구체예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물 및 조제물은 비경구 용량 유닛이 희석 전에 ADI-PEG를 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함하게 제조된다.
약학 조성물이 국소 투여 목적인 경우, 담체는 용액, 에멀션, 연고 또는 겔 베이스를 적절하게 포함할 수 있다. 예를 들면, 베이스는 다음 중 1 이상을 포함할 수 있다: 페트로라텀, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄유, 희석제 예컨대 물 및 알콜, 유화제 및 안정화제, 증점제가 국소 약학 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여 목적인 경우, 조성물은 경피 팻치 또는 이온토포레시스 장치를 포함할 수 있다. 약학 조성물은, 예를 들면 직장에서 용해되어서 약물을 방출하게되는, 좌제 형태의, 직장 투여용일 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적절한 비자극성 부형제로 유분이 많은 베이스를 포함할 수 있다. 이러한 베이스에는 제한없이, 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
약학 조성물은 고체 또는 액체 용량 유닛의 물리형을 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 활성 성분 주변에 코팅쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅쉘을 형성하는 물질은 대체로 불활성이고, 예를 들면 슈가, 셀락 및 다른 장용코팅제에서 선택될 수 있다. 다르게, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 내재될 수 있다. 고체 또는 액체 형태의 약학 조성물은 ADI-PEG에 결합하여 화합물 전달을 보조하는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적합한 작용제는 단일클론 또는 다클론 항체, 1 이상의 단백질 또는 리포솜을 포함한다. 약학 조성물은 에어로졸로 투여할 수 있는 용량 유닛으로 실질적으로 이루어질 수 있다. 에어로졸이라는 용어는 콜로이드 성질에서 가압 패키지로 이루어진 시스템에 이르는 범위까지 광범위한 시스템을 의미하는데 사용된다. 전달은 액화 또는 가압 가스에 의하거나 또는 활성 성분을 분배하는 적합한 펌프 시스템에 의할 수 있다. 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단층, 이층 또는 삼층으로 전달될 수 있다. 에어로졸 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는, 필수 용기, 액티베이터, 밸브, 서브용기를 포함한다. 당분야의 숙련가는 과도한 실험없이, 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.
약학 조성물은 약학 분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사 투여를 위한 약학 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 ADI-PEG 및 경우에 따라 1 이상의 염, 및/또는, 완충제 및/또는 안정화제를 포함하는 조성물을, 용액을 형성하도록 멸균, 증류수와 함께 배합하여 제조할 수 있다. 계면활성제를 부가하여 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 촉지할 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템 중 ADI-PEG의 균질한 현탁 또는 용해를 촉진하도록 ADI-PEG 조성물과 비공유적으로 상호작용한다.
조성물은 치료 유효량으로 투여될 수 있는데, 그 양은 적용되는 특정 화합물(예를 들면, ADI-PEG)의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간; 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 및 식이; 투여 방식 및 시기; 배출률; 약물 조합; 특정 질환이나 병태의 중증도; 및 치료를 겪는 피험체를 포함한, 다양한 인자에 따라 좌우된다.
본 발명의 화합물 중 하나의 치료 유효량은 종양 성장을 억제하는데 효과적인 양이다. 대체로, 치료는 일정 상황 하에서 최적 효능을 달성할 때까지 소량씩 증량시키면서 증가시킬 수 있는 소량으로 시작한다. 대체로, 본 발명의 화합물의 치료 용량은 약 1∼약 200 mg/kg으로 주당 2회 내지 약 2주 당 1회이다. 예를 들면, 용량은 2 mL 정맥 주사로 주 1회 약 1 mg/kg 내지 3일마다 1회 약 20 mg/kg일 수 있다. 추가 구체예에서, 용량은 약 50 IU/㎡∼약 700 IU/㎡일 수 있고, 대략 3일마다 1회, 대략 1주당 1회, 대략 주당 2회, 또는 대략 매2주 마다 1회 투여될 수 있다. 일정 구체예에서, 용량은 약 50 IU/㎡, 60 IU/㎡, 70 IU/㎡, 80 IU/㎡, 90 IU/㎡, 100 IU/㎡, 110 IU/㎡, 120 IU/㎡, 130 IU/㎡, 140 IU/㎡, 150 IU/㎡, 160 IU/㎡, 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 360 IU/㎡, 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 620 IU/㎡, 630 IU/㎡, 640 IU/㎡, 650　IU/㎡, 660 IU/㎡, 670 IU/㎡, 680 IU/㎡, 690 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡일 수 있고, 대략 3일마다 1회, 대략 주당 1회, 대략 주당 2회, 또는 매 2주마다 1회 투여될 수 있다. 일정 구체예에서, 피험체가 항-ADI 면역 반응을 시작하게 되는 경우, 용량은 숙련된 임상의가 요구하는 대로 변화시킬 수 있다.
ADI-SS-PEG5,000의 최적 투약은 대략 주당 2회일 수 있는 반면, ADI-SS-PEG20,000의 최적 투약은 대략 주당 1회 내지 대략 매 2주당 1회일 수 있다. 일정 구체예에서, ADI-SS-PEG20,000의 최적 투약은 대략 주당 2회일 수 있다.
ADI-PEG는 주사 전에, 인산염 완충 염수액과 혼합되거나, 또는 당분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 적절한 용액과 혼합될 수 있다. 일 구체예에서, ADI-PEG를 포함하는 액상 조성물은 약 10∼약 12 mg의 ADI, 약 20∼약 40 mg의 폴리에틸렌 글리콜, 1.27 mg +5% 1가 인산나트륨, USP; 약 3 mg의 +5% 2가 인산나트륨, USP; 7.6 mg +5% 염화나트륨, USP을 약 6.6∼약 7의 pH로, 적량의 주사용 물(예를 들면, 약 1 mL 또는 약 2 mL)에 포함한다. 일 구체예에서, ADI-PEG를 포함하는 액체 조성물은 히스티딘-HCl을 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물 완충제는 약 0.0035 M 히스티딘-HCl∼약 0.35 M 히스티딘-HCl이다. 일 특정 구체예에서, 조성물은 0.13 M 염화나트륨과 pH 6.8인 0.035 M 히스티딘-HCl을 포함하는 완충제에 제제화된다. 다른 구체예에서, 조성물은 0.13 M 염화나트륨과 pH 6.8인 0.02 M 인산나트륨을 포함하는 완충제에 제제화된다.
일 구체예에서, ADI 또는 ADI-PEG를 포함하는 조성물은 pH가 약 5∼약 9, 약 6∼약 8, 또는 약 6.5∼약 7.5이다. 일부 구체예에서, ADI를 포함하는 조성물은 pH가 약 6.8 ± 1.0이다.
일 구체예에서, ADI-PEG를 포함하는 조성물 중 자유 PEG는 1-10%이고, 추가 구체예에서는 총 PEG 중 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이다. 일정 구체예에서, ADI-PEG를 포함하는 조성물 중 천연 ADI는 약 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만이다. 대체로, ADI-PEG를 포함하는 조성물은 총 불순물이 약 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1% 또는 0.5% 이하이다.
일 구체예에서, ADI 또는 ADI-PEG를 포함하는 조성물 중 자유 설프히드릴은 약 90%를 넘는다. 일부 구체예에서, ADI 또는 ADI-PEG를 포함하는 조성물 중 자유 설프히드릴은 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95%, 약 96% 약 97%, 약 98% 약 99% 또는 그 이상이다.
일 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 Km이 약 0.5 μM∼약 15 μM이고, 추가 구체예에서, 약 1 μM∼약 12 μM, 약 1 μM∼약 10 μM, 약 1.5 μM∼약 9 μM, 약 1.5 μM∼약 8 μM 또는 약 1.5 μM∼약 7 μM이다. 일정 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 Km이 약 1.5 μM∼약 6.5 μM이다. 일부 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 Km이 약 1.5 μM, 약 2 μM, 약 2.5 μM, 약 3 μM, 약 3.5 μM, 약 4 μM, 약 4.5 μM, 약 5 μM, 약 5.5 μM, 약 6 μM, 약 6.5 μM, 또는 약 7 μM이다.
일 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 Kcat이 약 0.5 sec-1∼약 15 sec-1이고, 추가 구체예에서는, 약 1 sec-1∼약 12 sec-1, 약 1 sec-1∼약 10 sec-1, 약 1.5 sec-1∼약 9 sec-1, 약 2 sec-1∼약 8 sec-1 또는 약 2.5 sec-1∼약 7 sec-1이다. 일정 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 Kcat이 약 2.5 sec-1∼약 7.5 sec-1이다. 일부 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 Kcat이 약 2.5 sec-1, 약 3 sec-1, 약 3.5 sec-1, 약 4 sec-1, 약 4.5 sec-1, 약 5 sec-1, 약 5.5 sec-1, 약 6 sec-1, 약 6.5 sec-1, 약 7 sec-1, 약 7.5 sec-1 또는 약 8 sec-1이다.
일 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 전도성(당분야에서는 전도율(specific conductance))이라함)이 약 5 mS/cm∼약 20 mS/cm이고, 추가 구체예에서, 약 5 mS/cm∼약 15 mS/cm, 약 7 mS/cm∼약 15 mS/cm, 약 9 mS/cm∼약 15 mS/cm or 약 10 mS/cm∼약 15 mS/cm이다. 일부 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 전도성이 약 9 mS/cm, 약 10 mS/cm, 약 11 mS/cm, 약 12 mS/cm 또는 약 13 mS/cm, 약 14 mS/cm 또는 약 15 mS/cm이다. 일정 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 전도성이 약 13 mS/cm ± 1.0 mS/cm이다.
일 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 삼투압이 약 50 mOsm/kg∼약 500 mOsm/kg, 약 100 mOsm/kg∼약 400 mOsm/kg, 약 150 mOsm/kg∼약 350 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg∼약 350 mOsm/kg 또는 약 250 mOsm/kg∼약 350 mOsm/kg이다. 일정 구체예에서, 조성물 중 ADI 또는 ADI-PEG는 삼투압이 약 300 ± 30 mOsm/kg이다.
본원의 ADI-PEG를 포함하는 조성물은 1 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 그 전에, 또는 그 후에 투여될 수도 있다. 이러한 병용 요법은 본 발명의 화합물 및 1 이상의 추가적인 활성제를 포함하는 단일 약학 용량 제제의 투여, 및 그 자체의 개별 약학 용량 제제로 각 활성제 및 본 발명의 ADI-PEG(예를 들면, ADI-PEG 20)을 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 ADI-PEG 및 다른 활성제는 정제 또는 캡슐 등과 같은 단일 경구 용량 조성물로 함께 환자에게 투여되거나, 또는 개별 경구 용량 제제로 각 작용제가 투여될 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 ADI-PEG 및 다른 활성제는 염수 용액 또는 다른 생리적 허용 용액 등과 같은 단일 비경구 용량 조성물로 함께 환자에게 투여되거나, 또는 각 작용제가 개별 비경구 용량 제제로 투여될 수 있다. 개별 용량 제제가 사용되는 경우, ADI-PEG 및 1 이상의 추가적인 활성제를 포함하는 조성물들은 실질적으로 같은 시점에, 즉 동시발생적으로, 또는 개별적으로 엇갈린 시점에, 즉 순차적으로 및 임의 순서로 투여될 수 있고, 병용 요법은 이러한 모든 계획을 포함하는 것으로 이해한다.
따라서, 일정 구체예에서, 본원의 ADI 조성물제와 조합하여 투여되는 것을 고려한다. 이러한 치료제는 본원에 기술된 특정 질환 상태, 예컨대 특정 암 또는 GVHD에 대한 표준 치료법으로 당분야에서 허용될 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제의 예에는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 소염제, 화학요법제, 방사선치료제, 오토파지 억제제, 또는 다른 활성 및 보조 작용제가 포함된다.
일정 구체예에서, 본원에 개시된 ADI 조성물은 임의 개수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예에는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드(CYTOXAN™); 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 유레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸렌이민; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 카크티노마이신, 칼리체아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, ?라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르 시타라빈, 디데옥시우리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안트로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테트이미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 리플레니셔 예컨대 프로린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르미틴; 엘립티니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.RTM.; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2, 2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면 파클리탁셀(TAXOL® Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플라티늄 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 플라티늄; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴(DMFO); 레틴산 유도체 예컨대 Targretin™(벡사로텐), Panretin™(알리트레티노인); ONTAK™(데니류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 임의의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 또한 이러한 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제 예컨대 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타아제 억제제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤)을 포함하는 항에스트로겐제; 및 항안드로겐제 예컨대 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린이 포함된다. 추가 화학요법제는 소라페닙 및 다른 단백질 키나아제 억제제 예컨대 아파티닙, 아시티닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 트리조티닙, 다사티닙, 에를로티닙, 포스타마티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 렌바티닙, 머프리티닙, 닐로티닙, 파니투쿠맙, 파조파닙, 페갑타닙, 라니비주맙, 룩솔리티닙, 트라스트주맙, 반데타닙, 베무라페닙, 및 수니티닙; 시롤리무스(라파마이신), 에베롤리무스 및 다른 mTOR 억제제를 포함한다. 상기 임의의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 또한 본원의 사용에서 고려된다.
일정 구체예에서, 본원에 개시된 ADI 조성물은 임의 수의 오토파지 억제제와 함께 투여될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 오토파지 억제제는 클로로퀸, 3-메틸아데닌, 히드록시클로로퀸(Plaquenil.TM.), 바필로마이신 A1, 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보시드 (AICAR), 오카다산, 2A형 또는 1형 단백질 포스파타아제를 억제하는 오토파지-억제 알갈 톡신, cAMP의 유사체, 및 cAMP 농도를 상승시키는 약물, 아데노신, N6-머캅토퓨린 리보시드, 워트만닌, 및 빈블라스틴으로 이루어진 군에서 선택된다. 또한, 오토파지에 필수적인 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 또는 siRNA, 예컨대 ATG5도 사용될 수 있다.
일 구체예에서, ADI-PEG와 1 이상의 치료제의 병용은 부가적으로 또는 상승적으로 작용한다. 이러한 점에서, 상승제는 본원에 기술되어 있고, 본원에 제공된 바와 같이 ADI-PEG와 상승적으로 작용할 수 있는 치료제(예를 들면, 화학요법제, 오토파지 억제제, mTOR 억제제, 또는 본원에 기술된 바와 같은 암 또는 염증성 장질환 치료에 사용되는 임의의 다른 치료제)를 포함하고, 이러한 상승작용은 화학요법제가 존재하지만 ADI-PEG 조성물은 부재하는 경우, 및/또는 ADI-PEG는 존재하지만 화학요법제가 존재하지 않는 경우에 검출할 수 있는 효능 보다 그 규모가 보다 큰(즉, 적절한 대조군 조건에 대해 통계적으로 유의한 방식으로) 검출가능한 효능으로서 나타낸다. 상승작용을 측정하는 방법은 당분야에 공지이다(Cancer Res January 15, 2010 70; 440).
본원에 기술된 바와 같이, ADI, 및 경우에 따라 다른 치료제를 포함하는 조성물은 암을 치료하기 위한 치료 방법 및 암의 전이를 예방하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 다른 암을 치료하거나, 그 증상을 경감시키거나, 또는 그의 진행을 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 GVHD를 치료하거나, 그의 증상을 경감하거나, 또는 그의 진행을 예방하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 ADI 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하여, 암 또는 GVHD를 치료하거나, 그 증상을 경감시키거나, 또는 그 진행을 억제하는 것을 포함하는 환자에서 암 또는 GVHD를 치료하거나, 그 증상을 경감시키거나, 또는 그 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 따라서, 본원에 기술된 ADI 조성물은 염증성 장질환(예를 들면, 크론병; 궤양성 대장염), GVHD, 또는 백혈병(예를 들면, 급성 골수성 백혈병 및 재발성 급성 골수성 백혈병), 흑색종, 육종(제한없이, 전이성 육종, 자궁 평활근육종 포함), 췌장암, 전립선암(예컨대, 제한없이, 호르몬 불응성 전립선암 포함), 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 소세포 폐암, 유방암, 난소암, 직결장암, 위암(제한없이, 위 선암종), 신경교종, 다형성 교아종, 망막아세포종, 신경아세포종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신장암(제한없이, 신장 세포 암종 포함), 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암(제한없이, 두경부의 편평 세포 암종; 혀의 암), 자궁경부암, 고환암, 쓸개, 담관암, 및 위암을 포함하는 암으로 고생하는 개체에게 투여할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여, 골수성 백혈병, 예컨대 제한없이, 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 골수성 백혈병, 예컨대 AML은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 다른 구체예에서, 골수성 백혈병(예를 들면, AML)은 t(15;17) 전위를 포함하지 않는다. 추가 구체예에서, 본 발명은 대략 3일 마다 1회, 대략 주당 1회, 대략 주당 2회, 또는 대략 2주마다 1회 ADI-PEG 20을 투여하는 것을 포함하는 AML의 치료 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, AML의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, ADI-PEG로 AML의 치료가 ADI에 대한 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 AML을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고 1주 당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 상승시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, AML의 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5∼6.5, 또는 일 구체예에서, 4.5∼5.5 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 AML의 치료 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG, 일 구체예에서는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 천연 ADI(즉, PEG로 미개질됨) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCL 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본원은 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여, 전이성 육종을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 육종은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 대략 3일 마다 1회, 대략 주당 1회, 대략 주 당 2회, 또는 대략 매2주 당 1회 투여하는 것을 포함하는 육종의 치료 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, AML의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, ADI-PEG를 이용한 육종의 치료가 ADI에 대한 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 육종의 치료 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 2배이며 주 당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 상승된다. 일 특정 구체예에서, AML의 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5∼6.5개 또는 4.5∼5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물을 투여하는 것에 의한, 전이성 육종을 포함하는, 육종의 치료 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG 분자, 일 구체예에서는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 천연 ADI(즉, PEG로 미개질됨) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCl 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제, 예컨대 제한없이 클로로퀸, 3-메틸아데닌, 히드록시클로로퀸, 바필로마이신 A1, 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보시드(AICAR), 오카다산, N6-머캅토퓨린 리보시드, 워트만닌, 및 빈블라스틴과 조합하여 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하는 것에 의한 췌장암을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 췌장암은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제, 예컨대 클로로퀸의 치료 유효량을 조합하여, ADI-PEG 20을 대략 3일 마다 1회, 대략 1주 마다 1회, 대략 1주 마다 2회, 또는 대략 2주마다 1회 투여하는 것을 포함하는 췌장암의 치료 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 클로로퀸의 치료 유효 용량은 약 600 mg 베이스의 초기 용량 이후 추가 300 mg 베이스 및 2일 연속일 각각일에 300 mg 베이스 단일 용량이다. 이는 3일 동안 2.5 g의 클로로퀸 포스페이트 또는 1.5 g 베이스의 총 용량을 나타낸다. 추가 구체예에서, 용량은 약 300 mg 베이스이다. 클로로퀸, 또는 다른 오토파지 억제제의 용량은 당분야에서 공지된 복용량을 이용해 숙련된 임상의가 필요에 따라 변화시킬 수 있다. 당분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 오토파지 억제제는 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물 전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 일정 구체예에서, 췌장암의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, 클로로퀸과 조합하여 ADI-PEG로 췌장암을 치료하는 것이 ADI에 대한 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 췌장암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고 주당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, 췌장암의 치료를 위한 ADI은 ADI 당 3.5∼6.5개, 또는 일 구체예에서, ADI 당 4.5∼5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물과 조합하여, 클로로퀸, 또는 다른 적절한 오토파지 억제제를 투여하여 췌장암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG 분자, 일 구체예에서, 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 천연 ADI(즉, PEG로 개질되지 않음) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCL 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제와 조합하여 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여 소세포 폐암을 치료하거나, 이의 증상을 경감하거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 소세포 폐암은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제, 예컨대 클로로퀸의 치료 유효량과 조합하여, 대략 매 3일 당 1회, 대략 주당 1회, 대략 주당 2회, 또는 대략 매2주 당 1회에 ADI-PEG 20을 투여하는 것을 포함하는 소세포 폐암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 점에서, 클로로퀸의 치료 유효량은 약 600 mg 베이스의 초기 용량 이후 추가적인 300 mg 베이스 및 2일 연속일 각각에 300 mg 베이스의 단일 용량일 수 있다. 이는 총 용량이 3일 간 2.5 g 클로로 포스페이트 또는 1.5 g 베이스를 의미한다. 추가 구체예에서, 용량은 약 300 mg 베이스일 수 있다. 클로로퀸의 용량은 당분야에 공지된 복용량을 이용해 숙련된 임상의가 필요에 따라 변화시킬 수 있다. 당분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 오토파지 억제제는 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일정 구체예에서, 소세포 폐암의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서는 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, 클로로퀸과 조합하여 ADI-PEG로 소세포 폐암을 치료하는 것이 ADI에 대해 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 소세포 폐암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고 주당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 상승시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, 소세포 폐암의 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5∼6.5개, 또는 일 구체예에서, 4.5∼5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물과 조합하여 클로로퀸을 투여하는 것에 의한 소세포 폐암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG 분자, 일정 구체예에서, 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 천연 ADI(즉, PEG로 개질되지 않음) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCl 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제와 조합하여 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여 육종(제한없이, 전이성 육종을 포함함)을 치료하거나, 이의 증상을 경감하거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 육종은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제, 예컨대 클로로퀸의 치료 유효량과 조합하여, 대략 3일마다 1회, 대략 1주당 1회, 대략 1주당 2회, 또는 대략 2주마다 1회로 ADI-PEG 20을 투여하는 것을 포함하는 육종의 치료 방법을 제공한다. 이러한 점에서, 클로로퀸의 치료 유효량은 약 600 mg 베이스의 초기 용량 이후 추가 300 mg 베이스 및 연속 2일 각각에 300 mg 베이스의 단일 용량일 수 있다. 이는 3일 간 총 용량이 2.5 g 클로로퀸 포스페이트 또는 1.5 g 베이스임을 의미한다. 추가 구체예에서, 용량은 약 300 mg 베이스일 수 있다. 클로로퀸의 용량은 당분야의 복용법을 이용해 숙련된 임상의가 필요에 따라 변화시킬 수 있다. 당분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 오토파지 억제제는 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물 전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 투여할 수 있다. 일정 구체예에서, 육종의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, 클로로퀸과 조합하여 ADI-PEG로 육종을 치료하는 것이 ADI에 대한 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 육종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고, 1주 당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, 육종의 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5∼6.5개, 또는 일 구체예에서, 4.5∼5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물과 조합하여 클로로퀸을 투여하여 육종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개의 PEG 분자, 일 구체예에서는 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하며, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 천연 ADI(즉, PEG로 개질되지 않음) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCl 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 도세탁셀과 조합하여 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여 흑색종을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 흑색종은 ASS, ASL, 또는 그 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 도세탁셀의 치료 유효량과 조합하여 대략 3일 마다 1회, 대략 1주 마다 1회, 대략 1주 마다 2회, 또는 대략 매 2주마다 1회 ADI-PEG 20을 투여하는 것을 포함하는 흑색종의 치료 방법을 제공한다. 이러한 점에서, 도세탁셀의 치료 유효량은 대략 매 3주간 30분 내지 1시간 동안 정맥으로 투여되는 75mg/㎡ 또는 100 mg/㎡를 포함할 수 있다. 숙련된 임상의가 이해하는 바와 같이, 도세탁셀의 용량은 질환 징후에 따라 및/또는 치료 전에 변화시킬 수 있고, 도세탁셀은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일정 구체예에서, 흑색종의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서는 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, 도세탁셀과 조합하여 ADI-PEG로 흑색종을 치료하는 것이 ADI에 대한 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고, 1주 당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, 흑색종 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5 내지 6.5개, 또는 일 구체예에서, 4.5 내지 5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물과 조합하여 도세탁셀을 투여하는 것에 의해 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG 분자, 일 구체예에서, 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하며, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 천연 ADI(즉, PEG로 개질되지 않음) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCl 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 시스플라틴과 조합하여 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여 흑색종을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 흑색종은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 시스플라틴의 치료 유효량과 조합하여, 대략 3일 마다 1회, 대략 1주마다 1회, 대략 1주마다 2회, 또는 매2주 마다 1회로 ADI-PEG 20을 투여하는 것을 포함하는 흑색종의 치료 방법을 제공한다. 이러한 점에서, 시스플라틴의 치료 유효량은 주기(매3-4주) 당 1회 50-100 mg/㎡, 또는 주기 당 총 100 mg/㎡에 대해 5일간 매일 투여를 포함한다. 숙련된 임상의가 이해하는 바와 같이, 시스플라틴의 용량은 질환 징후, 개별 환자에 따라, 및/또는 치료전에 변화시킬 수 있고, 시스플라틴은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일정 구체예에서, 흑색종의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서는 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220 IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, 시스플라틴과 조합하여 ADI-PEG로 흑색종을 치료하는 것이 ADI에 대한 면역 반응을 유발시키는 경우, 본 발명은 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고 주 당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, 흑색종의 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5 내지 6.5, 또는 일 구체예에서, 4.5 내지 5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물과 조합하여 시스플라틴을 투여하는 것에 의해 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG 분자, 일 구체예에서, 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 ADI(즉, PEG로 개질되지 않음) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCl 완충제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 mTOR 억제제, 예컨대 제한없이 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 및 리다포롤리무스와 조합하여 ADI-PEG 20의 치료 유효량을 투여하여 신장 세포 암종을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일정 구체예에서, 신장 세포 암종은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신의 치료 유효량과 조합하여, 대략 3일마다 1회, 대략 주당 1회, 대략 주당 2회, 또는 매2주마다 1회 ADI-PEG 20을 투여하는 것을 포함하는 신장 세포 암종을 치료하는 방법을 제공한ㄷ. 라파마이신, 또는 다른 mTOR 억제제의 용량은 당분야에 공지된 복용량을 이용해 숙련된 임상의가 필요에 따라 결정할 수 있다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, mTOR 억제제는 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물 전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 투여할 수 있다. 일정 구체예에서, 신장 세포 암종의 치료를 위해 투여되는 ADI-PEG 20의 용량은 약 160 IU/㎡∼약 360 IU/㎡이고, 다른 구체예에서는 약 160 IU/㎡, 약 170 IU/㎡, 180 IU/㎡, 190 IU/㎡, 200 IU/㎡, 210 IU/㎡, 220　IU/㎡, 230 IU/㎡, 240 IU/㎡, 250 IU/㎡, 260 IU/㎡, 270 IU/㎡, 280 IU/㎡, 290 IU/㎡, 300 IU/㎡, 310 IU/㎡, 약 320 IU/㎡, 약 330 IU/㎡, 340 IU/㎡, 약 350 IU/㎡, 약 360 IU/㎡, 약 370 IU/㎡, 380 IU/㎡, 390 IU/㎡, 400 IU/㎡, 410 IU/㎡, 420 IU/㎡, 430 IU/㎡, 440 IU/㎡, 450 IU/㎡, 500 IU/㎡, 550 IU/㎡, 600 IU/㎡, 640 IU/㎡, 또는 약 700 IU/㎡이다. 일정 구체예에서, 클로로퀸과 조합하여 ADI-PEG로 신장 세포 암종을 치료하는 것이 ADI에 대한 면역 반응을 유도하는 경우, 본 발명은 신장 세포 암종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 ADI의 용량은 두배이고 주 당 640 IU/㎡ 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 일 특정 구체예에서, 신장 세포 암종의 치료를 위한 ADI는 ADI 당 3.5 내지 6.5개, 또는 일 구체예에서, 4.5 내지 5.5개 PEG 분자로 개질된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 조성물과 조합하여, 라파마이신, 또는 다른 적절한 mTOR 억제제를 투여하여 신장 세포 암종을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 5±1.5개 PEG 분자, 일 구체예에서, 5±1.5개 직쇄 PEG 분자로 개질된 ADI를 포함하고, 일정 구체예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 ADI(즉, PEG로 개질되지 않음) 및/또는 약 5% 미만의 자유 PEG를 포함한다. 추가 구체예에서, 조성물은 히스티딘-HCl 완충제를 포함한다.
일정 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 ADI를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 흑색종, 췌장암, 전립선암, 소세포 폐암, 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 간세포암, 또는 육종이 아니다.
본원은 또한 본원에 기술된 바와 같이, ADI(예를 들면, ADI-PEG, 구체적으로 ADI-PEG 20)을 포함하는 조성물을 단독으로 또는 1 이상의 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 염증 질환을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 또한 ADI(예를 들면, ADI-PEG, 구체적으로 ADI-PEG 20)을 포함하는 조성물을 단독으로 또는 1 이상의 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 염증성 장질환을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 점에서, 본 발명은 ADI(예를 들면, ADI-PEG, 구체적으로 ADI-PEG 20)를 포함하는 조성물을 단독으로 또는 1 이상의 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 크론병 또는 궤양성 대장염을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이, ADI를 포함하는 조성물, 및 경우에 따라 1 이상의 다른 치료제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 ASS, ASL, 또는 둘 모두가 결핍이다. 이러한 점에서, ASS 또는 ASL 결핍은 mRNA 발현 또는 단백질 발현으로 측정한 발현 감소이거나, 또는 단백질 활성 감소일 수 있고, 대체로, 당분야의 숙련가가 측정한 발현 또는 활성의 통계적으로 유의한 감소를 포함한다. 감소된 ASS 또는 ASL 발현 또는 활성은 암이 없는 것으로 알려진 적절한 대조군 샘플에서의 발현 또는 활성과 비교하여, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 그 이상의 발현 또는 활성 감소일 수 있다. 일정 구체예에서, ASS 또는 ASL 발현 또는 활성은 무암 대조군 샘플에서의 발현 또는 활성과 비교하여 2배 이상 감소된다.
일정 구체예에서, ASS 또는 ASL의 발현 또는 활성 감소는 ASS 또는 ASL 프로모터의 메틸화에 의한 것이다. 다른 구체예에서, ASS 또는 ASL의 발현 또는 활성 감소는 DNA 돌연변이(예를 들면, 1 이상의 점 돌연변이, 작은 결실, 삽입 등) 또는 유전자 결실을 일으키는 염색체 이상성에 의한다. 일 구체예에서, 암은 ASS 또는 ASL 음성이고, 발현 또는 활성이 관찰되지 않음을 의미한다.
ASS 또는 ASL 발현 또는 활성 감소는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 제한없이, 정량적 PCR, 면역조직학, 효소 활성 어세이(시트룰린이 아르기니노숙시네이트로의 전환 또는 아르기니노숙시네이트가 아르기닌 및 푸마레이트로의 전환을 측정하는 어세이, 예를 들면 도 1 참조) 등을 이용해 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 ADI를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 ASS 또는 ASL, 또는 둘 이상의 발현 또는 활성이 감소된 것으로 나타나고, 여기서 암은 제한없이, 백혈병(예를 들면, 급성 골수성 백혈병 및 재발성 급성 골수성 백혈병), 흑색종, 육종(제한없이, 전이성 육종, 자궁 평활근육종), 췌장암, 전립선암(예컨대, 제한없이 호르몬 불응성 전립선암), 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 소세포 폐암, 유방암, 난소암, 직결장암, 위암(제한없이, 위 선암종 포함), 신경교종, 다형성 교아종, 망막아세포종, 신경아세포종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신장암(제한없이 신장 세포 암종), 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암(제한없이, 두경부의 편평세포 암종; 혀의 암 포함), 자궁경부암, 고환암, 쓸개, 담관암, 및 위암을 포함한다.
문헌에서의 다양한 연구들은 ASS가 다음의 종양에서 결핍되어 있음을 보여주었다.
ASS-결핍 종양
종양 유형 ASS 결핍율(%)
전립선 88/88 (100%)
신장 98/98 (100%)
41/45 (91%)
31/31 (100%)
림프종 511/532 (96%)
육종 619/701 (88%)
췌장 41/47 (87%)
급성 골수성 백혈병 46/53 (87%)
소세포 폐 7/16 (44%)
HCC 33/44 (75%)
20/20 (100%)
흑색종 119/119 (100%)
24/29 (83%)
17/27 (63%)
20/20 (100%)
방광 31/48 (65%)
133/242 (55%)
중피종 52/82 (63%)
위 68/121 (56%)
유방 46/111 (41%)
비소세포 폐 28/90 (31%)
교모세포종 39/55 (71%)
직결장 31 (3%)
난소 진단시 23/54 (43%)
재발시 25/34 (74%)
따라서, 이러한 ASS-결핍암의 치료는 특히 ADI-PEG 20 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 하는 것을 특히 고려한다.
본 발명은 또한 오토파지 억제제와 조합하여, 본원에 기술된 바와 같이 ADI(예를 들면, ADI-PEG, 구체적으로 ADI-PEG 20)를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하거나, 이의 증상을 경감시키거나, 또는 이의 진행을 억제하는 방법을 더 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 오토파지 억제제와 조합하여 본원에 기술된 바와 같은 ADI를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 췌장암 또는 소세포 폐암이다.
일정 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 ADI를 포함하는 조성물의 투여가 혈장 내 아르기닌을 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 동안 고갈시키는 치료 방법을 제공한다.
실시예
실시예 1
아르기닌 디이미나아제는 아르기니노숙시네이트 신타아제-결핍 급성 골수성 백혈병 세포의 생존능을 감소시킨다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 성인에서 가장 흔한 백혈병이고 어린이에서는 두번째로 가장 흔한 백혈병으로, 미국에서만 연간 진단되는 수만 경우에서 상당한 건강 관리 비용을 차지하고 있다. 아스파라기나아제 형태의 효소 기반 요법은 급성 림프아구성 백혈병의 치료에 대변혁을 일으켰고, AML에서의 유사한 다루기 쉬운 대사 결핍을 활용하는데 그 관심이 높다. 아르기닌 생성에 대한 율속 효소, 아르기니노숙시네이트 신써타아제(ASS)의 결핍에 기인한 아르기닌 영양요구성 종양은 아르기닌 분해 효소에 대해 감응성이다.
이 실시예에서는, AML 세포주 및 1차 AML 샘플을 이용해 PEG화 아르기닌 디이미나아제(ADI-PEG 20)의 효율에 대해 ASS 음성이 예측하는지 여부를 확인하였다. ASS 단백질 결여는 7종의 백혈병 세포주 중 3종(K562, 카스미 및 KG-1)에서 그리고 세포유전적으로 정상 및 비정상 핵형 AML인 환자 유래의 모든 9종 샘플에서 확인되었다. ASS 프로모터의 메틸화가 ASS mRNA의 수준 감소 및 ASS 발현 부재와 상관있었다. AML이 있는 환자 유래의 골수 트레핀은 면역조직학을 통해 샘플의 87%(46/53)에서 ASS 단백질의 부재를 밝혔고, 이는 ASS 발현이 생체네에서 ADI-PEG 20에 대한 반응의 생체마커로 이용될 수 있음을 의미하는 것이다. ASS mRNA의 농도 증가 및 검출가능한 ASS 단백질 발현이 전위 t(15;17)을 갖는 급성 전골수성 백혈병에서 주목되었다.
유의하게, ADI-PEG 20은 ASS-음성 AML 세포주의 생존능을 저하시킨 반면, ASS-양성 대조군주, 후지오카 및 U937은 약물 유도 아르기닌 고갈에 내성이었다. NOD/SCID 마우스에서 생착이 양호한 1차 ASS-음성 AML 샘플이 동정되었고 이러한 1차 AML 이종이식 모델을 이용한 ADI-PEG 20의 효능 연구가 시작되었다. 본원에 기술된 결과 및 인간에서 독성이 낮은 아르기닌 고갈의 잠재적인 효능을 기반으로, ADI-PEG 20의 임상 II기 실험이 재발성 AML이 있는 환자에서 계획되었다.
실시예 2
오토파지의 억제는 아르기니노숙시네이트 신타아제-결핍 췌장 선암종 세포의아르기닌 디이미나아제-유도된 세포 사멸을 증가시킨다.
오토파지의 역할 및 이의 세포 사멸에 대한 기여는 모순적이다. 오토파지는 아르기닌 고갈 세팅에서 보호적이고 히드록시클로로퀸(ChQ)에 의한 오토파지의 억제는 세포 사멸을 증가시킨다는 가설이 있었다.
인간 췌장암 세포주 MIA-PaCa2를 시험관 내 및 생체내에서 PEG화된 아르기닌 디이미나아제(ADI-PEG) 단독으로 또는 ChQ 존재 하에 치료하였다. 세포 사멸은 프로피듐 요오다이드(PI)-FACS로 측정하여, 서브-G1 DNA 함량을 측정하였고, 아폽토시스는 아넥신 V-PI 유세포측정법으로 확인하였다. 캐스파아제 3의 절단은 웨스턴 블랏 및 ELISA를 통해 측정하였다. 오토파지는 웨스턴 블랏 및 ELISA를 통해 LC3 밍 뉴클레오포린 p62(p62)의 발현량을 확인하여 측정하였다.
생체내 실험은 무흉선 마우스에서 피하 이종이식편을 생성시킨 후 PBS, ADI-PEG, ChQ 또는 ADI-PEG 및 ChQ의 조합을 복강내 주사하여 수행하였다. 희생시, 종양을 제거하여 분석하였다. 종양 용해물은 캐스파아제 3 및 p62에 대해 웨스턴을 통해 분석하였다. 활성화된 캐스파아제 3 및 DNA 절편화(TUNEL)에 대한 면역조직화학 염색법을 역시 수행하였다.
ADI가 캐스파아제 의존적 방식으로 아폽토시스 및 오토파지를 유도하는지 여부를 확인하기 위해, 세포를 ADI-PEG 또는 ADI-PEG 및 팬 캐스파아제 억제제 ZVAD-fmk의 조합과 항온반응시켰다. 도 2A에 도시한 바와 같이, ADI-PEG와의 항온반응은 서브-G0/G1의 세포수를 증가시켰고, 이러한 효과는 팬 캐스파아제 억제제 ZVAD-fmk과의 공동 항온반응에서는 가역적이었다. 72시간 동안 ADI-PEG(0.3 ㎍/mL)와 시험관 내 췌장암 세포의 항온반응은 다른 아폽토시스 지시자인, 아넥신 V 탈분극화를 유도하였다(도 2B). ADI가 용량 의존적인 방식으로 72시간에 캐스파아제 절단 및 LC3B 접합을 유도하는 것을 더 검증하였다. 이러한 결과는 ADI가 캐스파아제 의존적 아폽토시스 및 오토파지를 시험관 내에서 유도함을 의미한다.
오토파지의 억제가 ADI 유도된 아폽토시스를 강화시키는지 여부를 확인하기 위해, 세포를 72시간 동안 ChQ(5 μM) 존재 또는 부재하에 ADI-PEG(0.3 ㎍/mL)와 배양하였다. 웨스턴 블란 분석 결과 캐스파아제 3 절단으로 측정시 ADI에 의한 아폽토시스 유도가 확인되었다(도 3). p62, LC3B-I, 및 LC3B-II의 농도는 오토파지 플럭스를 조사하기 위해 웨스턴 불랏으로 측정하였다. ChQ의 부가는 p62의 농도 증가 및 LC3B-I 및 LC3B-II의 축정 증가로 보여주는 바와 같이 오토파지 플럭스를 감소시켰다(도 3). 이러한 결과는 ChQ가 ADI 유도 아폽토시스를 강화시키고 시험관내에서 오토파지 플럭스를 억제함을 보여준다.
ChQ가 ADI와 조합하여 사용시 아폽토시스 또는 비아폽토시스 세포 사멸량을 변화시키는지 여부를 조사하기 위해, 세포를 ADI-PEG 단독 또는 ADI-PEG 및 ChQ의 조합과 항온반응시켰다. 세포 배양물에 ChQ 부가는 서브-G0/G1인 세포 비율 증가를 초래하였다(도 4B). 대조적으로 ADI-PEG 및 ChQ와 ADI-PEG를 항온반응시킨 배양물은 아넥신 V 양성 세포의 비율이 유사하게 나타났다(도 4A). 따라서, 이러한 결과는 ChQ가 시험관 내 비아폽토시스 세포 사멸을 증가시킴을 의미한다.
ADI-의존적 종양 성장 억제에 대한 ChQ의 효능을 평가하기 위해, MIA PaCa-2의 피하 이종이식을 무흉선 마우스에서 확립시켰다. 이어 마우스를 최대 7주 동안 PBS, ADI-PEG, ChQ, 또는 ADI-PEG + ChQ로 처리하였다. 주 2회 종양 부피를 측정하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, ADI-PEG + ChQ를 처리한 마우스는 ADI-PEG 단독을 처리한 마우스와 비교하여 종양 부피가 유의하게 작았다. 안락사시, 종양을 10% 포르말린에 보존하고 활성 캐스파아제 3, 증가된 p62, 및 DNA 절단을 포함한 아폽토시스 마커를 염색하였다(도 6). 이러한 결과들은 ADI-PEG 및 ChQ의 조합이 종양 성장에 대해 상승적 억제를 보여줌을 의미한다.
요약하면, 아르기닌 결핍은 ASS가 결핍된 세포주에서 오토파지 및 세포 사멸을 유도하였다. 오토파지는 췌장 선암종 세포에 대해 아르기닌 결핍시 보호적 역할을 하고, 히드록시클로로퀸에 의한 오토파지 불활성화는 생체내에서 종양 억제를 강화시키는 것으로 확인되었다.
실시예 3
아르기닌 디이미나아제는 아르기니노숙시네이트 신타제-결핍 소세포 폐암 종양 성장을 억제한다.
소세포 폐암(SCLC)은 화학요법에 대한 강한 초기 반응으로 특징되지만, 대부분의 환자가 재발된다(Dowell, Am J med Sci 339(1):68-76, 2010; Rodriguez 및 Lilenbaum, Curr Oncol Rep 12(5):327-334, 2010). 제1선 화학요법이 실패한 환자에서, 제2 치료에 대한 반응 기회는 대략 10%로 남고, 이들 환자의 전체 생존은 오직 3-4개월이다. 또한, 현재의 치료는 종양 특이성이 결여되었고 수많은 독성을 일으키고, 결과적으로 최대 효율 용량 이하로 치료제 투여가 제한될 수 있다(Demedts et al, Eur Respir J 35(1):202-215, 2010; Dowell, Am J med Sci 339(1):68-76, 2010; Rodriguez and Lilenbaum, Curr Oncol Rep 12(5):327-334, 2010). 이러한 상황은 높은 치료 지수의 효율적인 항암제의 지속적인 개발에 대한 요구를 강조하는 것이다.
이 실시예는 SCLC에서 아르기닌 영양요구도 및 이 질환에서 ADI-PEG 20 아르기닌 요법의 효능을 기술한다.
세포주, 항체 및 화학제
10 SCLC 패널을 루드비그 암 연구 센터, 메모리얼 슬로안-케터링 암 센터(MSKCC)의 뉴욕 지점의 세포 은행에서 획득하였다. 세포를 MSKCC에서 확립시키고 미국 세포주 은행(ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 세포를 10% v/v 태아소 혈청, 5% w/v 페니실린/스트렙토마이신(스트렙토마이신 설페이트 5000 mg ml-1 당 페니실린 G 5000 유닛 ml-1) 및 1% L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 웨스턴 블랏에 의한 아르기니노숙시네이트 신써타아제(ASS)의 세포내 발현은 항-ASS 항체(클론 25, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). LC3B(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), 활성 캐스파아제-3(Cell Signaling), 전체 캐스파아제-3(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 및 액틴(GeneTex, Irvine, CA, USA)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 확인하였다. 토포테칸 히드로클로라이드는 Axxora(San Diego, CA, USA)에서 구매하였고 클로로퀸은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
면역조직화학
종양 및 정상 조직은 [Jungbluth et al (Mod Pathol 23(Suppl 1):387A, 2010)]에 상세히 기술된 바와 같이, 항-ASS 항체 195-21-1(LICR, New York, NY, USA)를 이용해 염색하였다.
웨스턴 블랏 분석
SCLC 세포주의 전체 세포 용해물은 RIPA 용해 완충액(Tris-HCl 50 mM, 0.05% SDS, 0.5% Na-데옥시콜레이트, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM과 프로테아제 억제제 칵테일 완충제(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)으로 준비하였다. 단백질의 양은 Pierce BCA 단백질 어세이(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용해 확인하였고, 동량의 단백질을 4-12% 겔(NuPAGE, Invitrogen Life Technologies)을 이용한 SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 단백질을 PVDF 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮기고, 5% BSA로 블로킹하고, 적절한 항체를 사용해 밤새 4℃에서 프로빙하였다. 세척 후, 막을 이후 적절한 2차 항체로 프로빙한 후 마지막으로 ECL 시약(Perkin-Elmer, Fremont CA, USA)을 사용해 가시화하였다.
정량적-실시간 PCR
RNA 추출을 위해, 세포 펠렛은 600 ㎕ TRI 시약 용액(Ambion, Austin, TX, USA)에 용해시키고, 60 ㎕ 브로모클로로판을 부가하였다. 대략 2 방울의 최적 절삭 온도의 화합물(Miles Inc., Elkhart, IN, USA)을 튜브에 부가하고 혼합물을 와류시키고 2분간 RT에 정치시켰다. 10분간 14,000 r.p.m.에서 원심분리 후, 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 동량의 100% 이소프로판올을 부가하여 RNA를 침전시켰다. 14,000 r.p.m.에서 원심분리 후, RNA 펠렛을 75% 에탄올에 세척하고 다시 원심분리하고 50 ㎕의 온수에 재현탁하였다. RNA 농도는 나노포토미터(Implen Inc., Westlake Village, CA, USA)를 사용해 측정하였다.
cDNA 증폭을 위해, 1.5 ㎍ RNA는 10X 반응 완충액(Qiagen, Valencia, CA, USA), 5 mM dNTPase(Qiagen), 올리고 DT(Qiagen), 역전사효소(Invitrogen Life Technologies) 및 RNAse Out(Invitrogen)을 총 부피 20 ㎕에 포함하는 cDNA 반응 혼합물에 부가하였다. 정량적-실시간(qRT)-PCR 반응을 위해, 1.5 ㎕ cDNA를 5 ㎕ SYBRGreen(Invitrogen), 0.02 ㎕ Rox, 0.2 ㎕ 프라이머, 및 총 10 ㎕ 반응 부피에 대한 물을 포함하는 반응 믹스와 혼합하였다. ASS에 대한 프라이머는 다음과 같다; F: 5'-TTTAAGCAGACTAAGGGG-3'(서열번호 3) 및 R: 5'-CCAT CCCAGGTTATAAGCACA-3'(서열번호4). qRT-PCR 분석은 발현 정규화를 위해 사용된 GAPDH와 함께, 7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 이용해 수행하였다. 유전자 발현의 상대적 정량(표적 RNA의 상대량)은 방정식 2(-ΔΔCT)를 이용해 결정하였다.
증식 어세이
부착성 세포에 대한 ADI-PEG 20의 항증식 효과를 확인하기 위해, 세포는 96-마이크로웰 조직 배양 플레이트의 웰당 2 x 103 세포 밀도로 세포를 플레이팅하고 밤새 부착되도록 하였다. 다음날, 세포를 0∼10 mIU ml-1 범위의 ADI-PEG 20 (DesigneRx Pharmaceuticals, Vacaville, CA, USA, Polaris Group 자회사, San Diego, CA, USA)으로 처리하였다. 120시간 동안 항온반응 후, 세포 생존능을 제조사 프로토콜에 따라, (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움)(MTS, CellTiter 96 AQueous One Solution, Promega, Madison, WI, USA)으로 확인하였다. MTS 시약 20 마이크로리터를 적절한 대조군 및 어세이 웰에 부가하고 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 항온반응시키고 490 nm에서 흡광도를 판독하였다. 각 처리에 대한 절대 흡광도는 배경값 MTS 흡광도를 빼서 결정하였고, 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 세포 증식에 대한 오토파지 억제제 클로로퀸(Sigma)의 효과는 MTS 어세이를 사용해 평가하였다.
비부착 세포에서 ADI-PEG 20 활성 평가를 위해, 세포를 조직 배양 24웰 플레이트의 웰 당 1 x 105 세포 밀도로 플레이팅하였다. 0-10 mIU ml-1 범위의 최종 농도로 ADI-PEG 20을 포함하는 추가 배지를 부가하였다. 120시간 동안 ADI-PEG 20과 항온반응 후 증식에서의 변화를 측정하기 위해, 세포를 모으고, 세척하고 RIPA 완충액에서 용해시켰다. 각 처리에 대한 총 단백질은 총 세포수의 측정에 따라 BSA 단백질 어세이를 이용해 측정하였다. 모든 처리는 적어도 삼중으로 수행하였다.
서브-G1 염색을 위한 프로피디움 요오다이드 염색
아폽토시스는 [Riccardi et al (Riccardi and Nicoletti, Nat Protoc 1(3):1458-1461, 2006)]가 상세히 기술한 대로 프로피디움-요오다이드- 염색 세포의 FACS를 통해 측정하였다. 세포를 24웰 플레이트에 플레이팅하고 120시간 동안 ADI-PEG 20으로 처리하였다. 세포를 회수하고, 세척하고, 70% 에탄올에 고정시켰다. DNA를 10 ㎍ml-1 DNAse-무함유 RNAse A(Sigma-Aldrich)를 포함하는 20 ㎍ml-1 프로피디움 요오다이드를 이용해 염색하였다. 세포를 BD FACSCalibur(BD Biosciences)로 판독하고 Flow Jo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)를 이용해 분석하였다.
ASS 의 소형 간섭 RNA 하향 조절
ADI-PEG 20 치료에 대한 반응으로 세포내 ASS 발현의 중요성을 더욱 평가하기 위해, ASS의 발현을 ASS 특이적 siRNA를 사용해 침묵시켰다. 소형 간섭 RNA 구성체는 ASS 코딩 영역에 대해 Integrated DNA technologies(IDT, Coralville, IA, USA)에서 구입하였다. 임의의 다른 전사체 맷치가 없는 siRNA 구성체만을 추가 실험을 위해 선택하였다.
아르기니노숙시네이트 신써타아제-양성 SW1222를 100 mm 조직 배양 디쉬 중 8 mL 배지에 디쉬 당 6 x 105 세포 밀도로 플레이팅하였고 밤새 부착시켰다. 형질감염을 위해, 10 ㎕의 10 μM ASS siRNA을 990 ㎕ Opti-MEM 배지 및 20 ㎕ 리포펙타민 2000 시약을 980 ㎕ Opti-MEM 배지(Invitrogen Life Technologies)에 희석하였다. 이들 혼합물을 혼합 전에 RT에서 5분간 항온반응시키고 추가 20분간 RT에서 항온반응시켰다. 형질감염 혼합물을 이어 세포에 부가하고 24시간 동안 37℃에서 항온반응시켰다. 이 시점에, 형질감염된 세포의 준비물을 배양 디쉬로부터 올리고, 형질감염 세포의 성장에 대한 ADI-PEG 20의 효과를 평가하기 위해 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 추가적인 세포를 PCR 처리 및 웨스턴 블랏 분석 전에 72시간 동안 추가 항온반응시켰다.
아르기닌 디이미나아제-PEG 20 생체내 효능 실험
ASS-음성 SCLC SK-LC-13은 종양형성성인 것으로 확인되었고, 후속하여 생체내에서 ADI-PEG 20의 효능을 결정하는데 사용하였다. ADI-PEG 20의 활성은 또한 ASS-양성 NCI-H69 SCLC 이종이식편을 보유하는 마우스에서 평가하였다. 소세포 폐암 이종이식은 암컷 BALB/c-누드 마우스, 3-4 주령, 체중 ∼20 g의 마우스(Charles River Labs, Wilmington, MA, USA)에서 확립하였다. 종양을 확립시키기 위해, 배지 중 10 x 106 세포를 1:1로 Matrigel High Concentration(BD Biosciences)과 혼합하고 마우스 등쪽 영역에 피하 주사하였다. 종양 성장을 규칙적으로 측정하고 식(TV=(길이 X 너비2)/2)을 이용해 종양 부피를 계산하였다. 모든 동물 실험은 MSKCC 기관의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인받았다. 마우스는 종의 근사치 부피가 1,000 ㎣에 도달하면 안락사키켰다.
ADI-PEG 20의 항종양 효능은 중간 또는 거대 SK-LC-13 SCLC 이종이식편을 보유하는 마우스에서 동시에 평가하였다. 처음 실험에서, 치료는 종양이 평균 크기가 125 ㎣에 도달하면 시작하였다. 거대 이종이식편 실험에서, 치료는 종양이 평균 크기가 500 ㎣에 도달하면 시작하였다. 아르기닌 디이미나아제-PEG20을 20일 동안 5일마다 1회로 동물 당 1, 2 및 5 IU의 용량으로 투여하였다(5 용량). 지속 투약의 효과를 평가하기 위해, 모든 용량 수준에서 추가 그룹(n = 5)은 종양이 1,000 ㎣ 크기 한계까지 진행할때까지 5일마다 ADI-PEG 20의 장기 투여를 받았다. 추가적으로, ADI-PEG 20의 효과는 ASS-양성 NCI-H69 이종이식편을 보유하는 마우스에서 수행하였다. 여기서, 마우스는 종양이 평균 크기 150 ㎣에 도달하면 20일 동안 2 IU ADI-PEG 20의 5용량을 투여받았다. 아르기닌 디이미나아제-PEG 20을 모든 실험에서 복강내 주사하였다. 이 실험에서 사용된 ADI-PEG 20의 비활성은 단백질 1 mg 당 9 IU이었다. 따라서, 20 g 마우스 당 1 IU의 ADI-PEG 20은 160 IU m-2와 균등하다.
혈청 아르기닌 및 시트룰린의 측정
전산 아르기는 농도에 대한 ADI-PEG 20 처리 효과를 결정하기 위해, 마우스 혈청을 고속 액상 크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석하였다. L-아르기닌 및 L-시트룰린은 39℃ 반응 온도에서 그리고 형광발광 검출기 상에서 Pickering Laboratories PCX 5200 포스트-컬럼 유도화 장치(Pickering Laboratories, Mountain View, CA, USA)을 이용해 분리하였다. 완충액 및 컬럼을 포함한 모든 시약은 Pickering Laboratories에서 제안하는 대로 사용하였다. 전체 ADI-PEG 20 농도는 이전에 기술된 대로 ELISA를 통해 측정하였다(Holtsberg et al, J Control Release 80(1-3):259-271, 2002).
통계 분석
생체 내 ADI-PEG20 처리 효능은 GraphPad Prism(Version 5.0, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용해 대조군 종결시 비쌍 양쪽 t-테스트를 이용해 대조군 및 처리군의 평균을 비교하여 생체 내 ADI-PEG 20 처리 효능을 평가하였다. 95% 신뢰도를 사용하였고, 평균 종양 부피는 P < 0.05인 경우면 유의하게 상이하다라고 하였다.
결과
SCLC은 빈번하게 ASS 발현이 결여된다
ASS 발현 결여가 대체로 ADI 감응도와 관련되므로, 그 발현은 인간 SCLC 종양에서 평가하였다. 도 7C에 도시된 바와 같이, 인간 SCLC 종양의 초기 면역조직화학(IHC) 분석 결과 일부 SCLC가 ASS 발현이 거의 전체로 결여됨을 보여주었다. 이러한 초기 분석에서 종양의 대략 45%(16 중 7)가 ASS 발현이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 확인되었다. 대조적으로, ASS의 강한 발현이 정상 조직 예컨대 피부(도 7A) 및 다른 암 예컨대 결장 암종(도 7B; Jungbluth et al, Mod Pathol 23(Suppl 1):387A, 2010)에서는 분명하였다.
초기 면역조직학 분석이 SCLC 인간 종양에서 ASS 발현의 빈번한 상실을 보여주었으므로, SCLS 세포주의 패널에서 ASS의 발현 상태를 평가하였다. 웨스턴 블랏 결과 시험한 SCLC 세포주의 10중 5(50%)가 단백질 수준에서 ASS의 상당한 발현이 결여되었다(도 7D). 웨스턴 면역블랏팅으로 검출된 ASS의 세포 발현은 클론 25 및 195-21-1 항-ASS 항체 둘 모두 이용에서 유사하였다(데이타 도시하지 않음). qRT-PCR을 이용한 mRNA 수준 분석은 ASS mRNA 및 단백질 발현 수준간에 일반적인 상관성을 보여주었다(도 7E).
아르기닌 디이미나아제-PEG20은 시험관내에서 ASS-음성 SCLC 세포주의 증식을 억제한다
시험관 내 세포 증식에 대한 ADI-PEG 20의 효과는 ASS-양성 SCLC 세포 및 효소 발현이 결여된 것들 둘 모두에서 확인하였다. 부착 및 비부착 성장 조직 배양 특징을 갖는 세포를 이들 실험에 포함시켰다. 증식의 명확한 용량 의존적 감소가 부착성 ASS-음성 SCLC 세포주 SK-LC-13 및 SW1271에서 확인되었다. 이러한 효과는 부착성 ASS-양성 직장 암종 세포주 SW1222의 성장에서 분명하였다(도 8A). 비부착 세포의 경우, ASS-양성 세포는 ADI-PEG 20의 항증식 효과에 대해 거의 전체적인 내성을 보인 반면, 증식에서의 상대적 감소가 역시 ADI-PEG 20 처리 후 ASS-결핍 세포에서 관찰되었다(도 8B). ADI-PEG 20-감응성 세포주 SK-LC-13가 종양형성성인 것으로 확인되었으므로, 시험관 내 및 생체내 후속 실험을 위한 모델 세포주로 선택하였다.
아르기닌 디이미나아제-PEG20은 오토파지 및 캐스파아제 비의존적 아폽토시스를 유도한다
보다 일반적인 영양 기아 상태에서 처럼, ADI에 의한 세포내 아르기닌의 고갈은 대사 스트레스 및 후속한 세포 오토파지를 유도하는 것으로 관찰되었다(Kim et al, Cancer Res 69(2):700-708, 2009; Savaraj et al, Curr Mol Med 10(4):405-412, 2010). ADI-PEG 20 처리가 SCLC에서 세포 오토파지를 유도할 수 있는지 여부를 오토파지 관련 단백질 LC3-II의 형성에 대한 어세이로 확인하였다. LC3-II 발현의 일부 기초적 발현이 SK-LC-13에서 관찰되었지만, ADI-PEG 20 처리는 단백질의 검출가능한 세포 농도가 분명히 증가됨을 보여주었다(도 9E). 클로로퀸은 정상 리소솜 기능을 파괴하는 오토파지의 공지 억제제로 알려져 있고, 따라서, LC3-II의 세포 농도가 증가되었다. 후속하여, 양성 대조군으로 클로로퀸을 처리한 세포는 LC3-II가 매우 강하게 발현됨을 보여주었다. ADI-PEG 20 및 클로로퀸의 병용 처리는 개별 처리에 비해 생존능 감소가 작지만 유의(P = 0.008)하였고, 오토파지의 억제가 ADI-PEG 20의 효과를 증가시킴을 시사한다(도 14).
ADI-PEG 20의 항증식 효과에 대한 가능한 기전을 확인하기 위해, 서브-G1 DNA 함량에 의한 아폽토시스의 FACS 분석을 수행하였다. 세포는 분석을 수행하기 전에 72시간 동안 처리하였다. 미처리 세포에서는 아폽토시스가 거의 관찰되지 않은 반면, 양성 대조군으로 사용된, 25 nM 토포테칸은 SK-LC-13 세포의 대략 45%에서 아폽토시스를 야기시키는 것으로 관찰되었다(도 9A 및 B). 토포테칸만큼 효과적이지는 않지만, 1.0 및 10 mIU ml-1 ADI-PEG 20와의 항온반응은 각각 ∼6% 및 16% 세포에서 아폽토시스를 유도하였다(도 9C 및 D). 아폽토시스는 서브-G1 DNA 함량에 의해 명확해졌고, 캐스파아제의 무활성화는 토포테칸 처리 세포와 대조적으로 ADI-PEG 20으로 세포 처리 후 관찰되었다(도 9F).
ASS 발현 침묵화가 ADI-PEG 20에 대한 감응성을 유도한다
ASS-특이적 siRNA로 형질감염 후, ASS-양성 세포주에서 ASS의 상대적 발현은 실시간 PCR로 평가하였다. 도 10A에 도시된 바와 같이, ASS siRNA로의 형질감염은 72시간 항온반응 후 ∼90% 만큼 ASS mRNA 농도를 저하시켰다. 동시에 웨스턴 블랏 분석은 ASS-특이적 siRNa 처리된 세포에서 ASS 단백질 농도 발현이 확실하게 감소됨을 보여주었다(도 10B). 그러나, 이러한 조건 하에서 일부 ASS 발현이 남아있었다. MTS 어세이를 이용한 세포 생존능 조사는 ASS siRNA를 처리한 ASS-양성 세포가 ADI-PEG 20 유도된 아르기닌 고갈에 감응성이 되어서, 세포 생존능이 감소된 반면, 대조군 또는 스크램블된 siRNA 처리 세포에서는 생존능 감소가 관찰되지 않았다(도 10C).
아르기닌 디이미나아제-PEG20은 SCLC 이종이식편의 성장을 억제한다
생체 내 ADI-PEG 20으로 전신 처리의 항종양 효능을 인간 SCLC 이종이식편을 보유하는 BALB/c-누드 마우스에서 평가하였다. 개별 실험은 약 125 ㎣의 확립된 종양을 갖는 마우스에서 수행하였고, 처리 시작시 보다 큰 (∼500 ㎣) 종양을 보유한 마우스에서 수행하였다. 중간 정도 크기의 SK-LC-13 이종이식편(124.6 ± 37.1 ㎣)을 보유한 마우스에서, ADI-PEG 20은 대조군 마우스에 비해 종양 크기가 유의하게 용량 의존적으로 감소되게 하였다(도 11A-C). 대조군 마우스는 과도한 종양 부피로 인해 33일에 안락사시켰고, 이 시점에 대조군 마우스의 평균 종양 부피는 용량 또는 치료 스케쥴과 무관하게 ADI-PEG 20 처리 마우스군에서의 부피보다 유의하게 컸다(모든 처리 군에 대해 P > 0.0001; 도 11D). 실험 완료시, 5일마다 5 IU ADI-PEG 20의 장기 투약으로 처리된 종양은 오직 20일 동안 5일마다 투약된 경우에서 보다 유의하게 작았다(P = 0.0063). 그러나, 이러한 효과는 종양 성장이 단기 및 장기 투약을 받은 군에서 비슷한 정도로 진행되었으므로, 1 및 2 IU 용량 단위에서는 관찰되지 않았다. 후속하여, 단기 또는 장기 ADI-PEG 20 투약을 받는 마우스의 평균 종양 부피는 과도한 종양 부피로 인해 개별 단기 투약 군의 종결시에는 유의하게 다르지 않았다(1 IU: P = 0.251; 2 IU: P = 0.084). ADI-PEG 20으로 ASS-양성 NCI-H69 SCLC 이종이식편 처리는 종양 성장에 대해 어떠한 효과도 보이지 않았다(도 12).
ADI-PEG 20의 초기 투약 이전(0일), 동안(12일) 및 그 후(40일) 이들 마우스 유래의 혈청 분석은 ADI-PEG 20 혈청 농도가 용량 의존적임을 보여주었다(도 11E). ADI-PEG20을 오직 20일까지 투여한 마우스의 경우, 효소의 혈청 농도는 40일까지 기본 수준으로 되돌아 옴이 관찰되었고, 마우스에서 ADI-PEG 20의 ∼7일 반감기와 일치하였다(Ensor et al, Cancer Res 62(19):5443-5450, 2002; Holtsberg et al, J Control Release 80(1-3):259-271, 2002). 또한, 이러한 단기 치료는 기대하는 바와 같이, 오직 일시적으로 혈청 아르기닌이 고갈되었고, 후속하여 추가 ADI-PEG 20 투약없이 마지막 투약 이후 20일(40일)에 정상 수준으로 되돌아왔다(도 11F). 시트룰린 농도는 아르기닌에 대해 용량 의존적 관련성으로 상승되었고, ADI-PEG 20의 단기 처리는 시트룰린 농도가 기초값으로 회복되는 것과 관련있다(도 11G). 시트룰린 농도는 1 IU 농도에서 장기 투약에 따라 증가되었고, 아르기닌 혈청 농도가 검출 한계값 이하임에도 전신 아르기닌이 남고 시트룰린으로 대사되는 것과 일관적이다. 시트룰린 농도의 적은 증가는 2 및 5 IU 용량 수준에서의 장기 투약에서 관찰되었다.
ADI-PEG 20의 생체내 2차 실험에서, 처리는 종양이 473.4 ± 161.0 ㎣의 비교적 큰 크기로 성장했을 때 시작하였다. 종양 성장의 용량 의존적 억제가 역시 관찰된 반면(도 13A-C), 이는 보다 작은 이종이식 보유 동물에서 관찰된 것 만큼 유의하지 않았다. 종양 부피는 이 실험의 32일에 대조군 코호트 종결시 비교하였다(도 13D). 1 IU ADI-PEG 20을 사용한 장기 투약은 대조군 마우스에 비해 종양 부피를 유의하게 감소시킨 반면(P = 0.007), 단기 처리는 종양 크기를 통계적으로 유의하게 감소시키지 않았다(P = 0.07). 또한, 장기 투약은 39일에 단기 처리군의 종결시 평가한 바와 같이, 단기 처리에 비해 종양 부피가 중간 정도로 유의한(P = 0.26) 감소를 일으키는 것으로 관찰되었다. ADI-PEG 20의 고용량에서, 미처리 대조군에 대한 종양 부피의 유의한 감소가 2 IU 농도로 단기(P = 0.004) 및 장기(P = 0.0007) 투여에서, 그리고 또한 5 IU 용량 농도에서 단기(P = 0.0003) 및 장기(P = 0.0001) 스케쥴에서도 관찰되었다. 그러나, 장기 투약은 단기 치료에 비해 이러한 용량에서 유의하게 반응을 개선시키기 않았다.
요약하면, 이 실시예는 SCLC의 큰 비율이 ASS 발현이 결여되었고, ASS-음성 SCLC가 아르기닌 고갈 요법에 감응성임을 보여주었다. ASS 결핍 빈도는 흑색종에서 보고된 바와 같은 거의 전체적인 발현 부재와 같지는 않았으나, 미국에서 년간 보고된 SCLC의 거의 30,000의 새로운 사례의 50%가 아르기닌 고갈 요법에 감응성인 것으로 남았다.
부착성 및 미부착성 ASS-결핍 SCLC 세포주를 이용한 시험관내 실험은 ADI-PEG 20이 용량 의존적 항증식 효과를 일으키는 것으로 확인해주었다. 본원에 기술된 결과들은 ASS 단백질 결여가 그렇지 않으면 동일 세포에서 ADI-PEG 20의 항증식 효과와 관련있고 또한 다른 ASS 발현의 SCLC 암에서 관찰된 상대적 감응도를 추가로 검증하였다. 세포보호성 오토파지의 억제는 ADI-PEG 20의 항증식 효과를 강력화할 수 있고, ADI-PEG 20과 25 mM의 오토파지 억제제 클로로퀸의 병용은 시험관 내에서 확인하였다(Kim et al, Cancer Res 69(2):700-708, 2009). 그러나, 병용만이 유의하지만(P = 0.008), 중간 정도로 SCLC 세포에서 ADI-PEG 20의 항증식 효과를 증가시켰다(도 14). ADI-PEG 20으로 SCLC 처리는 프로피디움 요오다이드로 염색후 서브-G1 피크의 세포 개체군을 증가시켰고, 이들 세포가 아폽토시스를 겪는 것임을 시사한다. 웨스턴 블랏 분석 결과 ADI-PEG 20은 SK-LC-13 SCLC 세포에서 캐스파아제 활성화를 일으키지 않았다. 임의 이론에 고착되지 않고, SCLC 세포에서 ADI-PEG 20에 의해 유도된 아르기닌에 대한 전반적인 세포 반응은 오토파지의 유도에서 보이는 초기 대사 반응, 이후 캐스파아제 비의존적 세포 사멸을 포함하는 복합 기전을 통해 작동되는 것으로 보인다.
마우스에서의 생체내 실험은 SK-LC-13 이종이식편의 성장이 용량 의존적 방식으로 ADI-PEG 20에 의해 폐지되었다. 유의한 항종양 활성이 동물 투약 당 1, 2 및 5 IU 용량에서 관찰되었다. 중요하게, 보다 강한 종양 성제 억제가 보다 작게 (∼120 ㎣) 확립된 종양을 보유한 마우스에서 관찰되었지만, ADI-PEG 20은 또한 보다 큰(∼500 ㎣) 이종이식편을 보유하는 마우스에서도 유의한 항종양 효능이 확인되었다. 다른 종양 유형의 직접적 비교가 어렵지만, SCLC 이종이식편에서 ADI-PEG 20으로 관찰된 항종양 효능은 유사하고 신장암 및 전립선암 이종이식편을 포함하는 다른 종양 유형에서 ADI-PEG 20의 균등한 용량을 사용시 관찰되는 것보다 아마도 우수할 것이다.
실시예 4
아르기닌 디이미나아제는 ASS-결핍 전이성 육종의 성장을 억제한다.
육종이 드문 종양 군이지만, 현행 임상 계획에 대한 불충분한 반응은 종양학에서 중요한 충족지 못한 요구를 의미한다. 육종 성장의 물질대사 및 생물학의 보다 나은 치료적 이해가 이러한 종양 군을 갖는 환자를 치료하는 새로운 요법을 개발하는데 필요하다. 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS)는 시트룰린에서 아르기닌으로의 전환시의 율속 효소이다. ASS가 발현되지 않는 경우, 아르기닌은 다이어트로부터 전달되어야 하는 암 세포에 대한 필수 아미노산이 된다.
육종의 45 아형을 나타내는 701명 환자 표본의 면역조직화학 분석은 ASS는 육종의 85%(701명 환자 샘플 중 619)에서 발현되지 않는 것으로 확인되었다. 이는 육종이 PEG화 아르기닌 디이미나아제(ADI-PEG 20)을 이용한 아르기닌 고갈 요법에 감응성임을 시사한다.
평활근육종, 골육종, 폐포성 연부 육종, 악성 말초 신경 시트 종양 및 어윙 육종 세포주 패널에 대한 ADI-PEG 20 처리는 ASS 발현이 낮은 경우에 세포 주기 정지를 일으켰지만 아폽토시스는 일으키지 않은 반면 ASS가 높은 골육종 세포주 MG63은 계속 분열되었다. 육종 세포주에서의 반응은 골육종, 연조직 육종, 복합 세포유전적 육종, 및 전위 의존적 육종이 모두 ADI-PEG 20 처리시 세포 주기 억제를 검증한 바와 같이, ASS 발현에 의존적이었다. ADI-PEG 20으로 처리한 세포주의 IC50은 ASS 발현이 낮은 감응성 세포주에서 0.02 내지 0.1 ㎍/mL 범위였다.
ADI-PEG 20으로 ASS 결여 육종의 처리는 오토파지를 유도하였다. 오토파지의 억제제인, 클로로퀸과 병용시 ASS 결핍 육종에서 ADI-PEG 20에 의한 아르기닌의 고갈은 아넥신 V로 측정한 세포 사멸을 유도하였다.
ASS 저발현 골육종 세포주 MNNG를 누드 마우스에 이종이식한 후 ADI-PEG 20을 처리하면 PBS 처리 대조구노가 비교하여 종양 성장률의 유의하게 보다 더 느린 것으로 확인되었다.
상기 실시예와 관련하여, 신장 세포 암종 이종이식편 모델에서, ADI-PEG 20과 오토파지 억제제, 히드록시클로로퀸은 부가 효과를 일으키지 않는 것으로 관찰되었음을 주목한다. 따라서, 임의의 특정 암에서 오토파지 억제제와 ADI-PEG 20의 효과는 예측가능하지 않았고, 본원의 놀라윤 효과를 더욱 강조하였다.
실시예 6
시스플라틴과 조합된 ADI-PEG 20은 생체내에서 유의하게 항종양 활성을 증강시킨다.
이종이식편 시험을 시스플라틴과 조합한 ADI-PEG 20의 생체내 효능을 평가하기 위해 수행하였다. ADI-PEG 20은 누드 마우스에서 2종의 상이한 인간 흑색종 이종이식 모델의 처리에서 시스플라틴과 조합하거나 또는 단일 작용제로서, 치료 효능에 대해 생체내에서 평가하였다. 시스플라틴 용량은 소정의 6일 간 x3 용량으로 복강내에 6 mg/kg 또는 18 mg/㎡(Km=3)이다. 인간에 외삽한 동일 용량은 40 mg/㎡ (Km=40), 또는 3주간 120 mg/㎡의 총 용량이었따. ADI-PEG 20은 매 6일 마다 IM x 4용량으로 53.3 IU/kg로 주었다. 인간에 외삽한, 동일한 ADI-PEG 20 용량은 160 IU/㎡ 또는 18 mg/㎡였다. 도 15에 도시한 바와 같이, ADI-PEG 20 및 시스플라틴 병용 처리는 작용제 단독과 비교하여 활성을 유의하게 증강시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 이종이식편 데이타는 ADI-PEG 20 및 시스플라틴의 병용이 시스플라틴을 제한된 기간 동안 투여시에도, ASS 결핍 흑색종 세포에서 종양 활성을 강화시키는 결과를 일으켰다.
실시예 7
도세탁셀과 병용한 ADI-PEG 20의 임상 I기 인간 실험
단일 중심, 오픈 라벨, I기 용량 상승 실험은 진행성 고형 종양을 갖는 환자에 3주마다 정맥내(IV) 투여되는 도세탁셀과 병용한 ADI-PEG 20의 최대 내성 용량 및 용량 제한 독성(MTD 및 DLT)를 측정하기 위해 시작하였다. 환자는 상응 용량으로 주마다 근육내(IM) ADI-PEG 20을 받은 후 1시간 후에(1일에) 도세탁셀 75 mg/㎡ IV를 투약받았다. 주기 길이는 21일이었다. ADI-PEG 20은 전반적으로 주당 IM 주사로 계속하였다. 용량 상승은 표준 3+3 디자인을 이용해 수행하였다. 각각의 새로운 용량 수준 호트는 마지막 피험체가 이전 코호트에 들어간 후 21일에 들어갔다. 18 mg/㎡는 대략 160 IU/㎡와 균등하다. 투약 계획은 이하 표 2에 요약하였다.
도세탁셀 + ADI-PEG 20 투약 계획
용량 수준 도세탁셀(mg/㎡) ADI-PEG 20(mg/㎡)
-1* 75 2.2
1 75 4.5
2 75 9
3 75 18
4 75 36
* 시도는 수준 1에서 시작하였고 DLT가 관찰되면 -1 수준으로 감소시킨다.
치료 계획을 이하 표 3에 요약하였다.
치료 계획
1일
주기 11 		8일
주기 11 		15일
주기 1		 22일
주기 2+
도세탁셀2 X X
ADI-PEG 203 X X X X
1: 1 주기는 21일임
2: 각 주기의 1일에 도세탁셀 IV 투여(30분간 주입)
3: ADI-PEG 20은 1주 당 1회 근육내 투여된다.
이 실험에 의한 초기 결과는 이하 표 4에 요약하였다. 구체적으로, 8명의 환자중 정보가 이용가능하게 지금까지 치료하였고, 객관적인 임상 혜택은 다음과 같다:
실험 결과 요약
종양 최고 반응 치료 지속기간
폐-비소세포 안정한 질환 33 주
폐-비소세포 안정한 질환 12 주
혀(두경부) 안정한 질환 12 주
혀(두경부) 부분 반응(검증됨) 12 주
전립선 안정한 질환 8 주
지금까지 가입된 환자 8명 중 6명(75%)가 임상적 혜택을 가졌다(안정한 질환 + 부분 반응 + 완전한 반응).
이 실험에 사용된 용량은 저용량인데, 18 mg/㎡가 3기 간세포 암종 실험에 사용되었고, 36 mg/㎡이 흑색종에서 유효한 것으로 확인되었기 때문이다. 따라서, 이러한 초기 데이타는 이러한 저용량에서도 양성 반응이 제공되어 상당히 고무적이고 도세탁셀과 ADI-PEG 20의 병용이 효과적인 암치료임을 시사한다. 구체적으로, 도세탁셀은 유방암, 비소세포 폐암, 호르몬 불응성 전립선암, 위 선암종 및 두경부암의 편평 세포 암종에서의 종양 치료에 대해 US에서 승인받았다. 또한, 이는 육종, 특히 자궁 평활근육종, 및 다양한 암의 치료에서 사용되었다. 이와 같이, ADI-PEG 20과 병용하여 도세탁셀로 이러한 암을 치료하는 것을 본원에서 특별히 고려한다.
실시예 8
ADI-PEG 20과 라파마이신은 신장 세포 암종의 생체내 이종이식 모델에서 상승적 효과가 검증되었다.
마우스 이종이식편 모델을 사용해 신장 세포 암종의 치료를 위한 라파마이신과 병용한 ADI-PEG 20 및 ADI-PEG 20 단독의 효과를 확인하였다.
ADI-PEG 20의 활성은 Caki-1(ATCC No. HTB-46TM) 이종이식편을 보유한 마우스에서 수행하였다. 신장 세포 암종 Caki-1 이종이식편은 3-4주령, 20 g 체중의 암컷 BALB-c 누드 마우스(SLAC, Shanghai, China)에서 확립하였다. 종양을 확립하기 위해, 배지 중 5 x 106 세포를 1:1로 Matrigel 고농도(BD Biosciences)와 혼합하고 및 마우스의 복부에 피하 주사하였다. 종양 성장을 정기적으로 측정하고 종양 부피는 (TV= (길이 x 너비2)/2) 식을 이용해 계산하였다. 종양이 대략 125 ㎣에 도달하면, ADI-PEG20를 근육내 주사를 통해 4주 동안 주당 1회 160, 320 및 640 IU /㎡의 용량으로 투여하였다. 각 실험군은 9마리 마우스였다. Mice는 종양이 대략 1100 ㎣에 도달하면 안락사시켰다. 그 결과 ADI-PEG 20은 용량 의존적 방식으로 종양 성장을 억제하였다. 80% 이상의 종양 억제가 640 IU/㎡를 사용시 달성되었다.
추가 실험에서, 단일 작용제로서 또는 라파마이신과 병용하여 ADI-PEG 20의 활성을 Caki-1 이종이식편 보유 마우스에서 수행하였다. 신장 세포 암종 이종이식편은 3-4주량의 약 20 g 체중의 암컷 BALB/c-누드 마우스(SLAC, Shanghai, China)에서 확립시켰다. 종양을 확립시키기 위해, 배지 중 5 X 106 세포를 1:1로 Matrigel 고농도(BD Biosciences)와 혼합하고 마우스 복부에 피하주사하였다. 종양 성장을 정기적으로 측정하고 종양 부피는 식 (TV= (길이 x 너비2)/2)로 계산하였다. Caki-1 이종이식편이 대략 125 ㎣에 도달하면, 마우스를 무작위로 군 당 8마리씩 6군으로 분리하고 다음의 프로토콜에 따라 처리를 시작하였다: 40 ㎕ PBS를 4주 동안 매주 1회 근육내 주사받은 1군, 4 용량을 근육내 주사로 매주 1회 ADI-PEG 20(320 IU/㎡)을 투약받는 2군, i.p. 주사로 21일 동안 매일 1회 라파마이신(0.5 mg/kg)을 투약받는 3군, i.p. 주사로 21일 동안 매일 1회 라파마이신(0.2 mg/kg)을 투약받는 4군, 4주간 매주 1회 ADI-PEG20(320 IU/㎡) 및 21일 동안 매일 1회 라파마이신(0.5 mg/kg)을 투약받는 5군, 4주 동안 1주당 1회 ADI-PEG20(320 IU/㎡) 및 21일 동안 매일 1회 라파마이신(0.2 mg/kg)을 투약받는 6군, 마우스는 종양 부피가 대략 2500 ㎣에 도달하면 안락사시켰다.
도 16에 도시한 바와 같이, 결과는 ADI-PEG 20 및 라파마이신 병용이 상승적으로 ADI-PEG 20 또는 라파마이신 단독과 비교하여 종양 억제를 증강시키는 것으로 나타났다.
문헌의 데이타는 ADI-PEG 20과 오토파지 억제제 또는 mTOR 억제제 예컨대 라파마이신의 병용 효과에 대해 상이한 암 유형에 대해 일관적이지 않다. 따라서, 라파마이신과 병용한 ADI-PEG 20이 신장 세포 암종 종양을 억제하는데 상승적으로 작용한다고 예측할 수 없다. 이러한 결과들은 당분야의 숙련가가 ADI-PEG 20과 임의의 특정 조합이 암, 특히 신장 세포 암종의 치료에 효과적인지 여부를 예측할 수 없다는 것을 의미한다.
상기 기술된 다양한 구체예들은 추가 구체예를 제공하고자 조합할 수 있다. 본원에 연급하고/하거나 출원 데이타 시트에 열거한 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 출판물은 참조하여 전체로 본원에 편입시킨다. 구체예의 측면들은 추가의 구체예를 제공하기 위해 다양한 특허, 특허출원 및 출판물의 개념을 도입하는데 필요하면, 변형시킬 수 있다.
이러한 그리고 다른 변화들은 상기 구체적인 설명의 관점에서 구체예들에 적용할 수 있다. 대체로, 이하의 청구항에서, 사용된 용어들은 본원의 명세서 및 청구항에 개시된 특정 구체예에 대한 청구항을 제한하려는 것이 아니지만, 이러한 청구항이 주장하는 균등물의 전체 범주와 함께 가능한 모든 구체예를 포함시키고자 한다. 따라서, 청구항은 본원에 의해 국한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Polaris Group Bomalaski, John S. Wu, Bor-Wen <120> METHODS OF TREATMENT WITH ARGININE DEIMINASE <130> POLA-001/01WO <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Mycoplasma hominis <400> 1 Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu 1 5 10 15 Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile 20 25 30 Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile 35 40 45 Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile 50 55 60 Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu 85 90 95 Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys 100 105 110 Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu 115 120 125 Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu 130 135 140 Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp 145 150 155 160 Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn 180 185 190 His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys 195 200 205 Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu 210 215 220 Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu 225 230 235 240 Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val 245 250 255 Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp 260 265 270 Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn 275 280 285 Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu 290 295 300 Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser 305 310 315 320 Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala 325 330 335 Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr 340 345 350 Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys 355 360 365 Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His 370 375 380 Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met 385 390 395 400 Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 405 <210> 2 <211> 409 <212> PRT <213> Mycoplasma hominis <400> 2 Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu 1 5 10 15 Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile 20 25 30 Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile 35 40 45 Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile 50 55 60 Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu 85 90 95 Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Glu 100 105 110 Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu 115 120 125 Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu 130 135 140 Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp 145 150 155 160 Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn 180 185 190 His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys 195 200 205 Met Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu 210 215 220 Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu 225 230 235 240 Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val 245 250 255 Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp 260 265 270 Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn 275 280 285 Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu 290 295 300 Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser 305 310 315 320 Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala 325 330 335 Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr 340 345 350 Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys 355 360 365 Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His 370 375 380 Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met 385 390 395 400 Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 405 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Forward PCR primer used to amplify argininosuccinate synthetase cDNA <400> 3 tttaagcaga ctaagggg 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Reverse PCR primer used to amplify argininosuccinate synthetase cDNA <400> 4 ccatcccagg ttataagcac a 21

Claims (52)

  1. PEG화 아르기닌 디이미나아제(ADI-PEG)를 포함하는, 아르기니노숙시네이트 신써타아제의 감소된 발현을 나타내는 암의 치료에 사용되는 액상 약학 조성물로서, 상기 ADI-PEG는 ADI-PEG 20이고, 상기 액상 약학 조성물은 멸균되고, pH 6.6 내지 7.0이며, 0.0035 M 내지 0.35 M 히스티딘-HCl을 포함하는 액상 약학 조성물.
  2. PEG화 아르기닌 디이미나아제(ADI-PEG)를 포함하는, 아르기니노숙시네이트 신써타아제의 감소된 발현을 나타내는 암의 치료에 사용되는 액상 약학 조성물로서, 상기 ADI-PEG는 ADI-PEG 20이고, 상기 액상 약학 조성물은 멸균되고, pH 6.6 내지 7.0이며,
    0.13 M 염화나트륨과 pH 6.8인 0.035 M 히스티딘-HCl을 포함하는 액상 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 췌장암, 소세포 폐암(SCLC), 중피종 또는 간세포암;
    (b) 오토파지 억제제와 조합하여 췌장암, 육종, 또는 소세포 폐암;
    (c) 시스플라틴과 조합하여 흑색종;
    (d) 도세탁셀과 조합하여 비소세포 폐암, 두경부암 또는 전립선암;
    (e) 라파마이신과 조합하여 신장 세포 암종; 또는
    (f) 급성 골수성 백혈병, 재발성 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 직결장암, 위암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암, 및 위암으로 이루어진 군에서 선택되는 암
    의 치료에 사용되는 액상 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1주 당 2회 내지 2주 당 1회 투여되는 것인 액상 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 주 1회 투여되는 것인 액상 약학 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 80 IU/㎡ 내지 650 IU/㎡의 용량으로 투여되는 것인 액상 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 160 IU/㎡의 용량으로 투여되는 것인 액상 약학 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 160 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되는 것인 액상 약학 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 160 IU/㎡ 내지 640 IU/㎡의 용량으로 주 1회 투여되는 것인 액상 약학 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기니노숙시네이트 신써타아제의 발현 감소는 아르기니노숙시네이트 신써타아제 프로모터의 메틸화에 의한 것이거나, 또는 DNA 돌연변이 또는 결실에 의한 것인 액상 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 암은 아르기니노숙시네이트 신써타아제 음성인 것인 액상 약학 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료는 생체내에서, NO 합성을 억제하거나, 혈관생성을 억제하거나, 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하거나, 또는 이의 조합인 액상 약학 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료 결과로 안정한 질환이 되거나, 또는 환자에서 무진행 생존 시간을 증가시키는 것인 액상 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 치료는 환자에서 무진행 생존 시간을 증가시키는 것인 액상 약학 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈장 아르기닌은 1개월 이상 동안 고갈되는 것인 액상 약학 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈장 아르기닌은 2개월 초과 동안 고갈되는 것인 액상 약학 조성물.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적인 화학요법제와 조합하여 사용되는 것인 액상 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 화학요법제는 시클로포스파미드, 젬시타빈, 시스플라틴, 소라페닙, 수니티닙 및 에베롤리무스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 액상 약학 조성물.
  19. 제3항에 있어서, 오토파지 억제제는 클로로퀸, 3-메틸아데닌, 히드록시클로로퀸, 바필로마이신 A1, 5-아미노-4-이미다졸 카르복사미드 리보시드(AICAR), 오카다산, N6-머캅토퓨린 리보시드, 워트만닌, 및 빈블라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 액상 약학 조성물.
  20. 제3항에 있어서, 아르기닌 디이미나아제(ADI) 및 오토파지 억제제는 상승적으로 작용하는 것인 액상 약학 조성물.
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